Nuovi strumenti diagnostici

Paola Grammatico

Vivere con una malattia rara Dalla diagnosi alla presa in carico

18 maggio 2016

Il Laboratorio di Genetica medica nella diagnosi delle malattie rare

Citogenetica classica

Citogenetica molecolare

Array-CGH

Il Laboratorio di Genetica medica nella diagnosi delle malattie rare

MLPA

Reverse dot blot

Sequenziamento: Metodo Sanger

Frederick Sanger: due premi Nobel in Chimica (1958 e 1980)

Real time PCR

Sequenziamento del DNA: Metodo Sanger

Analisi di un singolo frammento

amplificato mediante PCR

Gene grande > numerosi frammenti di

PCR > numerose sequenze

La sequenza viene allineata al

riferimento e analizzata per identificare

eventuali varianti nucleotidiche

1987: primo sequenziatore automatico (Applied Biosystem ABI370) 500.000 pb/giorno output: 500 kb/die Lunghezza massima del frammento: 600 basi

SEQUENCE REVOLUTIONS

NGS: sequenziamento massivo parallelo

Thro

ughput

Kb

Gb

Mb

Lenght of Read (bp)

700 300 50

NGS whole genome (WGS)

whole transcriptome

whole exome (WES)

THROUGHPUT

target seq

Più geni / pazienti in un singolo esperimento

Ieri…

Oggi..

Il Laboratorio di Genetica medica nella diagnosi delle malattie rare

Next generation sequencing (NGS)

Ricerca: contributo alla identificazione di nuovi geni responsabili di tratti fenotipici

Diagnosi: incremento delle potenzialità dei test genetici nella identificazione della causa

molecolare della patologia

Sequenziamento di centinaia di Mb (milioni di bp)

in un’unica seduta analitica

SEQUENZIAMENTO NGS

Piattaforme NGS diverse per concezione e chimica ma accomunate dalla capacità di generare informazioni di sequenza ad alta produttività (lettura di decine di migliaia di sequenze in parallelo)

PIATTAFORME HIGH THROUGHPUT

CONCEPITE PER SEQUENZIARE AMPIE REGIONI GENOMICHE

PIATTAFORME MIDDLE THROUGHPUT

CONCEPITE PER SEQUENZIARE REGIONI GENOMICHE

DI DIMENSIONI MINORI

La tecnologia NGS consente l’esecuzione di indagini in precedenza tecnicamente non fattibili o economicamente proibitive

Un genoma umano può essere sequenziato in poche

settimane ad un costo paragonabile a quello di

alcuni dei test diagnostici molecolari convenzionali

Diagnosi molecolare di condizioni precedentemente caratterizzate solo fenotipicamente

Diagnosi molecolare di malattie associate a mutazioni in geni di difficile approccio mediante sequenziamento Sanger

Diagnosi molecolare di malattie a ereditarietà multigenica

NGS: potenzialita’ in ambito diagnostico

Tipologie dei test NGS

Sequenziamento dell’intero genoma

(Whole genome sequencing, WGS)

Sequenziamento dell’intero esoma

(Whole exome sequencing, WES)

Sequenziamento mirato di pannelli di geni

(Target NGS testing o Panel NGS testing)

Il sequenziamento del DNA di nuova generazione: indicazioni per l’impiego clinico: documento SIGU_NGS, gennaio 2016

Risultati

Preparazione del campione

Sequenziamento

Analisi bioinformatica

NGS, workflow di un esperimento

Validazione

Disegno esperimento

output dell’esperimento

Allineamento delle letture ottenute con sequenza di riferimento

Identificazione di TUTTE le varianti

identificazione delle varianti patogenetiche

Varianti di sequenza

Varianti causative

Varianti responsabili di fenotipi non collegati al

quesito clinico (Incidental findings, IF)

Varianti di sequenza con effetti funzionali e clinici

non definiti (variants of uncertain significance, VUS)

CLASSIFICAZIONE DELLE VARIANTI IDENTIFICATE

American College of Medical Geneticists

Disease causing già descritte come causa della malattia (es. delezione F508 in CFTR)

Likely disease causing mai descritte in precedenza, ma si suppone siano causative in base alla tipologia della mutazione (es. Una mutazione nonsense in un gene per cui alter mutazioni di questa tipologia sono state già descritte

Possibly disease causing mai descritte in precedenza; in base al tipo di mutazione potrebbero o non potrebbero essere causative di malattia

Likely not disease causing mai descritte in precedenza; probabilmente non causative di malattia

Not disease causing già descritte come varianti neutrali

Variant of unknown clinical significance varianti nè già descritte nè attese come causative, ma identificate in associazione a quadri clinici

Exome sequencing

Target sequencing

Whole genome sequencing

Next Generation Sequencing nella diagnosi delle malattie rare

Fattori determinanti nella scelta dell’approccio

• Costi: il costo del sequenziamento di un esoma può oggi essere minore del sequenziamento di un pannello di geni

• Finalità: malattie ad elevata eterogeneità genetica/malattie mendeliane (o sospette tali) con gene ancora non noto

• Sensibilità: è in funzione del coverage delle sequenze indagate (n. letture “reads” dei singoli tratti del DNA esaminati e del grado di sovrapposizione tra queste)

• Probabilità di ottenere IF e VUS: dipende dall’ampiezza della porzione di genoma analizzata e interrogata.

• Archiviazione dei dati: necessità di disporre di piattaforme adeguate alla archiviazione di un gran volume di dati.

Sequenziamento dell’intero genoma (Whole genome sequencing, WGS)

L’analisi mediante WGS non viene ancora considerata come applicabile a livello

diagnostico per le difficoltà interpretative.

Il sequenziamento del DNA di nuova generazione: indicazioni per l’impiego clinico: documento SIGU_NGS, gennaio 2016

Vantaggi Analizzare e identificare nuovi geni malattia in pazienti già sequenziati Identificare mutazioni in geni malattia noti in fenotipi “atipici”

Indicazioni principali Patologie genetiche le cui basi molecolari risultino sconosciute

Limiti Necessità di un adeguato sistema di archiviazione dati

Whole exome sequencing, WES

Sequenziamento delle regioni codificanti dei geni di un individuo

Clinical Exome Sequencing

Sequenziamento delle regioni codificanti dei geni noti per essere associati a

malattia (OMIM)

6 anni, caso isolato, genitori non consanguinei

Alla nascita, fistola tracheoesofagea ad oggi residuano, reflusso

gastro-esofageo ed anemia

Ritardo di acquisizione della parola

Microcefalia (CC <3°centile, P&A

10°centile)

Ipoplasia zigomatica e mandibolare

Dismorfismo auricolare

Diagnosi gestaltica

di:

Disostosi

mandibolofacciale,

tipo Guion-Almeida

CASO 1

CASO 1

Disostosi mandibolofacciale, tipo Guion-Almeida

Disostosi facciale rara

Base molecolare definita nel 2012 (Lines et al., AJHG)

Unico gene: EFTUD2 (no eterogeneità di locus)

Nessun laboratorio in Italia

Tre laboratori in UE

(www.orpha.net)

Approccio NGS

TruSight One (Illumina)

(in coll. Dr.ssa Iascone)

EFTUD2

c.[492+4A>G]

Eterozigote, de novo

Delezioni e mutazioni di splicing

comuni in EFTUD2

CASO 2

Nascita/6 mesi, 1° figlio, genitori consanguinei

SGA, importante microcefalia alla nascita

Fronte sfuggente, overlapping delle suture,

micrograzia

Screening ecografico (addome e cuore) nella

norma

RMN cerebrale: grave microcefalia con

semplificazione delle circonvoluzioni

Diagnosi gestaltica

& radiologica di:

Microcefalia

primaria/sindrome

di Seckel

CASO 2

Microcefalia primaria/sindrome di Seckel

Spettro clinico raro con eterogeneità clinica e di locus

Almeno 16 geni fin ora identificati

Tre di questi sono stati identificati solo in s. di Seckel

Nessun laboratorio in Italia

Vari laboratori in UE

(www.orpha.net)

Approccio NGS

TruSight One (Illumina)

(in coll. Dr.ssa Iascone)

ASPM

p.[Gln509ter]

Omozigote

Targeted sequencing

Vantaggi

Arricchimento specifiche regioni genomiche Abbattimento dei costi Analisi di un numero elevato di pazienti contemporaneamente

Limiti

Necessità di un aggiornamento del pannello con l’identificazione di nuovi geni associati alla malattia di interesse

Indicazioni principali: patologie dove mutazioni in geni noti sono responsabili della maggior parte dei casi (es. Teleangectasia Emorragica Ereditaria – mutazioni geni ENG, ALK1 e SMAD4 nell’80%-87% dei casi)

Studio di 62 geni sarcomerici e non sarcomerici in 44 paz con cardiomiopatia ipertrofica mediante NGS

Definizione di un protocollo bioinformatico per l’interpretazione delle varianti identificate mediante NGS, sia in ambito di ricerca che in ambito diagnostico

155 varianti

SANGER VALIDATION

FILTERING

(MAF<0,01) +

PRIORITIZATION

(Ex ± 10bp)

18.810 varianti

RISULTATI

36/44 (82%) pazienti portatori di almeno una variante non-sinonima rara (frequenza < 1%)

RISULTATI identificazione di pazienti affetti da cardiomiopatia ipetrofica secondaria

Paziente 10, ♀, 65 anni

MUTAZIONE: GLA c.A644G,p.N215S (eterozigosi) GLA: malattia di Fabry, X-linked recessiva (1-5/10.000) Sebbene la malattia di Fabry sia caratterizzata da segni neurologici, angiocheratoma, insufficienza renale, cardiomiopatia, la pz.10 mostrava solo cadiomiopatia

Paziente 24, ♀, 7 anni

sindrome di Cantù (<1/1.000.000) autosomica dominante, ipertricosi congenita, osteocondrodisplasia, cardiomegalia, cardiomiopatia e dismorfismi MUTAZIONE: ABCC9 c.C3460T,p.R1154W (eterozigosi)

Paziente 27, ♀, 23 anni

Malattia di Danon (<1/1.000.000) X-linked recessiva cardiomiopatia, debolezza muscolare, ritardo mentale MUTAZIONE: LAMP2 c.453delT,p.F151fs

RENE POLICISTICO DELL’ADULTO

ADPKD

RENE POLICISTICO RECESSIVO

ARPKD

MALATTIA VON HIPPEL LINDAU

MALATTIE DEL SISTEMA GENITO-URINARIO

SINDROME DI MECKEL

SINDROME OROFACIODIGITALE

TIPO 1

Sindrome Branchio-Oto-Renale

(BOR)

RENE POLICISTICO DELL’ADULTO

ADPKD RENE POLICISTICO

RECESSIVO ARPKD

PKD1, PKD2

PKHD1

MALATTIA VON HIPPEL LINDAU

VHL

Analisi di geni selezionati PANNELLI GENICI SEMPLICI

MALATTIE DEL SISTEMA GENITO-URINARIO

SINDROME DI MECKEL

MKS1, MKS2, MKS3

SINDROME OROFACIODIGITALE

TIPO 1

OFD1 Sindrome

Branchio-Oto-Renale (BOR)

EYA1, SIX5, SIX1

SINDROME DI ALPORT

SINDROME DI BARDET-BIEDL

SINDROME DI BARTTER

Congenital Anomalies of the Kidney and the Urinary Tract

(CAKUT)

SINDROME DI JOUBERT

SINDROME DI MECKEL

MALATTIE DEL SISTEMA GENITO-URINARIO

SINDROME DI ALPORT

SINDROME DI BARDET-BIEDL

SINDROME DI BARTTER

Congenital Anomalies of the Kidney and the Urinary Tract

(CAKUT)

SINDROME DI JOUBERT

COL4A3, COL4A4, COL4A5, MYH9

ALMS1, ARL6, BBS1, BBS10, BBS12, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS9, CCDC28B, CEP290,

LZTFL1, MKKS, MKS1, NPHP1, SDCCAG8, TRIM32, TTC8, WDPCP

ATP6V1B1, BSND, CA2, CASR, CLCNKA, CLCNKB, CLDN16, CLDN19,

FXYD2, HSD11B2, KCNJ1, KCNJ10, KLHL3, NR3C2, SCNN1A, SCNN1B,

SCNN1G, SLC12A1, SLC12A3, SLC4A1, SLC4A4, WNK1, WNK4

ALDH1A2, BICC1, BMP4, CHD1L, EYA1, FGF20, FOXC1, FRAS1, FREM1, FREM2, GATA2, GATA3, GDNF, GRIP1, HNF1B, NPHP3,

OSR1, PAX2, RET, ROBO2, SDCCAG8, SIX1, SIX5, SOX17, TFAP2A, UPK3A, WT1

AHI1, ARL13B, B9D1, B9D2, C5orf42, CC2D2A, CEP290, CEP41, KIF7, MKS1, NPHP1, NPHP3, OFD1, RPGRIP1L, TCTN1, TCTN2,

TMEM138, TMEM216, TMEM237, TMEM67, TTC21B

MALATTIE MULTIGENICHE AD EREDITARIETA’ COMPLESSA

Analisi di geni selezionati PANNELLI GENICI complessi

SINDROME DI BARDET BIEDL

Patologia geneticamente eterogenea (21 geni), trasmessa per lo più come carattere AR; in alcuni casi è stata osservata una modalità di trasmissione oligogenica

80% dei casi

Mockel et al, 2011

BBS1 23%

Heon et al, 2016

Mutazioni a diversi loci BBS possono interagire e

determinare o modulare il fenotipo di alcuni individui

Il documento tratta l’ampio range di aspetti etici, legali, sociali e pratici che scaturiscono dall’uso della tecnologia NGS in ambito diagnostico-clinico

NGS: REGOLAMENTAZIONE

25 raccomandazioni per implementare l’uso dei test dagnostici mediante NGS massimizzandone i benefici e minimizzando i potenziali rischi dovuti ad un loro impiego non corretto

Definizione criteri standardizzati per la scelta dei geni da inserire nei pannelli diagnostici, curati, validati e aggiornati da un team multidisciplinare di esperti (clinici e laboratoristi)

• Raccomandazioni operative per i test NGS

• Consulenza genetica nei test NGS (Peculiarità e Contenuti specifici)

• Comunicazione dei risultati (consulenza post-test)

• Analisi dei dati NGS e requisiti di qualità

• Conservazione dei dati NGS

Problematiche rilevanti: Incidental findings (IF)

Identificazione di varianti a carico di geni responsabili di patologie non correlate al quadro clinico per cui si sta eseguendo l’accertamento.

Riscontro che abbia potenziale importanza per la salute o rappresenti un rischio riproduttivo

Consenso informato Consulenza genetica

Diagnosi prenatale non invasiva

Diagnosi preimpianto

Il Laboratorio di Genetica medica nella diagnosi delle malattie rare

cffDNA: DNA fetale libero circolante Origina da cellule placentari e viene rilasciato nel sangue materno

cffDNA è presente nel plasma materno a partire dalla IV-V settimana di gestazione e la sua concentrazione (mediante compresa tra il 2% e il 40%) aumenta proporzionalmente con l’età gestazionale. Entro circa 2 ore dal parto non è più presente nel plasma materno FRAZIONE FETALE (FF): % di cffDNA nel plasma materno. Per poter effettuare NIPT la FF deve essere almeno il 4%

NIPT - Non Invasive Prenatal Testing

NIPT - Non Invasive Prenatal Testing

Il DNA libero circolante viene sequenziato e il numero di sequenze per ogni cromosoma viene confrontato con un genoma di riferimento. Se il numero di sequenze di un cromosoma si discosta dall’atteso, viene segnalata un’aneuploidia Anomalie cromosomiche indagate: trisomia 13, 18, 21 + aneuploidie dei cromosomi sessuali Riduzione attesa del ricorso a procedure di diagnosi prenatale invasiva: 95%

NIPT - Non Invasive Prenatal Testing

FATTORI CHE INFLUENZANO AFFIDABILITA’ DEL TEST

-Mosaicismi confinati alla placenta -Vanishing twin -Peso della madre (influenza Frazione Fetale) -Fumo, alcol, droghe da parte della madre (influenzano Frazione Fetale) -Infezioni materne -Neoplasie materne -Trasfusioni di sangue, trattamento con cellule staminali, trapianti materni

LA NIPT è un test di screening (non diagnostico)

Diagnosi prenatale non invasiva

Diagnosi preimpianto

Il Laboratorio di Genetica medica nella diagnosi delle malattie rare

CHI RICHIEDE PGD

• Coppie a rischio infertili

• Coppie fertili con rischio 25-50%

• Coppie a rischio con una storia di ripetuti aborti per feto affetto e/o che rifiutano aborto

Chi richiede la PGD

COPPIE CON RISCHIO AUMENTATO PER UNA PATOLOGIA EREDITARIA GRAVE

Nuovi strumenti diagnostici nel Laboratorio di Genetica medica

Conclusioni

Implementazione delle capacità diagnostiche dei test genetici

Standardizzazione dei percorsi di validazione

dei test genetici

Centralizzazione dei test genetici di II livello (DCA 549 del 18-11-2015)

Adeguamento delle dotazioni organiche dei Laboratori di Genetica medica

Implementazione degli ambulatori

di consulenza genetica

Forte interazione tra genetisti di laboratorio e genetisti clinici

Nuovo nomenclatore/tariffario

Nuovi strumenti diagnostici nel

Laboratorio di Genetica medica

Conclusioni