OBTENCION DE CLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE PERIFRICA

En el anlisis del sistema inmune es necesario evaluar las clulas que se desarrollan y activan en forma especfica o inespecfica, en cada tipo de respuesta. De all el inters por separar las clulas y evaluarlas en forma diferenciada. En muchos de los experimentos in vivo e in vitro que llevan a cabo los inmunlogos son precisas poblaciones linfocitarias puras. Las principales fuentes de linfocitos de animales de experimentacin son el timo, el bazo y los ganglios linfticos perifricos. En los estudios llevados a cabo en seres humanos la fuente de linfocitos ms cmoda es la sangre perifrica, pero tambin se pueden obtener clulas del bazo, las amgdalas o los ganglios linfticos mediante procedimientos quirrgicos. Hay que tener en cuenta que las poblaciones celulares obtenidas a partir de cada una de estas zonas es diferente de las dems en lo que respecta a la madurez de los linfocitos y a la proporcin relativa de los diversos tipos de clulas que contiene. La inmunologa dispone de varios mtodos para la separacin rpida de poblaciones linfocitarias, dentro de ellas contamos con la separacin en gradientes de densidad, la formacin de rosetas, la separacin celular por medio de partculas magnticas, Identificacin de linfocitos por Inmunofluorescencia y la identificacin por Citometra de flujo. Nosotros en la prctica realizaremos la tcnica de separacin por gradientes de densidad, la cual se basa en que los linfocitos son menos densos que los eritrocitos y los granulocitos, y se utiliza para separar conjuntamente todos los linfocitos sanguneos.

Materiales: Microscopio ptico Tubos de vidrio (13x100 12x75)

Gradillas para Tubos Pipetas pasteur

Cmara de Neubauer Centrfuga

Lminas Portaobjeto Laminillas Cubreobjeto

Reactivos:1. Solucin de Ficoll HipaqueFicoll 400................................... ....... 9 grs. Agua destilada .................................. 115.0 ml Hipaque al 50%.................................. 30 ml.

2. PBS (Solucin salina amortiguadora con fosfatos)Cloruro de Sodio.................................. 17 grs. Fosfato dibsico de sodio (7 H2O)..... 2.35 grs. Fosfato monobsico de sodio............. 0.45 grs. Agua destilada c.s.p............................ 2.0 litros. Ajustar pH a 7.4 con HCl 6 N.

3. Azul de Tripn al 1% acuoso

4. PBS-GlicerolPBS..................................................... 1.0 ml Glicerol............................................... 7.0 ml

Obtencin de muestras para estudio de sangre perifrica: i. Por venipuntura, extraer la sangre en una jeringa que contenga heparina a concentracin de 10 U.I. por ml, mantener en agitacin lenta a temperatura ambiente. No dejar transcurrir ms de 4 horas antes de procesar la muestra. ii. Otra forma es obteniendo por venipuntura sangre venosa en un tubo con EDTA, mezclar y puede ser conservada a temperatura ambiente hasta por 48 horas. Mdula sea:

Por puncin medular o de cresta iliaca, extraer 2 5 ml de mdula sea en una jeringa que contenga 10 ml de PBS y 150 UI de heparina. Esta dilucin es indispensable para obtener una adecuada separacin de clulas mononucleares. Las muestras de mdula que no son diludas en el momento de su obtencin deben rechazarse. La agitacin y tratamiento hasta el procesamiento es igual que para sangre perifrica. Obtencin a partir de ganglio:

a) Se coloca el ganglio en un mortero, se cubre con PBS y se punza con una aguja; sta accin facilitar la salida de las clulas. A partir de esta emulsin se obtendrn las clulas a investigar. b) Otra forma es colocar el ganglio en un mortero y presionarlo con el piln y a la vez se va agregando PBS, formndose as un machacado de donde se obtendrn las clulas a investigar. Mtodo: 1. Dilur la muestra de sangre perifrica heparinizada o con EDTA 1:2 (2 ml de sangre + 2 ml de PBS ). Las muestras de mdula sea ya diludas no deben diluirse nuevamente.

Tubo con sangre 2ml ms 2 ml del buffer PBS

2. En un tubo sobre un volumen de 2 ml de ficoll-hipaque, depositar cuidadosamente en zona la muestra diluda. La mezcla se evita si la muestra se desliza por la pared del tubo en tanto ste se mantiene inclinado.

Tubo con 2 ml de sangre ms 2 ml de PBS y luego aadimos Ficoll, que es la parte transparente.

3. Centrifugar a 1000 3000 r.p.m. durante 20 30 minutos en centrfuga refrigerada o a medio ambiente.

Halo con clulas mononucleares, eso lo extraemos, para su estudio de linfocitos T

4. Separar de la interfase formada la capa de linfocitos con una pipeta de Pasteur.5. Lavar las clulas mononucleares dos veces con PBS, centrifugando a 3,000 r.p.m. durante 10 minutos cada vez.

Al separar el Halo con clulas mononucleares, separamos y lo lavamos 2 veces con PBS. Al ltimo separamos 0.5ml

6. Contar en cmara de Neubauer o en contador electrnico y ajustar en PBS la densidad requerida ( Un milln de clulas por c.c.) 7. Podemos realizar comprobacin de viabilidad celular, colocando una gota de azul de Tripn al 1% + 1 gota de clulas en una lmina porta-objetos, cubrirla con una laminilla cubre-objetos y observar al microscopio. Las clulas muertas se vern de color azul y las vivas o viables se vern refringentes. Una buena obtencin de mononucleares debe presentar menos del 5% de clulas muertas.

Esquema de la gradiente de densidad.En el microscopio observamos las clulas con Azul de tripan que sirve para ver si es VIABLE, solo las clulas muertes se vern de color azul.

InterpretacinObservaremos como los componentes de la muestra se ubicaran a diferentes niveles dentro del tubo segn su propia densidad. La capa de mononucleares obtenida es bastante pura y contiene linfocitos y monocitos, los que se pueden distinguir por su morfologa, antgenos de superficie, capacidad fagoctica, actividad enzimtica, adherencia.Notas: La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologas utilizadas para este fin. Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos celulares, permite mantener una buena viabilidad celular para realizar otros anlisis. No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir por las paredes del tubo y de inmediato debe ser centrifugada.

CUESTIONARIO1.- En qu consiste la separacin celular por medio de partculas magnticas? Separacin InmunomagnticaEstas tcnicas se basan en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas esferas formadas por un material superparamagntico (es decir, que solo son magnticas en presencia de un campo magntico) recubierto de un polmero. Los anticuerpos se unen de manera especfica a un antgeno presente en la superficie de un tipo celular concreto y, mediante un simple imn, se pueden separar las clulas unidas a los anticuerpos de las dems. Existen en el mercado dos sistemas de separacin de clulas basados en el uso de esferas metlicas unidas a anticuerpos: Dynabeads y MACS. a. Dynabeads (Life technologies) Son unas esferas de poliestireno en cuyo interior hay partculas superparamagnticas que contienen hierro, homogneamente distribuidas. Su tamao es uniforme, con un dimetro de 4,5 micras (comparable al tamao de una clula). Sobre su superficie se pueden unir covalentemente diversos ligandos biorreactivos: anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, estreptavidina, oligonucletidos, etc.

b. Microesferas MACS (Magnetic-activated cell sorting) (Miltenyi Biotec)Son partculas supe paramagnticas formadas por xido de hierro y polisacridos (dextranos). Son muy pequeas, con un dimetro aproximado de 50 nm, y se encuentran unidas a anticuerpos especficos. Al ser tan pequeas, no alteran ni la estructura, ni la funcin, ni la actividad de las clulas. No son txicas y son biodegradables. La separacin se lleva a cabo haciendo pasar la muestra a travs de una columna que contiene una matriz de esferas ferromagnticas recubiertas de un material inerte que no daa las clulas. Cuando se coloca la columna sobre un imn, las esferas crean un campo magntico de gran intensidad que atrae fuertemente las microesferas MACS y las clulas unidas a ellas, mientras que las clulas que no se han unido a las microesferas MACS fluyen libremente a travs de la columna. Se necesita un campo magntico muy intenso porque las microesferas son muy pequeas y las clulas estn mnimamente marcadas.

2.- Qu es el Ficoll? El Ficoll es un polmero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las clulas mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugacin nos ser fcil obtener las clulas mononucleares de sangre perifrica.

3.- Qu es el Hipaque?3.a) Hypaque megluminaMarca del diatrizoato de meglumina, es un agente de diagnstico, radiopaco y soluble en agua. Es un derivado triyodado del cido benzoico con 47.06% de yodo unido orgnicamente. Est constituido por un anin yodado (diatrizoato) y un catin radiolcido (meglumina). Es una solucin acuosa estril con 60 g de la sal meglumnica del cido diatrizoico por cada 100 ml de solucin. La solucin es transparente, incolora o amarillo plida, y el pH ha sido ajustado entre 6.5 y 7.7 con cido diatrizoico o solucin de meglumina. Es una solucin relativamente termoestable y puede ser autoclavada sin que se produzcan efectos deletreos, pero debera ser protegida de la luz fuerte. La solucin al 60% contiene edetato de calcio disdico 1:10.000 como agente estabilizador secuestrante. Cada 1 ml contiene aproximadamente 282 mg de yodo unido orgnicamente. La viscosidad de la solucin es 6.17 cp a 25 C y 4.12 cp a 37 C. Es hipertnica a la sangre, con una osmolalidad de 1.415 mosm/kg (determinado por VPO). Una solucin al 13% (p/v) es isotnica. Es un slido microcristalino, incoloro, muy soluble en agua. Qumicamente corresponde a 3.5-diacetamida-2, 4, 6-triyodobenzoato de meglumina (C11H9I3N2O4.C7H17NO5) con un peso molecular de 809.13.3.b) Hypaque-76Marca de diatrizoato de meglumina y diatrizoato sdico, es un agente de diagnstico, radiopaco soluble en agua. Se presenta bajo la forma de una solucin acuosa estril al 76 %, que contiene 66% (p/v) de diatrizoato de meglumina y 10% (p/v) de diatrizoato sdico. Es un derivado triyodado del cido benzoico con 37% (p/v) de yodo unido orgnicamente. Cada ml contiene 370 mg de yodo y 3.68 mg (0.16 mEq) de sodio. Est constituido por un anin yodado radiopaco -diatrizoato- y los cationes radiolcidos, meglumina y sodio. Es el yodo unido orgnicamente del anin la parte de la molcula que opacifica las estructuras internas para visualizacin por medio de los rayos X y la fluoroscopa. La solucin es hipertnica a la sangre, con una osmolalidad de 2016 mosm/kg (determinado por VPO). La viscosidad es de 9 cp a 37 C. El pH ha sido ajustado entre 6 y 7.7 usando Na2CO3con HCI o NaOH. El pKa es 3.4 para el cido diatrizoico. Se ha agregado edetato de calcio disdico al 0.01% como agente estabilizador secuestrante. La solucin es transparente, incolora o amarillo plida. El diatrizoato meglumina corresponde al 1-deoxi-1-(metilamino)-D-glucitol-3.5-diacetamida-2,4,6-triyodobenzoato (sal). El diatrizoato sdico corresponde al 3.5 -diacetamida-2,4,6- triyodobenzoato monosdico.

INTRODUCCIN En estos 2 informes que presentaremos a continuacin, bsicamente detallaremos en el primer informe como extraer clulas mononucleares a partir de sangre perifrica, luego los estudiaremos y por ltimo en el informe posterior extraeremos Linfocitos T. Una Clula mononuclear de sangre perifrica (PBMC) es una clula sangunea caracterizada por poseer un nico ncleo redondo, como los linfocitos o los monocitos. Estas clulas sanguneas son un componente crtico en el sistema inmune, concretamente para combatir las infecciones. Estas clulas se obtienen a menudo de la sangre usando ficol, un polisacrido hidroflico que separa capas de la sangre, con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la capa del plasma. Este buffy contiene las PBMCs. Las PBMCs tienen vastos usos clnicos y en investigacin. Por ejemplo, se emplean en la investigacin del virus HIV porque las PBMCs incluyen los linfocitos T4, que el HIV infecta Los linfocitos T o clulas-T pertenecen al grupo de leucocitos que son conocidos como linfocitos. Estas clulas tienen ncleos de forma ovoide que ocupan la mayora del espacio intracelular. Los linfocitos T son los responsables de coordinar la respuesta inmune celular constituyendo el 70% del total de los linfocitos que segregan protenas o citocinas. Tambin se ocupan de realizar la cooperacin para desarrollar todas las formas de respuestas inmunes, como la produccin de anticuerpos por los linfocitos B. Se diferencian de los linfocitos B y de las clulas NK (o clula Natural Killer, en espaol asesina natural) por poseer un receptor especial en la superficie de la membrana, el receptor de linfocitos T (tambin llamado TCR, por su denominacin en ingls T cell receptor). Sin embargo, en un frotis microscpico de sangre no es posible distinguir uno de otro a simple vista.

CONCLUSIN La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologas utilizadas para este fin. Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos celulares, permite mantener una buena viabilidad celular para realizar otros anlisis. No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir por las paredes del tubo y de inmediato debe ser centrifugada. La muestra usada debe ser fresca. Los glbulos rojos de carnero pueden ser lavados en solucin salina fisiolgica hasta que no se observe hemlisis o sea el sobrenadante debe ser incoloro y transparente. La formacin completa de las rosetas se da a las 18 24 horas a una temperatura de 2 8 C (refrigeracin) Realiza el clculo de los linfocitos T de la muestra trabajada.