normas de seguridad específicas. Toda herida, aún los pequeños cortes, que se produzca durante un trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente al docente. Al terminar

Guía de Trabajos Prácticos

I

Esta guía de Trabajos Prácticos corresponde a los cursos de Biología Celular para las

carreras de Licenciatura en Biología Molecular (Plan de Estudios Ord. CD 10/12) y

Licenciatura en Biotecnología (Plan de Estudios Ord. CD 15/14), y el curso Biología Celular y

Molecular de la Licenciatura en Ciencias Biológicas (Plan de Estudios Ord. CD 8/13). Estas

carreras se dictan en la Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia de la Universidad

Nacional de San Luis. Estos cursos corresponden al ciclo básico y se dictan en el 2º

cuatrimestre del Segundo año de estas carreras. Posee un crédito horario de 105 horas, con

4 horas de clases teóricas y 3 horas de trabajos prácticos semanales. Se utiliza como

complemento educativo el uso de un Aula virtual. El objetivo de esta propuesta es ampliar su

formación en la disciplina, mediante la resolución de problemas, discusión de trabajos

científicos, entre otros, aportando una nueva herramienta de aprendizaje autónomo.

En esta guía se encuentran todas las actividades prácticas que se realizan durante el

dictado de la asignatura. Estas actividades están orientadas a reforzar los conceptos teóricos

de Biología Celular, para lo cual se utilizarán diferentes estrategias didácticas de abordaje

del aprendizaje: a) Trabajos de Aula con resolución de problemas o casos de estudio,

seminarios y laboratorios virtuales, en estos casos se promoverá el estudio grupal,

independiente y autónomo mediante el uso de búsqueda de información en internet y libros,

b) Trabajos Prácticos de laboratorio para que los alumnos adquieran habilidades en el manejo

de instrumental de laboratorio, c) charlas debate, a partir del estudio de películas de ciencia

ficción, drama y documentales sobre temas inherentes al quehacer científico (por ej: bioética),

esta estrategia es innovadora en esta asignatura, aunque es utilizada para el aprendizaje en

otras ramas de la ciencia, por ejemplo la Física. Nuestro interés en esta actividad es que los

propios alumnos generen preguntas, bajo la guía de los docentes. Por último, d) la búsqueda

de información científica, en diferentes buscadores científicos, tanto en español como en

inglés, y posteriormente el análisis de un trabajo científico, en este caso resaltaremos la

importancia de buscar en sitios confiables.

Autores de la Guía:

Dr. Juan Gabriel Chediack

Lic. Guido Fernández Marinone

Lic. Belén Jeréz

Lic. Victoria Medawar Aguilar

Lic. Cintia Garro


II

INDICE

Medidas de seguridad en el laboratorio……………………………………………………………III

Actividad Nº 1……….………………………………………………………………………………..1

Trabajo Práctico de Aula. Análisis de casos, problemas e interpretación de datos en Biología

Celular

Actividad Nº 2……….………………………………………………………………………………..5

Trabajo Práctico de Laboratorio. Cuantificación de proteínas en muestras biológicas

Actividad Nº 3……….…………………………..……………………………………………………12

Trabajo Práctico de Laboratorio. Fraccionamiento celular

Actividad Nº 4………..……………………………………………………………………………....19

Trabajo Práctico de Laboratorio. Extracción de ADN

Actividad Nº 5…………………………………………………………………………....................25

Charla Debate ¿Son previsibles los avances científicos?

Actividad Nº 6………………………………………………………………………………………..27

Trabajo Práctico de Laboratorio. Técnicas de ADN recombinante

Actividad Nº 7………………………………………………………………………………………..32

Seminario de discusión. Ecología molecular aplicada a la conservación de especies

Actividad Nº 8………………………………………………………………………………………..34

Trabajo Práctico de Laboratorio. Aislamiento y cultivo de células

Actividad Nº 9……………………………………………………………..………………………....41

Trabajo Práctico de Aula. Laboratorio virtual de Investigación Biomédica

Actividad Nº 10…………………………………………….…………………………………………43

Trabajo Práctico de Aula. Análisis de un trabajo científico

ANEXO I………………………………………………………………………………………………48


III

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

Objetivo

Contribuir a la instrumentación de medidas de seguridad básicas que prevengan,

protejan y/o eliminen los riesgos físicos, químicos y biológicos en los Laboratorios de

Trabajos Prácticos de Biología.

Introducción teórica

Cuando se trabaja en un laboratorio existe el peligro potencial de accidentes, debido

a las sustancias químicas y elementos que se utilizan y la posibilidad de cometer algún error

al realizar un experimento, por tal motivo la seguridad y la protección de la salud son

indispensables para un ambiente de estudio y trabajo seguro en un laboratorio. Todo

estudiante, profesor o empleado debe cumplir las reglas de seguridad e higiene en el

laboratorio.

Buenas Prácticas de Laboratorio:

No entrar al laboratorio sin estar presente el Jefe de Trabajos Prácticos.

Seguir todas las indicaciones del Jefe de Trabajos Prácticos.

Leer y estudiar cada trabajo práctico antes de clase.

Familiarizarse con los elementos de seguridad disponibles: salidas, extintores,

duchas, lavaojos.

No usar el teléfono celular durante la realización del trabajo de laboratorio.

Está prohibido comer, beber (incluye tomar mate), almacenar alimentos, fumar,

maquillarse o manipular lentes de contacto en el laboratorio.

El área de trabajo debe estar limpia y ordenada. No deben colocarse libros, abrigos

o bolsas sobre las mesadas. Se deberá verificar que la mesa de trabajo esté limpia

al comenzar y al terminar el trabajo realizado.

Nunca probar, ni oler en forma directa ningún producto en el laboratorio.

Prohibido pipetear con la boca. Se podrán utilizar pipetas de vidrio o plástico con

propipetas o pipetas automáticas.

Manejar con especial cuidado el material frágil, por ejemplo, el vidrio.

Antes de encender un mechero asegúrese que lo hace en un lugar permitido donde

no haya material inflamable a su alrededor. Al encender el mechero hágalo con la


IV

menor apertura posible del robinete. No abandone el laboratorio sin haber apagado

los mecheros.

Utilizar pinzas de madera para calentar tubos de ensayo, sujetar el instrumental de

vidrio y retirarlo del fuego para evitar quemaduras. Cuando caliente no mirar

directamente al interior del tubo por su abertura ni dirigir esta hacia algún compañero.

Antes de trasladar o desarmar un aparato eléctrico, desconectarlo de la red.

No utilizar ninguna herramienta o máquina sin conocer su uso, funcionamiento y

normas de seguridad específicas.

Toda herida, aún los pequeños cortes, que se produzca durante un trabajo práctico

deben ser informados obligatoriamente al docente.

Al terminar la práctica, limpiar y ordenar el material utilizado y el espacio de trabajo.

Recuerde: su seguridad y la de sus compañeros en el laboratorio depende del

conocimiento de las buenas prácticas, el sentido común y la solidaridad en el

ambiente de trabajo.

Vestimenta adecuada en el laboratorio

Guardapolvo de manga larga que cubra la ropa de calle, preferentemente de

algodón (que no será utilizado fuera del laboratorio), zapatos cerrados (no sandalias

ni ojotas) y tener el pelo recogido.

Guantes apropiados acorde a los riesgos y los reactivos que se manipulen. Los

guantes de látex previenen el contacto con agentes tóxicos o biológicos. Los guantes

deberán descartarse al alejarse de la mesada de trabajo, no se tocarán con ellos

lapiceras, carpetas, picaportes, teclados, etc. En el caso de accidentalmente, tocar

algún producto químico en forma directa no llevarse las manos a la cara y lavar

inmediatamente.

Antiparras o anteojos de seguridad, en aquellos Trabajos Prácticos que así lo

requieran. Los ojos absorben rápidamente algunos compuestos químicos (aerosoles

y vapores). Las gafas son de uso personal y no pueden ser intercambiadas entre los

alumnos.


V

Riesgos en el laboratorio

Todo producto químico debe ser considerado un tóxico potencial por sí mismo o por su

reacción con otros. Es por eso que en el laboratorio:

Se debe almacenar la menor cantidad posible de drogas y reactivos. Los mismos

deberán estar debidamente etiquetados.

Todos los productos inflamables deben almacenarse en un lugar adecuado y

separados del resto (ácidos, bases y reactivos oxidantes).

Antes de cada experimento, observar los signos de peligrosidad indicados en la

etiqueta de los frascos de los productos químicos que se disponga a usar (ver

pictogramas de peligrosidad).

Cuando el experimento involucre gases, vapores, humos o partículas sólo podrá

realizarse bajo campana.

Los ácidos y las bases fuertes han de manejarse con mucha precaución, ya que la

mayoría son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir heridas y

quemaduras importantes.

Al mezclar algún ácido (por ejemplo, ácido sulfúrico) con agua, añadir el ácido

sobre el agua, nunca al contrario, pues se producen proyecciones del ácido y podría

provocar quemaduras en la cara y los ojos.

No dejar destapados los frascos ni aspirar su contenido. Sustancias líquidas como

alcohol, éter, cloroformo, amoníaco etc. emiten vapores tóxicos.

Evitar el contacto de sustancias inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) con fuentes

de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará a baño María,

nunca directamente a la llama.

No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados.

Pictogramas de peligrosidad

En las etiquetas de algunos reactivos pueden encontrarse 1 ó 2 de los pictogramas

mostrados a continuación. Estos símbolos muestran, gráficamente, el nivel de peligrosidad de

la sustancia etiquetada:


VI

T+

Muy Tóxico

E

Explosivo

O

Comburente

F

Fácilmente

inflamable

Xn

Nocivo

F+

Extremadamente

inflamable

Xi

Irritante

C

Corrosivo

N

Peligro para el

medio ambiente

T

Tóxico

Riesgos biológicos:

La manipulación de microorganismos (incluidos los genéticamente modificados), cultivos

celulares, animales, muestras de fluidos o tejidos, etc. debe realizarse con extrema precaución

y los protocolos de trabajo deben estar autorizadas por autoridades pertinentes.

Algunas de las precauciones a tomar para evitar riesgos son:

Desinfectar y ordenar las zonas de trabajo antes de comenzar y al terminar con el uso

de lavandina 5%, alcohol al 70%.

Cubrir adecuadamente con elementos protectores heridas o abrasiones preexistentes

en la piel.

El derrame o caída de muestras contaminadas, diluciones, etc. debe ser informadas al

docente, de forma inmediata. El área afectada debe ser tratada con solución

desinfectante, y recogida con papel absorbente. Una vez limpia la zona, tratar

nuevamente con desinfectante.

Desactivar y eliminar residuos patológicos en forma correcta (ver tabla de desactivación

y eliminación)

http://www.texca.com/picto/Gvo07.gif

http://www.texca.com/picto/GVO03.gif










VII

Desactivación y eliminación de residuos generados en los laboratorios

Con el fin de disminuir los riesgos en el laboratorio se han implementado formas de

desactivación y eliminación de residuos, las cuales están resumidas en la siguiente tabla:

RESIDUO TIPO DE RECIPIENTE

A UTILIZAR

DISPOSICIÓN Y/O

DESACTIVACIÓN

Ordinarios o comunes

Residuos sólidos de oficinas,

áreas comunes y de uso general.

Bolsa Negra o común Son recolectados por la

dependencia correspondiente.

Residuos de riesgo biológico

infecciosos.

Residuos que contienen

microorganismos tales como

bacterias, parásitos, virus,

hongos.

Bolsa Roja

Desactivación previa en una

autoclave. Se envían luego a

incineración.

Residuos de animales

Animales y/o residuos de animales

utilizados en experimentación.

Bolsa Roja Se mantienen congelados

hasta que se envían luego a

incineración.

Elementos cortantes

Agujas, láminas de bisturí o vidrio

y cualquier otro elemento punzo

cortante.

Recipiente para

elementos cortantes

Se almacenan en los

recipientes que después son

recolectados por el personal

autorizado.

Residuos ácidos o básicos

Residuos líquidos provenientes de

sustancias con carácter ácido o

alcalino.

Almacenar en

recipientes especiales

resistentes a la

corrosión

Estos residuos se deben

neutralizar con una base o

ácido débil según sea el caso,

hasta obtener un pH cercano a

la neutralidad.

Primeros auxilios en caso de accidente

La rápida actuación ante un accidente puede salvar la vida de una persona o evitar el

empeoramiento de las posibles lesiones que padezca. Por ello es necesario conocer tanto las

actuaciones básicas generales frente a una emergencia, como las actuaciones específicas


VIII

frente a agentes químicos, cancerígenos y biológicos que permitan controlar adecuadamente

la situación.

Mantener la calma

Evaluar la situación

Proteger al accidentado asegurando que tanto él como la persona que lo socorre estén

fuera de peligro. Esto es especialmente importante cuando la atmósfera no es

respirable, se ha producido un incendio, existe contacto eléctrico o una máquina está

en marcha.

Avisar de forma inmediata a los servicios sanitarios. El aviso ha de ser claro y conciso,

indicando el lugar exacto donde ha ocurrido la emergencia, las condiciones de especial

riesgo que pudieran concurrir en el laboratorio atendiendo a la existencia de agentes

químicos, cancerígenos y biológicos y las primeras impresiones sobre la persona o

personas afectadas y las precauciones a tener en cuenta.

No mover al accidentado salvo que sea necesario para protegerle de los riesgos aún

presentes en el laboratorio.

No dar de beber ni medicar al accidentado.

En caso de fuego el laboratorio: Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por

la salida principal o la salida de emergencia. Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que

se extienda el pánico y conservando siempre la calma, avisar al servicio de extinción de

incendios. Si el fuego es pequeño y localizado, apagar utilizando un extintor adecuado, arena,

o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue. Retirar los

productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilizar nunca agua para

extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.

Quemaduras: Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o

mantas calefactoras, etc., se tratan lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15

minutos. Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.

Cortes: Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el

laboratorio. Estos cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua y jabón. Si son

pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lavar con agua y jabón y tapar con una venda

o apósitos adecuados. Si son grandes y no paran de sangrar, requieren asistencia médica

inmediata.

Lesión por productos químicos sobre la piel: Los productos químicos que se hayan vertido

sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo


IX

durante 15 minutos. Es necesario sacar toda la ropa contaminada a la persona afectada lo

antes posible. Recuerde que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la

gravedad y la extensión de la herida. Acudir al médico con prontitud aportando la información

contenida en la etiqueta o ficha de datos de seguridad del producto.

Corrosiones en los ojos: En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos).

Cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lavar los dos ojos con

agua corriente abundante durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos. Es

necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado

debajo de los párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la

lesión.

Ingestión de productos químicos: Antes de cualquier actuación concreta pedir asistencia

médica. Si el paciente está inconsciente, ponerlo en posición inclinada, con la cabeza de

lado. Si está consciente, mantenerlo apoyado. No provocar el vómito si el producto ingerido

es corrosivo.

Inhalación de productos químicos: Conducir inmediatamente la persona afectada a un

sitio con aire fresco. Pedir asistencia médica lo antes posible.

Bibliografía:

Mc Cormack ML, Manacorda AM. Manual de higiene y seguridad para laboratorios

universitarios de enseñanza e investigación. Áreas: química, biología y microbiología.

2007.Editorial Educo.Universidad Nacional de Comahue.

Recalde Ruiz D, Laborada Grima R, Tolsa Martínez R, Marqués Jiménez N.. Manual de

seguridad para operaciones en laboratorios de biotecnología y de tipo biológico.

2002.Universidad Politécnica de Valencia.

Menéndez CJA. Seguridad e higiene: manual para laboratorios químicos y biológicos.

Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia.2008. Universidad Nacional de San Luis.


1

ACTIVIDAD N°1: TRABAJO PRÁCTICO DE AULA

Análisis de casos, problemas e interpretación de datos en Biología Celular

Objetivos

Adquirir conocimientos en Biología Celular a partir del método de Aprendizaje basado

en casos y problemas.

Profundizar en el conocimiento del método científico: desarrollar la capacidad de

observación y de análisis crítico, de recolección de información, evaluación y

clasificación de datos, elaboración de hipótesis y deducción de conclusiones.

Seleccionar los métodos gráfico y numérico apropiados para examinar las

características de los datos y/o relaciones de interés.

Conocer diferentes técnicas de uso común en Biología Celular para identificar

componentes celulares.

El aprendizaje basado en casos y problemas es un método de enseñanza que se viene

implementando y desarrollando desde hace unos años en distintas universidades del mundo,

cuya finalidad es el aprendizaje de conocimiento, por parte del alumno, a partir de un rol activo

dentro de un grupo de estudio, donde el profesor cumple el rol de guiar al alumno en la

adquisición del conocimiento. Este método se desarrolla a partir de la presentación de un caso

o problema y luego los alumnos conforman grupos de trabajo para plantear la resolución del

problema. Esta metodología está basada en el aprendizaje colaborativo e independiente.

El procedimiento del aprendizaje basado en problemas consta de los siguientes pasos:

Leer y analizar el problema

Realizar una lluvia de ideas: en este paso los alumnos plantearán hipótesis sobre las

causas del problema e ideas de cómo resolverlo. Estas hipótesis se pondrán a prueba

en pasos siguientes.

Realizar un listado de lo que se conoce y desconoce del problema planteado. Se debe

hacer una lista de aquello que se conoce, como causante del problema, o aquello que

se desconoce y que puede estar involucrado en el problema.


2

Resolver el problema. A partir de un diseño experimental, realizar posibles

experimentos que permitan develar el problema y aportar resultados concretos para

su resolución.

Comunicar los resultados. Se debe exponer los resultados obtenidos del experimento

realizado.

Problemas

1. Marco Teórico: El Diazinón, es un insecticida que se usa para el control de

plagas en zonas residenciales. El efecto sobre los insectos es inhibir la acetilcolinesterasa,

enzima necesaria para el correcto funcionamiento del Sistema Nervioso. Diazinón tiene una

baja persistencia en el suelo, su vida media es de 2-6 semanas. Sin embargo altas dosis

pueden provocar envenenamiento y los síntomas asociados a este compuesto en seres

humanos, incluyen: debilidad, jaquecas, visión borrosa, sudor, vómitos y diarrea, entre otros.

En 2004 fue prohibido para el uso residencial en los Estados Unidos, sin embargo aún está

permitido en el uso agrícola.

Problema: Un agricultor utiliza este insecticida en sus cultivos, para controlar las plagas

que le están afectando sus cultivos. En la etiqueta del veneno le dicen las concentraciones

recomendadas por el vendedor (de 0,75 a 1,50 g por litro de agua). Al tiempo de la aplicación,

nota que la cantidad de insectos en sus cultivos había descendido, sin embargo, los animales

que se alimentaban de ellos (principalmente gallinas) presentaban diferentes síntomas de

enfermedades como pérdida de plumaje y diarrea. Inmediatamente el agricultor se comunica

con el veterinario quien le dice que sus animales estaban envenados. Rápidamente le se

notifica al Centro de Toxicología donde usted trabaja y le piden que elabore un informe técnico.

Discuta con sus compañeros de grupo el diseño de un experimento con las variables

macroscópicas (a nivel de organismo) y microscópicas (a nivel celular) a evaluar en los

animales de experimentación (gallinas envenenadas). Discutan qué técnicas se podrían

utilizar en este diseño experimental (por ej: western-blot, especifique los pasos que debería

seguir para realizar la técnica elegida y realice un esquema de los resultados esperados).

Nota: tenga en cuenta que la proteína Citocromo P450 (citocromo detoxificante presente

en el retículo endoplasmático liso) se ve involucrada en estos procesos, por lo cual es un buen

marcador celular de detoxificación. Investigue en Internet sobre esta proteína y sobre otras

variables para evaluar el efecto de envenenamiento por insecticidas.


3

2. Usted se encuentra realizando una pasantía en un laboratorio de biología celular en

donde se estudia cómo influye el estrés celular en la secreción de colágeno utilizando

como modelo una línea celular de epitelio murino. En estudios previos han encontrado

que diferentes estresores pueden afectar la expresión y secreción de distintos tipos de

colágeno (si no conoce esta proteína investigue en internet, libros o revistas). La

hipótesis de trabajo es: el estrés modifica la secreción del colágeno I en células

epiteliales. Discuta con sus compañeros el diseño del experimento y la metodología que

podría utilizar para estudiar este proceso. ¿Este proceso ocurrirá en todas las células

de un organismo? ¿Qué resultados espera obtener, si realmente afecta la secreción?

¿Y a nivel génico?

3. A partir de la siguiente observación planteen un experimento para poder corroborar el

resultado obtenido por los investigadores:

Se ha observado que los animales que viven en zonas de altura (por ej: las llamas o

alpacas que viven en la Cordillera de los Andes a 4200 m sobre el nivel del mar) poseen

mayor concentración de la proteína muscular mioglobina que los que viven sobre el

nivel del mar. Esta observación corresponde a una adaptación fisiológica de los

organismos, lo que significa que las modificaciones fisiológicas que se operan en los

organismos en presencia de circunstancias o entornos difíciles (en este caso la altura)

sirven para favorecer de alguna forma la supervivencia de los seres en cuestión.

Plantee un experimento para poner a prueba esta hipótesis y metodologías para arribar

a los resultados. Exprese los resultados en forma de tablas o gráficas.

4. Usted debe resolver (identificar según peso molecular) una mezcla con las proteínas

detalladas más abajo. Discuta con sus compañeros qué técnicas podría utilizar si

quisiera obtener fracciones de proteínas que estén en estado nativo (no

desnaturalizado) y en caso de sólo querer identificar el peso molecular.

Proteína Peso molecular

mioglobina 16900

maltasa 221600

citocromo c 13370

miosina 524800

quimiotripsinógeno 23240


4

seroalbúmina 68500

5. En algunas enfermedades es necesario realizar un estudio genético para poder

corroborarla, ese es el caso de la corea de Huntington, una enfermedad en el cual las

neuronas en ciertas partes del cerebro se desgastan o se degeneran. Se sabe que la

mutación del gen para la patología produce un producto génico de mayor peso

molecular, de hasta 3 veces el tamaño normal. El gen normal tiene un peso molecular

de 537 pares de bases. Se corrieron muestras de 3 individuos en un gel de agarosa.

Los resultados fueron, un homocigoto sano, un heterocigoto y un homocigoto para la

mutación. ¿Cómo se vería el gel de agarosa?

Bibliografía:

Aprendizaje basado en problemas. 2008. Servicio de Innovación Educativa de la

Universidad Politécnica de Madrid.

Juan Ignacio Domínguez Martínez. 1999. Información y análisis exploratorio de datos. Uno:

Revista de didáctica de las matemáticas, Nº. 20, pags. 41-56.

Approches to cell biology teaching. Allen & Tanner. 2003. Journal of Cell Biology Education.

El mundo de la Célula. 2007. 6ta Edición. Becker W, Kleinsmith L, Hardin J. Editorial

Pearson Education S.A. Madrid.

Introducción a la Biología Celular. 2011. 3º Edición. Alberts B, Hopkin J, LewisR, Roberts

W. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. .

Biología Celular y Molecular”. 2016.Lodish y col. 7ma. Edición. Editorial Médica

Panamericana.


5

ACTIVIDAD N°2: TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO

Cuantificación de proteínas en muestras biológicas

Objetivos:

Propiciar los conocimientos, para que el alumno comprenda los fundamentos de algunas

técnicas de uso común en laboratorios de Biología Celular.

Conocer y saber cuándo aplicar los principales métodos químicos de cuantificación de

proteínas.

Construir una curva de calibración de concentración de proteínas mediante el uso de un

kit comercial que se basa en el método de Biuret.

Determinar la concentración de proteínas en distintas muestras biológicas.

Temario: Proteínas. Composición química. Funciones. Importancia biológica. Cuantificación

de proteínas en muestras biológicas. Métodos de determinación de proteínas.

Conceptos básicos

Las proteínas son biomoléculas que forman parte importante de los seres vivos. Estas

constituyen unidades estructurales que forman a la célula llegando a representar la mayor

parte de su biomasa, además de darle forma y estructura, cumplen la mayor parte de las

funciones celulares por ejemplo enzimáticas, transportadoras, estructurales, motoras, de

señalización, receptoras y reguladoras génicas.

Son macromoléculas lineales constituidas por la unión de aminoácidos, esta secuencia

de aminoácidos representan la estructura primaria. Estas estructuras lineales se pliegan

adquiriendo una estructura tridimensional (estructuras secundaria y terciaria) particular que

determinará su función.

La enorme complejidad del conjunto total de proteínas de los organismos vivos obliga

al empleo de diversas técnicas para separar dichas proteínas. Durante la separación es

importante poder cuantificar el rendimiento del proceso de purificación de proteínas de

interés, utilizándose diferentes técnicas espectroscópicas (fluorescencia, espectrofotometría).


6

Métodos más comunes de valoración de proteínas

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina

básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se

quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de

enfermedades, así como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la

cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:

a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV,

b) la formación de derivados químicos,

c) la capacidad que tienen las proteínas de unirse a ciertos colorantes.

Los métodos más usuales para el estudio de la cantidad y tipo de proteínas son:

- Reacción del Biuret: reacción colorimétrica basada en la unión de Cu+2 en medio alcalino

con los grupos amino de las proteínas.

- Método de Lowry: método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la

muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la

intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas (coloración azulada). Provoca

el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos

fenólicos de tirosina que participan de la reacción.

- Método de Bradford: basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-

250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona

con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. La unión del colorante con

proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm.

- Método del ácido Bicincónico: Método para la cuantificación de proteínas, sencillo, rápido,

sensible, y con gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. El ácido

bicinconínico constituye la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso

producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino.

- Absorción en el ultravioleta: Las proteínas poseen una banda de absorción a 280 nm como

consecuencia de la absorción de los residuos de tirosilo y triptofanilo en esta región del

espectro. Es un método no destructivo. El rango de concentración que se puede determinar

depende del contenido de los aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.

Métodos inmunológicos: métodos altamente específicos, basados en la reacción antígeno-

anticuerpo. Pueden ser de difusión radial, electrodifusión, precipitación y radioinmunológicos.

Pueden alcanzar sensibilidades del orden de ng/ml.

Procedencia de las proteínas que queremos cuantificar en el trabajo práctico

Se determinará la concentración de proteínas en homogenato de intestino y de hígado de

aves de la especie Passer domesticus. Además se medirá la concentración proteica de


7

muestras de leche entera y descremada de distintas marcas. La determinación de la

concentración de proteínas será llevada a cabo por el método de Biuret.

Método de Biuret (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol. Chem., 177-766):

Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una

solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con

aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm.

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de

dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco.

El método permite cuantificar soluciones que contengan entre 1 y 0 mg de proteínas

por mililitro y no depende de la composición de aminoácidos.

Las características más importantes de la reacción son:

La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y

proteínas.

Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.

No depende de la composición de aminoácidos.

Algunos compuestos (NH4, Tris, etc.) también reaccionan con el reactivo de Biuret.

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación

de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). Se basa en la formación de un complejo

coloreado entre el Cu+2 y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu+2 se

acompleja con 4 NH. El complejo presenta un color violeta-púrpura, que presenta un máximo

de absorción a 540nm. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad

de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas

sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja (rango de 1 a 6 mg/mL) y sólo

se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados, como

por ejemplo en suero.

Reacción de Biuret. Imagen extraída de Química de los Alimentos.


8

El color generado por este método es poco estable y depende de las condiciones de reacción,

por lo que se debe realizar una curva de calibración con soluciones de una proteína de

concentración conocida. La curva de calibración es un método de química analítica empleado

para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie

de soluciones de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio

lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia) y la variable a determinar

(concentración). Para ello, se efectúan diluciones de una solución de concentración conocida

y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que

relacione ambas. Después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la

sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de la

muestra. De este modo empleando la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la

muestra problema hasta encontrar la concentración.

Figura 3: Curva patrón de proteína.

PROCEDIMIENTO

I. Construcción de curva de calibración para el método de Biuret.

1. Encender el espectrofotómetro y ajustar la longitud de onda del espectrofotómetro a

540 nm.

2. Colocar en una gradilla 14 tubos de ensayos limpios y secos. Los tubos se enumeran

del 1 al 14 con un marcador (cada tubo tendrá una concentración y un duplicado).

y = 0,0469x - 0,003R² = 0,9974

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 1 2 3 4 5 6

Ab

sorb

anci

a

Concentración (mg/ml)

Curva calibración proteínas totales


9

3. Con pipetas adecuadas al volumen a medir, colocar en cada tubo los volúmenes de

solución patrón de albumina de suero bovino (4,8 mg/ml) y de agua destilada que se

indican en la siguiente tabla:

Tubo (N°) Patrón de proteínas (µl) Agua (µl)

1 0 200

2 20 180

3 40 160

4 60 140

5 80 120

6 100 100

7 200 0

4. Añadir a cada tubo de ensayo 1,75 ml del reactivo de Biuret, tapar e invertir dos veces

para mezclar o vortexear.

5. Colocar la gradilla con los tubos en un baño termostático a 37°C durante 15 min.

6. Una vez transcurrido los 15 min, retirar los tubos del baño y dejar a enfriar unos

minutos a temperatura ambiente.

7. Proceder a medir en el espectrofotómetro, para lo cual primero se ajusta el cero de

absorbancia con la solución blanco exenta de proteína (tubo 1 y 2). Luego se miden

las absorbancias de los tubos 3 a 14 y se anotan las medidas de absorbancia en el

cuaderno de laboratorio.

8. Calcular la concentración de proteína que se ha colocados en cada uno de los tubos

de ensayo. Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 20

µl de proteínas totales BSA 4,8 mg/ml y se han diluido a un volumen de 200 µl con

agua destilada. Por lo tanto la concentración de proteína en el tubo será:

(20 µl x 4,8 mg/ml) / 200 µl = 0,48 mg/mL

9. En una hoja de cálculo de Excel, representar los valores experimentales de

absorbancia obtenidos frente a la concentración de proteína estándar calculada de

cada uno de los tubos en una recta ajustada por el método de mínimos cuadrados.

Así se obtiene una curva calibración donde las abscisas (x) representan la

concentración de proteína (mg/mL) y las ordenadas (y) los valores de absorbancia.

Obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de determinación (R2). Mediante la

ecuación de la recta se puede calcular la concentración de proteína en una muestra

despejando los valores de x de la ecuación de la recta.


10

II. Determinación de concentración de proteínas en muestras biológicas.

La concentración de proteínas totales se medirá utilizando el método de Biuret.

1. Encender el espectrofotómetro y ajustar la longitud de onda del espectrofotómetro a

540 nm.

2. Colocar en una gradilla tubos de ensayos limpios y secos. Los tubos se rotulan para

cada muestra biológica.

3. Con pipetas adecuadas al volumen a medir, colocar en cada tubo un volumen de 25

µl de muestras problemas (homogenato de intestino, homogenato de hígado, leche).

4. Añadir a cada tubo de ensayo 1,75 ml del reactivo de Biuret, tapar con papel parafilm

e invertir dos veces para mezclar.

5. Colocar la gradilla con los tubos en un baño termostático a 37°C durante 15 min.

6. Una vez transcurrido los 15 min, retirar los tubos del baño y dejar a enfriar unos

minutos a temperatura ambiente.

7. Proceder a medir en el espectrofotómetro, para lo cual primero se ajusta el cero de

absorbancia con la solución blanco exenta de proteína (tubo 1). Luego se miden las

absorbancias de los tubos restantes y se anotan las medidas de absorbancia en el

cuaderno de laboratorio.

8. Mediante la ecuación de la recta obtenida a partir de la curva de calibración se puede

calcular la concentración de proteínas en las muestras despejando los valores de x

de la ecuación de la recta.

Para pensar y responder….

1. La masa del intestino de ese ave era de aproximadamente 342 mg y se hizo una

homogenización del tejido con buffer Tris en una proporción 1:5, el hígado tuvo un peso de

467 mg y se homogenizó de la misma manera ¿qué proporción de proteínas tendrá cada

tejido?

2. ¿Qué característica determina la gran variedad de funciones que desempeñan las

proteínas?

3. ¿Qué método emplearía si necesita determinar la concentración de una proteína en el rango

entre los 0,1 a 2 mg? ¿Y en el caso de una muestra que se piensa tiene aproximadamente 10

ng? Explique qué ocurriría si emplea un método demasiado sensible o poco sensible para

analizar su muestra.

4. ¿Qué enlaces intervienen en la conformación de la estructura terciaria de las proteínas?


11

Bibliografía

Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.

Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial Publidisia.

Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman.

Beas C., D. Ortuños y J. Armendariz (2009) Biología molecular. Fundamentos y

aplicaciones. Editorial Mc Graw-Hill.



Introducción a la Biología Celular. 2011.3º Edición. Alberts B, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff,

Roberts, Walter. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires.

Biología Celular y Molecular”. 2016. Lodish y col. 7ma. Edición. Editorial Médica

Panamericana.


12


Fraccionamiento celular

Objetivos

Entender el principio físico utilizado para la separación de organelas

Aislar e identificar cloroplastos, núcleos y mitocondrias del tejido de plantas.

Observar/examinar esas fracciones microscópicamente.

Experimentar con fracciones aisladas de cloroplastos

Temario: Métodos y técnicas fundamentales para el estudio de la Célula. Microscopía

óptica. Organelas: estructura y función.

Conceptos básicos

El fraccionamiento celular o fraccionamiento subcelular es una técnica de laboratorio, tras la

disgregación de las células del tejido, en la que se intenta reagrupar las partículas,

generalmente células y organelas, en función de sus propiedades biofísicas. Mediante el

fraccionamiento celular se consigue separar conjuntos homogéneos, por lo general de

organelas, a partir de una población heterogénea de células. Esta metodología es usada para

investigar la bioquímica y fisiología de las mismas fuera del ambiente complejo de la célula.

Homogenización

Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se los debe suspender en

un medio apropiado (una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener

la integridad de las organelas y enzimas durante el procedimiento del fraccionamiento, todas

las soluciones y material de vidrio deben mantenerse en frío. Después de rebanar las hojas,

el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces

celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de

células fragmentadas se llama homogenato. Para los tejidos de plantas, la homogenización

se debe realizar con un mortero, a la cual se le puede añadir arena como abrasivo. En este

trabajo práctico los cloroplastos se aislarán de la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán

de la coliflor.

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=T%C3%A9cnicas_de_laboratorio&action=edit&redlink=1


13

Centrifugado

Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una

fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga

relativa (RCF) o en unidades g (unidades de gravedad). La RCF es una función de velocidad

de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje

de rotación. Cuando decimos "centrifugamos a 100000g" queremos decir que centrifugamos

con una fuerza de 100000 veces mayor que la de la gravedad.

Centrifugación diferencial

En la centrifugación diferencial, el homogenato es centrifugado repetidas veces a altas

velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. El método está

ilustrado en la figura de abajo. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual

sedimenta la fracción nuclear. Este “pellet” contiene el núcleo, células intactas y tejido. La

próxima separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre

el “pellet” nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10000g por

30 minutos en una centrífuga. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial;

éste contiene mitocondria y microsomas.

Los cloroplastos de las células de espinaca se aislarán utilizando el método modificado

de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en una solución salina.

Después que el tejido de la planta se macera en un mortero, el homogenato se filtra a través

de una gasa o algodón para remover los pedazos grandes de tejidos. El filtrado es

centrifugado, sedimentando los cloroplastos.

La fracción nuclear y mitocondrial de las células de la coliflor se obtendrán utilizando

una centrifugación diferencial escrita por W.D. Bonner (1967). El tejido se homogeniza en una

solución de NaCl. Después se la filtración a través de una gasa, el homogenato es

centrifugado como se ilustra en la fig. 2, paso 3.


14

Imagen representativa del proceso de fraccionamiento celular. Extraída de:

biologia.laguia2000.com

Examinación microscópica

Todas las fracciones aisladas se examinarán microscópicamente para identificar las organelas

presentes.

Cloroplastos. Los cloroplastos son relativamente grandes, por lo tanto, algunos detalles

internos se observan con el microscopio óptico. Luego de examinar la morfología normal de

los cloroplastos de la espinaca, se estudiarán los efectos de dos compuestos orgánicos. Los

cloroplastos serán tratados con una solución saturada de urea 8N. Urea es conocida por

desnaturalizar proteínas, ya que una solución saturada de este soluto produce un aumento de

la fuerza iónica del medio lo que provoca una disminución en el grado de hidratación de los

grupos iónicos superficiales de las proteínas. Este aumento de la fuerza iónica se debe a que

los solutos (urea) compiten por el agua por lo que se rompen los puentes de hidrogeno o las

interacciones electrostáticas, de forma que las moléculas proteicas se agregan y precipitan.

Además los cloroplastos serán tratados con una solución acuosa de Tritón X-100 al 2%, el

cuál es un detergente no iónico usado para desnaturalizar membranas celulares sin

desnaturalizar las proteínas.

Núcleo. Para la observación de los núcleos se debe realizar una tinción. El colorante a utilizar

será azul de metileno, el cual lo tiñe de azul.


15

Mitocondria. Las mitocondrias son teñidas con el colorante verde Jano (a una concentración

de 0,01%). Después de la tinción, la mitocondria se tiñe azul-verdosa, que es el color del

colorante en su forma oxidada. El verde Jano se mantiene en estado oxidado por el sistema

de oxidasa citocromo de la mitocondria.

PROCEDIMIENTO

I. Aislamiento de la fracción de cloroplastos

1. Pese 4 g de hojas frescas de espinaca, a las cuales se les removieron las venas

centrales.

2. Corte las hojas en pequeños pedazos y colóquelas en un mortero frío. Añada 2 ml de la

solución amortiguadora de Tris-HCl pH=8 fría, 8ml de solución de NaCl 0,35M y arena

purificada. Macere el tejido por 4 minutos colocando el mortero sobre el hielo para inactivar

las enzimas hidrolíticas que se liberan durante la ruptura celular.

3. Filtre la suspensión a través de algodón a un tubo de centrífuga de 15 ml frío. Luego

trasvase el líquido a varios tubos de 1,5 ml.

4. Centrifugue el líquido filtrado a 500g por 3 minutos, para sedimentar fragmentos de tejido

y organelas grandes. Verifique que los tubos de centrífuga estén balanceados.

5. Recupere el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugue a 3000g por 10 minutos en

esta centrifugación la mayor parte de los cloroplastos sedimentan formando un pellet en el

fondo del tubo.

6. Descarte el sobrenadante y usando una pipeta automática, añada 250µl de la solución

NaCl 0,35M al “pellet” que quedó en cada tubo de la centrífuga. Resuspenda el “pellet” suave

y lentamente con una pipeta Pasteur.

7. Adicione 500µl más de la solución de NaCl 0,35M.

8. Centrifugue a 3000g durante 10 minutos para lavar los cloroplastos.

9. Descarte con cuidado el sobrenadante y resuspenda el pellet en 2ml de solución

amortiguadora (Tris-HCl 0,2M, pH=8) para concentrar los cloroplastos en una sola muestra.

10. Tape el tubo y colóquelo en hielo.


16

II. Observación microscópica de la fracción de cloroplastos

1. Con una pipeta Pasteur remueva una gota de la suspensión de cloroplastos y lleve a

cabo una preparación húmeda. Use una pequeña gota de modo que no tenga que ejercer

presión sobre el cubreobjetos, dañando los cloroplastos.

2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de mayor aumento en seco (40X) y luego

bajo el objetivo de inmersión en aceite (100X).

3. Observa la morfología de varios cloroplastos. Identifica los cloroplastos que tengan

una morfología interna poco homogénea.

III. Observación microscópica de los cloroplastos tratados con urea

1. Coloque una pequeña gota de la suspensión de cloroplastos en un portaobjeto limpio.

Añada una gota de la solución de urea saturada 8N y coloque un cubreobjetos, cuidando de

no presionar el mismo.

2. Examine los cloroplastos primero con el objetivo de 40X y luego con el de 100X con

aceite de inmersión.

3. Dibuje los cloroplastos que presenten una morfología alterada.

IV. Observación microscópica de los cloroplastos tratados con triton

1. Prepare un montaje húmedo usando una pequeña gota de la suspensión de

cloroplastos y una gota de solución de Tritón X-100 al 2%.

2. Examine la preparación bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersión de aceite.

OBSERVACIONES Y PREGUNTAS:

¿Cuál es la forma de un cloroplasto individual?

¿Qué estructuras son visibles en los cloroplastos?

¿Qué cambios morfológicos ocurren en los cloroplastos cuando son tratados con urea?

¿Qué cambios morfológicos ocurren en los cloroplastos cuando son tratados con Tritón X-

100?

V. Aislamiento de fracciones celulares y mitocondriales

1. Remueva 20 g de la parte externa de la coliflor con un escalpelo.


17

2. Coloque el tejido en un mortero frío con 30 ml de solución NaCl 0,35M fría. Macere los

tejidos por 4 minutos.

3. Filtre la suspensión a través de algodón a un tubo de centrífuga. Deje reposar el tubo

por 2 minutos en hielo.

4. Coloque cuidadosamente el sobrenadante en varios tubos de 1,5 ml y centrifugue a 600

g por 10 min a 4° C.

5. Coloque el sobrenadante post nuclear a un tubo de centrífuga y el “pellet” nuclear llévelo

a un baño de hielo.

6. Centrifugue el sobrenadante post nuclear a 10.000 g por 30 min a 4° C.

7. Descarte el sobrenadante post mitocondrial y añada 250µl del solución Tris-HCl 0,2M fría

al “pellet mitocondrial”.

8. Con una espátula remueva el “pellet” mitocondrial de las paredes del tubo de centrífuga

y luego con una pipeta Pasteur, resuspéndalo en la solución de Tris-HCl 0,2M.

9. Transfiera la suspensión mitocondrial a un tubo y colóquelo en un baño de hielo.

VI. Observación microscópica de la fracción mitocondrial

1. Coloque 5 gotas de la suspensión mitocondrial en un tubo pequeño. Añada 5 gotas del

colorante verde Jano, agite y espere 10 minutos.

2. Coloque una gota de la mezcla en un portaobjeto y observe bajo el objetivo de alta

potencia y el de inmersión en aceite del microscopio. Identifique las mitocondrias.

3. Observe la morfología de las mitocondrias.

VII. Tinción de mitocondrias de células epiteliales humanas

Materiales

-Hisopo estéril -Verde Jano B 0,01% en solución salina

-Cubreobjetos -Portaobjeto

Procedimientos

1. Con el hisopo estéril raspar suavemente la parte interna de la mejilla. Se colectarán un

gran número de células de esta manera.

2. Suavemente frotar el hisopo sobre el portaobjetos en una dirección para esparcir las

células. Dejar secar las células.


18

3. Poner unas gotas de la solución de verde Jano y dejar actuar por 5-10 min.

4. Luego de los primeros 5, lavar las células suavemente 1 vez con agua destilada. Montar

las células en una gota de agua destilada con un cubreobjeto y observar bajo el

microscopio.

Observación

Se debe ver en cada célula un gran número de cuerpos pequeños y alargados. Generalmente

no se tiñen tan fuertemente aparecen como pecas. Las mitocondrias se distinguen de una

bacteria debido a que las últimas se tiñen más fuertemente.

OBSERVACIONES Y PREGUNTAS:

¿Qué estructuras celulares pudo observar en estas células?

Observe varias células y establezca la posición de las organelas.

Bibliografía

Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. Bregman, Allyn. 1990. 3ra Ed. John

Wiley & Sons, N.Y.

Protocols on cell biology experiments. Indian Society of Biology



Introducción a la Biología Celular. 2011.3º Edición. Alberts B, Hopkin, Johnson, Lewis,

Raff, Roberts, Walter. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires.

Biología Celular y Molecular”. 2016. Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott,

Zipursky, Darnell. 7ma. Edición. Editorial Médica Panamericana.


19


Extracción de ADN

Objetivos

Practicar el manejo de diferentes técnicas de laboratorio para extraer el ADN de un

producto natural.

Comprender la utilidad de las distintas técnicas de extracción de ADN.

Temario: La molécula de DNA: estructura y conformaciones. Cromatina: componentes

proteicos. Las histonas: distintos tipos y propiedades. Nucleosomas.

Fundamento

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en que los iones salinos son

atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción

de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su

contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento,

el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos,

proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN se van

separando de él por acción del detergente y por el fraccionamiento del ADN en cadenas más

pequeñas. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla tampón y detergente, para lo

cual se utiliza alcohol isoamílico, probablemente el único reactivo de esta práctica que no

suele encontrarse en una cocina.

MATERIAL Y REACTIVOS

Levadura (Saccharomyces cerevisiae) y tomate (Solanum lycopersicum)

Agua destilada

Cloruro de sodio

Bicarbonato sódico

Detergente líquido o champú

Alcohol isoamílico

Batidora

Baño de hielo

Centrífuga


20

Vaso

Tubo de ensayo

Varilla de vidrio fina

REALIZACIÓN

Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la heladera o en un

baño de hielo triturado:

120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral.

1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.

5 g de bicarbonato sódico.

5 ml de detergente líquido o champú.

Preparar la muestra que va a proporcionar el ADN, en el caso de la levadura,

disgregarla con agua destilada. Para el tomate, cortarlo en cuadrados chicos.

Triturar la muestra en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos.

Así se romperán una gran cantidad de células, mientras que otras quedarán sanas. Las sanas

son en las cuales el detergente podrá producir la lisis.

Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y

agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Centrifugar a baja velocidad 5 minutos y

pipetear el sobrenadante.

Colocar 5 ml del caldo molecular en un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de

alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara

interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

Se introduce la punta de una varilla de vidrio hasta justo debajo de la separación entre

el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán

enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla

atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el

aspecto de un copo de algodón mojado. Guardar en freezer de -20°C para utilizarlo en el TP.

Protocolo de extracción de ADN plasmídico (minipreps)

ATENCIÓN: se deberá trabajar con sumo cuidado, con guantes durante todo el

proceso. Limpiar el lugar de trabajo antes y después de la experiencia y trabajar siempre sobre

papel secante y los preparados. Recuerde son bacterias resistentes a antibióticos


21

MINIPREPS DE DNA PLASMÍDICO (ver anexo)

Tomar 1,4ml de los cultivos de bacterias seleccionadas y pasarlos a tubos de

1,5 ml.

Centrifugar 10000rpm por 10min. Descartar el sobrenadante.

Agregar al pellet 300ul de solución I y resuspender suavemente.

Nota: las bacterias sin plásmido forman un pellet más compacto y difícil de

resuspender.

Agregar 300ul de solución II y mezclar por inversión. NO VORTEXEAR!!!!!

Agregar 300ul de la solución III, (para precipitar el DNA genómico, el

plasmídico queda en el sobrenadante). Incubar en hielo 15min.

Centrifugar a 13200rpm por 15min a 4°C.

En tubos nuevos poner 2ul de RNASA (sobre hielo).

Trasvasar el sobrenadante a tubos con 2ul (20mg/ml) de RNasa. Incubar 1h a

37°C. en estufa.

Extracción de proteínas: Agregamos 600ul de cloroformo: isoamílico (24:1).

Vortexear.

Centrifugar 13200rpm a temperatura ambiente (TA) por 2min.

Recuperar el sobrenadante (fase acuosa superior).

Precipitación: Agregar 600ul de isopropanol 100 %. Mezclar por inversión e

incubar a TA 1h (o toda la noche a 4°C).

Centrifugar 13200rpm a 4°C por 30min.

Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 500ul de EtOH 70% en agua

ultrapura (MQ) (despegar el pellet).

Centrifugar 12000rpm por 10min a 4°C.

Eliminar el sobrenadante y secar el pellet a 37°C por 5min.

Resuspender en H2O MQ (30ul).

Guardar en freezer de -20°C para utilizarlo em el TP N°6

SOLUCIÓN PREPARACIÓN FUNCIÓN

I 25mM de Tris-HCl, pH=8; 50mM de

glucosa; 10mM de EDTA

Es para resuspender a las

bacterias.

II Se prepara en el momento; 0,2N

NaOH; 1% SDS

Lisis de bacterias


22

III 60ml de acetato de potasio 5M;

11,5ml de ácido acético glacial;

28,5ml de H2O. VF=100ml

Precipita el ADN genómico

dejando al ADN plasmídico

en solución.

ANEXO (previo al práctico)

Preparado de placas y medio de cultivo

Medio LB Vf: 500ml

El medio LB (caldo Luria Bertani), es un medio nutricional con los siguientes

componentes:

5g de triptona 1%

2,5g de extracto de levadura 0,5%

5g de NaCl 1%

Estos reactivos proveen fuentes de proteína e hidratos de carbono, necesarias para el

correcto crecimiento bacteriano de nuestra cepa DH5de Escherichia coli. Otros procariotas

pueden precisar otros requerimientos.

Llevar a 475ml con H2O Ultrapura (MQ), llevar a pH y completar 500 ml

Para medio sólido agregar 15g/l de agar.

Antibiótico preparado: 125ul (200mg/ml). Trifacilina 1000 + 5ml de H2O(d)

Siempre trabajamos en condiciones estériles y en este caso el uso del antibiótico nos

permite seleccionar sólo las bacterias que tienen el plásmido insertado (porque presenta

resistencia a este antibiótico).

LIGACIÓN

Este proceso es una de las principales etapas para realizar el subclonado. Aquí

nuestro producto de PCR de interés es insertado en el vector de clonación (plásmido). De esta

manera, ahora el vector tiene un mayor tamaño, porque el producto de PCR se encuentra

inserto en él.

-2ul H2O

-1ul solución salina

-1ul vector

-2ul producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

VF: 6ul

La concentración óptima es 1:3 del inserto:vector

Transformación de células competentes con los productos de ligación

Una vez que nuestro vector ha sido modificado, debemos colocarlo en nuestras

células, este proceso se denominan transformación.


23

Aclaración! no todas recibirán un plásmido y además no todos los plásmidos tienen

el inserto.

Mezclar y hacer un spin (centrifugación corta). Dejar 15-20min de incubación a

temperatura ambiente (TA) para optimizar la ligación.

Se agregan 2ul de la ligación a cada tubo con bacterias competentes. Se

incuba 15min en hielo.

Se realiza un shock térmico 42°C por 30min para permitir el ingreso del

plásmido a la bacteria.

Incubar en hielo 5min y luego agregar 250ul de SOC (medio de cultivo que

viene con el kit de transformación) a temperatura ambiente.

Incubar en agitación horizontal a 200rpm 1h a 37°C.

Mientras tanto, preparar las placas con X-gal 2% en DMF (40 ul por placa). El

X-gal es un sustrato de β-galactosidasa (el gen para esta enzima se encuentra en el vector),

y cuando se encuentra esta enzima, las colonias se ponen azules. El inserto del PCR se

coloca en el medio de este gen, por lo cual, las colonias de interés serán las azules. Es el

método para saber que está nuestro inserto presente.

Sembrar en placas de LB + antibiótico (100ug/ul) e incubar durante toda la

noche a 37 °C.

Colocar las placas en heladera unos minutos (ayuda a distinguir las azules de

las blancas)

Para cultivar a cada tubo se le agrega medio líquido LB con antibiótico, unos

3ml.

Elegir sólo colonias blancas o celeste (las azules no tienen el inserto).

Cultivar 24hs.

Proceder a obtener el ADN plasmídico con nuestro inserto (Minipreps).

Análisis de placas de células transformadas

Seleccionar 4 colonias transformadas (blancas) y una celeste de cada placa

con antibiótico. Para distinguirlas mejor se las puede colocar unos minutos en la heladera.


24

Imagen extraída de: https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-

science/cloning/topo/topo-ta-cloning.html

Bibliografía:

Biología Celular y Molecular, /ª ed. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C, Krieger

M, Scout MP, Zipursky L, Darnell J. 2016. Editorial Médica Panamericana. Madrid.



Introducción a la Biología Celular. 2011. 3º Edición. Alberts B, Hopkin, Johnson, Lewis,


Modificado del protocolo TOPO TA cloning kit de Invitrogen. [Internet]. Disponible en:

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/topota_man.pdf


25

ACTIVIDAD N°5: CHARLA DEBATE

¿Son previsibles los avances científicos?

Objetivos:

Analizar películas de ciencia ficción para debatir acerca de los límites éticos y

técnicos de la ciencia.

Analizar los avances biotecnológicos planteados en las películas y plantear su

factibilidad de realización en el mundo real.

Concientizar acerca de la manipulación génica y sus implicancias sociales y

evolutivas.

Introducción

En esencia, el avance científico tiene por finalidad mejorar la calidad de vida de todos los

integrantes de la sociedad. Los avances técnicos en el área de la biomedicina han permitido

grandes logros en cuanto a generar mejores condiciones de vida. Sin embargo, ¿ha llegado

este avance científico a todos los habitantes? el avance de la técnica y sus aplicaciones

¿pueden ir más allá de los principios morales y éticos de la sociedad?

Con la observación de estos films se discutirá los límites técnicos, éticos y morales de la

ciencia para el mejoramiento de la calidad de vida de la sociedad. Siendo los ejes temáticos

la imagen de la ciencia, los científicos, del futuro y las alternativas.

Películas

1- Parque Jurásico (Jurassic Park) (País de origen. USA, Año 1993). Duración: 126 min.

Dirigida por Steven Spielberg.

Esta película de ciencia ficción se trata de la creación de un parque temático en una Isla, en

donde, por medio de un equipo de científicos genetistas (y una inversión millonaria) se crean

dinosaurios clonados que habitan la misma como animales silvestres.

2- Gattaca (País de origen. USA, Año 1997). Duración 112 min. Dirigida por Andrew

Niccol.


26

El eje temático central de esta película de ciencia ficción se trata de la modificación genética

de embriones y las implicancias sociales de hacer bebés a medida, con determinadas

características.

3- Mundo Jurásico (Jurassic World) (País de origen. USA, Año 2015). Duración 124 min.

Dirigida por Colin Trevorrow.

Esta película de ciencia ficción, es una secuela de Parque Jurásico, en donde, 10 años

después de la inauguración, se ha seguido investigando sobre los dinosaurios. Para lo cual,

se continuó clonando y modificando genéticamente a los dinosaurios (invirtiendo millones de

dólares en esa experimentación).

Actividad: se estimulará a los alumnos que elaboren preguntas en base a los ejes temáticos

y debatan sobre las mismas.

Bibliografía

Sierra-Cuartas, Carlos Eduardo de Jesús. 2007. Fortalezas epistemológicas y

axiológicas de la ciencia-ficción: un Potosí pedagógico mal aprovechado en la

enseñanza y divulgación de las ciencias. Revista Eureka sobre Enseñanza y

Divulgación de las Ciencias. Vol. 4 núm. 1, pp. 87-105.

Petit, M.F. y Solbes, J. 2016. El cine de ciencia ficción en las clases de ciencias de

enseñanza secundaria (II). Análisis de películas. Revista Eureka sobre Enseñanza y

Divulgación de las Ciencias, 13 (1), 176-191.

Barnett, M., Wagner, H., Gatling, A., Anderson J., Houle M., Kafka A. 2006. The Impact

of Science Fiction Film on Student Understanding of Science. Journal of Science

Education and Technology. Volume 15, Issue 2, pp 179–191.


27


Técnicas de ADN recombinante

Objetivos

Practicar el manejo de diferentes técnicas de uso común en laboratorios de

biología celular y molecular.

Resolver problemas relacionados con las técnicas de ADN recombinante.

Temario: Estructura del ADN. Plásmidos bacterianos. Endonucleasas de restricción,

separación del ADN. Electroforesis de ácidos nucleicos. Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR). Clonado de ADN.

Guía de problemas:

1. Marque cuál de los siguientes pares de enzimas son isoesquisómeros:

Enzima de restricción Mbo I EcoR I Bst1107 I

Cadena 5´-3´ NGATCN GAATTC GTATAC

Cadena 3´-5´ NCTAGN CTTAAG CATATG

Enzima de restricción Eco32 I Cla I BamH I

Cadena 5´-3´ GATATC ATCGAT GGATCC

Cadena 3´-5´ CTATAG TAGCTA CCTAGG

En el medio de los nucleótidos subrayados es donde se encuentra el sitio de corte de

la enzima.

2. Trabajando con bacterias en el laboratorio se observó que una cepa de

bacterias E. coli no estaban produciendo una proteína necesaria para la hidrólisis del

monosacárido manosa. Se desea reconocer si esta observación se debe a algún evento que

esté ocurriendo a nivel del ADN de la bacteria. ¿Cuál sería la hipótesis más probable de este

problema? ¿Cómo haría para evaluar esta hipótesis?

3. En un laboratorio de Biología Molecular se logró identificar y aislar una

secuencia de nucleótidos que se piensa es el gen de la mioglobina de llamas (alpacas

andinas). Posteriormente esta secuencia fue amplificada por la técnica de PCR, ahora usted

debe:


28

a) determinar si ese fragmento identificado es el gen de interés.

b) ¿Cómo haría si usted quiere producir esa proteína en altas concentraciones para

estudiarla? Analice varias posibilidades.

4. Se ha hecho un estudio de filogenia molecular para armar el árbol genealógico de

la familia Cortés, lo que se sabe de ellos, es que muchos de los miembros de la familia

padecen una enfermedad genética muy rara, producida por la mutación del gen H, “Ñ fobia”,

los afectados por este mal, no pueden pronunciar, ni ver la letra Ñ debido a que les produce

mal de ojo.

El procedimiento fue el siguiente: se obtuvo ADN genómico de los familiares y se

amplificó por PCR el exón 4 del gen H (fragmento de 300pb). Se digiere el mismo con la

enzima de restricción Vod K y se hizo una corrida electroforética.

Cuando el individuo es sano, el fragmento de 300pb, es diana para Vod K y se

obtienen dos fragmentos uno de 100pb y otro de 200pb. Pero cuando está afectado la

mutación hace que el exón 4 del gen H ya no sea diana de la enzima.

Analizar en función de la explicación anterior la electroforesis del siguiente gel de

agarosa al 3%, indicando quienes estarán afectados y quiénes no.

a) ¿Qué criterios ha seguido para identificar los fragmentos?

b) ¿Se hubiesen obtenidos resultados parecidos con otras enzimas de restricción?

¿Está seguro de su respuesta?

5- Suponga que usted desea localizar en el cromosoma el gen que codifica para la

insulina en el lagarto overo. Para esto la información que usted conoce de la insulina es la

secuencia de aminoácidos de la proteína y además posee las herramientas para sintetizar

una molécula artificial con la secuencia de nucleótidos que usted elija. ¿Cómo haría para llevar

a cabo su objetivo?

Suponga que desea separar el gen de la insulina del resto del cromosoma. ¿Cómo

procedería?

6- Para identificar si una persona tiene el virus del HIV se realizan diferentes estudios,

primeramente un ELISA, que si da positivo se realiza un Western Blot (presencia de las


29

glicoproteínas gp41 y gp121). En caso de que el paciente presente esas proteínas es

necesario contar la cantidad de virus mediante el uso de sondas Taqman (qPCR). Además

se debe analizar por citometría de flujo las poblaciones de las células del sistema inmune que

participan en respuesta a esa infección (CD4+ y CD8+)

Imagen extraída de: http://www.grupocitometria.org.ar/wp-

content/uploads/2013/08/ABA-CLASE-CUANTIFICACION-CD4.pdf

Analizar los siguientes resultados:

Imagen extraída de: http://www.grupocitometria.org.ar/wp-

content/uploads/2013/08/ABA-CLASE-CUANTIFICACION-CD4.pdf

¿Qué puede decir respecto al western blot anterior?

Antes de comenzar el tratamiento el paciente tenía 25000 copias de virus/ml de

muestra. Luego de 6 meses de tratamiento se repite el conteo y da como resultado: ARN de

virus, no detectado.

¿Qué indica esto?


30

7- El ornitorrinco probablemente es el mamífero “más raro” de todos, durante mucho

tiempo desconcertó a los biólogos debido a sus características. Sin embargo, al analizar por

sonda el genoma se descubrió lo siguiente:

Presenta genes específicos de mamíferos (gen de la caseína, necesario para la

composición de la leche materna), pero a su vez una gran cantidad de genes de reptiles. ¿Qué

nos dice esto?

PARTE PRÁCTICA:

Digestión con enzima de restricción para obtener un producto de PCR que fue

previamente ligado a un plásmido.

1- Producto de PCR (no se realizará en el práctico)

Para la obtención de suficiente cantidad de una secuencia de ADN previamente se

realizó una RT-PCR, en esta técnica una hebra de ARN es retrotranscrita en ADN

complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa reversa, y el resultado, se

amplifica en una PCR tradicional.

Para obtener el producto de la RT-PCR primero se realizó una extracción de ARN

(método del Trizol) a partir de un homogenato de tejido. Luego con el ARN total obtenido del

paso de la extracción se llevó a cabo una retrotranscripción usando una enzima transcriptasa

reversa, oligo-dt y dNTPs para obtener ADNc. A continuación, se realizó la reacción en

cadena de la polimerasa PCR utilizando las siguientes condiciones, cada mezcla de PCR

tiene: PCR buffer, dNTPs, MgCl2, Taq polimerasa, primers (forward y reverse

primer), templado de ADNc. Esta mezcla de reacción fue sometida a los siguientes ciclos: 1

ciclo de desnaturalización inicial (94 ºC, 3 minutos); 35 ciclos de amplificación a las siguientes

temperaturas: (94ºC, 1 minutos); (57ºC, 1 minutos); (72 ºC, 1 minutos.) con una elongación

final a (72 ºC, 5 minutos).

2- Ligación del producto de PCR al plásmido (no se realizará en el práctico)

Se llevó a cabo una reacción de ligación incubando al plásmido y el producto de PCR

con una enzima con actividad DNA ligasa.

3- Digestión con enzimas de restricción

En el práctico se realizará la digestión con enzimas de restricción para recuperar el

producto de PCR del plásmido. Para esto se incubarán los plásmidos ligados al producto de

PCR con las enzimas de restricción durante 1 hora a 37°C.


31

Enzimas de restricción a utilizar para digerir el plásmido

Sitio B: BamHI 5'-G/GATCC-3'

Sitio E: EcoRI 5'-G/AATTC-3’

Posteriormente se hará una corrida en un gel de agarosa al 2,5%. La electroforesis se

llevará a cabo utilizando buffer TBE 0,5X (poner que contiene el buffer), a voltaje constante

(50 mV/cm) durante 90 minutos. El gel se teñirá con Gelred para luego observarse en un

transiluminador (luz UV).

Bibliografía

Biología Celular y Molecular, 7ª ed. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C, Krieger






Sumanas, Inc. Multimedia Development Services. [Internet]. Disponible en:

http://www.sumanasinc.com

Animación de Southern Microbiology. 6a Ed. Prescott Harley Klein. En:

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781

B E

p426-TcL19Δ 6000pb

Producto de PCR

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781


32

ACTIVIDAD N°7: SEMINARIO DE DISCUSIÓN

Ecología molecular aplicada a la conservación de especies

Objetivos

Discutir sobre el uso de la Biología Molecular en ecología de poblaciones.

Analizar los alcances de la Biología Molecular en la conservación de las

especies.

Trabajo de discusión: Capítulo 8: Ecología Molecular de la Conservación. Libro:

Ecología Molecular. 2007.

El capítulo del libro se encuentra como Anexo al final de la Guía.


33

Bibliografía







Ecología Molecular. Cap 8: Ecología Molecular de la Conservación. 2007. Rocha M.

Gasca Jaime.Editor: Moreno-Letelier A. Universidad Nacional Autónoma de México.

México


34


Aislamiento y cultivo de células

Objetivos

Conocer la importancia de los cultivos celulares en la investigación científica.

Conocer técnicas que permiten el aislamiento de células para su cultivo.

Determinar la viabilidad celular del grupo de células aisladas.

Conocer las morfologías de distintos tipos celulares.

Temario: Interacciones entre las células y su entorno. Uniones celulares. Matriz

extracelular.

Conceptos básicos

Los cultivos de células “in vitro”, es decir en el laboratorio, consisten en un sistema

formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en

medios de cultivo de composición química definida (nutrientes y factores de crecimiento) y en

condiciones de temperatura, concentración de O2 y CO2, pH y humedad controladas. De esta

manera, es posible su supervivencia y multiplicación, manteniendo todas sus funciones

metabólicas de una manera semejante a las que tenían en el huésped.

El cultivo celular tuvo su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del

comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro

del organismo y bajo el estrés de un experimento. En la actualidad, pueden cultivarse en el

laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes.

Particularmente en experimentos de biología celular, las técnicas de cultivo celular permiten

el estudio de múltiples procesos celulares: procesos metabólicos, mecanismos de control del

ciclo celular, regulación de la expresión génica, el estudio de numerosos procesos del cáncer

y su diagnóstico, etc.

Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original

recién extraído (por ejemplo: extracción de hepatocitos del hígado), este cultivo recibe el

nombre de Cultivo Primario. Cuando este cultivo primario es sometido a procesos de

transformación que le confieren capacidad ilimitada de multiplicación, recibe el nombre de

Línea Celular.


35

Los cultivos de células animales también se pueden clasificar de acuerdo a su

capacidad de adherencia o no a una superficie determinada, pudiendo crecer en forma de

monocapa, en una placa de cultivo, o en suspensión en frascos de cultivo.

Métodos de aislamiento de células epiteliales del intestino

El cultivo de células intestinales, como así su aislamiento permite el estudio de

diversas funciones intestinales, tales como, mecanismos de digestión enzimática y proteínas

transportadoras de nutrientes. Como dijimos, el aislamiento de células a partir de un tejido

consiste en reducir el mismo a una suspensión celular. Esto se consigue mediante la ruptura

de las uniones celulares (de gran importancia y abundancia en el tejido epitelial), existentes

entre las células y con la matriz extracelular.

Una amplia variedad de técnicas han sido descritas para la preparación de

suspensiones de células aisladas a partir del epitelio del intestino delgado. La mayoría de

estas técnicas proporcionan una gran cantidad de células y usualmente permiten una

separación razonable entre células de las vellosidades y células de las criptas. Estas técnicas

pueden ser agrupadas de acuerdo al principio empleado para la disociación (o disgregación)

del epitelio intestinal: Disociación Mecánica; Disociación Química y Digestión Enzimática

a) Disociación mecánica

El aislamiento de las células epiteliales a partir del intestino delgado es posible

mediante la aplicación de distintas fuerzas mecánicas sobre este órgano. Dentro de los

métodos de aislamiento mecánico se encuentran: raspado de la mucosa intestinal y agitación

del tejido cortado en trozos, siendo éste último el más usado.

b) Disociación química

El aislamiento celular puede también ser fácilmente realizado por medio de la

incubación del intestino delgado con compuestos químicos, principalmente agentes quelatos,

que permiten liberar las células de sus interacciones dependientes de calcio (Ca+2) y magnesio

(Mg+2) entre sí y con la membrana basal.

Entre los reactivos empleados para aislamiento por medio de agentes quelatos, el

EDTA ha sido el más empleado, aunque también han sido usados el citrato de sodio y el

EGTA.

c) Digestión enzimática

La digestión por medio de enzimas consiste en la ruptura de las proteínas que

conforman las diferentes uniones celulares, liberando las células. Las enzimas proteolíticas

más usadas para la separación celular del epitelio intestinal incluyen tripsina, hialuronidasa,

colagenasa y dispasa. Siendo la Tripsina en bajas concentraciones la más usada.


36

En ocasiones se pueden realizar técnicas mixtas, por ejemplo usar soluciones de

EDTA con Tripsina en bajas concentraciones, de esta manera se acelera el aislamiento de

células. Por otro lado, la elección de las distintas técnicas va a depender del tipo de diseño

experimental y los procesos celulares que quieran estudiarse.

Existen dos formas de producir el aislamiento del epitelio intestinal: a) Aislamiento en

una etapa y b) Aislamiento en más de una etapa (aislamiento secuencial)

a) Aislamiento del epitelio intestinal en una etapa

Es utilizado principalmente para la producción de cultivos primarios y líneas celulares.

También se lleva a cabo con el fin de comparar diferentes técnicas de disociación, estudiar

reacciones metabólicas en enterocitos aislados e incluso el estudio del proceso de

diferenciación de las células madre intestinales.

b) Aislamiento secuencial del epitelio intestinal

El aislamiento secuencial, el cual implica que las células son aisladas en más de una

etapa, se realiza principalmente con el fin de separar sub-poblaciones de enterocitos a lo largo

del eje cripta- vellosidad, con el fin de estudiar la función del enterocito in vitro, por medio de

la determinación de la actividad de diversos marcadores, principalmente enzimas y

transportadores de membrana ligados al proceso de diferenciación celular. También es

posible realizar este aislamiento secuencial para aislar tipos celulares más indiferenciados,

con el fin de producir cultivos celulares sin interferencia de fenotipos diferenciados.

El enterocito es el tipo de célula más importante que pertenece al epitelio intestinal,

constituye más del 90% de las células epiteliales en las criptas y más del 95% de las células

de las vellosidades.

Determinación de la viabilidad celular por exclusión con azul tripán.

Una vez aisladas las células se debe conocer el estado de salud de la célula, para lo

cual se realiza la tinción de Tripán. La reactividad del azul tripán está basada en que el

cromóforo no interacciona con las células a menos que la membrana esté dañada, por lo cual,

las células azules, en las que ha penetrado el colorante se consideran no viables (muertas).

El procedimiento general es el siguiente: Se mezcla una fracción de solución de azul

tripán con la suspensión celular y luego de esa mezcla se siembran 10 l en un portaobjeto

especial denominado cámara de Neubauer (figura 1), y 1 minuto después se lleva al

microscopio y se comienza a contar, en ambas cámaras, el número de células hasta el minuto

15, como máximo, pasado ese tiempo la mayoría de las células se tiñen. Las células totales

(transparentes y azules) y viables (transparentes) se cuentan al mismo tiempo y se realiza el

cálculo final:

Nº de células/ml = (Nº de células contadas/Nº de cuadros contados) x 16 x 104 x 5

Donde 5 es el factor de dilución de la suspensión celular.


37

Figura 1: cámara de Neubauer

Cultivo celular

Teniendo en cuenta la cantidad de células por mililitro en la suspensión obtenida, se

procede a realizar la siembra en cajas de petri, placas de cultivo o frascos de cultivo, con un

medio de cultivo apropiado para el tipo celular.

Medios de cultivo

Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes

necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento

de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo

que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se

presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya

preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido.

Composición

• Macronutrientes.

• Micronutrientes o elementos traza.

• Factores de crecimiento

Algunos de los medios más utilizados son:

1. Medio Basal de Eagle (BME)

2. Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM)

http://es.wikipedia.org/wiki/PH

http://es.wikipedia.org/wiki/Virus

http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_(microbiolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos

http://es.wikipedia.org/wiki/Planta


38

3. R.P.M.I. 1640.

4. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM).

5. Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM).

En el práctico usaremos DMEM el cual es una modificación del medio basal medium

Eagle (BME), contiene una mayor concentración de aminoácidos y vitaminas, así como la

adición de antibióticos y la suplementación con suero fetal bovino. El suero fetal bovino (SFB)

es un subproducto derivado del faenamiento de vacas preñadas. Aunque la composición, los

efectos y las interacciones exactas de todos los componentes de SFB tienen todavía que ser

esclarecidas (descubiertas), los componentes principales pueden ser resumidos como sigue:

- Proteínas necesarias para la adherencia de las células a la matriz de soporte

- Enzimas y Hormonas proteicas

- Factores específicos de promoción del desarrollo celular

- Factores de inhibición del desarrollo celular

- Hormonas no proteicas

- Lípidos esenciales para el desarrollo, diferenciación y multiplicación celular

- Minerales

- Metabolitos y nutrientes

- Substancias con capacidad de tampón (buffer)

- Inhibidores de proteasas

- Ligantes

- Inactivantes de materiales tóxicos

Además, con el fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele

suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. La adición de

antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo.

Una de las mezclas de uso más común es: 9 Penicilina (100 U/mL) / 1 Estreptomicina (100

μg/mL).

PROCEDIMIENTO

VIII. Observación de tejido de intestino.

Observación microscópica de un corte histológico de intestino delgado coloreado con

hematoxilina-eosina. Observar detenidamente, dibuje e identifique las partes constituyentes

del epitelio intestinal.


39

IX. Aislamiento de enterocitos a partir de intestino de paloma

1. El primer paso para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido consiste en

separar la matriz extracelular que las mantiene unida, tratando de mantener las condiciones

necesarias de esterilidad.

2. Colocar la muestra de tejido en solución buffer salina en una caja de Petri en baño

de hielo, y cortar con bisturí o tijera quirúrgica hasta obtener pequeños trozos de tejido.

3. Trasvasar en un tubo de ensayo y tratar la muestra con una solución de

Tripsina/EDTA 0.05%. Agregar cantidad necesaria hasta que los tejidos queden sumergidos

en la solución.

4. Agitar y llevar a estufa a 37ºC durante 30 min. Agitar cada 15 minutos. Después de

este período de tiempo, y mediante una suave agitación, se obtendrá la suspensión celular

que contiene a todas las células presentes en ese tejido.

5. Agitar y recoger con pipeta el sobrenadante en tubos de 1,5 ml.

6. Centrifugar a 500g por 5min. Eliminar el sobrenadante y lavar los pellets celulares

con medio de cultivo dos veces, centrifugando nuevamente a 500g por 5min.

7. Resuspender las células aisladas en medio de cultivo con suero y antibióticos,

posteriormente evaluar la viabilidad celular con solución de tripán.

8. Observar en microscopio óptico.

X. Técnica de azul tripán

Se utilizarán 250 ul de azul tripán 0,4% en PBS, 150 l de HBSS-manitol y 100 l de

la suspensión celular, lo cual diluye dicha suspensión 5 veces (dilución 1/5). Todo este

procedimiento es llevado a cabo a 4ºC, con el fin de minimizar la actividad de las proteasas.

Realizar los pasos especificados anteriormente en la guía.

XI. Realización de un cultivo celular.

Se realizará la siembra de células en un medio de cultivo suplementado con 10% de

suero fetal bovino y antibióticos (para evitar contaminación), en cajas de petri tratadas con

colágeno (como proteína de adherencia).

Bibliografía






40



Isolation and Culture of Intestinal Epithelial Cells. Booth C. and O’Shea J. 2002.

Second Edition. 303-335. R. Ian Freshney (Editor), Mary G. Freshney (Editor).

Evaluation of three methods for secuential isolation of epithelial cells from avian

intestine.2008. Mac Donal O, Chediack JG and Caviedes-Vidal E. Biocell; 32(3):219-

27.


41

ACTIVIDAD N°9: TRABAJO PRÁCTICO DE AULA

Laboratorio virtual de Investigación Biomédica

Objetivos

Integrar el aprendizaje de técnicas en Biología Molecular mediante recursos

informáticos (usos de TICs).

Link para acceder al laboratorio virtual:

https://www.xplorehealth.eu/es/media/investiga-una-cura-para-el-cancer-colorrectal

Imagen extraída de Xplore Health

Fundamento teórico:

Es importante implementar nuevas estrategias de enseñanza, o nuevos escenarios

didácticos que permitan a los estudiantes otras formas de adquirir ciertas competencias como

el pensamiento científico y metodología de investigación. En la aplicación de estos escenarios,

los laboratorios virtuales son herramientas que resultan atractivas ya que despiertan

motivación y curiosidad por el conocimiento científico en los alumnos. Entre las ventajas que

presentan podemos mencionar la posibilidad de repetir cada experiencia tantas veces como

el alumno la necesite sin restricciones horarias ni de tipo económico. Además, como en los

mismos la información se brinda en el momento en la cual es necesaria, permite una

comunicación más eficiente con el alumno, al evitar los “ruidos” habituales en un laboratorio



42

presencial donde la relación no es uno a uno, y las indicaciones pueden ser desoídas al ser

enunciadas cuando el alumno está abocado a otra tarea.

Bibliografía:

Infante Jiménez, Cherlys. 2014. Propuesta pedagógica para el uso de laboratorios

virtuales como actividad complementaria en las asignaturas teórico-prácticas. Revista

mexicana de investigación educativa, 19(62), 917-937.

Biología Celular y Molecular, 7ª ed. 2016. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C,

Krieger M, Scout MP, Zipursky L, Darnell J. Editorial Médica Panamericana. Madrid.





Laboratorio virtual Xplore Health. [Internet]. Disponible en:

https://www.xplorehealth.eu/es/media/investiga-una-cura-para-el-cancer-colorrectal.



43

ACTIVIDAD N° 10: TRABAJO PRÁCTICO DE AULA

Análisis de un trabajo científico

Objetivos

Conocer la importancia de comunicar los resultados de una investigación

científica.

Analizar el avance de la Biología Celular a través de la búsqueda bibliográfica.

Discutir la importancia de la rigurosidad en la difusión/divulgación de la ciencia.

Conocer y entender cuáles son las partes principales de un artículo científico.

GENERACIÓN Y DIVULGACIÓN DEL CONOCIMIENTO

El conocimiento científico contribuye a explicar y comprender los fenómenos de la

naturaleza y se genera a partir de la aplicación del método científico, el cual consta de una

serie de pasos sistemáticos para resolver un problema real mediante una investigación. Estos

pasos son: observación del fenómeno, hacer preguntas, proponer hipótesis, diseñar y realizar

un experimento, colectar los datos resultantes, elaborar tablas y gráficas para realizar una

interpretación de estos resultados y finalmente llegar a las conclusiones. Sin embargo, la tarea

del investigador no termina cuando finaliza la fase de campo de su experimento, es decir

cuando ha dilucidado cómo actúa una enzima o cómo las aves migratorias optimizan la

energía para llegar a su destino. El trabajo estará concluido cuando otros investigadores

puedan hacer uso de los resultados y de los métodos empleados en la investigación. Esto es

la divulgación del conocimiento generado a partir de una investigación. La forma más común

para comunicarlo entre pares o colegas investigadores es la publicación la investigación

“artículo” en una revista científica. Lo que se investiga y no se publica, es como si no se

hubiera hecho. En este sentido es importante saber que la ciencia es dinámica, es decir,

cambia constantemente. Toda teoría puede reinterpretarse o ser reemplazada por otra, si

nuevas observaciones demuestran que es incorrecta. Debido a esto, resulta imprescindible

que cada experimento que se realice sea reproducible (es decir, el mismo resultado pueda

ser obtenido por distintos investigadores bajo las mismas condiciones de experimentación),

para que los resultados obtenidos en las distintas instancias sean comparables. Esta es una

de las normas básicas del método científico. Para que esto ocurra, uno de los aspectos más

importantes a tener en cuenta es que el procedimiento escrito y la expresión de los resultados

de toda actividad, puedan ser interpretados por toda la comunidad científica de todos los

países. Es relevante la homogeneidad en la expresión ya que permite el preciso intercambio


44

de procedimientos y resultados en la investigación científica. Esto hace que las hipótesis

puedan ser corroboradas y así la ciencia avance. Una vez que se tienen las conclusiones el

próximo paso es redactar un artículo y publicarlo en una revista científica; de esta forma la

investigación pasa a formar parte del conocimiento científico y está disponible para una

cantidad mucho mayor de personas.

La estructura de los artículos científicos tienen en general las siguientes

características:

Título: refleja en forma sintética el tema del trabajo y anticipa la principal conclusión a

la que se llegó.

Autores: el orden en que se ubican la lista de autores refleja la contribución de cada

uno al trabajo científico, generalmente el primer autor es el que ha tenido la mayor

participación en cuanto a la realización de los experimentos y el diseño experimental, mientras

que el último es común que sea el director del proyecto quién aporta en cuanto al diseño

experimental, financiamiento y/o escritura del trabajo.

Resumen: esta sección sintetiza o resume todas las partes del trabajo científico que

se detallarán posteriormente (introducción, objetivos, metodología, resultados y

conclusiones).

Introducción: en esta sección se plantea ¿cuál fue el problema abordado y por qué?.

Es decir, esta parte incluye los antecedentes que se conocen de la problemática a tratar

(información relacionada con el trabajo, escrito u observado por otros autores), explica la

importancia del estudio, plantea los objetivos y la hipótesis del trabajo.

Materiales y Métodos: en esta parte se detalla cómo, cuándo y dónde se hizo la

investigación. Se expone el material y la metodología usada. Se debe explicar en detalle, ya

que los experimentos deben ser reproducibles (duplicados) por otros colegas investigadores.

Se mencionan los análisis estadísticos realizados.

Resultados: En esta sección se reflejan cuáles fueron los hallazgos encontrados, a

partir de la representación de los datos y resultados en forma concisa y clara. Según la

naturaleza del trabajo los resultados pueden ser imágenes, tablas, gráficos, dibujos, videos,

etc… En algunas ocasiones los resultados están organizados mediante subtítulos, con una

breve reseña de lo que expresan, para facilitar la lectura e interpretación.

Discusión: En esta sección se responde el siguiente interrogante ¿Qué significado o

implicancia tienen los resultados? Para ello se discuten nuestros hallazgos, la interpretación

de los datos obtenidos, con los hallazgos obtenidos por otros autores, después analizamos y

expresamos opiniones fundadas sobre la validez de los resultados que obtuvimos. Al final de

esta sección se colocan las conclusiones.


45

Agradecimientos: esta sección hace referencia a las personas e instituciones que

ayudaron de alguna menor manera en la realización de la investigación.

Bibliografía: se citan todos los trabajos o artículos científicos que hicieron un aporte,

en cuanto a metodología, importancia de la problemática y discusión de la investigación.

Publicación de un artículo científico

Los trabajos o artículos científicos en el lenguaje académico coloquial, se conocen

como “paper” o publicación científica. En general se publican en idioma inglés, ya que es el

idioma más utilizado en el ambiente científico para intercambiar estos conocimientos. Las

revistas científicas, más serias y exigentes en cuanto a calidad de los trabajos, publican los

trabajos en inglés. Aunque también hay revistas que publican trabajos científicos tanto en

inglés como en español. Todas estas revistas publica trabajos con distinta frecuencia, algunas

son semanales, otras quincenales, mensuales, bimensuales, etc… muchas veces depende

del área temática que publiquen. En Biología Celular y Molecular la mayoría de las

publicaciones son en inglés y podemos encontrar cientos o miles de trabajos sobre cada tema

en particular.

Hay revistas que incluyen publicaciones de diversas ramas de las ciencias

experimentales, las más notorias son Nature y Science (Nature se edita semanalmente en

Londres desde el año 1869, Science fue fundada en 1880 en Estados Unidos y también se

edita semanalmente) y otras dedicadas a una disciplina en particular (por ejemplo: Journal of

Microbiology, Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, Journal of Cell Biology, etc..).

Actualmente existen miles de revistas científicas, que abarcan todas las especialidades

científicas, aproximadamente 23000 según el sitio Scimago (http://www.scimagojr.com/). Es

importante resaltar que todos los resultados obtenidos en una investigación científica son

importantes, aún los negativos, es una tendencia que están aplicando ciertas revistas, por

ejemplo la Editorial PLOS tiene una sección denominada The Missing Pieces: A Collection of

Negative, Null and Inconclusive Results.

Existen grandes bibliotecas digitales en donde se encuentran indexados todos los

artículos científicos de estas revistas a disposición del público en general, y de los científicos

en particular.

Algunos de estos buscadores científicos son:

Artículos en español publicados en revistas de américa latina:

RedALyC: http://www.redalyc.org

SciELO: http://scielo.org

Latindex: http://www.latindex.org

http://www.scimagojr.com/


46

Artículos en inglés publicados en revistas internacionales:

PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

Sicencedirect http://www.sciencedirect.com/

DOAJ (Directory of Open Access Journals): http://www.doaj.org

Google Académico: https://scholar.google.com.ar/

Actividad Práctica

A- Buscar en el buscador PubMed trabajos científicos que contengan la palabra

apoptosis, exosomas (“exosomes”), células madre (“stem cells”), ciclo celular (cell cycle”),

etc… y averigüe desde que año se registran publicaciones y cuantas se registran en los

últimos 5 años. ¿qué conclusión puede sacar con respecto al avance de la biología celular en

estos últimos 30 años?

B- Se formarán grupos de no más de tres alumnos y buscarán un artículo científico

de su interés en alguno de estos buscadores. Una vez elegido el trabajo científico contestar

las siguientes preguntas:

1. ¿Es el título del paper claro y adecuadamente informativo? ¿Podemos predecir

de qué tratará el artículo?

2. Basándose en el resumen, ¿se puede describir brevemente de qué trata el

artículo? ¿Qué entendió? Escríbalo para discutirlo con sus compañeros.

3. ¿Cuál es la hipótesis del experimento? ¿Está redactada claramente? ¿Se

predicen los resultados?

4. ¿Cuál o cuáles son los objetivos del estudio?

5. ¿Se detalla en forma suficiente la metodología usada en los experimentos?

6. Localice en el texto referencias a otros artículos. ¿Cuál es el rango de fechas

de los trabajos de referencia?

7. ¿Qué tipo de tablas, gráficas y figuras utilizan los autores?

8. Muestre dónde en la discusión se comparan los resultados con investigaciones

previas del mismo autor o de otros autores.

9. ¿Sigue el artículo el método científico?

C- Analizar un trabajo científico “paper” que se le va a entregar en el Trabajo

Práctico y responda las preguntas detalladas anteriormente.

http://www.doaj.org/


47

Bibliografía:

Golombek D (Comp.). Demoliendo papers. La trastienda de las

publicaciones científicas. 2007. Colección Ciencia que ladra. Buenos Aires: Siglo XXI

Editores.

Ecología molecular de la conservación 251

Capítulo 8

Ecología molecular de la conservación

Martha Rocha y Jaime Gasca

251

Actualmente la diversidad de los seres vivos atraviesa por una crisis, ya que muchas especies se encuentran amenazadas o en peligro y en el peor de los casos, ya se han extinguido por efecto de las actividades del hombre. En los últimos años se ha hecho una infinidad de estudios para comprender los procesos ecológicos y evolutivos por los que atraviesan las especies y tratar de proponer estrategias de conservación que sean exitosas. Sin embargo, aún nos encontramos en la fase de construcción del cuerpo teórico que nos permitirá preservar de la mejor manera las especies, y se ha sugerido que se requiere de un trabajo “transdisciplinario”, donde se involucren profesionales tanto de las ciencias naturales como sociales. Dentro de las ciencias naturales se requieren especialistas de diversas disciplinas como la taxonomía, la ecología, la botá-nica, la zoología y la biología evolutiva. En este capítulo nos enfocaremos en el papel de los biólogos evolutivos, en particular de los ecólogos moleculares, y qué pueden éstos aportar a la teoría sobre la conservación de especies.

La genética de poblaciones es una parte central de la teoría evolutiva mo-derna, y sus aportaciones a la biología de la conservación han ido creciendo conforme su teoría y práctica han ido integrándose en la disciplina que ahora se conoce como Genética de la Conservación (Eguiarte y Piñero, 1990).

Temas fundamentales252

Un poco de historia

Los orígenes de la genética de la conservación se dan poco después de haber surgido la biología de la conservación, cuando se hicieron evidentes varios problemas genéticos asociados con las especies en peligro de extinción. Por ejemplo, se resaltó que la disminución de los tamaños poblacionales iba acompañada de la pérdida de diversidad genética y que la fragmentación de los hábitats tenía un efecto en la estructura poblacional. Desde el punto de vista evolutivo, se hizo entonces necesario entender los procesos de extinción de las especies (Simberloff, 1988, Eguiarte y Piñero, 1990).

Sobre las bases de la teoría de biogeografía de islas, en los años 70, se desa-rrolló la teoría para el diseño de refugios y para la toma de decisiones al planear los tamaños y formas óptimas de las reservas, así como la conectividad entre ellas. En la década de los 80 comenzaron a usarse sistemáticamente los análisis genéticos en especies en cautiverio, se realizaron los primeros experimentos en laboratorio y se avanzó en los estudios de metapoblaciones, enfocados en la cuantificación de la variación genética y los tamaños poblacionales efec-tivos. El avance en el uso de marcadores moleculares permitió a su vez una espectacular recopilación de datos genéticos de las poblaciones naturales de especies amenazadas o en peligro y mostró la relevancia de los factores gené-ticos, particularmente en casos como la depresión por endogamia (Meffe y Carroll, 1994; Eguiarte y Piñero, 1990; Primack et al., 2001).

En la década de los 90 los principales avances estuvieron relacionados con los nuevos métodos moleculares y computacionales que permitieron nuevos análisis y predicciones, dando mayor importancia al reconocimiento de las unidades fundamentales de conservación (especies, subespecies y ESU o Unidades Evolutivamente Significativas -ver más adelante).

El rápido avance de la genética de la conservación se puso de ma-nifiesto con la publicación en el año 2000 de la revista Conservation Genetics (http://www.kluweronline.com/jrnltoc.htm/1566-0621) y la reciente aparición de libros como Introduction to conservation genetics (Frankham et al., 2002), así como la sección Population and conservation genetics en la revista Molecular Ecology. (http://www.blackwelloublishing.com/journals/mec).


Pero, ¿qué relación guardan la genética y la conservación?

Uno de los objetivos clave de la genética de la conservación es ayudar a mi-nimizar las extinciones evitando los problemas relacionados con tamaños efectivos pequeños (véase el capítulo 3 de este libro), como el efecto deletéreo de la endogamia (depresión por endogamia; véase el capítulo 6 de este libro), la pérdida de diversidad y la habilidad para evolucionar en respuesta a los cambios ambientales, así como los efectos deletéreos que ocurren por la cruza entre individuos muy distintos (depresión por exogamia; Amos y Balmford, 2001; Frankham et al., 2002). Los análisis genéticos también permiten estudiar el efecto de la fragmentación y la reducción del flujo génico en poblaciones estructuradas y el efecto de la acumulación y pérdida de mutaciones deletéreas. Por otro lado, con la genética también se puede dar solución a problemas de tipo taxonómico, por ejemplo establecer especies prioritarias para la conser-vación, resolver incertidumbres taxonómicas, definir unidades evolutivamente significativas y unidades de manejo, y en el ideal, poder proteger los procesos evolutivos que mantienen la diversidad biológica (Moritz, 2002).

Una aplicación más de la genética de la conservación en la práctica es la identificación de material biológico y su procedencia, ya que muchas veces resulta muy difícil identificar si un organismo o producto (huevos, carne, huesos, semillas, etc.) proviene de especies protegidas por la ley. Existen varios ejemplos que han demostrado la efectividad de las técnicas moleculares para detener el comercio ilegal de recursos biológicos. Un caso particular ha sido el de las ballenas, grupo en el cual muchas especies se encuentran amenazadas y por tanto protegidas por la ley, y a pesar de esto se continúa la cacería para consumo de su carne. Baker y colaboradores (2000) desarrollaron métodos con ADN mitocondrial para identificar la especie a la que pertenecían muestras de carne de ballena, y encontraron que un 9% de la carne de mercados de Japón y Korea proviene de especies amenazadas. Para el caso de los tiburones (cuya aleta dorsal es muy apreciada en Asia), Shivji y colaboradores (2002) diseñaron marcadores ribosomales específicos para varias especies, lo que facilitará el reconocimiento de productos que provengan de tiburones protegidos. Las técnicas anteriores no sólo sirven en análisis forenses, ya que también se han usado para determinar la procedencia de organismos que han sido extraídos de su hábitat para su posterior reintroducción (Frankham et al., 2002).


Especies en peligro, ¿a quién hay que proteger?

En principio, es necesario establecer los criterios para decidir si una especie debe o no ser conservada, o más precisamente, si se encuentra en un estado crítico donde la conservación sea de carácter urgente. La Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN, International Union for Con-servation of Nature and Natural Resources) ha determinado tres categorías: “críticamente en peligro”, “peligro” y “vulnerable”, en donde se incluyen taxa que se consideran en amenaza de extinción. Tales categorías se basan en tres criterios principales: i) la disminución de las poblaciones, que se refiere a una reducción del tamaño de la población en un 90%, 70% y 50%, para cada cate-goría respectivamente, en los últimos 10 años o las últimas tres generaciones; ii) el área de ocupación, que propone áreas de de 100 km2, 500 km2 y 2 000 km2, para cada categoría respectivamente y iii) los tamaños poblacionales, que se miden en número de individuos maduros y son de 50, 2 500 y 10 000 para cada categoría respectivamente (UICN, 2001). Esta misma unión reconoce tres niveles en que debe conservarse la naturaleza: la diversidad genética, la diversidad de especies y la diversidad de ecosistemas (McNeely et al., 1990).

Como podemos ver, los análisis genéticos son fundamentales para estas caracterizaciones, ya que nos permiten calcular tanto los tamaños efectivos de las poblaciones (cabe señalar, sin embargo, que según el criterio iii) la UICN reconoce tamaños poblacionales censales y no tamaños poblacionales efec-tivos, lo que sería más adecuado), además de la diversidad genética, aunque veremos más adelante que hay muchos otros factores genéticos importantes que deben ser tomados en cuenta.

Principios básicos en genética de la conservación

Causas genéticas de la extinción, problemas de las poblaciones pequeñas

El objetivo central de la genética de la conservación en los últimos años ha sido entender y disminuir los problemas genéticos enfrentados por las poblaciones pequeñas. A la fecha existen numerosos ejemplos donde los factores genéticos parecen estar implicados en la disminución de poblaciones de animales como las panteras de Florida (Felis concolor), los pericos de Puerto Rico (Amazona vittata), los lobos de la isla Royal (Canis lupus), el borrego cimarrón (Ovis


canadensis), el pájaro carpintero (Dendrocopos medius) y los leones asiáticos (Panthera leo persica), entre otros (Hedrick ,1995; O’Brien, 1994; Frankham et al., 2002). Entre los factores genéticos que se han reconocido, la pérdida de variación genética y la depresión por endogamia han recibido la mayor atención, por lo que serán tratadas con mayor cuidado más adelante.

Cuando las poblaciones son pequeñas son más propensas a la extinción, ya que los factores estocásticos (tanto genéticos como demográficos, ambientales y catástrofes) aceleran su decline (Primack et al., 2001) y las llevan a los llama-dos vórtices de extinción (Primack et al., 2001; Frankham et al., 2002). Éstos se inician cuando las poblaciones son pequeñas, demográficamente inestables y tienen niveles altos de endogamia; la disminución poblacional reduce la adecuación y se produce una retroalimentación negativa, lo que refuerza el decline, aumenta la depresión por endogamia y la susceptibilidad a eventos estocásticos reduciendo aún más el tamaño poblacional, y así sucesivamente hasta llegar a la extinción (figura 1).

Figura 1. Cuando una población es muy pequeña, los fenómenos estocásticos incrementan el efecto de los problemas genéticos, por lo que la población sufre un vórtice de extinción

ExtinciónMenor tamaño

efectivo Ne

Variación ambientalEventos catastróficos

Cambio climático

Destrucción del hábitatDegradación ambiental

FragmentaciónSobreexplotaciónEspecies invasoras

+ Variación demográfica

+ Deriva génica

+ Subdivisión por fragmentación

+ Depresión por endogamia

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Otro problema que se ha descrito es el llamado colapso mutacional (o mutational meltdown). Lynch (1993) observó que las mutaciones deletéreas se acumulan más en poblaciones pequeñas, ya que la selección es menos eficiente. Cuando las poblaciones son grandes las mutaciones deletéreas son removidas por la selección natural y ésta elimina a los individuos con mayor carga genética. Si la población comienza a declinar, el número de individuos disponible para que se eliminen las mutaciones deletéreas disminuye, la purga se vuelve cada vez menos eficiente, aumenta la carga genética de la población y la adecuación disminuye (Lynch, 1993; Lande, 1995; Lynch et al., 1995). El resultado es una retroalimentación negativa similar al vórtice de extinción (Amos y Balmford, 2001).

Los cuellos de botella, por otra parte, son reducciones drásticas en los tamaños efectivos y pueden repercutir en los niveles de variación genética. Si las poblaciones permanecen pequeñas por largos periodos de tiempo, el efecto de error de muestreo es acumulativo. Esto genera cambios al azar en las frecuencias alélicas, lo que se conoce como deriva génica (Hartl y Clark, 1997). Debido a que en poblaciones de mayor tamaño las fluctuaciones no son tan grandes, se espera que mantengan niveles de variación genética mayores que en las poblaciones pequeñas.

Un ejemplo clásico del efecto de la deriva génica después de un cuello de botella es el caso del elefante marino Mirounga angustirostris, que fue sujeto a intensa cacería durante el siglo XIX, hasta casi llegar a la extinción. En 1892 fueron reportados 8 individuos (de los cuales mataron a 7) en la isla de Guadalupe; para 1922 lentamente se iba recuperando una población re-lictual que contaba ya con 350 individuos que además comenzaron a recibir protección legal y, para los años 80 se estimó un número de entre 550,000 y 750,000 individuos. Los análisis genéticos mostraron que la población tuvo un 20% de probabilidad de extinción y que poseía un monomorfismo genético en isoenzimas debido al severo cuello de botella. Actualmente se cree que el haber pasado por este cuello de botella puede tener repercusiones como la vulnerabilidad a agentes infecciosos y la presencia de problemas en la repro-ducción (Hoelzel et al., 1993).

Para poder entender mejor las consecuencias de los tamaños pequeños, es necesario identificar si la población ha sufrido reducciones drásticas recientes en su tamaño, para lo que se han desarrollado métodos estadísticos que infie-ren los cambios en el pasado y modelos que ayudan a distinguir las razones ecológicas de la reducción (para una revisión ver Beaumont, 2001).


Causas ecológicas de la extinción: controversias

Cuando comenzaron a acumularse evidencias de las causas genéticas de la extinción, los estudios genéticos comenzaron a cobrar importancia en los programas de conservación. Sin embargo, algunos expertos en el área se dieron cuenta de que las poblaciones se enfrentaban a otros problemas de más corto plazo, como las fluctuaciones de los tamaños poblacionales, el reclutamiento y la sobrevivencia; mientras que la pérdida de diversidad genética o la depre-sión por endogamia parecían menos tangibles y tener efecto más bien a largo plazo (Moritz et al., 1993).

En 1988, Lande publicó un artículo muy persuasivo en el que concluyó que la estocasticidad ambiental y demográfica pueden llevar a las poblaciones pequeñas a la extinción, antes de que los factores genéticos desempeñen un papel importante. Trabajos posteriores interpretaron esta crítica como si no se debiera confiar en los datos genéticos y solamente se debieran emplear los datos demográficos (Caughley, 1994) o bien ser muy cuidadosos con los resultados obtenidos de la genética (Caro y Laurenson, 1994). Sin embargo, la crítica de Lande era en el sentido de que no se emplearan solamente datos genéticos sino también otros aspectos de la ecología de las poblaciones. Así lo demuestran Westemeier y colaboradores (1998), quienes encontraron cambios demográficos y genéticos en el urogallo (Tympanuchus cupido) durante 35 años y mostraron evidencias de que había una interacción de la genética con la pérdida de hábitat y la variación estocástica, lo que daba como resultado una disminución de los tamaños poblacionales de manera similar al vórtice de extinción.

Mills y Smouse (1994) mostraron que los estudios de viabilidad poblacional no necesariamente deben marcar una dicotomía entre los factores genéticos y las fluctuaciones demográficas y ambientales, sino que tanto la estocasti-cidad genética (endogamia) como las fuerzas estocásticas no genéticas son sumamente importantes para determinar la probabilidad de extinción. Estos autores hacen énfasis en que tanto la genética como la ecología deben ser tomadas en cuenta, así como las interacciones entre ellas.

La pérdida de diversidad genética

La diversidad genética es sin lugar a dudas la materia prima para la evolución, ya que de ella dependen tanto la adaptación como la especiación. Los niveles altos de diversidad pueden dar la habilidad para responder a enfermedades,


parásitos, depredadores y cambios ambientales (Hedrick, 2001), y fue por ello que los primeros trabajos de conservación buscaban simplemente mantener niveles de diversidad altos.

En general se han encontrado patrones en los niveles de diversidad con los que se hacen inferencias en los estudios de conservación; por ejemplo, las poblaciones grandes, que se entrecruzan, tienen altos niveles de diversidad genética, mientras que las poblaciones pequeñas y asexuales tienen niveles de diversidad bajos (Amos y Harwood, 1998).

No obstante, no siempre se cumplen las predicciones evolutivas con los patrones de diversidad observados: algunas especies para las que se predice poca variación tienen niveles altos, mientras que otras especies presentan mucha menor variación de la esperada. Al parecer, no se puede generalizar la regla de que altos niveles de diversidad significan buen estado evolutivo. Por ejemplo, se encuentran especies muy abundantes e incluso invasivas que tienen poca variación (como las hierbas acuáticas y algunos pastos) y especies con mucha variación y cuyas poblaciones están declinando (Baur y Schmid, 1996; Amos y Harwood, 1998).

Por otro lado, generalmente se asume que la reducción en la diversidad se correlaciona con una baja adecuación, los ejemplos clásicos son la asimetría en los dientes del chita (Acinonyx jubatus), los defectos anatómicos en el lince (Linx pardinus) o el bajo reclutamiento en el trébol Trifolium hirtum (Baur y Schmid, 1996).

Entre los muchos ejemplos de organismos en que se ha cuantificado la di-versidad genética, mencionaremos el caso de la nutria marina (Enhydra lutris), cuyas poblaciones han pasado por cuellos de botella debido al comercio de pieles y tienen niveles bajos de variación. Tal carencia de variación pudo ser resultado de la extensiva cacería, o bien a niveles de variación históricamente bajos. Para comprobar esto, Larson y colaboradores (2002) analizaron marca-dores mitocondriales en huesos de nutrias que vivieron antes del comercio de pieles y los compararon con datos de las poblaciones actuales. Los resultados mostraron una reducción de al menos un 62% de los alelos y un 43% de he-terocigosis en las poblaciones actuales, lo que apoyó la idea de la reducción debida a la cacería. Los datos obtenidos sugieren que debe llevarse a cabo un monitoreo continuo de las poblaciones para determinar si la pérdida de variación genética pudiera tener un efecto en la sobrevivencia a largo plazo de las nutrias marinas.


El paradigma de la baja diversidad en especies raras o amenazadas

Analizar los niveles de diversidad en plantas resulta complejo por diver-sas razones, entre otras por que pueden presentar sistemas complejos de polinización y de dispersión (Falk y Holsinger, 1991). Recientemente se han usado los patrones de distribución espacial para definir a las especies “raras” como aquéllas que presentan una distribución espacial restringida y en éstas enfocar los esfuerzos de conservación (Rabinowitz, 1981; Kunin y Gaston, 1993).

Se ha observado que la distribución y niveles de variación genética en las poblaciones de especies raras son muy variables, y dependen de si la especie ha sido históricamente rara o la rareza ha sido reciente, en tal caso, muy probablemente por causas humanas (Bevill y Louda, 1999). Debido a la com-plejidad en el análisis de la diversidad en especies raras, una estrategia que se ha seguido es comparar especies raras y comunes que pertenezcan al mismo género. Los primeros trabajos indicaron que las especies raras tienen niveles de variación significativamente más bajos que sus congéneres con amplia distribución (Karron, 1987; Frankham, 1995); sin embargo, también hay casos en los que la variación es sorprendentemente alta para especies raras y, por otro lado, en algunos casos ambas especies (raras y comunes) tienen niveles muy altos o muy bajos de variación (Young y Brown, 1996).

Gitzendanner y Soltis (2000) publicaron una revisión de todos los tra-bajos reportados donde se comparan especies raras y comunes y también llegaron a conclusiones contradictorias: por una parte, el porcentaje de loci polimórficos, el número de alelos por locus y la heterocigosis fueron menores en especies raras que en las comunes; sin embargo, entre el 24% y el 29% de las especies raras analizadas fueron tanto o más variables que las comunes. Posteriormente, Cole (2003) amplió la comparación de congéneres raros y comunes a un mayor número de especies y concluyó al igual que Gitzen-danner y Soltis que los índices de variación son menores en especies raras, aunque la diferencia en los sistemas reproductivos afecta la manera en que se estructura la diversidad, de modo que se pone de manifiesto que los niveles de variación también están determinados por atributos ecológicos. Por lo anterior, el alto porcentaje de especies raras con igual o mayor variación que las especies comunes hace necesaria la evaluación de otros factores como los atributos reproductivos, las formas de vida, la demografía, las estrategias del ciclo de vida, los caracteres de respuesta al ambiente y las interacciones con


otros organismos, ya que todos estos factores pueden afectar los niveles de variación genética (Bevill y Louda, 1999).

Actualmente las prácticas de manejo están generalmente centradas en man-tener altos niveles de diversidad y no consideran que en algunos casos puede ser normal que existan niveles bajos por razones históricas o ecológicas.

Diversidad y sistemas de apareamiento

Tanto en plantas como en animales la estructura y diversidad genética refleja en gran medida el sistema reproductivo de la especie. La variación genética es mínima en individuos de una misma clona y la variación se mide como el número de individuos por clona (Baur y Schmid, 1996); por ejemplo, se ha encontrado falta de variación en isoenzimas en gasterópodos terrestres que se auto-fertilizan (Baur y Klemm, 1989). Un trabajo interesante sobre los niveles de diversidad se hizo con el género Styolanthes: S. humilis es una planta anual, mientras que S. viscosa es perenne. Sawkins y colaboradores (2001) encontra-ron que S. humilis tiene menor variación genética que S. viscosa, lo cual puede deberse a la diferencia en los sistemas reproductivos. Existen varias revisiones a este respecto, por ejemplo, Loveless y Hamrick (1984) y Hamrick y Godt (1990) compararon atributos de la historia de vida con la estructura genética en plantas. Ellos observaron que las plantas que presentan tiempos generacionales cortos, que eran polinizadas por animales, que tenían baja fecundidad y con baja dis-persión de semillas, presentaban a su vez poco flujo génico, tamaños efectivos reducidos y baja diversidad. En otro trabajo clásico, pero con animales, Nevo (1983) encontró que el tamaño efectivo, la fecundidad y la amplitud de nicho estaban positivamente asociados con la diversidad genética.

Una reflexión importante sobre los niveles de diversidad genética es que éstos dependen del sistema reproductivo y de la historia de la especie; por ejem-plo, es posible que parte de las especies que están enlistadas como amenazadas hayan sido siempre raras y hayan persistido en poblaciones pequeñas durante su historia, mientras que otras hayan sufrido recientemente una importante reducción en sus poblaciones, que eran anteriormente grandes y ahora deben ser prioritarias para la conservación (Moritz et al., 1993).

Restauración de la diversidad genética

Se sabe que los inmigrantes de poblaciones aledañas pueden prevenir la extinción de poblaciones pequeñas por el proceso llamado rescate genético


(Ingvarsson, 2001) o restauración genética (Hedrick, 2005). En mariposas, aves y plantas se ha visto que las cruzas entre diferentes poblaciones generan una heterosis (también llamado vigor híbrido) en donde la heterocigosis per se tiene una influencia positiva sobre la adecuación y además disminuye la expresión de los alelos recesivos deletéreos. Por esto es importante mantener el flujo génico entre las poblaciones que quedan en hábitats fragmentados para mantener aquellas que son sensibles a la endogamia (Keller y Waller, 2002).

En estudios experimentales con Drosophila se mostró que la adición de un solo inmigrante en una población endógama puede tener un efecto impresio-nante y mejorar la adecuación hasta en un 50% (Spielman y Frankham, 1992). Recientemente se publicó un ejemplo muy interesante de rescate genético en el lobo gris escandinavo (Canis lupus), en donde la inmigración de un solo individuo provocó el aumento en la heterocigosis, se evitó la endogamia, se dispersaron rápidamente los nuevos alelos en la población y aumentó la tasa de crecimiento poblacional (Vilà et al., 2003).

Tamaños efectivos y tamaño mínimo viable (TMV)

Dado que los recursos tanto físicos como monetarios necesarios para la con-servación de especies son enormes, resulta necesario tomar medidas de la manera más pragmática posible, ya que por una parte la retención de pocos individuos puede tener efectos genéticos deletéreos, pero también puede resul-tar contraproducente destinar demasiados recursos a una sola especie. En este sentido, un aspecto importante en la caracterización genética de las especies en peligro es poder calcular los tamaños efectivos (Ne) de las poblaciones. La metodología para estimar Ne ha sido revisada por Moreno (capítulo 3 de este libro) y también puede verse la revisión de Beaumont (2001).

En el ámbito de la conservación se ha llegado a la definición de tamaño mí-nimo viable (TMV) como “el número de individuos necesarios para asegurar la supervivencia de una especie a largo plazo”; es el tamaño poblacional más pequeño que tiene un alta probabilidad de sobrevivir en el futuro cercano.

Franklin (1980) sugiere que un tamaño efectivo de 500 sería necesario para mantener los niveles de diversidad encontrados en la naturaleza, basándose en un balance entre deriva y mutación. Soulé y colaboradores (1986) sugieren que el principal objetivo es mantener el 90% de la variación en 200 años. El tamaño estaría en función del tamaño de la población fundadora, la tasa de crecimiento poblacional y el tiempo generacional.


Debido al estado actual de amenaza de muchas especies, el desarrollo del TMV resulta vital para la recuperación de sus poblaciones. Diversos trabajos han calculado los TMV para diversas poblaciones, como las de rinocerontes de un cuerno de la India (Rhinoceros unicornis), que a pesar de mostrar nive-les normales de variación genética en isoenzimas (Dinerstein y McCracken, 1990), se han presentado argumentos que anticipan un lento deterioro gené-tico a largo plazo (Frankham, et al., 2002). Otro ejemplo es el de los leones dorados tamarinos (Leontopithecus rosalie) en donde se calculó un TMV de 400 individuos para mantener el 98% de su diversidad genética dentro de los próximos 100 años (Ballou et al., 1998).

Variación en caracteres cuantitativos

Hasta el momento nos hemos referido a los niveles de diversidad genética según los datos de marcadores de loci individuales, como son los marcadores de ADN o las isoenzimas. Por otro lado, existe la genética cuantitativa, que es un área de investigación muy amplia que analiza caracteres poligénicos a partir de valores fenotípicos que se distribuyen de manera continua, es de-cir, caracteres cuantitativos (Falconer y Mackay, 1996; Cap. 11 en Hedrick, 2000). La preocupación de los genetistas cuantitativos al hacer análisis de conservación con técnicas de loci sencillos es el estimar si la variación está correlacionada con la variación en caracteres ecológicos importantes que le confieran al individuo la capacidad de sobrevivir a cambios del ambiente (Storfer, 1996). Se ha visto que la diversidad que es resultado de la evolución adaptativa se mide preferentemente con la variación fenotípica, ya que en pocas ocasiones los análisis moleculares con pocos genes pueden predecir la variación en la adecuación total.

Reed y Frankham (2001), con un meta-análisis, demostraron que las medidas de marcadores moleculares sólo explicaban un 4% de la varianza en caracteres cuantitativos y lo que más llamó su atención era que la relación era aún menor para caracteres de interés en conservación, como aquellos relacionados con la historia de vida. Esto se explica porque los marcadores neutros evolucionan principalmente por deriva, mientras que los caracteres cuantitativos lo hacen por selección, ya que están directamente relacionados con la sobrevivencia (Reed y Frankham, 2001; Frankham et al., 2002).

La heterocigosis en genes que afectan caracteres cuantitativos es proporcio-nal a la varianza genotípica que está determinada genéticamente (y no por el ambiente), y el parámetro que mide la importancia de esta varianza es llamado


heredabilidad (Falconer y Mackay, 1996; Hedrick, 2000). Cuando la varianza genotípica es muy baja, el riesgo de extinción es más alto por la incapacidad de responder a los cambios del medio ambiente. Estimar la heredabilidad puede servir para indicar la respuesta a la selección y a su vez el potencial evolutivo de las poblaciones, ya que la correlación entre heredabilidad y adecuación es muy alta (Reed y Frankham, 2003).

Por otro lado se ha observado que los caracteres cuantitativos retienen mas variación en poblaciones pequeñas y se recuperan más rápidamente de los cuellos de botella que las isoenzimas (Lande y Barrowclough, 1987). Asimismo, existen muchos ejemplos en los que las especies exhiben niveles de diversidad fenotípica muy alta y habitan en ambientes extremadamente variables, aunque muestren niveles de diversidad isoenzimática bajos (Reed y Frankham, 2003).

Depresión por endogamia

El mismo Darwin reconoció la disminución de la adecuación cuando hay endogamia. Durante muchos años analizó el efecto de cruzas en plantas y se dio cuenta de que la entrecruza era generalmente benéfica y la autocruza perjudicial (Darwin, 1876). La endogamia, como sabemos, es una fuerza evolutiva que actúa cuando los apareamientos no son al azar sino entre in-dividuos relacionados. En este caso los alelos idénticos por descendencia se encuentran juntos con mayor frecuencia y se redistribuyen las frecuencias de los genotipos aumentando los homócigos. Las mutaciones deletéreas que normalmente se van acumulando de manera recesiva aumentan (provocando una carga genética para la población), teniendo como resultado una reduc-ción en la adecuación que se conoce como “depresión por endogamia” (DE; Hedrick, 2000; véase el capítulo 6 de este libro).

Existen dos explicaciones genéticas alternativas a la depresión por endo-gamia; una es la dominancia, en donde la adecuación baja por la homocigosis en loci particulares con alelos recesivos deletéreos y que se encuentran en-mascarados en las poblaciones no endógamas por los alelos dominantes no deletéreos (Husband y Schemske, 1996; Byers y Waller, 1999; Charlesworth y Charlesworth, 1999; Frankham et al., 2002). Por otro lado, está la muy difun-dida idea de la sobredominancia o vigor híbrido, en que la heterocigosis per se tiene una influencia positiva sobre la adecuación. Charlesworth y Charleswor-th (1999) demuestran con experimentos en Drosophila y con evidencias en plantas, que la hipótesis del efecto de los alelos recesivos, algunos mantenidos


por mutación y otros por selección balanceadora (por ventaja del heterócigo), parecen ser la principal causa de depresión por endogamia.

Un ejemplo de la repercusión que puede tener la DE se observó en Pinus taeda en donde se calculó que la especie portaba al menos ocho equivalen-tes letales (es decir, aquellos alelos que pueden causar la muerte en forma homóciga) y una depresión del 98% en la progenie endógama (Remington y O’Malley, 2000). Posiblemente hasta la fecha se haya subestimado el impacto de la DE porque en muchas ocasiones los genes letales y sub-letales se expre-san en estadíos tempranos del desarrollo y sólo se desarrollan los heterócigos, que son los que nosotros muestreamos, dando bajos niveles de endogamia. Keller y Waller (2002), demuestran que hay DE en alrededor de 40 especies de animales y plantas.

Las consecuencias de la DE abarcan diferentes aspectos de la biología de los individuos como reducción en la fecundidad y la sobrevivencia. Se ha obser-vado que en aves y mamíferos la DE afecta el peso al nacer, la sobrevivencia, la reproducción y la resistencia a enfermedades, así como al estrés ambiental y a la depredación (Crnokrak y Roff, 1999; Hedrick y Kalinowski, 2000). En plantas, se ve afectada la producción de semillas viables, la germinación, la sobrevivencia y la resistencia al estrés (Keller y Waller, 2002).

Existen dos ejemplos interesantes en los que se ha demostrado la depresión por endogamia en ambientes naturales. La planta Clarkia pulchella demostró un mayor riesgo de extinción debido a la disminución de los tamaños efectivos y al aumento de la endogamia (Newman y Pilson, 1997). El otro trabajo fue sobre una metapoblación de mariposas del género Melitaea (Saccheri et al., 1998), donde se mostró que el riesgo de extinción aumentaba considerable-mente si disminuía la heterocigosis y aumentaba la endogamia. En este mismo trabajo se encontró que los componentes de la adecuación que se modificaban con la baja heterocigosis eran la sobrevivencia de las larvas, la longevidad de los adultos y el número de huevos que eclosionan.

Con simulaciones en computadora se ha demostrado que la DE es un factor probable que aumenta el riesgo de extinción en poblaciones que normalmente son exógamas en la naturaleza (Mills y Smouse, 1994).

También se ha demostrado que la endogamia hace a los individuos más susceptibles a la mortalidad debida al ambiente (Reed et al., 2002). Hay dos ejemplos interesantes al respecto; en borregos de la especie Ovis aries los homócigos eran más susceptibles al parasitismo y su sobrevivencia menor (Coltman et al., 1999). Otro caso es el de los gorriones Melospiza melodia, donde las aves endógamas morían con mayor frecuencia durante tormentas


severas. Aunque la muerte era causada por las tormentas, la endogamia de-terminaba quiénes eran los sobrevivientes (Keller et al., 1994).

¿Y si se purgan las poblaciones?

En los experimentos en los que por primera vez Darwin notó la depresión por endogamia realizando cruzas controladas en Ipomea purpurea, notó que después de varias generaciones de autocruza, surgían plantas con un sor-prendente vigor a los que él llamó plantas “héroe”. Los descendientes de estos héroes mantenían este vigor y Darwin concluyó que los cambios deletéreos, que inicialmente producían depresión por endogamía eran eliminados de alguna manera, siendo éste justamente el efecto de la purga (Byers y Waller, 1999). Actualmente sabemos que este desarrollo superior de algunos individuos re-sultado de autocruzas como el héroe de Darwin y la reducción de la depresión por endogamia en líneas autógamas son el resultado de la eliminación prefe-rencial de alelos recesivos letales (Byers y Waller, 1999). La endogamia expone rápidamente los recesivos letales en los individuos homócigos y la selección natural reduce su frecuencia. Las mutaciones deletéreas en recesivos se purgan más fácilmente en poblaciones pequeñas o endógamas que en poblaciones grandes con apareamiento al azar (Charlesworth y Charlesworth, 1999).

Una idea que se adoptó en los programas de manejo de especies en peligro fue forzar la endogamia para purgar las mutaciones deletéreas de la población. Aunque en el caso en que la depresión por endogamia sea resultado de muchos alelos deletéreos con efecto menor, el forzar la endogamia provocará que se fijen estos alelos en lugar de purgarlos, produciendo una disminución en la adecuación global (Hedrick y Kalinowsky, 2000).

A la fecha se han hecho varias revisiones importantes del efecto de la purga, Ballou (1997) examinó 25 estudios sobre mamíferos y Byers y Waller (1999) 52 sobre plantas, y concluyeron que la purga sólo reduce la depresión por endogamia en algunos caracteres, en algunas poblaciones y en un grado limitado.

Hibridación e introgresión

La introgresión es la introducción en una población de material genético de otras especies o subespecies; dando como resultado una hibridación entre dos formas previamente diferenciadas (véase el capítulo 13 de este libro). Este pro-ceso puede amenazar la integridad genética de una población, cuando son in-


troducidas especies exóticas dentro del rango de distribución de especies raras o cuando hay una alteración del hábitat en donde especies que se encontraban aisladas entran en contacto e hibridizan. Una forma particular de introgresión deletérea, en el caso de plantas, ocurre cuando entran en contacto poblaciones tetraploides y diploides, dando como resultado poblaciones triploides estériles (Young y Murray, 2000). También se ha observado la presencia de genes de perros en varias especies de lobos (Randi y Lucchini, 2002). Para remediar los efectos causados por la introgresión es necesario en principio eliminar la especie introducida o translocar individuos puros a regiones aisladas o de cautiverio, para después volver a fundar la población.

Otro ejemplo es el de Gliricidia sepium, una leguminosa que se distribuye desde México hasta Centroamérica, con gran importancia económica porque mejora la productividad de los sistemas agrícolas. Dado que se entrecruza con la especie G. maculata, que se distribuye en la península de Yucatán, Dawson y colaboradores (1996) investigaron las posibles interacciones entre ambas especies para poder definir estrategias de conservación y manejo. Ambas especies presentan plasticidad morfológica (lo que hace difícil identificar híbridos), por lo que las técnicas moleculares permitieron determinar el flujo génico dentro y entre las poblaciones así como la posible introgresión. Se identificó una zona híbrida que concuerda con la dispersión antropogénica, lo cual representaría un mecanismo de erosión genética que en un futuro puede poner en riesgo a las especies.

Los enfoques actuales de la genética de la conservación

Con los nuevos avances en los métodos de análisis genéticos y la gran cantidad de información que se ha obtenido con la liberación de muchas secuencias de ADN e genomas completos, no sólo se ha revolucionado la genética de poblaciones, sino su aportación a la conservación. Además, cada vez parece más claro que en los programas de genética de la conservación deben ser incorporados datos de la taxonomía y ecología de las especies, además del empleo de nuevas herramientas moleculares y computacionales para deter-minar el estatus de las especies que se quieren conservar.

Desde el punto de vista taxonómico se ha enfatizado en conservar aquellos taxa que contribuyen a la biodiversidad global en una escala proporcional a sus características distintivas tanto morfológicas como genéticas (por ejemplo organismos como el celacanto o el tuátara). Con el desarrollo de métodos


filogenéticos se pueden hacer comparaciones de secuencias y calcular el largo de las ramas en los árboles filogenéticos para estimar qué tan distintivos son los taxa (Bowen, 1999). Por otro lado, los conocimientos actuales de genomas y el desarrollo de la teoría de evolución molecular han permitido aumentar el conocimiento sobre la diversidad genética, así como como identificar a los grupos con alta capacidad de producir nuevas especies que serán la fuente de futura biodiversidad (Erwin, 1991).

Otro enfoque que ha tomado auge en los últimos años es el de conservar los procesos evolutivos y mantener la capacidad de respuesta evolutiva ante los cambios ambientales (Erwin, 1991). Por ejemplo, Moritz (2002) propone que generalmente existen zonas donde está bien representada la diversidad genética, y en estas áreas se debe maximizar la protección de gradientes am-bientales continuos, en donde interactúan la selección y la migración para mantener la viabilidad de las poblaciones.

Unidades Evolutivamente Significativas y Unidades de Manejo

En años recientes el problema de definir las prioridades de conservación ha recaído un poco más en el área de la sistemática para tratar de entender las “unidades evolutivas” que deben ser conservadas. Durante mucho tiempo en biología ha existido un debate sobre qué es una especie y sobre los diversos conceptos de especie que se han generado (véase el capítulo 10 de este libro). La mayoría de especies prioritarias se han propuesto a partir de un concepto tipológico, lo que trae como desventaja el que no se considere la diversidad real dentro de las especies, ni la variación geográfica, ni la posibilidad de mantener su potencial evolutivo (Rojas, 1992).

En el contexto de la conservación se requiere delimitar ciertas unidades de conservación, que han sido definidas como unidades evolutivamente signi-ficativas (o ESU, por sus siglas en inglés) y que son “unidades poblacionales que merecen manejo propio y que tienen una alta prioridad de conservación” según la definición de Ryder (1986). Estas unidades deben darnos una idea acerca de los procesos evolutivos y la distribución de la diversidad genética para llevar a cabo estrategias de conservación. Las ESUs no tienen que coincidir forzosamente con la categoría de especie, ya que pueden tratarse de poblacio-nes distintas genéticamente del resto o que han estado históricamente aisladas (Soltis y Gitzendanner, 1999; Fraser y Bernatchez, 2001). En este sentido, la diferenciación dentro de las especies hace que se tengan que conservar más


poblaciones para asegurar que se mantenga suficiente variación genética para asegurar la superviviencia de la especie.

La categoría de unidad de manejo (MU), por otra parte, ha servido para reconocer poblaciones demográficamente distintas que deben ser manejadas para asegurar la viabilidad de las ESU que son más grandes. Las unidades de manejo se han utilizado principalmente cuando se conoce la estructura poblacional actual y no la estructura histórica (Moritz, 1994).

Por ejemplo, la serpiente mocasín mexicana Agkistrodon bilineatus presenta una considerable variación en el patrón de color, lo que representa un problema taxonómico. Parkinson y colaboradores (2000) mostraron con datos molecu-lares que la subespecie Agkistrodon bilineatus taylori merecía ser considerada como una unidad aparte (y no una subespecie), lo que hace urgente un plan de conservación para ella, ya que además se encuentra en grave amenaza (mucho más que otras variedades). Se ha observado que la mocasín mexicana puede ser criada con éxito en cautiverio, aunque se debe poner énfasis en mantener a las distintas variedades como unidades separadas.

Por otro lado, la musaraña Sorex ornatus es una especie rara que está sub-dividida en nueve subespecies (Owen y Hoffman, 1983), de las cuales siete tienen distribuciones en pequeños parches, S. o. ornatus se encuentra en Baja California Norte y S. o. lagunae habita en la punta de Baja California Sur. Su distribución presenta barreras geográficas que generan diferencias genéticas, además de que sus hábitos muestran altos grados de especialización, por lo que las poblaciones se encuentran muy aisladas y con dispersión muy limitada. Con técnicas moleculares se demostró que las poblaciones son genéticamente divergentes, aunque se encuentren geográficamente cerca, y se encontró que existen tres poblaciones que forman clados bien definidos (Maldonado et al., 2001). Se propone que la especie tuvo alguna vez una distribución continua y que la explotación de las tierras y mantos acuíferos fue aislando a las po-blaciones, al grado que las poblaciones actuales de Baja California son muy pequeñas y fragmentadas y tienen una alta probabilidad de extinción. Por ello se sugiere que los clados encontrados deben ser manejados como unidades independientes, ya que pueden responder de manera independiente a los cambios ambientales, es decir, que si una población se extingue, difícilmente va a poder recolonizarse la zona donde habitaba. Hay que considerar que las poblaciones mexicanas, además de ser las más amenazadas también son las más distintas genéticamente, por lo que es imperativo realizar acciones que permitan mantener sus hábitats para proteger a las pocas poblaciones exis-tentes. Adicionalmente se encontró que los resultados no concuerdan con los


estatus taxonómicos propuestos, por lo que es necesaria una revisión para determinar con mayor certeza las unidades de manejo.

Para el caso del borrego cimarrón Ovis canadensis se han hecho muchos esfuerzos por mantener tanto la especie como sus subespecies (tradicional-mente siete), sin embargo el valor taxonómico de las subespecies es bastante dudoso, lo cual resulta muy importante para los programas de reintroducción. Ramey (1995) encontró que no hay datos moleculares que apoyen la existencia de cinco de la siete subespecies, lo cual puede simplificar los programas de reintroducción.

Metapoblaciones

La estructura poblacional ha tenido una repercusión muy importante en los modelos de biología y genética de poblaciones. Metapoblación puede referirse casi a cualquier población estructurada espacialmente, aunque la definición tradicional es la de Levins (1969): conjunto de poblaciones inestables, que ocupan parches o segmentos de hábitat discretos, que varían en área, grado de aislamiento y calidad y cantidad de los recursos que requiere dicha especie. En otras palabras, las metapoblaciones son un mosaico cambiante de poblaciones temporales interconectadas por algún grado de migración (Levins, 1969). Una metapoblación clásica persiste por un balance entre las “muertes “ (extinciones locales) y los “nacimientos” (establecimiento de nuevas poblaciones en sitios desocupados previamente) (Hanski, 1998). Dado que en las metapoblaciones los eventos de extinción son recurrentes, y no eventos únicos y aislados, nos permiten comprender mejor el fenómeno de la extinción, ya que dependen, al igual que en las poblaciones pequeñas, de la estocasticidad demográfica, genética y ambiental. El conocimiento acerca de los eventos de colonización y migración permite considerar el efecto fundador y de deriva. Existen ejemplos como el mono tití del Amazonas (Callicebus bernhardi), en donde el enfoque metapoblacional ha permitido mantener algunas poblaciones muy pequeñas en fragmentos ya deteriorados del Amazonas y por otro lado una población núcleo en cautiverio (Primack et al., 2001).

La fragmentación del hábitat puede crear una metapoblación de lo que fue un gran población con distribución continua y sin pasar por cuellos de botella se puede perder una gran diversidad (Gilpin, 1991; Hanski y Gilpin, 1997).


Filogeografía

Con el desarrollo de técnicas moleculares que estudian el ADN de mitocon-dria y de cloroplasto, se han construido filogenias de haplotipos en las que se examina la distribución geográfica de la variación genética; a esto se le conoce como filogeografía molecular (véase los capítulos 14 y 15 de este libro). Dado que la aproximación de la filogeografía se basa más en la representatividad de los linajes, pueden protegerse los principales linajes históricos dentro de las especies, lo que tiene gran importancia porque una vez perdidos los linajes ya no pueden ser recuperados (Avise, 2000). La filogeografía también ha permi-tido, en estudios de animales, dilucidar cómo la historia evolutiva reciente ha moldeado los patrones de diversidad dentro de las especies (Avise, 1998), por ejemplo debido a eventos como las expansiones del rango de distribución, la fragmentación y los cuellos de botella, que parecen haber tenido una mayor influencia en los patrones de diferenciación genética que lo que se había cal-culado previamente con modelos tradicionales de genética de poblaciones (Schaal et al., 1998).

La filogeografía ha mejorado mucho la descripción de la distribución geográfica, las relaciones filogenéticas y distancias genéticas entre linajes de animales, logrando tener una mejor comprensión de la biogeografía regional y áreas de endemismo. Justamente, comparar los patrones filogeográficos de varios grupos en una misma región es cuando podemos comprender la historia de dicha región, lo que se conoce como biogeografía comparada (Bermingham y Moritz, 1998).

Por otro lado, comprender las respuestas históricas de las especies a cam-bios en el ambiente y la evolución de áreas evolutivamente aisladas es de gran importancia para la conservación, ya que puede ayudar a planear estrategias de conservación (Bermingham y Moritz, 1998; Moritz y Faith, 1998). Por ejemplo, la distribución original del jaguar (Panthera onca) abarcaba desde el sur de Estados Unidos hasta la Patagonia, pero ha disminuido recientemente y en la actualidad existen poblaciones fragmentadas de tamaño variable, que se distribuyen desde México hasta Brasil. Eizirik y colaboradores (2001) presentaron un estudio filo-geográfico sobre su historia poblacional y diversidad genética, encontrando que la especie es joven y que ha tenido una reciente expansión poblacional, pero que el tiempo ha sido insuficiente para generar diferenciación regional, lo que a su vez sugiere que mantuvieron altos niveles de flujo genético en grandes distancias. No se detectó evidencia alguna que sugiriera la reducción de variación genética, aunque esto puede estar influido por el reciente origen de la especie; además,


no encontraron subdivisiones que indiquen subespecies, lo que se contrapone con la clasificación de algunos autores. Así, este trabajo sugiere que los planes de manejo deben permitir la existencia de flujo génico entre poblaciones que se encuentren aisladas, así como entre ejemplares que se encuentren en cautiverio, aunque también se deben considerar posibles adaptaciones locales que no hayan sido detectadas por los marcadores moleculares.

Conclusiones y perspectivas

Pese al debate que ha existido entre la importancia de los procesos genéticos en el campo de la biología de la conservación, es claro ahora que la demografía, ecología y genética de poblaciones interactúan y afectan la persistencia de las poblaciones pequeñas (Eguiarte y Piñero, 1990). Hoy en día existe evidencia de que los factores genéticos están involucrados en el riesgo de extinción en las especies, aunque el efecto ocurre a diferentes escalas temporales. Por ejemplo, el efecto más rápido lo podría tener la deriva génica, ya que al aumentar las cruzas entre parientes y la fijación de la carga genética, se reduce la adecuación y se produce la depresión por endogamia (Keller y Waller, 2002).

Tal vez el papel de la endogamia se ha subestimado al no conocer exacta-mente su interacción con la selección y su efecto en la dinámica poblacional. Los últimos trabajos sobre depresión por endogamia dejan abierto un campo de estudio muy amplio porque aún no se han encontrado patrones generales de cómo la DE varía entre diferentes taxa, ambientes y poblaciones con histo-rias genéticas y demográficas contrastantes (Crnokrak y Roff, 1999; Hedrick y Kalinowski, 2000; Keller y Waller, 2002).

Otra recomendación importante es conocer los niveles de diversidad y lo que éstos pueden decirnos sobre el riesgo de especies amenazadas; un ejemplo claro es la falta de información sobre caracteres cuantitativos, en particular en las especies en peligro que han mostrado bajos niveles de variación. La baja correlación entre caracteres moleculares y cuantitativos da la idea de que los primeros no pueden ser usados como el único medio para evaluar la diversidad, ya que no necesariamente reflejan el potencial evolutivo de las poblaciones, principalmente para los caracteres relacionados con la historia de vida o los caracteres adaptativos. Las especies en peligro han mostrado niveles de variación bajos, pero son muy pocos los estudios que han medido la variación cuantitativa. Sería importante poder comparar desde esta pers-pectiva la reducción en el potencial evolutivo entre especies en peligro y sus congéneres no en peligro (Reed y Frankham, 2001).


También es necesario comprender de mejor manera cómo los diferentes procesos genéticos llevan al llamado vórtice de extinción.

Por otro lado, los principios de la genética de la conservación deben ser evaluados de manera especial para cada especie, ya que se ha visto que el efecto de la reducción en los tamaños poblacionales depende del sistema reproductivo, la selección natural, la demografía y la historia de las especies (Moritz et al., 1993).

Por su parte, los enfoques nuevos como las herramientas filogeográficas, o la conservación de la complejidad taxonómica (Ennos et al., 2005), nos per-miten evaluar de manera más integral los diferentes procesos evolutivos, para que la genética de la conservación pueda brindar las herramientas necesarias a los manejadores y aportar información práctica relevante para priorizar y medir la biodiversidad (Moritz, 2002).

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normas de seguridad específicas. Toda herida, aún los pequeños cortes, que se produzca durante un trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente al docente. Al terminar