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Obtención de Agentes de Control Biológico .

Métodos de aislamiento y selección

Objetivos:

Transmitir la importancia de los procesos de búsqueda y selección de ACB como base del éxito de un programa de CB.

Analizar las diferentes vías o caminos posibles en el proceso de búsqueda y selección.

Discutir los factores que condicionan estos procesos.Comprender como los resultados finales pueden estar

condicionados por las técnicas o métodos utilizados.Analizar posibles objetivos y estrategias de búsqueda y

selección de ACB

Aislamiento de ACB

Aislamiento de ACB¿Dónde encontrar ACB?¿Cómo aislar?¿Cualquier antagonista?

¿Qué características deseamos encontrar?

Importancia del aislamiento y selección“El aislamiento y la selección de microorganismos

antagonistas sustentan a todo Programa de Control Biológico determinando las chances de éxito”. (Bettiol 1991)

El número de microorganismos en una comunidad microbiana es inmenso.

En la rizosfera de un árbol de roble se calcula que existen 45 mil billones de m. o. (45 x 1015)

Dónde encontrar ACB

En cualquier lugar puede existir algún microorganismo antagonista.

Muchos m.o. valiosos se encuentran en forma azarosa.

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Penicillium rugulosum Dónde se puede encontrar un ACB

En cualquier lugar puede existir algún microorganismo antagonista pero….

¿Existe algún lugar donde sea más probable hallarlo?

En aquellos sitios donde, coincidiendo la presencia del patógeno, la planta huésped y el ambiente favorable al desarrollo de la enfermedad ésta no ocurre, es posible que allí esté funcionando naturalmente algún tipo de biocontrol.

Dónde encontrar ACB cont..

Esto puede suceder naturalmente:suelos supresivos

Podemos forzar la situación:Colocamos plantas o frutos en situaciones

favorables al desarrollo de la enfermedad y seleccionamos aquellos individuos que se mantuvieron sanos.

Monilinia fructicola en duraznos.Penicillium expansum en manzana.

Selección de ACB para Monilinia

Aislamiento

Selección de ACB para P. expansum

Aislamiento

Algunos lugares

Suelos supresivosSobre las partes aéreas de las plantas (m.o. epifíticos,

o del filoplano) Sobre la superficie de las raíces (rizoplano)Colonizando a patógenosDentro de la planta (endofitos)Fitopatógenos (razas leves o avirulentas)

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Algunos Objetivos

Efectividad antagónica.Adaptación al lugar de acción. (hojas, frutos,

heridas)Adaptación al ambiente. (Cámara de frigorífica)Espectro de acción. Ausencia de producción de antibióticosResistencia a fungicidas.

¿Por qué sobre la planta?

Porque se ha demostrado que sobre la planta viven numerosos m.o. entre los cuales existen antagonistas de los patógenos y promotores de las defensas de las plantas.

¿Por qué sobre la planta?En el agua de lavado concentrada crecen solamente bacterias y levaduras

Chalutz, E., and Wilson, CL .1990. "Postharvest biocontrol of green andblue mold and sour rot of citrus fruit by Debaryomyces hansenii". PlantDisease. 74(22):134-137.

¿Por qué sobre la planta?

Porque se supone que si están allí es porque están adaptados a vivir en esas condiciones.

Si queremos controlar a un patógeno que ingresa por heridas nos interesa que nuestro antagonistas sea un buen colonizador de heridas.

¿Por qué sobre la planta?

Porque existe mayor aceptación por parte de los consumidores a admitir a los m.o. que naturalmente viven sobre la planta que a otros extraños.

Aislamiento a partir de la flora epifíticadel fruto

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Aislamiento a partir de la flora epifíticadel fruto

Aislamiento de colonizadores de heridas

Aislamiento

Aislamiento de cepas adaptadas al frío

Aislamiento

Aislamiento de cepas adaptadas al frío y heridas.

Agar jugo de manzana 5 ºC

Colonizadores de patógenos

Se pueden encontrar antagonistas colonizando naturalmente a los patógenos de plantas.Se pueden utilizar a los patógenos como cebo para capturar a sus antagonistas.

Colonizadores de esclerotos

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Endófitos

Microorganismos que habitan en el interior de los tejidos vegetales sin causar aparentemente ningún daño a su hospedero.

Endófitos

Para superar una de las limitantes mayores del CB. Obtener antagonistas con capacidad curativa.Control de patógenos vasculares.

Endófitos

Lavado de los frutos con agua destilada estéril1 min. En alcohol 96%Hipoclorito al 3% por 4 min.

3 lavados con agua destilada estérilTrozos se Siembran en medio Sabouraud

Camatti-Sartori et al. VII Reuniao de controle biologico de fitopatogenos. 26-27 de novembro de 2001. Bento Goncalvez, RS.

Endófitos

Endófitos de frutosHipoclorito de Sodio al 1% + Tween 80 por 3 min.Enjuaga con agua destilada estérilSecado y siembra de discos de fruta en medio de cultivo.

Aislamiento

En medio generalesSelectivamente

HongosBacteriasCapaces de digerir al patógeno

Selección

In vitroCultivos duales

In vivoInoculación en plantas

Intermedios utilizando trozos de vegetal

Buscando alguna característica especial

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Cultivos dualesConsiste en sembrar en una misma placa

enfrentados al antagonista y al patógeno

Selección “in vitro”

Fácil de realizarRápidaMenor costo relativo.

Solamente selecciona por algunos mecanismos de acción, descartando antagonistas que podrían funcionar sobre la planta.Tiene baja correlación con la performance a campo.

Selección “in vivo”Consiste en inocular plantas con el patógeno y

al antagonista

Selección sobre frutos

Selección “in vivo”

Selecciona independientemente de los mecanismos de acción antagónica.

Implica un mayor trabajoMayor tiempoMayor costo relativo.Mayor equipamiento (Plantas, invernáculo, personal,

etc)

Selección combinada

Consiste en inocular tejidos vegetales en el laboratorio.

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Selección de levaduras productoras de sideróforos

Selección de cepas resistentes a fungicidas

Selección de cepas no productoras de antibióticos

X X

X

Selección de cepas de con amplio espectro

Otras consideraciones

¿A quién debe enfrentar nuestro antagonista?¿En qué condiciones?

Elección de la cepa más agresiva

Elección de la cepa más resistente a fungicidas

Resumen final

El aislamiento y selección de antagonistas es un proceso fundamental en cualquier programa de control biológico.Las técnicas utilizadas pueden sesgarnos los

resultados.No existe una única estrategia de trabajo.El arte está en diseñar aquella estrategia que nos

conduzca en la forma más directa hacia nuestro objetivo final.