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밝은빛 이용 우수 연구논문

다세포 생물의 생존에 있어서 세포사멸은 중요한 역

할을 한다. APIP (Apaf-1 interaction protein)는 저산소

증, 국소빈혈과 세포독성약물에 의해 유도되는 세포자살

을 억제하는 것이 보여진 바 있다. 저산소증, 국소빈혈과

세포독성약물에 의해서는 caspase-9에 의한 미토콘드

리아 경유의 세포사멸이 유도된다. 최근에 APIP는 살모

넬라 감염에 의해 발생되는 세포죽음인 pyroptosis도 억

제한다는 사실이 보고되었다. 박테리아 염증에 의한 세

포죽음은 caspase-1을 경유하는 과정이다. 또한 APIP의

돌연변이체가 전신성 염증 반응 증후군을 겪는 환자에서

발견되었다.

APIP는 세포죽음 억제 활성 외에 메티오닌 재생

과정을 구성하는 효소의 하나인 MtnB 효소 활성

을 갖소 있다. 사람의 APIP는 바실러스균과 효모의

5-methylthioribulose-1-phosphate dehydratase (MtnB)

와 아미노산 서열이 23-26% 일치한다. 메티오닌 재생과정

은 6가지 효소에 의해 MTA (5-Methylthioadenosine)을 메

티오닌으로 변환하는 과정이다. MtnB는 그 중 세 번째 효소

로서 MTRu-1-P (5-methylthioribulose-1-phosphate)

를 탈수반응을 통해서 DK-MTP-1-P (2,3-diketo-5-

methylthiopentyl-1-phosphate)로 변환한다. APIP의 발

현이 없다면 메티오닌이 부족할 때 MTA를 넣어주더라

도 세포가 성장할 수 없다. 이러한 연구결과들은 APIP가

MtnB 효소라는 것을 입증하고 있다.

메티오닌 재생과정은 박테리아부터 동식물에 이르기

까지 모든 생물종이 갖고 있다. 이 재생과정은 폴리아

민 합성의 부산물인 MTA의 재사용에 있어서 중요한 역

할을 하는데, 특히 MTA가 갖고 있는 황(sulfur)의 재

생과정으로 볼 수 있다. 또한 메티오닌 재생과정은 사

람의 대사과정에 있어서도 중요한 의의가 있는데, 이

는 메티오닌이 필수아미노산 중 하나로서 반드시 섭취

해야 하는 영양소이기 때문이다. 최근에 메티오닌 재생

과정은 세포죽음과 염증질환에 관련된 질병치료와 관련

하여 의학적인 관심을 받고 있다. MTA와 2-keto-4-

methylthiobutyrate (KMTB)는 세포자살을 유도하는 효

과를 가지고 있으며, MTA는 박테리아에 의한 염증반응

에 있어서 caspase-1을 경유하는 세포자살을 유도하기

때문이다. 또한 5-methylthioadenosine phosphorylase

(MTAP, 메티오닌 재생과정의 첫 번재 효소)는 다양한

종양의 억제자 (tumor suppressor)이다. Acireducton

dioxygenase 1 (ADI1 또는 MtnD, 메티오닌 재생과정

의 다섯 번째 효소)는 전립선 암의 억제자이다. 최근에

APIP는 구강이나 후두의 편평상피암에서 과발현 되어

있으며, 비소세포성폐암 에서는 적게 발현되어 있다는

사실이 보고되었다. 또한 APIP는 전신성 염증반응 증후

군과 같이 caspase-1을 경유하는 pyroptosis 및 염증반

응에 관련되어 있다.

이번 연구에서는 APIP의 결정구조를 2.0Å의 고해상

도로 분석하였고 MtnB 효소로서의 구조적 및 행화학적

특성들을 규명하였다. 또한 삼차원 구조 분석 정보에 기

반하여 제작한 효소활성 자리 돌연변이체들의 MtnB 효

소 활성과 세포죽음 억제 활성을 각각 측정함으로써 이

두 가지 활성 사이의 연관성을 조사하였다. 본 연구 결

과는 2014년 1월 PNAS (Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA)에 발표하였다.

세포죽음 억제 단백질 APIP의 고해상도 구조 및 MtnB 효소로서의 생화학적/구조적 특성 규명

MX분과

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VOL.21/NO.3/Autumn 2014밝은빛 이용 우수 연구논문

1. 메티오닌 재생과정의 MtnB 효소 활성을 갖는 APIP

APIP의 MtnB 효소활성을 재조합 단백질 샘플을 이용

하여 in vitro 실험을 통해 측정하였다 [그림 1]. APIP의

기질인 MTRu-1-P은 MTR-1-P (Methylthioribose-1-

phosphate) 와 MtnA 효소 (메티오닌 재생과정에서 MtnB

효소의 직전 반응효소) 에 의해 공급하였고, 그 농도는

MTR-1-P와 MTRu-1-P의 평형상수에 의해 계산하였다.

일곱 가지 서로 다른 기질농도에서 초기반응 속도를 측

정하여 미카엘리스-멘텐 속도론 분석을 통해 최대속도

Vmax (1.39μmol min-1)와 Km (9.32μM) 값을 결정하였다.

이로써 기존에 세포 내 유전자 조작 실험 등을 통해 보여

진 바 있는 APIP의 MtnB 활성을 전통적인 생화학적 효소

활성 평가를 통해 확증하였다.

2. APIP의 전체 구조와 활성자리 구조의 특징 및 촉매

메커니즘

APIP의 결정구조는 2.0Å의 해상도로 해석하였다.

결정격자의 비대칭 단위 안에서 APIP는 C4 대칭성을

갖는 4량체를 형성한다. SEC-MALS(Size exclusion

chromatography-multiangle-light scattering)실험을

통해 용액상에서도 4량체로 존재한다는 것을 확인하였

다 [그림 2]. 각각의 단량체는 활성자리에 아연을 갖고

있는데, 3개의 히스티딘 잔기와 3개의 물 분자가 배위되

어 있다.

그림 1. 메티오닌재생과정의MtnB효소로서의 APIP. (A)

MtnB활성에대한Michaelis-Mentenkinetics분석. (B)사람

과Saccharomycescerevisiae의메티오닌재생과정. (점선은B.subtilis의경우)

그림2.APIP/MtnB의삼차원구조.(A)MonomericAPIP구조.아연이온은회색공으로표시.(B)결정격자안비대칭단위에서사량체를구

성하고있는APIP.(C)SEC-MALS결과

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Docking simulation을 통해 얻어진 기질 결합 구조와 위

에서 분석한 결정구조를 비교하여 효소반응 메커니즘을

제안하였다 [그림 3]. 이 메커니즘에서는 이웃 subunit의

Glu139*가 catalytic acid/base의 핵심적 역할을 하는 것이

가장 중요한 특징이다 (이웃 subunit의 잔기를 별표*로 표

시). 첫 번째 반응단계에서 Glu139*가 MTRu-1-P의 C3위

치에 있는 수소를 제거한다. 이어서 C4위치의 수산화 이온

이 제거되어 enol form을 형성한다. 제거된 수산화 이온은

아연과 배위결합을 하게 된다. 두 번째 반응은 열역학적으

로 자연스럽게 이루어지는 enol-keto tautomerization이다.

이 반응으로 di-keto 생성물인 DK-MTP-1-P가 생성된다.

세 번째 반응으로 Glu139*가 수산화 이온에게 수소를 제공

하며, DK-MTP-1-P가 활성자리 밖으로 나오게 된다. 이

와 함께 물 분자가 다시 활성부위로 들어가게 되면 결정구

조에서 관찰된 상태와 같이 아연에 3개의 히스티딘 잔기와

3개의 물 분자가 배위를 하여 팔면체 배위구조를 갖게 된

다. Glu139 돌연변이체는 in vitro 활성실험을 통해 MtnB

활성이 거의 사라졌다는 것을 확인하였다 [그림 3].

3. 세포죽음 억제 활성과 MtnB 효소 활성 사이의 상관

관계

APIP의 MtnB 효소 활성자리 돌연변이체 네 가지

(Q96A, C97A, E139A, H115A)에 대해 두 가지 세포죽음

(세포자살 & pyroptosis)의 억제 정도를 평가하였다. Cas

pase-1을 경유하는 pyroptosis의 경우, MtnB 효소 활성

이 감소하는 정도를 따라 각각의 pyroptosis 억제 활성도

감소하였다. 하지만 caspase-9을 경유하는 세포자살의

경우에는 저산소 조건과 etoposide 처리에 의한 세포자살

모두 MtnB 효소 활성과 연관성을 보이지 않았다. 이전

연구에서 APIP의 발현이 적을 때 MTA를 넣어준다면 세

포사멸이 증가된다고 하였다. 이 사실은 APIP에 의한 cas

pase-1을 경유하는 pyroptosis의 억제는 MTA에 의해 조

절된다는 것을 의미한다. 앞서 우리 실험에서 APIP 활성

자리 돌연변이체가 왜 pyroptosis을 저해하지 못했는지

설명할 수 있게 된다. 돌연변이체는 메티오닌 재생과정이

순환되지 못하여 MTA가 축적되어 세포사멸이 저해되지

못한 것이다. 또한 염증유발상태에서는 백혈구의 급증과

그림3.활성부위구조와효소반응메커니즘.(A)결정구조분석으로확인한활성부위의삼차원구조.(B),(C)기질결합상태의insilicodocking예측구조.(D)활성자리돌연변이체의MtnB효소활성.(E)MtnB효소반응메커니즘

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급성기단백질이나 폴리아민의 합성에 필수적인 메티오닌

의 수요가 급격하게 증가하게 된다. 이러한 수요는 세포

사멸과 MTA의 상관관계를 설명한다.

4. APIP의 구조 및 기능연구의 의의

메티오닌 재생과정에 참여하는 효소 중 하나인 APIP의

MtnB 활성을 확인하고 그 고해상도 삼차원 구조를 규명

하였다. 그리고, 그 효소활성과 세포죽음 억제 활성과의

연관성을 조사하였다. 연구결과는 앞으로 APIP가 어떻게

세포죽음과 염증반응을 조절하는지에 대한 메커니즘을

이해하고 관련 질병의 발생과정을 연구하는데 기초자료

로 활용될 수 있을 것이다.

참고문헌

Kang W, Hong SH, Lee HM, Kim NY, Lim YC, Le le TM, Lim B, Kim HC, Kim TY, Ashida H, Yokoya A, Hah SS, Chun KH, Jung YK, Yang JK (2014) Structural and biochemical basis for the inhibition of cell death by APIP, a methionine salvage enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 111(1), E54-61Ko DN, Gamazon ER, Shukla KP, Pfuetzner RA, Whittington D, Holden TD, Brittnacher MJ, Fong C, Radey M, Ogohara C, Stark AL, Akey JM, Dolan ME, Wurfel MM, Miller SI. (2012) Functional genetic screen of human diversity reveals that a methionine salvage enzyme regulates inflammatory cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109(35), E2343-52

그림4.APIP의세포죽음저해활성.(A)Caspase-1에의해유도된pyroptosis.(B)저산소증에의해유도된세포자살.(C)세포독성물질

etoposide처리에의해유도된세포자살

―저 자 약 력

양진국 교수는 서울대학교 화학과에서 박

사학위를 받고 미국 코넬의대에서의 박사

후연구원 과정을 거쳐 2006년부터 숭실

대학교 화학과에 재직 중이다.

jinkukyang@ssu.ac.kr

강원철은 현재 숭실대학교 화학과 박사과정

학생이다. wonchullk@ssu.ac.kr