Każda cząsteczka mRNA ( messenger RNA, informacyjny RNA ) organizmów eukariotycznych i większości wirusów posiada na swoim końcu 5’nietypową strukturę zwaną kapem. Składa się ona z 7-metyloguanozyny połączonej wiązaniem 5’, 5’ – trifosforanowym z kolejnym nukleozydem, co jest zapisywane skrótowo jako MMG-kap (monometyloguanozyno kap ). Główną funkcją pełnioną przez kap jest jego udział w procesie inicjacji translacji. Cząsteczka mRNA zostaje wprowadzona do maszynerii translacyjnej poprzez oddziaływanie jej struktury kapu z białkowym faktorem inicjującym eIF4E. Oddziaływanie to jest etapem limitującym szybkość całego procesu biosyntezy białka.

NPE - 2-(4-nitrophenyl)ethanolDBU - 1,8-

diazabicyclo[5.4.0]undec-7-eneDIAD - diisopropyl azodicarboxylate

O

N

N

NH

N

NH2

AcO

OAc

OAc

O

O

AcO

AcO

OAc

N

N

NH

N

ONPENH2

O

OHOH

OH

N

N

N

N

N

CH3

H3CONPE

O

OHOH

OH

N

N

NH

N

ON

CH3

H3C 1. NaNO2, HBF4

O

OHOH

OH

N

N

NH

N

NH2 O

DBU

Ac2O, pirydyna, DMF PPh3, NPE, DIAD

toluen

2. (CH3)2NH

Cel pracy magisterskiej :

opracowanie i zoptymalizowanie drogi syntetycznej prowadzącej do otrzymania N2,N2 dimetyloguanozyny optymalizacja warunków reakcji fosforylacji metodą Yoshikawy otrzymanie pięciu mononukleotydowych analogów TMG kapu zawierających w pozycji N7 dimetyloguanozyny różne podstawniki alkilowe (etylowy, n-propylowy, izopropylowy, n-butylowy oraz izobutylowy)

Mechanizm wiązania MMG kapu z faktorem eIF4E został rozszyfrowany dzięki wieloletnim badaniom, w których wykorzystano całą gamę chemicznie zmodyfikowanych analogów kapu. U nicieni znaczna część cząsteczek mRNA posiada na swoim końcu 5’ zamiast MMG kapu jego formę hipermetylowaną tzw. TMG kap (trimetyloguanozyno kap), zawierającą 7-metyloguanozynę z dwiema dodatkowymi grupami metylowymi w pozycji N2. W organizmach tych wykryto, obok białka oddziałującego z MMG kapem, izoformy faktora eIF4E, które wiążą zarówno MMG jak i TMG kap. Do tej pory nie udało się niestety ustalić jak wygląda molekularny mechanizm oddziaływania tych białek z TMG kapem. Niewątpliwie, tak jak w przypadku badań nad oddziaływaniem eIF4E z MMG kapem, pomocne byłyby badania z wykorzystaniem różnie zmodyfikowanych analogów TMG kapu. Substratem wyjściowym do syntezy takich związków jest N2,N2-dimetyloguanozyna (m2

2,2Guo), której otrzymywanie stwarza od lat problemy chemikom.

Synteza N2,N2 dimetyloguanozyny

Synteza N7 alkilopochodnych monofosforanu N2,N2 dimetyloguanozyny

Uzyskane przeze mnie analogi mają w przyszłości posłużyć jako narzędzie do badań prowadzących do uzyskania odpowiedzi, czy i w jaki sposób, wielkość oraz rozgałęzienie podstawnika alkilowego w pozycji N7 dimetyloguanozyny wpływa na specyficzność oddziaływań struktury końca 5’ mRNA z białkami rozpoznającymi kap.

jodek alkilu ( RI )

czas reakcji / temp.

wydajność

jodek etylu 20h / RT 57%

1-jodopropan 26h / RT 45%

2-jodopropan 24h / 60oC 40%

1-jodobutan  48h / 60oC 30%

2-jodobutan 48h / 60oC  18%

O

OHOH

OH

N

N

NH

N

ONCH3

CH3

(CH3O)3PO , POCl3

O

OP

O

O-OH

OH

N

N

NH

N

N

CH3

CH3

O

O-

Synteza 5’monofosforanu N2, N2-dimetyloguanozyny

O

OP

O

O-

OH

OH

N

N

NH

N

N

CH3

CH3O

O-

O

OP

O

O-

OH

OH

N

N+

NH

N

N

CH3

CH3O

O-

R

DMSO , RI

Syntezę N2,N2 dimetyloguanozyny przeprowadziłam wprowadzając grupę aminodimetylową w pozycję N2 układu purynowego drogą substytucji nukleofilowej. Do zabezpieczenia pozycji O6 guanozyny wykorzystałam reakcję Mitsunobu. Wielką zaletą tej reakcji jest jej uniwersalność i możliwość stosowania łagodnych warunków. Niestety, podobnie jak inni, napotykałam problemy z wyodrębnieniem produktu finalnego z mieszniny reakcyjnej.

W celu wprowadzenia grupy fosforanowej w pozycję 5’ m22,2Guo zastosowałam metodę

fosforylacji przy użyciu trichlorku tlenku fosforu w fosforanie trimetylu. Manipulując czynnikiem temperaturowym oraz czasem prowadzenia reakcji udało mi się doprowadzić do osiągnięcia prawie 100% wydajności tej reakcji.