OCJENE EJAKULATA I SPERMIJA - porodnistvo.vef.unizg.hrporodnistvo.vef.unizg.hr/wp-content/uploads/2011/04/ocjena... · Ocjenjuje se pokretljivost ili motilitet (povezano s plodnošću)

OCJENE EJAKULATA I SPERMIJA

2

Spermu ocjenjujemo

da bismo odredili svojstva dobivenog ejakulata,

da bismo kontrolirali preživljavanje spermija poslije pohrane, konzerviranja i prije osjemenjivanja,

kada želimo ocijeniti plodnost ili ustvrditi neplodnost rasplodnjaka

3

veterinar na terenu mora znati ocijeniti spermu

prilikom ocjene sperme rasplodnjaka na terenu, najbolje je ejakulat dobiti pomoću umjetne vagine

uzorak za pretragu iznimno se može uzeti iz vagine pripuštene krave ili s penisa bika neposredno nakon pripusta ili pak masažom ampula sjemenovoda per rectum

4

razlikujemo sanitarnu i makroskopsku ocjenu ejakulata i ocjene kvalitete spermija

ako sperma ne odgovara u sanitarnom pogledu, ejakulat se ne smije upotrijebiti

Za ocjenu kvalitete sperme postoje ocjene (izvrstan, vrlo dobar i dobar)

postoje minimalne ocjene koje još dopuštaju uporabu ejakulata

ocjena spermija i ejakulata stroga namjeravamo li ju konzervirati dubokim

5

SANITARNA OCJENA EJAKULATA osim pregleda, obuhvaća i ocjenu

zdravlja rasplodnjaka; za umjetno osjemenjivanje mogu se upotrebljavati samo ejakulati posve zdravih rasplodnjaka

nepažljivim radom mogu se i umjetnim osjemenjivanjem putem sperme, iako rasplodnjak ne dolazi u izravni kontakt s plotkinjama, prenositi spolne zarazne bolesti (genitalna kampilobakterioza, trihomonijaza, bruceloza i tuberkuloza)

6

osim ocjene ejakulata, obavezne pretrage rasplodnjaka s obzirom na spolne zaraze i leukozu

Za plotkinje su opasni ejakulati rasplodnjaka koji boluju od upalnih žarišta unutarnjih spolnih organa (upala sjemenih vrećica, prostate, epididimisa itd.) - otkrivamo androloškim pretragama rasplodnjaka

na to nas najprije upućuje već makroskopska ocjena sperme

7

U ejakulatima oboljelih rasplodnjaka nalazimo primjese žutog gnoja koji se taloži na dno spermohvatača

kod vezikulitisa u spermi nalazimo bjelančevinaste pahuljice

Naglo ugibanje spermija poslije uzimanja također upozorava na mogućnost da sekreti akcesornih spolnih žlijezda sadrže štetne upalne produkte

8

pojava velikog broja nezrelih spermija i otpalih glava pobuđuju sumnju na epididimitis

porast pH na više od 7,5 uz normalan broj spermija upozorava na postojanje upalnog žarišta u spolnim organima rasplodnjaka

takva sperma nije prikladna za uporabu jer ima smanjenu sposobnost oplodnje

9

Ejakulat ne smijemo upotrijebiti ni u slučajevima ako u njemu nađemo primjese mokraće (miris), krvi (crveni talog i boja) ili bilo kakva vanjska onečišćenja (komadiće balege, stelje, previše vazelina iz umjetne vagine, prašine, zemlje itd.)

U novije vrijeme predlaže se i određivanje koli-titra ejakulata, koji pokazuje je li ejakulat uzet maksimalno higijenski

10

U sumnjivim slučajevima poslužit ćemo se bakteriološkom i mikološkom pretragom ejakulata

Ako u njemu nađemo mnogo klica, osobito ako se radi o Cb. pyogenes, Ps. aeruginosa, E. coli, hemolitičkim stafilokokima i streptokokima, te nekim vrstama gljivica, ejakulate odbacujemo

Ako se takav nalaz više puta ponavlja, morat ćemo rasplodnjaka isključiti iz eksploatacije

11

MAKROSKOPSKA OCJENA EJAKULATA

Svrha makroskopske ocjene ejakulata je da ustanovimo prikladnost za razrjeđivanje i konzerviranje, te umjetno osjemenjivanje

Primjenjujući niz fizikalnih, kemijskih i biokemijskih ocjena ejakulata, dobivamo uvid u njegovu kvalitetu koja nam jamči da su spermiji sposobni za konzerviranje

12

Da bismo što objektivnije mogli ocijeniti ejakulat, moramo ga neposredno poslije dobivanja zaštititi od štetnih utjecaja (naglih promjena temperature, izravne svijetlosti, hipotonije i hipertonije itd.)

neposredno nakon uzimanja, ejakulat stavljamo u vodenu kupelj zagrijanu na 35-37°C, a spermohvatač začepimo da u njega ne padaju klice i nečistoća iz zraka

13

Neposredno poslije polučivanja, usporedno sa sanitarnom radimo i makroskopsku ocjenu ejakulata

Ona obuhvaća ocjenu:

a) volumena

b) boje

c) konzistencije i

d) mirisa

14

prosječni volumen ejakulata kod rasplodnjaka sljedeći:

bik - 5-7 mL

ovan i jarac - 1 mL

pastuh - 30 mL

nerast - 250 mL

pas - 1-50 mL (ovisi o pasmini, odnosno veličini)

mačak- 0,01-0,12 mL

kunić – 0,2- 3 (6) mL

deva- 3,5 mL

15

Osnovna boja ejakulata u svih je životinja podjednaka, a mijenja se u ovisnosti o njegovoj gustoći

Što je ejakulat gušći, boja se mijenja od bijele prema žućkastoj nijansi, a u rijetkih ejakulata nalazimo vodenasto bijelu ili plavičastu boju

Postoje razlike prema vrsti životinja pa je u bika ejakulat slabo žućkastobijel (krem), ovna žućkast ili sivobijel, u nerasta, psa i mačka je fiziološki vodenastobijel, a u pastuha i deve sivobijel. Ejakulat kunića je vodenasto mliječan

16

Miris ejakulata specifičan je s obzirom na vrstu životinje

Ako ejakulat ima miris na mokraću, trulež ili kakav drugi neugodni miris treba ga odbaciti

17

Konzistenciju ejakulata možemo približno ocijeniti

fiziološka konzistencija ejakulata bika, ovna, jarca odgovara konzistenciji vrhnja, dok je ejakulat deve želatinozan

U nerasta i pastuha, osim ako se uzima frakcionirano, ejakulat ima konzistenciju mlijeka.

18

Neposredno poslije makroskopske ocjene treba odrediti i ocjenu pH ejakulata

Vrijednost pH utvrđujemo indikator papirom ili pomoću tekućine univerzalnog indikatora koji, pomiješan sa spermijima, mijenja boju, ovisno o stupnju pH

19

Fiziološke vrijednosti za pH ejakulata rasplodnjaka su:

bik - 6,2-6,8

ovan i jarac - 6,2-7,0

pastuh – 7,2-7,7

nerast - 6,4-7,4

pas - 6,0-7,0

mačak- 6,9-7,4

kunić - 6,6-7,5

deva – 7,2- 7,8

20

MIKROSKOPSKA OCJENA SPERMIJA

Ocjenjuje se pokretljivost ili motilitet (povezano s plodnošću)

Prije ocjenjivanja spermu potrebno zagrijati tako da ju stavimo na predmetnicu koja je prethodno zagrijana na 35-40°C (spermoterm, bioterm, plamen upaljača, trljanje rukama)

21

Kap sperme na sredinu predmetnice, pokriti pokrovnim stakalcem i promatrati prvo pod malim a zatim pod velikim povećanjem

Kretanje spermija:

Progresivno (pravocrtno naprijed)

Manježno ili kružno (vrte se u krug)

Retrogradno (rep im prebačen preko vrata pa se gibaju u smjeru suprotnom od glave)

nepomični

22

Nepomični i spemiji koji se ne gibaju progresivno naprijed se smatraju nesposobnima za oplodnju

OCJENA POKRETLJIVOSTI (izbrojati 10 spermija u nekoliko vidnih polja i odrediti aritmetičku sredinu te postotak):

5- >90% spermija progresivno pokretljivo

4- do 80% spermija progresivno pokretljivo




23

Stupanj progresivnog motiliteta prema Zavosu:

0- nema gibanja

1- oscilirajuće pokretanje na mjestu (treperenje)

2- sporo gibanje s neodređenim smjerom

3- sporo progresivno gibanje

4- brzo progresivno gibanje

24

bik: min 80% (ocjena 4)

nerast: 70 % (ocjena 3,5)

pastuh: 50%

Kod ocjenjivanja ejakulata preživača i guste frakcije nerasta- masovno gibanje spermija u obliku valova:Vihorenje 4+ (++++)

Jako valovito gibanje 3+ (+++)

Valovito gibanje 2+ (++)

Slabo valovito +

Nema masovnog ali se ipak pokreću ± (+,-)

Mirovanje -

25

Od oka ocjena i koncentracije, tj gustoće spermija:

Spema densum (G)- u vidnom polju ejakulata bika ima toliko spermija da između njih ne može stati glava po širini, >800 milijuna/mL;

Sperma semidensum (SG)- međuprostori dovoljno široki da stane glava, 500-800 milijuna/mL;

Sperma rarum (R)- još veći razmaci, <500 milijuna/mL

Objektivno mjerenje- objektivne metode i specijalni pribor ili aparati- CASA (computer assisted sperm analyser)

26

OCJENA KONCENTRACIJE SPERMIJA U EJAKULATU

Komorica po Thoma-i (16 velikih kvadrata od

kojih svaki ima po još 16 manjih); spermiji se broje u 4 velika kvadrata dijagonalno odozgo prema dolje i u petom koji je u suprotnom lijevom ili desnom uglu

Prije brojanja potrebno razrijediti spermu pomoću melanžera (eritrocitni za preživače a leukocitni za nerasta, pastuha i psa)

27

Eritrocitni: ovan i jarac do oznake 0,5 a bik do oznake 1, zatim NaCl do 101 (razrjeđenje za bika 100, a za ovna i jarca 200 puta)

Leukocitni: spermu navući do oznake 0,5 a NaCl do 11 (razrjeđenje 20 puta)

Mućkati 1-2 min (minimalno 50 puta)

Prvih par kapi izbacimo a 5. kapnemo na rub pokrovnice koju smo pritisli uz komoricu za brojenje

28

Broje se samo spermiji kojima se glave drže desnog i gornjeg ili lijevog i donjeg rube mrežice te sve spermije kojima su glave u velikom kvadratu, kao i same glave bez repova

K= n x D x 50 (u 1mm3; x 1000= 1u mL)

K- koncentracija

N- zbroj spermija u 5 kvadrata

D- stupanj razrjeđenja

29

Broj spermija domaćih životinja u 1mL:

Bik: 300 milijuna- 2 milijarde

Ovan i jarac: 2-5 milijardi

Pastuh: 0,1-0,3 milijarde

Nerast: 0,025- 0,3 milijarde

Pas: 0,004 -0,400 milijardi (prosjek 0,125)

Mačak: 0,5-2,2 milijarde

Kunić: 0,1- 3 milijarde

Deva: 0,140- 0,760 milijardi

30

OCJENA INTEGRITETA STANIČNE MEMBRANE SPERMIJA

Ocjena rezistencije spermija

Rezistencija na temperaturni šok

Ocjena strukturalnog integriteta:

Supravitalno bojenje po Bloomu

Flourescentna bojanja

31

OCJENA INTEGRITETA STANIČNE MEMBRANE SPERMIJA

Ocjena funkcionalnog integriteta (aktivnosti):

HOS test (hypoosmotic swelling)

32

SUPRAVITALNO BOJENJE SPERMIJA

Određivanje % živih i mrtvih spermija u svježem ilirazrjeđenom ejakulatu

Metoda po Bloomu: kroz ovojnicu mrtvog spermijaprolazi crvena boja eozin, a kroz ovojnicu živog neprolazi

5% vodena otopina eozina i 10% vodena otopinanigrozina

Razmaz (predmetnica s brušenim rubom)

Ocjena razmaza na fazno kontrastnom mikroskopu(1000X)

U svakom vidnom polju brojimo bijele i crvene (do

33

SUPRAVITALNO BOJENJE SPERMIJA

Određivanje % živih i mrtvih spermija u svježem ilirazrjeđenom ejakulatu

Teratološki oblici (više glava, više repovadeformacije repova)

Postotak nezrelih spermija (protoplazmatskakapljica) – u ejakulatu preživača i psa do 2%, a unerasta i pastuha do 10%

34

OCJENA REZISTENCIJE SPERMIJA (R)

Lipoproteinska ovojnica (dozrijevanje u epididimisu)

Ioni klora uzrokuju bubrenje te zatim i destrukcijulipoproteinske ovojnice spermija

Rezistencija spermija (R) – pokazatelj otpornostispermija prema 1% otopini NaCl

Izražavamo je brojem ml 1% otopine NaCl koju trebadodati određenoj količini svježe uzete sperme da biprestalo progresivno pokretanje spermija

35


Götzeova metoda:

1% NaCl zagrijan na 30 do 35°C

Sprema preživača: razrjeđenje 1 : 10 000

Sperma nerasta i pastuha: razrjeđenje 1 : 1 000

Svakih 5 min uzima se kap razrijeđene spreme igleda ima li progresivno pokretljivih spermija

R izražavamo u minutama

36


Preživači:

Vrlo dobra: R = 80 min

Dobra: R = 45 min

Loša: R = 15 min

Pastuh:

Vrlo dobra: R = 60 min

Dobra: R = 35 min

Loša: R = 10 min

37

HOS test

Ocjena funkcionalnog integriteta (aktivnosti) staničnemembrane:

Održavanje metabolizma

Nesmetano odvijanje kapacitacije i akrosomskereakcije

Vezanje spermija i njegova penetracija kroz jajnustanicu

Osmotski šok DS/odmrznutog sjemena: izlaganjespermija izotoničnim uvjetima nakon hipertonije(dodavanje glicerola)

Dovodi do smanjene vitalnosti i oštećenja stanične

38

HOS test

Promjene na spermijima nakon izlaganjahipoosmotskoj otopini mogu se koristiti zapredviđanje kvalitete sperme

Hipoostmotska otopina – molekule vode prelaze ustanicu kroz staničnu membranu

Funkcionalno intaktna membrana nabubri počevši odvlakana repa spermija (fazno-kontrasni mikroskop)

Intaktna membrana - nabubreni spermiji: HOS+

Oštećena membrana – neuvrnuti rep: HOS-

39

HOS test

Hipoostmotska otopina: fruktoza i Na-citratu destiliranoj vodi, osmolarnost 100mOsm/kg

Broji se najmanje 200 spermija – 5 skupinaTip A – maksimalno bubrenje

Tip B i C – srednji stadij

Tip D – početni stadij bubrenja

Tip E – neakstivni, nenabubreni spermiji

40

OCJENA STATUSA AKROSOME SPERMIJA

Nakon otapanja DS sjemena sposobnostsperme da oplodi jajnu stanicu ovisi o brojuživih spermija s intaktnim akrosomima udozi.

Ocjena akrosome (oštar apikalni rub) nakonbojenja:

Test dvostukog bojenja Tripansko modrilo –Giemsa

Fast green FCF/Eozin B

Eozin B – Anilinsko modrilo

Testovi lektinskog bojenja (florecsentnimarkeri)

41

OCJENA STATUSA AKROSOME SPERMIJA

Lažna akrosomska reakcija javlja se kodmrtvih spermija

Neophodno je odrediti postotak živihspermija

42

MORFOLOŠKA OCJENA SPERMIJA

Primarni patološki oblici – rezultatporemećaja za vrijeme spermiogeneze(defekti spojnog dijela, patuljasti spermiji,spermiji s više glava ili repova)

Sekundarni patološki oblici – nastaju uepididimisu ili kasnije (otpale glave, kape,repovi...)

43


Abnormalnosti spermija prema mjestunastanka:

Glave: premala, prevelika, kruškolika, uska,deformirana

Kape: granulirana, kosa, otpala, deformirana,

Vrata: prelomljen, nema glave, zakržljali spermij

Spojnog dijela: tanak, kratak, debeo, spiralnozavijen, deformiran, prelomljen, presavijen

Repa: prebačen u petlju, zavrnuti, smotan okoglave, rudimentaran

44


Teratomni oblici spermija: višestruke glave irepovi, samo repovi, višestruki repovi,razvojni stadiji (spermatociti, spermatide)

Morfološka ocjena i određivanje postotka živihspermija

45


Tuš-preparati (nigrozinski preparati)

Fiksacija i bojanje preparata spermijaMetoda po Blumenscheinu (kongorot i

viktorijablau)

Metoda po Karrasu (metakromgelb i viktorijskomodrilo)

Kompjuterska obrada ejakulata (CASA =Computer Aided Sperm Analysis)

46


Dopušteni postotak patoloških oblika spermija:

Bik: 18%

Ovan i jarac: 14%

Pastuh: 25%

Nerast: 20%

Documents

OCJENE EJAKULATA I SPERMIJA - porodnistvo.vef.unizg.hrporodnistvo.vef.unizg.hr/wp-content/uploads/2011/04/ocjena... · Ocjenjuje se pokretljivost ili motilitet (povezano s plodnošću)