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1NRH
REPARACIÓN DEL DNATema 4
Lesiones del DNA. Origen de las mutaciones
Mecanismos de reparación
• Reparación directa del daño: DNA fotoliasas
• Escisión de la región dañada seguida de remplazamiento preciso• Escisión de base• Escisión de nucleótido
• Reparación de errores de replicación
a) Desapareamientos (“mismatch repair”: MMR)
b) Translesión (“by-pass”)
• Reparación de roturas de doble cadena
a) Unión de extremos no-homólogos
b) Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga
Papel de la proteína p53
Enfermedades asociadas con defectos en la reparación del DNA
2NRH
DAÑOS DEL DNA
• Errores en la replicación del DNA
• Ataques expontáneos
Ataques hidrolíticos
Daño oxidativo
Metilaciones descontroladas
Estos ataques espontáneos producen despurinaciones y desaminaciones
• Agentes químicos externos: CARCINÓGENOS
Son compuestos con grupos electrófilos que reaccionan con O y N
Modifican las bases nitrogenadas
Pro-carcinógenos: su metabolismo en el organismo mediante el citocromo P450 los transforma en carcinógenos
• Agentes físicos: radiaciones
Luz UV: dímeros de timina (dímeros de pirimidinas)
Radiaciones : rotura de la doble cadena del DNA
3NRH
Lesiones del DNA que requieren reparación
Lesión del DNA Causa
Pérdida de una base Eliminación de purinas por ácidos y calor (en el genoma humano, hidrólisis espontánea de 10.000 enlaces glucosídicos/día )
Base alterada Radiaciones ionizantes, agentes alquilantes, especies reactivas de oxígeno (ROS: O2
-., HO., H2O2)
Base incorrecta Desaminación espontánea (C pasa a U y A pasa a hipoxantina), errores en la replicación no corregidos por exo 3’-5’)
Deleción/Inserción Agentes intercalantes (naranja de acridina, proflavina)
Dímeros de pirimidina Radiación UV
Rotura de las cadenas Radiación ionizante, agentes químicos (bleomicina)
4NRH
oxidación hidrólisis
metilación no controlada
El tamaño de las flechas indica la frecuencia relativa de cada acontecimiento
Fig 5-46 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Estas alteraciones conducen a ladespurinación o desaminación de la doble cadena de DNA
DAÑOS DEL DNA
Alteraciones espontáneas que requieren reparación del DNA
5NRH
Despurinación y Desaminación
Fig 5-47 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Sitio apurínico
Otras desaminaciones (menos frecuentes)A HipoxantinaG Xantina
Sitio apurínico
6NRH
Desaminación de bases
adenina hipoxantina
guanina xantina
citosina uracilo
timina
no hay desaminación
5-metil citosina timina
Fig 5-52 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
7NRH
Mutaciones producidas por desaminación
Fig 5-49 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Cambio de apareamiento G=C por A=T; transición
8NRH
Mutaciones producidas por desaminación
La desaminación de C y A origina TRANSICIONES, mutaciones puntuales
producidas por la sustitución de una purina (pirimidina) por otra.
G A ; C T
citosina uracilo adenina
adenina hipoxantina citosina
T = A
G C
transición
CG a TA
AT a GC
9NRH
Azúcar despurinado
(A)
Fig 5-49 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Mutaciones producidas por despurinación
Deleción de 1 par de bases (Ej. AT)
10NRH
La radiación UV produce dímeros de timina
Fig 5-48 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
La luz UV une de forma
covalente dos residuos de
timina adyacentes en una
hebra cadena de DNA,
formando ciclobutano
Con menos frecuencia se
pueden formar otros dímeros
de pirimidinas
T-T > T-C, C-T > C-C
Los dímeros de timina
producen una distorsión local
del DNA
11NRH
Oxidación de bases
El metabolismo celular expone el DNA a los efectos perjudiciales de las
especies reactivas de oxígeno (ROS: O2-., HO., H2O2), subproductos
naturales del metabolismo oxidativo.
Se conocen más de 100 modificaciones oxidativas diferentes en el DNA.
p. Ej.: G puede oxidarse a 8-oxoguanina
oxoG puede aparearse con C o con A.
Si oxoG se con A se
produce una TRANSVERSIÓN.
TRANSVERSIÓN: mutación
puntual producida por la
sustitución de una purina por
una pirimidina o al revés.
G C T =A
12NRH
Alquilación de bases
Agentes alquilantes
Puede aparearse con C o T, produciendo transversiones
La alquilación de la posición N7 de un nucleótido de purina, hace
que su enlace glucosídico sea susceptible a la hidrólisis y lleve a la
pérdida de la base: despurinación
13NRH
Sistemas de reparación del DNA
• Escisión de la región dañada seguida de remplazamiento preciso Escisión de base Escisión de nucleótidos
• Reparación de errores de replicación
a) Desapareamientos (“mismatch repair”)
b) Translesión (“by-pass”)
• Reparación de roturas de doble cadena
a) Unión de extremos no-homólogos
b) Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga
14NRH
Reparación por escisión
Etapas principales
• Reconocer la lesión
• Eliminar la lesión escindiendo parte de una de las hebras
• Nueva síntesis para llenar el hueco
• Sellar la mella para reestablecer la continuidad del DNA
Reparación por escisión de base
• Una glucosilasa elimina la base, deja la cadena intacta
• La AP endonucleasa corta la cadena, la AP liasa elimina el azúcar
• La DNA polimerasa rellena el hueco
• La DNA ligasa sella la mella
Reparación por escisión de nucleótido
• Un corte doble elimina la lesión, se elimina un oligonucleótido
(12-13 nucleótidos en E. Coli, 27-29 en humanos)
• La DNA polimerasa rellena el hueco
• La DNA ligasa sella la mella
15NRH
Reparación por escisión de base
Fig 5-50a .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
DNA glucosilasa: hidroliza el enlace -glucosídico que une la base dañada al azúcar.Existen al menos 6 tipos de gluocosilasas (reconocen desaminaciones de C y A; bases oxidadas o alquiladas; bases con anillos alterados, etc…)
Genera un sitio sin base: apurínico o apirimidínico. Sitio AP
AP endonucleasa: rompe el enlace fosfodiéster del sitio AP gererado por la glucosilasa
Sistema de replicación: DNA polimerasa I y DNA ligasa
“UNG”
16NRH
Reparación por escisión de base
En humanos
• La desaminación de 5-metil-C (habituales en secuencias CG)deja T en lugar de U, actúan glucosilasas que reconocen el par desapareado T:G, eliminando preferentemente la T, sin embargo a veces elimina la G, produciendo una mutación.
• La AP endonucleasa más importante es APE1
Corta la cadena por el lado 5’ del sitio AP
Recluta la DNA pol b
La DNA pol b, que tiene dos actividades enzimáticas,
elimina el fosfato-azúcar abásico, con su actividad AP liasa,
y rellena el hueco con su actividad polimerasa
17NRH
Reparación por escisión de base
El sistema de reparación por
escisión de base repara los
daños en el DNA producidos
por despurinación de bases, a
partir de AP endonucleasa
Despurinación de G
C
C
C
C
G
G
Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col. (modificada)
G
18NRH
Reparación por escisión de nucleótido
Es el sistema de reparación más genérico y flexible
Este sistema de reparación actúa sobre una gran variedad de lesiones
• Dímeros de pirimidina
• Modificaciones químicas con carcinógenos: benzopireno, aflatoxina y
con agentes quimioterápicos como cisplatino
• Bases desapareadas y pequeños lazos del DNA
19NRH
Reparación por escisión de nucleótido
De forma general este sistema implica:
• Detección del daño: mecanismo de “escaneo”
• Actividad endonucleasa: ESCINUCLEASA
• DNA helicasa
• Sistema de replicación: DNA polimerasa y DNA ligasa
Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
20NRH
Sistemas enzimáticos en E. Coli: 4 componentes
Reparación por escisión de nucleótido
Función Componente
Escaneo DNA UvrA
Nucleasa: ESCINUCLEASA UvrB, UvrC
Helicasa UvrD
Sistema de replicación DNApol I/DNApol II; ligasa
21NRH
Reparación por escisión de nucleótido (E. Coli)
Fig 9-16 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.
22NRH
Reparación por escisión de nucleótido
Función E. Coli Humanos
Escaneo DNA UvrA XPA, XPC; RPA
Nucleasa: ESCINUCLEASA
UvrB, UvrC XPF, XPG
Helicasa UvrD XPB, XPD
Sistema de replicación
DNApol I/DNApol II;
ligasa
DNApol /; ligasa
Comparación en E. Coli y en humanos
23NRH
Reparación por escisión de nucleótido en humanos
Gen humano Función de la proteína
XPA Proteína de reconocimiento del daño (interacción con DNA lesionado)
XPB DNA helicasa, subunidad de TFIIH
XPC Reconocimiento inicial de la lesión. Interacción con TFIIH
XPD DNA helicasa, subunidad de TFIIH
XPF Actividad nucleasa (5’lesión)
XPG Actividad nucleasa (3’ lesión)
ERCC1 Unión a XPF y a proteína RPA
RPA Unión al complejo XPF-ERCC1 (reconocimiento de lesión junto a XPA)
24NRH
Reparación por escisión de nucleótidoen humanos
Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.
25NRH
Reparación por escisión de nucleótido en humanos
XERODERMIA PIGMENTOSA
Trastorno asociado al sistema de reparación por escisión de nucleótidos
Síntomas: Fotosensibilidad Elevada predisposición a padecer cáncer de piel
En eucariotas superiores este tipo de reparación es más activa en genes transcripcionalmente activos
Reparación asociada a transcripción
26NRH
Enzimas MMR en E. Coli: 4 componentes
Función Componente
Escaneo DNA MutS
Reparación de erroresMutL
MutH (endonucleasa)
MutU (UvrD helicasa)
Sistema de replicación DNApol III; ligasa
Reparación de desapareamientos post-replicativos o apareamiento incorrecto de base o MisMatch Repair (MMR)
27NRH
Reparación de desapareamientos post-replicativos (MMR)
El sistema tiene que distinguir la base errónea en la cadena hija, sin afectar a la cadena molde
La cadena hija permanece sin metilar en las secuencias GATC varios minutos después de su síntesis
¿Cómo se reconoce la cadena dañada?
Sistema MMR
Fig 14-29 .- Genes VII., Lewis.
28NRH
Reparación de desapareamientos(E. Coli)
Fig 25-20 .- Lehninger 3ª ed
• Los apareamientos incorrectos son reconocidos por un homodímero MutS, al que se une MutL
• Los 2 monómeros MutS crean un bucle que contiene el apareamiento incorrecto
• La endonucleasa MutH se une a sitios hemimetilados, permanece inactiva hasta que interacciona con el complejo MutL-MutS
• MutH corta la hebra hemimetilada, del lado 5’ ó 3’ del desapareamiento
29NRH
Reparación de desapareamientos(E. Coli) (cont.)
Fig 25-21 .- Lehninger 3ª ed (Modificada)
MutSMutLMutH
MutS, MutLMutU (helicasa)Exo VII o RecJ
(5’ a 3’ exo)Exo I o Exo X(3’ a 5’ exo)
DNA pol IIISSB
DNA pol IIISSB
Hueco de 1000nucleótidos
30NRH
Función E. Coli Humanos
Escaneo DNA MutS hMSH2-hMSH6
Reparación de errores
MutL
MutH (endonucleasa)
MutU (UvrD helicasa)
hMLH1-PMS1, PMS2
MED1 (endonucleasa)
Sistema de replicación
DNApol III; ligasa DNApol /; ligasa
Comparación de los sistemas enzimáticos en E. Coli y en humanos
Reparación de desapareamientos
31NRH
Fig 23-28 .- Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.
Reparación de desapareamientos(En humanos)
DNApol /; ligasa
¿Cómo se distingue la cadena hija en humanos?
No determinado, pero intervienen
• Las secuencias CG metiladas
• Las mellas transitorias de los fragmentos de OKAZAKI
32NRH
Reparación de desapareamientos y Cáncer
El mal funcionamiento del sistema de reparación de desapareamientos post-
replicativo MMR) predispone al CÁNCER de COLON
Cáncer de colon no poliposo hereditario (HNPCC)
• Enfermedad autosómica dominante
• Causas: defectos de MLH1, MSH2 o PMS2
33NRH
Reparación por síntesis de translesión
“trans lesion synthesis” (TLS)
Actúa un mecanismo de seguridad que permite que la maquinaria de
replicación se salte “by –pass” estos sitios de lesión
¿Qué ocurre si la DNA pol de replicación encuentra una lesión, dímero de T o un sitio AP, que no ha sido reparada?
Síntesis de translesión
Este sistema es muy propenso a cometer errores, pero evita que un cromosoma se replique de manera incompleta
34NRH
Reparación por síntesis de translesión (TLS)
Polimerasas de translesión:
Familia Y de DNA polimerasas
• Sintetizan DNA a través del sitio de la lesión
• Son dependientes de molde
• Incorporan nucleótidos de
una manera independiente de
apareamiento de bases, por
eso cometen errores con
frecuencia
Fig 9-18 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.
E. Coli
35NRH
Reparación de roturas de doble cadena
Las roturas de doble cadena son potencialmente letales
Causas de rotura de doble hebra
• Radiaciones ionizantes(rayos g, rayos X)
• Especies de oxígeno reactivas
• Quimioterápicos (bleomicina)
36NRH
Fig 23-32 .- Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.
DNA-PK: Proteína quinasa dependiente de DNA
Proteína KU: ATPasa dependiente de DNA con actividad helicasa
Unión de extremos no-homólogos
KU desenrrolla los extremos del molde hasta que regiones muy cortas (2-6 pb) puedan aparearse
p. ej.: nucleasas; eliminan los extremos no apareados
Se eliminan pb
37NRH
ATM: proteína quinasa activada por rotura de cadena doble
Unión de extremos homólogos:
recombinación homóloga
Un filamento nucleoproteíco busca la secuencia homóloga de DNA doble sobre la cromátida hermana
RAD51: conduce el apareamiento de DNA homólogos e invasión de cadenas
38NRH
39NRH
La proteína p53 detiene el ciclo
celular si el DNA está dañado
Fig
17-
33 .-
Bio
logí
a M
olec
ular
de
la C
élul
a 4ª
ed.
, Alb
erts
y c
ol.
40NRH
Fig
23-
23 .-
Bio
logí
a C
elul
ar y
Mol
ecul
ar 5
ª ed.
, Lod
ish
y co
l.
La quinasa ATM activa p53
41NRH
Enfermedades asociadas con alteraciónes en el sistema
de reparación por unión de extremos homólogos
ANEMIA DE FANCONI
Síntomas: Anomalías de desarrollo (infertilidad, deformidades esqueleto)
AnemiaElevada predisposición a padecer leucemia mieloide
CÁNCER DE MAMA HEREDITARIO
Por deficiencia en BRCA-1 y BRCA-2
ATAXIA TELANGIECTASIA
Inestabilidad genómica, Disfuncióin del sistema inmunePredisposición a padecer linfomas, leucemias.Producida por alteraciones en la proteína quinasa ATM
42NRH
Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.
