Сравнительная геномика штаммов Bifidobacterium longum, выделенных из

кишечника человека

Чаплин А. В.

Научные руководители:д. м. н., профессор Ефимов. Б. А.

к. м. н. Смеянов В. В.

Москва, 2013 г.

Российский Национальный Исследовательский Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова

Кафедра микробиологии и вирусологии

Изменчивость бактериального генома

• Основные движущие силы изменения генома бактерий:

– Изменение существующих генов с помощью мутаций.

– Появление генов с помощью дупликации с дивергенцией.

– Потеря генов из-за делеций или превращения в псевдогены.

– Горизонтальный перенос генов между бактериями.

• Горизонтальный перенос генов может происходить между сколь угодно далекими организмами, однако с наибольшей частотой он протекает внутри вида.

• Он может приводить как к изменению последовательностей имеющихся генов, так и к приобретению новых.

Пути горизонтального переноса генов

Трансформация Трансдукция Агенты переноса генов

Конъюгация Мембранные нанотрубки

Мембранные везикулы

Частота горизонтального переноса генов среди

разных бактерий варьирует более чем в 1000 раз.

Bifidobacterium longum

• Представители рода Bifidobacterium – грам-положительные облигатно анаэробные неподвижные палочки.

• Составляют основную часть кишечной микрофлоры детей и около 3-6% микрофлоры взрослых.

• Специализируются на сбраживании широкого спектра олигосахаридов растительного и животного происхождения.

• Вид Bifidobacterium longum широко распространен среди людей:

– Подвид infantis встречается только у грудных детей.

– Подвид longum обнаруживается во всех возрастах.

Данные бактерии широко используются в составе пробиотиков.

Секвенирование геномных последовательностей

• В данном исследовании была просеквенирована de novo геномная ДНК 7 штаммов Bifidobacterium longum, выделенных от двух здоровых детей.

Название штамма Платформа Число контигов Источник выделения1-5B Illumina HiSeq 29 Обследуемая А, возраст 1 год1-6B 454 FLX 171 Обследуемая А, возраст 1 год44B Illumina HiSeq 54 Обследуемая А, возраст 6 лет

17-1B Illumina HiSeq 24 Обследуемая А, возраст 11 лет2-2B 454 FLX 141 Обследуемая Б, возраст 1 год35B 454 FLX 131 Обследуемая Б, возраст 6 лет7-1B Illumina HiSeq 40 Обследуемая Б, возраст 11 лет

Геномика Bifidobacterium longum

Название штамма Число контиговDJO10A 1

NCC2705 1157F 1

ATCC 15697 1BBMN68 1

JCM 1217T 1JDM301 1

KACC 91563 1F8 scaffold

CCUG 52486 22AGR2137 49

12_1_47_BFAA 61ATCC 55813 114

Другие геномные последовательности, использованные для анализа

2.2000000000000002 2.4 2.6 2.80

5

10

Размер генома, Mb

Коли

чест

во ге

ном

ов

59.559.7

59.960.1

60.301234567

Доля GC-пар, %

Коли

чест

во ге

ном

ов

Методы анализа

• Все геномные последовательности аннотировались с помощью системы RAST.

• Полногеномное выравнивание выполнялось в Mauve 2.2.1.

• Филогенетический анализ проводился в программе ClonalFrame 1.1 со 100 000 итерациями MCMC.

• Гомологичные гены из разных штаммов были кластеризованы в группы генов с использованием OrthoMCL 2.0.5.

• Функциональная аннотация генов проводилась по базе данных COG.

• Филогенетический анализ, основанный на присутствии или отсутствии умеренно распространенных генов проводился по алгоритму “Wagner parsimony” с использованием пакета PHYLIP 3.69.

Полногеномное выравнивание

ATCC 15697

JDM301

157F

BBMN68

DJO10A

JCM 1217T

KACC 91563

NCC2705

Набор генов «домашнего хозяйства»

• Для построения филогенетического дерева с учётом горизонтального переноса генов был использован набор из 45 генов «домашнего хозяйства», удаленных друг от друга не менее чем на 10 kb.

B. longumsubsp. longum

JCM 1217T

Филогенетическое дерево

B. longumsubsp. longum

B. longumsubsp. infantis

JDM301AGR2137

ATCC 15697

NCC2705KACC 91563

CCUG 52486

DJO10A12_1_47BFAA

ATCC 55813

BBMN68F8

157F

7-1B2-2B

1-6B44B

35B

1-5BJCM1217T

17-1B

Изменения генов горизонтальным переносом

Параметр Значение95% доверительный

интервал

0,090 0,071 – 0,114

1,06 0,83 – 1,310

Частота горизонтальных переносов

Частота точковых мутаций

Вероятность, что отдельный нуклеотид будет изменен горизонтальным переносом

Вероятность точковой мутации

• Вклад горизонтального переноса генов в изменчивость последовательности генов «домашнего хозяйства» сравним со вкладом точковых мутаций.

• Нет значимых барьеров между подвидами longum и infantis.

ρ

θ

r

m

Сравнение с другими бактериальными видами

Leptospira interrogans Bifidoabcterium longum Streptococcus pneumoniae0,01

0,1

1

10

100

r

m

Консервативнаячасть генома

Концепция распределенного генома

Геном отдельного

штамма

Пан-геном(совокупность всех генов

бактериального вида).

Часто он значительнобольше отдельного

генома.

Распределенный геном Bifidobacterium longum

Пан-геном Консервативная часть генома

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Число штаммов

Числ

о гр

упп

гено

в

Математическая характеристика пан-генома

0 5 10 15 20 250

1000

2000

3000

4000

5000

f(x) = 2001,75 x^0,28R² = 1

Число штаммов

Числ

о гр

упп

гено

в

1 10 1001024

10240

f(x) = 2001,75 x^0,28R² = 1

Число штаммов

Числ

о гр

упп

гено

в

0 5 10 15 20 250

100

200

300

400

f(x) = 429,15 x^-0,6R² = 0,99

Число штаммов

Прир

ост г

рупп

гено

в

1 10 10032

320

3200

f(x) = 429,15 x^-0,6R² = 0,99

Число штаммов

При

рост

груп

п ге

нов

-1.2

-1.075

0000

00000

0004

-0.95

0000

0000

0000

062

-0.825

0000

0000

0000

62

-0.700

0000

0000

0000

62

-0.575

000000

00000

062

-0.45

0000

0000

0000

018

-0.325

0000

0000

0000

340

50

100

150

Коэффициент степенной функции прироста числа групп генов

Числ

о ре

зуль

тато

в пр

и пр

оцед

уре

Jack

nife

Закрытыйпан-геном

Открытыйпан-геном

Математическая характеристика пан-генома

0 5 10 15 20 250

100

200

300

400

f(x) = 429,15 x^-0,6R² = 0,99

Число штаммов

Прир

ост г

рупп

гено

в

1 10 10032

320

3200

f(x) = 429,15 x^-0,6R² = 0,99

Число штаммов

При

рост

груп

п ге

нов

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Количество штаммов, в которых присутствуют данные группы генов

Коли

чест

во гр

упп

гено

в

Редко встречающиеся гены Консервативные гены

Умеренно распространенные гены

Метаболизм аминокислот

Метаболизм нуклеотидов

Трансляция

Посттрансляционная модификация, фолдинг

Метаболизм углеводов

Транскрипция

Репликациярекомбинация и

репарация

Защитные механизмы

Распределение умеренно распространенных генов

Выводы

• Горизонтальный перенос генов играет значительную роль в формировании геномного разнообразия Bifidobacterium longum.

• Влияние горизонтального переноса генов на последовательность генов «домашнего хозяйства» сопоставимо с влиянием точковых мутаций.

• Пан-геном Bifidobacterium longum является открытым, его состав отражает специализацию на сбраживании широкого спектра углеводов.

• Показана возможность долговременной персистенции представителей узкой внутривидовой группы штаммов Bifidobacterium longum в микрофлоре кишечника человека.

Спасибо за внимание!