제조은나노 물질에 대한 유해성 연구webbook.me.go.kr/DLi-File/NIER/06/001/5256594.pdfⅡ. 연구내용 및 방법 6) * B

발 간등 록 번호 NIER NO. 2010-49-1224

11-1480523-000271-10

제조은나노 물질에 대한 유해성 연구

환경건강연구부 위해성평가연구과

김수진, 이병천, 이상희, 윤준헌, 이재안, 류태권, Duong N.Cuong, 김경태, 조재구, 이재우, 김지은, 서균백, 최민, 백용욱, 김필제, 김삼권

Study on hazardous properties of manufactured

silver nanoparticles

S.J. Kim, B.C. Lee, S.H. Lee, J.H. Yoon, J.A. Lee, T.K. Ryu,

Duong N.Cuong, K.T. Kim, J.G. Cho, J.W. Lee, J.E. Kim, G.B. Seo,

M. Choi, Y.W. Baek, P.J. Kim, S.C. Kim

Risk Assessment Division

Environmental Health Research Department

National Institute of Environmental Research

2010

목 차❚

i

목 차

목차 ······························································································································· i표목차 ·························································································································· ii그림목차 ····················································································································· iiiAbstract ······················································································································ v

Ⅰ. 서 론 ·····················································································································1

Ⅱ. 연구내용 및 방법 ································································································3

1. 수생태 시험종의 독성시험 ···················································································3

2. 설치류에 대한 경구독성 시험 ·············································································7

3. 흡착·탈착 시험 ········································································································9

4. 생물학적 및 비생물학적 분해 거동 ·································································10

5. OECD 작업반 활동 및 연구동향 ······································································12

Ⅲ. 연구결과 및 고찰 ······························································································13

1. 어류, 물벼룩, 조류, 박테리아에 대한 급만성 독성 ······································13

2. 설치류의 급성, 아급성, 아만성 경구독성시험 ···············································16

3. 토양과 퇴적물에 대한 거동 ···············································································18

4. 생물학적 및 비생물학적 분해 특성 ·································································21

5. OECD 작업반 활동 및 연구동향 ······································································28

Ⅳ. 결 론 ···················································································································31

참 고 문 헌 ················································································································33

부 록 ······················································································································37

목 차❚

ii

표 목 차

<표 1> Acute toxicity on embryo and adult of Oryzias latipes ············13

<표 2> Comparison of toxicity between AgNPs and AgNO3 ···············14

<표 3> Distribution coefficient(Kd) and apparent desorption coefficient

(Kdes) of silver nano particles in soils and sediment ·····················20

<표 4> Mineral medium contents for biotic degradation test ··············38

<표 5> Total length of O. latipes at 14 day upon exposure to different AgNPs

concentrations. Values are presented as mean ± standard deviation ·······38

<표 6> Chronic toxicity test of AgNPs with D. magna ··························38

<표 7> Biomass change of P. subcapitata during the definitive test ·39

<표 8> Average Specific Growth Rate (ASGR) during the definitive test ···40

<표 9> Area under ASGR during the definitive test ······························40

<표 10> Mortality after AgNPs administration in acute oral toxicity test ·····40

<표 11> Body weight change in rat after oral toxicity test ··················41

<표 12> Biochemical serum values in SD rats after oral administrated

AgNPs for 28 days ·············································································42

<표 13> Biochemical serum values in SD rats after oral administrated

AgNPs for 90 days ·············································································43

<표 14> Physicochemical property of soil samples for adsorption and

desorption test ·······················································································44

<표 15> The volume and concentration of AgNPs and mass of quarts sand, soils and

sediment sample for adsorption and desorption test ····································45

<표 16> Definitions and units of symbols for adsorption equation ·· 46

<표 17> Freundlich adsorption coefficient, regression constant, correlation coefficient ·· 47

<표 18> Freundlich desorption coefficient, regression constant, correlation coefficient ·· 47

<표 19> Abiotic degradation of AgNPs with salts ···································48

<표 20> Abiotic degradation of AgNPs with NOMs ·······························48

목 차❚

iii

그 림 목 차

<그림 1> Experiment procedure for Acute oral toxicity test ··················8

<그림 2> Concentration of Ag ion with exposure time of A(left) and B(right) filter ···25

<그림 3> TEM image of microorganisms exposed to AgNPs ··············27

<그림 4> Sampling sites of soil and sediment for Adsoprtion and Desorption test ··49

<그림 5> Hatching rate of O. latipes embryos/larvae at 14 day upon

exposure to different concentrations of AgNPs ······························49

<그림 6> Heart beat of O. latipes embryos at 3, 5 and 7 day upon exposure to

0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 and 1 mg/L AgNPs ·········································50

<그림 7> Fecundity of D. magna exposed to AgNPs for 21 days.

mean±standard deviation ·································································50

<그림 8> Growth of D. magna exposed to AgNPs for 21 days.

mean±standard deviation ·································································51

<그림 9> Growth rate of P. subcapitata test ··············································51

<그림 10> Changed growth rate for exposure time during the definitive test ·····52

<그림 11> Inhibition curve of vibrio fischeri at 15 min and 30 min ·····52

<그림 12> GPT values in SD rats after oral administrated AgNPs for 28 days ··· 53

<그림 13> TG values in SD rats after oral administrated AgNPs for 90 days ···· 54

<그림 14> T-BIL values in SD rats after oral administrated AgNPs for 90 days ···· 55

<그림 15> SEM-EDS analysis of Soil #1 ·······················································56

<그림 16> Adsorption test for soil/sediment sample as function of time ····56

<그림 17> Adsorption percentage of AgNPs ···················································57

<그림 18> Adsorbed concentration(left) and mass(right) of AgNPs as

function of initial AgNPs concentration ··································58

<그림 19> Desorption percentage of AgNPs ···············································59

<그림 20> Desorbed Ag mass as function of initial AgNPs concentration ····60

<그림 21> Dark field(left) and bright field(right) image of Soil ·········61

<그림 22> Linearized Freundlich adsorption plot ·····································62

목 차❚

iv

<그림 23> Linearized Freundlich desorption plot ·····································62

<그림 24> AgNPs in DW(left) and culture medium(right) ····················63

<그림 25> Ag species in mineral medium (10 mg/L of Ag ion) ······63

<그림 26> Microbial inactivation by AgNPs ···············································64

<그림 27> Ag ion concentration in the presence of microorganisms ······64

<그림 28> Biodegradation concentration of 10 mg/L AgNPs ··············65

<그림 29> Biodegradation percentage of 10 mg/L AgNPs ···················65

<그림 30> UV/vis spectra of AgNPs with concentration of salts ······66

<그림 31> Concentration of Ag ion with exposure time of NaCl(left)

and MgCl2(right) ··············································································67

<그림 32> Concentration of Ag ion with exposure time of humic acid

(left) and fulvic acid(right) ···························································67

<그림 33> Image of AgNPs solution with exposure time of light ···· 67

<그림 34> UV/vis spectra of AgNPs with exposure time of light >400 nm(left)

and >300 nm(right) ················································································68

<그림 35> Abiotic degradation of AgNPs in the presence of light ··· 68

<그림 36> Bioaccumulation of AgNPs ···························································69

<그림 37> Bioaccumulation concentration and percentage of AgNPs ········69

<그림 38> Size distribution of AgNPs in microorganism ······················70

<그림 39> AgNP numbers uptaken by microorganism ···························70

Abstract❚

v

Abstract

The study was conducted to investigate (a) the aquatic toxicity on

waterflea, medaka embryo and algae; (b) to acute, subacute and subchronic

oral toxicity to rats; (c) the environmental fate of silver nanoparticles (AgNP,

citrate capped, colloid, <20 nm).

The lethal concentrations (LC50) were 2.4 μg/L and 0.33 mg/L on waterflea

(Daphnia magna(21 days)) and the embryos Japanese medaka (Oryzias latipes)

respectively.

The acute, 28 and 90 days repeated dose oral toxicity tests on AgNP

was conducted with SD rats in accordance with OECD TG 423, 406 and

407 respectively. The LD50 (14 days) is found to be >2000 mg/kg bw. The

exposure to AgNPs for 28 days or 90 days induced minimal changes in

the blood chemistry.

AgNPs were found to be attached or accumulated in the

microorganisms. All abiotic factors induced instability of AgNPs,

suggesting that the toxicity of AgNPs might be reduced by the abiotic

factors. It is noted that the interaction between AgNPs and soil or

sediment contents should be considered more important rather than the

absolute quantity of AgNPs adsorption or desorption.

OECD WPMN modified the list of representative nanomaterials with

Ag, MWCNT, SWCNT, fullerene, TiO2, SiO2, ZnO, Al2O3, CeO, Fe,

dendrimer, nanoclay, gold and postponed assessment of the interim report

for the sponsorship programme.

Ⅰ. 서 론❚

1

Ⅰ. 서 론

나노기술은 정보, 재료소재, 에너지, 환경, 생명공학 등 각종 분야에서 활발히

응용되고 있으며, 특히 최근에는 의약품 관련 분자적 도구로서도 많은 관심을

받고 있다. 이러한 나노기술의 발전에 대응하여 우리나라는 2001년 7월 나노

기술종합발전계획을 수립하여 나노기술개발을 위한 주요 인프라를 구축해오고

있으며 국제적으로 뒤쳐지지 않는 성과를 달성하고 있다. 또한 2005년 12월에

는 제2기 나노기술종합발전계획을 수립하여 나노기술이 의학, 소재, 정보, 생활

용품, 화장품 등으로 실용화 및 산업화가 가속되고 있다.

나노 기술개발이 본격화됨에 따라 나노기술의 사회적 영향문제가 주요한 이슈

로 등장하고, 나노물질의 불확실성과 위험성 논란이 제기되기 시작하면서 인체

및 환경에 대한 유해성 문제는 2000년대 들어 현안으로 대두되었다. 나노물질로

부터 야기되는 나노독성은 입자독성의 한 분야이다. 크기가 나노 수준으로 작

아지면 입자의 표면적은 증가하게 되고 입자의 반응성도 증가하므로 나노물질

의 표면적 등 물리화학적 성질에 대한 개념이 매우 중요하다. 또한 나노물질은

미세한 크기로 인해 피부나 세포막을 쉽게 통과하며 결국 혈관계로 유입되어

전신조직으로 확산될 수 있는 우려를 가지고 있다. 이러한 이유로 나노물질에 대

한 건강 및 생태계 위해성이 제기되었으며, 나노물질의 잠재적 위해성이 최근

독성학 분야의 새로운 논의주제로 떠오르게 되었다(국립환경과학원 2007~2009).

경제협력개발기구(OECD, Organization for Economic Cooperation and

Development)에서는 나노물질의 건강 및 환경의 안전성에 대한 각 국가의 노력

을 조율하고 효율적인 방안을 제시하기 위하여 2006년 화학물질위원회 산하에 "

제조나노물질 작업반(The Working Party on Manufactured Nanomaterials,

WPMN)"을 설치하였다. 2007년 11월에 열린 OECD WPMN회의에서는 안전성시

험 지원사업을 위해 14개 제조나노물질을 선정하여 우선시험항목 선정, 참여국

선정 등에 대하여 합의하였다. 우리나라는 14종 제조나노물질 중 은(Ag)나노,

Ⅰ. 서 론❚

2

이산화티타늄(TiO2), 다층벽탄소나노튜브(MWCNT), 이산화규소(SiO2)의 안전성

평가 사업에 참여하고 있으며, 특히 은나노 물질에 대해서는 미국과 함께 독성자료

생산의 주무국으로 지원사업을 총괄하고 있다. 이에 따라 우리나라는 2011년에

은나노물질의 안전성평가 보고서를 작성하여 OECD에 제출해야 한다. 은나노

입자는 항균, 살균, 탈취 효과를 가져 일상 생활용품에서 다양하게 사용되고

있다. 그러나 현재까지 안전성에 대한 자료는 충분하지 않아, 이를 뒷받침할 수

있는 나노물질의 독성관련 연구 자료의 확보가 필요한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 은나노물질을 대상으로 나노물질의 안전성 자료를

확보하기 위하여 생태독성, 건강영향 및 환경거동 분야에서 OECD 시험법 11

개에 대한 시험을 수행하였으며, 각 시험에 대한 나노물질의 적용성을 검토하

고자 하였다. 생태독성 분야에서는 물벼룩, 어류 등 수생태 서식 생물 4종에

대하여 은나노물질의 급성·만성독성을 평가하였다. 건강영향 분야에서는 설치

류에 대하여 급성경구독성, 28일간 반복투여독성, 90일간 아만성독성 영향을

조사하였다. 환경거동 분야에서는 은나노물질의 생물학적 분해, 비생물학적

분해, 흡착·탈착, 생물축적성에 대한 특성을 조사하였다.

Ⅱ. 연구내용 및 방법❚

3

Ⅱ. 연구내용 및 방법

1. 수생태 시험종의 독성시험

본 연구에서 수행된 수생태 및 포유류에 대한 독성시험의 대상 시험물질은

은나노물질(AgNPs, silver nanoparticles)로서 ABC nanotech(대한민국)에서

구입하여 이용하였다. 은나노물질은 구연산(citrate)으로 기능화(capping)된 물질

로서 평균 입자크기(nominal size)는 12 nm이었다.

가. 어류 독성 시험(1) 급성독성 시험

은나노 시험물질의 조제는 200,000 mg/L인 원액을 증류수를 이용하여 100

mg/L로 희석한 후 각 시험별 요구되는 노출농도는 사육수를 이용하여 제조하였다.

어류 급성독성 시험은 OECD TG 203에 준하여 진행하였으며, 시험종인

송사리(Oryzias latipes)는 수온 25 ± 1 ℃, pH 7.5 ± 0.2, 용존산소 7 ∼ 8 mg/L,

광주기 16(명):8시간(암)의 조건으로 사육하였다. 시험에 사용된 성어는 약 4개

월 된 개체로, 체장 2 ~ 3 cm인 것을 이용하였다. 노출농도는 예비시험을 바탕

으로 0.2, 0.3, 0.45, 0.67, 1.0 mg/L로 설정하였으며, 대조군 및 시험군에 각각 7

개체씩 노출하였다. 시험기간 중 먹이는 공급하지 않았으며, 노출용액은 48시간

마다 전수 교환하였다. 관찰항목으로는 이상반응개체 및 치사개체를 초기 3시간,

6시간에 확인하였으며, 24시간마다 특징을 관찰·기록하였다.

(2) 배아 및 난황단계 치어독성 시험

노출시험은 OECD TG 212에 준하였으며, 송사리의 초기단계에서 은나노

물질을 노출시킨 후, 배아(embryo)시기와 부화 직후의 난황단계치어(sac-fry)에

서 치사영향, 발생장애, 기형 등을 관찰하였다. 시험물질의 노출은 수정란에서

치어의 난황이 완전히 흡수되는 시기까지 실시하였다. 여기서 배아는 수정란이

분열하여 발생 진행부터 부화 직전까지 단계를 말하며, 난황단계 치어(sac-fry)

는 부화된 후 난황이 흡수되기 전까지의 개체를 의미한다(T.L. Metcalfe et al.,


4

2008; C.M. Powers et al., 2010). 사육은 어류 급성독성 시험방법과 동일하며,

수정란 확보를 위해 부화 후 4개월 이상인 외관상 기형이 없는 건강한 암․수개체를 1:1의 비율로 교배하였다.

노출시험에 사용한 수정란은 건강한 송사리 성어로부터 산란된 알 중에서

수집하였으며 수정 후 포배기이전 단계의 개체를 현미경 관찰로 선별하였다.

수정란은 각 처리군 별로 30개를 10 ea/well의 비율로 노출하였다. 노출시점은

수정란에서부터 대조군의 부화 후 난황 흡수가 완료되는 시점까지 설정하였다.

노출 농도는 대조군, 0.1, 0.25, 0.5. 0.75. 1.0 mg/L에서 수행하였다. 본 시험에

서는 14일간 노출하였으며, 48시간마다 노출용액을 교환하였다. 초기 발생과정

에서 시험물질의 영향을 확인하기 위하여 실체현미경(Stemi SV11, Zeiss co.,

Germany)을 이용하여 24시간마다 치사율, 기형 발생율, 부화율을 주요 종말점

으로 측정하였다. 부화율은 난 상태에서 치사한 것과 부화되지 아니한 것을 모두

포함하였다. 치사는 성어의 경우 아가미 호흡이 정지하였거나, 건드려도 반응이

없는 개체를, 배아는 심장박동을 정지한 것을 기준으로 하였다. 치사율은 EPA

에서 제공하는 통계프로그램(probit analysis program, version 1.5)을 이용하여

계산했다.

나. 물벼룩 만성독성 시험수서무척추동물인 물벼룩(Daphnia magna)의 급성노출시험은 OECD TG 202,

만성노출시험은 OECD TG 211에 의거하여 수행하였다. 시험용물벼룩은수온 20 ± 1 ℃,

조도 800 룩스, 용존산소 3 mg/L 이상, 광주기는 16(명):8시간(암)의 조건으로 OECD

TG에서 제시한 방법에 따라 M4 배지에서배양하였다. 먹이로는녹조류인클로렐라를 1

일 1회 충분히공급하였다. 시험에사용한물벼룩은 3회이상어린개체를생산한어미로

부터 얻은 24시간 미만의 어린 개체만을 선별하여 시험에 이용하였다. 급성독성시험은

노출기간 동안 먹이를 공급하지 않았다.

만성독성시험은 21일 노출기간 동안 은나노물질이 물벼룩의 생식능력에 미치는

영향을 평가하는 것이다. 배지는 급성독성시험과 같은 EPA 경수를 사용하였다.

각 농도별로 준비된 시험용액을 유리비커에 50 mL 첨가한 후, 각 용기마다

물벼룩 1마리씩 노출하였으며, 각 농도별로 10개의 반복구를 두어 시험 농도당


5

10마리의 물벼룩을 노출하였다. 급성독성 시험 결과 LC10 4.7 μg/L인 것으로

나타나, 이를 바탕으로 만성독성 시험 농도범위를 설정하여 수행하였다. 나노

물질의 노출농도는 대조군, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0 μg/L로 설정하였다.

시험은 반지수식(semi-static)으로서 2일에 1회 시험용액을 전수 교환하였으며,

먹이는 매일 클로렐라를 5×105 cells/mL의 밀도로 공급하였다. 노출기간에 24

시간마다 개체별로 태어난 개체수를 계수하였다. 모체로부터 태어난 개체는

계수 후 시험용기로부터 즉시 제거하였으며 무영향농도(NOEC, No observed

effect concentration) 및 최소영향농도(LOEC, Lowest observed effect

concentration)는 통계프로그램(Dunnett 1.5)으로 처리하였다.

다. 조류 성장저해 시험조류 성장저해시험은 화학물질, 농약 및 의약품의 수서생물 중 단세포담수조류

의 성장에 대한 영향을 평가하는데 목적이 있다. 조류 성장저해시험의 원리는

지수성장기에 있는 조류를 농도별로 시험물질에 노출시킨 후 일정 조건하에서

배양을 하면서 조류의 성장에 미치는 시험물질의 영향을 평가하는 것이다.

시험에 사용된 조류(Pseudokirchneriella subcapitata)는 23 ± 2℃, 24시간, 6,000

룩스, 100 rpm 조건으로 주 1회 계대 배양하였고 배양액은 OECD TG 201에 제시

된 방법으로 조제하여 사용하였다. 계대배양액으로부터 조류를 채취하여 배양

액에 접종 한 후, 배양액 내의 생물량이 1☓104

cells/mL가 되도록 희석하여

진탕배양하였다. 은나노물질에 대한 적합한 노출농도를 설정하기 위하여 예비

시험을 진행하였다. 농도설정실험의 범위는 10 mg/L부터 10배 간격으로 희석

하여 5개 시험물질 처리군로 진행하였다. 농도설정 시험의 결과에 따라 5 ~

95% 성장이 저해되는 범위 내에서 농도를 2배 간격으로 희석하여 진행하였다.

농도별로 준비된 시험용액을 100 mL 용량의 삼각플라스크에 넣고 조류를

1×104 cells/mL 농도로 접종하였고 대조군은 배양액을 이용하였다. 시험은 배

양과 동일한 조건으로 수행하였으며 시험기간 동안 시험용액을 교환하지 않는

지수식 방법으로 노출하였다. 조도가 균일하게 가해지도록 24시간 간격으로

진탕배양기 내 플라스크 배치의 열과 행을 순차적으로 바꿔주었다.

노출 후 24시간, 48시간 및 72시간에 대조군과 시험물질 처리군의 모든 플라


6

스크에서 샘플을 채취하여 현미경으로 조류의 수를 계수하고 형태이상 등의

특징을 관찰하였다. 노출 후 72시간에서 평균특이성장률에 대한 저해율을

계산하여 반수영향농도(EC50) 및 95% 신뢰한계를 산출하였다. 평균특이성장률

및 저해율은 아래의 식에 따라 계산하였다.

Ln Ln

×

여기에서, : 부터 사이의 평균특이성장률

: 에서의 생물량 : 에서의 생물량

: 노출개시 후 시간 : 노출개시 후 시간

: 평균특이성장률에 대한 저해율

: 대조군 평균특이성장률의 평균값

: 노출군 평균특이성장률의 평균값

라. 발광박테리아 발광율 저해시험발광박테리아 발광율 저해시험법의 원리는 발광성 미생물(Photobacterium

phosphoreum)의 발광도가 유해화학물질에 의해 감소되는 것을 이용한다. 해양

에 존재하는 발광성 박테리아(Vibrio fischeri)의 발광 저해도를 측정하여 영향을

확인하는 독성평가 기법이다. 최적의 성장조건을 주면 체내에서 생성되는 대사

에너지의 일부(약 10%)가 전자전달계에 의해 화학에너지로 바뀌어 빛(최대파장

: 490 nm)을 낸다. 박테리아의 세포구조가 변형되거나 세포내 대사과정에 변화

가 있으면 세포의 호흡량이 달라지고 동시에 발광도가 변화한다. 박테리아 배양

액에 시험물질을 첨가 후 30분 내에 나타나는 발광도의 차이로 물질의 독성을

측정한다.

발광박테리아는 동결 건조된 상태의 박테리아를 시험을 실시하기 직전, 활성

화 용액에 녹인 뒤 사용하였으며, 한번 녹인 발광박테리아는 5시간 이내에 시험

에 사용하였다. 발광박테리아 발광율 저해시험은 N-Tox(NeoEnBiz Co.) 매뉴얼

에 제시된 방법에 따라 수행하였다. 은나노물질은 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.3,

3.1, 1.6, 0.8, 0.4 mg/L 농도로 시험용액을 조제하였다. 활성용액에 녹인 발광


7

박테리아를 희석용 용액에 넣은 후 4℃에서 배양하였다. 96웰 플레이트의 각

웰에 배양된 발광박테리아를 100 μL씩 넣고 초기 발광량을 측정한 후, 시험용

액 100 μL을 가하고 15 ℃에서 노출하였으며, 반복구는 4개를 두어 수행하였다.

노출 후 15분 및 30분에 발광량을 측정하였다. 노출 후 15분 및 30분의 발광

저해율을 계산하여 반수저해농도(IC50) 및 95% 신뢰한계를 산출하였다. 발광

저해율은 아래의 식에 따라 계산하였다.

발광저해율

×

여기에서, : 초기 발광율(시험용액을 첨가 전의 발광율)

: t시간에서의 발광율(노출을 t시간 경과 후의 발광율)

2. 설치류에 대한 경구독성 시험

가. 급성경구독성 시험시험에 사용된 SD 랫드(Sprague-Dawley), SPF(Specific Pathogen Free) 동물

은 설치류의 실험동물로서 종과 계통이 확립되었고, 화학물질 등의 안전성 시험

에 널리 사용되고 있는 것으로 오리엔트바이오(대한민국)에서 구입하여 사용하

였다. 사용된 개체는 7일간의 검역과 순화기간 중에 매일 1회 일반증상 관찰을

실시하였고, 동물의 건강상태를 확인하였다. 6주령을 구입하여, 순화한 후 실험

에는 7 주령이 된 후 사용하였다. 사육 동물실은 SPF-3, 사육상자는 스테인레스

철망 사육상자(W210×D350×H180 mm)를 이용하였으며, 사육동물은 상자별로

2 ~ 3마리씩 수용하였다. 온도는 23 ± 3 ℃, 습도(상대습도)는 50 ± 20%, 명암주

기 및 조명시간은 12h 점등/ 12h 소등(오전 8시 ~ 오후 8시 조명)로 하였다.

급성등급법 실험에서는 사육상자와 급이기를 1회/1주 빈도로 교환하였으며, 28

일 및 90일 반복독성시험에서는 사육상자와 급이기를 2회/1주 빈도로 교환하였다.

급성경구독성은 OECD TG 423(독성등급법)에 따라 진행하였다. 시험용량당 암

컷 3마리씩을 사용하였다. 투여는 금속성 존데를 이용하여 강제 위내 투여를 하였

다. 시험 1단계, 2단계에서 투여량은 300 mg/kg이었으며 2주간 관찰후 부검하였고, 3

단계, 4단계에서는 투여량을 2,000 mg/kg하여 2주간 관찰 후 부검하였다.


8

<그림 1> Experiment procedure for Acute oral toxicity test.

다. 아급성경구독성 시험아급성경구독성 시험은 OECD TG 407을 따랐다. 은나노입자의

용량의존적인 변화를 관찰하기 위하여 25, 100, 400 mg/kg의 용량으로 매주

2회 체중과 음수량을 측정한 후 섭취량을 계산하였다. 노출실험은 계산결과를

바탕으로 음수에 은나노입자 농도를 맞춘 후 자유섭취하게 하였다. 28일간

노출시키고 노출종료 후, 랫드를 치사시키고 임상변화를 관찰하였다. 각

처리군별로 암수 5마리씩 분배하여 총 40마리가 사용되었으며 사육조건은

급성경구독성과 동일하다.

노출 종료 후 랫드를 치사시킨 후 복대정맥에서 채혈하고, 간 등의 장기를

육안으로 관찰하였다. 혈액 중 일부를 혈액구성비율을 측정하기 위해 분리하고,

나머지 분획은 상온에서 30분 동안 안정시킨 후 3000 rpm에서 10분간

원심분리하여 혈청을 취하였다.


9

라. 아만성경구독성 시험아만성경구독성 시험은 OECD TG 408에 따라서 아급성경구독성 시험과

동일하게 사육과 노출을 진행하였다. 노출은 90일간 진행하였으며, 노출 종료

후, 치사시켜 임상변화를 관찰하였다. 각 그룹 당 암수 10마리씩 처리하여 총

80마리가 실험에 사용되었다. 노출 종료 후 해부, 조직관찰, 혈청분석 등도

아급성경구독성 시험과 동일하게 수행하였다.

3. 흡착·탈착 시험

흡착, 탈착시험은 은나노물질이 토양 또는 퇴적물과 결합되어 축적되거나 해

리되는 성질을 파악함으로써, 매질내 나노물질의 이동과 분포를 파악하는데

기초정보로 활용가능하다. 본 시험에서는 물리적, 화학적 흡착을 구분하지 않고

은나노물질이 토양과 퇴적물에 흡착된 양을 측정하였으며, 탈착시험의 경우　토양에 결합한 은나노물질이 탈착되는 양을 측정하였다.

시험은 OECD TG 106(Batch equilibrium method)에 따라 수행하였다. 시료

는 토양 5종(한국화학융합시험연구원 제공), 퇴적물 1종(국립환경과학원 제공),

규사 1종(Quartz sand, Sigma aldrich)의 총 7종을 사용하여 수행하였다. 시료

채취 지점은 부록의 <그림 4>에 나타내었다. 토양과 퇴적물의 전처리는 상온

보관 후, 환기가 잘 되는 곳에서 풍건된 상태를 유지하였다.

가. 토양 및 퇴적물의 흡착 시험은나노물질은 1 ~ 100 mg/L 사이의 농도로 희석하여 사용하였다. 시험물질이빛과

온도에 민감하여 응집, 이온화, 용기에 흡착되므로 은나노 용액은 알루미늄 호일로

밀봉한 불활성 용기에 담아 보관하였으며, 상온에서 응집되므로 냉장 보관하였다.

은나노물질과 용액을 혼합·교반한 후, 원심분리기를 이용하여 회전속도 및

시간을 조절하여 현탁액에서 0.2 μm 이상 크기의 입자를 침전·분리하였다

(OECD TG 106). ICP-AES를 이용하여 은나노물질을 정량하였고, 토양시료에

흡착된 은나노입자는 암시야 현미경을 이용하여 관찰하였다.

흡착반응 후 분포계수(distribution coefficient, )가 0.3 이상인 것을 확인하


10

고, 흡착반응 후 원심분리로 흡착되지 않은 은나노 입자를 분석하였다. OECD TG

106에서는 토양 및 시료의 용매로서 인공강우인 0.01 M의 염화칼슘(CaCl2)을 사용

한다. 그러나 이 방법은 화학물질을 대상으로 한 시험방법이므로 나노입자에 적용

하기 위해서는 물질의 안정성을 확인하기 위하여 예비시험을 수행한 결과, 염화

칼슘의 높은 이온강도로 인하여 정전기적 반발력이 발생하여 안정성 유지를 위해

구연산으로 코팅된 은나노 입자의 안정성이 유지되지 않음을 확인하였다. 따라서

본 연구에서는 용매의 이온세기에 의한 침전을 배제하기 위하여 증류수를 이용하여

시험함으로써 나노입자와 토양입자의 상호작용에 초점을 맞추었다. 토양시료를

은나노 용액에 노출시킨 후 급속교반하여 은나노 용액과 시료를 완전히 혼합하였

다. 교반기로 36시간(예비실험을 통해 흡착평형의 도달시간을 확인함) 동안 섞은 후,

원심분리하여 입자 크기가 0.2 μm 이상의 토양만을 선택적으로 침전시켰다. 0.2

μm이하 입경의 토양에 흡착된 은나노입자는 고려하지 않았다(OECD TG 106).

나. 토양 및 퇴적물의 탈착 시험탈착시험은 흡착시험이 완료된 시료를 오븐에서 완전히 건조시키고, 흡착에

사용된 은나노 용액과 동일한 부피의 증류수를 첨가하였다. 흡착시험 방법과

동일하게 급속교반하고 36시간 동안 교반 후 원심분리 하여 탈착된 은나노 입자

를 측정하였다. 또한 예비실험을 통하여 실험에 적절한 토양과 은나노 용액의

비율을 결정하였다.

4. 생물학적 및 비생물학적 분해 거동

가. 생물학적 분해 시험일반 화학물질의 미생물 분해는 환경 내에서의 거동에 매우 중요한 인자로서

미생물 분해가 잘 되는 물질일수록 환경 중 잔류하는 시간이 적고 그만큼 위해성

이 낮아진다. 본 시험에서는 유기물 시험법인 OECD TG 301C(MITI(I) test)에

준하여 은나노입자를 정량할 수 있도록 수정·보완하여 수행하였으며, 은나노

물질의 환경 미생물에 의한 분해율을 조사하였다.


11

은나노 입자를 여과할 수 있는 나노필터 시스템을 도입하고, 은이온의 분리는

나노여과막(Woongjin NE 2540-90 Membrane)으로 처리 후, ICP-MS를 이용하여

분해된 은이온을 정량하였다. 시험에 사용된 미생물은 GLP 시험기관인 한국화

학시험연구원에서 제공받았는데, OECD 시험법에 따라 하천, 도시하수처리장,

산업체 폐수처리장 등 10개 이상의 지역에서 채취된 것이다. 미생물이 채취된

장소는 하수처리장 5개소(중랑천, 탄천, 난지도, 가양천, 고양시), 폐수처리장 2개

소(과천시, 동두천시), 하천수 3개소(한강난지도, 뚝섬지점, 남양주시도농천)이었다. 시

험 미생물에 영양분(Glucose, Peptone, Potassium phosphate 각 0.1%)을 공급하여

30일 배양 후 한천배지(nutrient agar plate)를 이용하여 생균수를 계수하였다.

생물학적 분해 시험법에서는 시험물질의 농도를 30 mg/L로 권고하고 있으

나, 은나노의 특성을 고려하여 도말평판법으로 농도를 변경, 시험하여 24시간

동안 미생물 독성이 일어나지 않는 농도를 사용하였다. 기초배양액의 구성성분

은 부록의 <표 4>와 같으며, 실험은 25℃, 100 rpm, 암조건에서 시험을 수행하

였다. 은이온을 은나노의 분해산물로 간주하여 생분해시험 후 은이온의 생성량

을 정량하였으며, 은나노 물질의 분해도가 20% 이상일 경우에 생분해성이 있다

고 판단하였다(OECD TG 301C).

나. 비생물학적 분해 시험수계에 존재하는 다양한 비생물적 요소(염, 빛, 천연유기물)에 의한 은나노

물질의 상태변화를 규명하는 시험으로서, 수질에 따른 은나노물질의 상태변화

를 통해 수생태계에 미치는 영향을 파악하는데 기초 자료로 활용 할 수 있다.

빛은 OECD TG 316(Photo-transformation of Chemicals in Water–Direct

Photolysis)을 참고하여 수행하였다. 염과 천연유기물질은 해당 OECD TG가 없기

때문에 관련논문 및 선행 연구를 참고하여 시험을 수행하였다.

빛은 필터를 이용하여 제논램프(xenon lamp)의 290 nm 이상의 빛을 사용하

였다. 염 농도는 해수(해수 1 kg당 평균 염의 량, NaCl(27.1 g), MgCl2(3.8 g),

MgSO4(1.7 g)를 기준으로 1, 10, 100, 1000배 희석하여 사용하였다. 천연유기물질

은 휴믹산과 펄빅산을 각각 20, 60, 100 mg/L 농도로 제조·사용하였다. 은나노

물질의 농도가 10 mg/L가 되도록 3차 증류수로 희석하여 시험을 수행하며, 12


12

시간까지 빛을 쪼인 후 분해된 은이온 농도를 pAg 미터로 측정하였다. 염에 의

한 분해시험은 3차 증류수에 은나노물질을 10 mg/L 분산시키고, 농도별로 염화나

트륨(NaCl), 황산마그네슘(MgSO4), 염화마그네슘(MgCl2)에 노출시킨 후 시간에 따른

은이온 농도를 pAg 미터를 이용하여측정하였다. 천연유기물에 의한 분해시험은 3차

증류수에 은나노물질을 10 mg/L 분산시키고 각 농도의 휴믹산과펄빅산에 노출시킨

후, 시간에 따라 은이온 농도를 pAg 미터를 이용하여 12시간까지 측정하였다.

다. 생물축적성 시험은나노물질의 환경 거동을 예측하기 위해 미생물 내로 축적되는 은나노 물질

의 양을 측정하였다. 생물축적성 시험은 OECD TG 305를 참고하여 미생물에

맞게 실험 환경을 변경하였으며 미생물 관련 내용은 OECD TG 301C를 참고하

였다. 미생물배양은 ‘생물학적 분해시험’에서 사용한 것과 동일하게 수행되었

다. 축적된 은나노 양의 측정은 원심분리(1,000 g, 10 분)를 통하여 미생물을

회수하여 수행하였다. 회수된 미생물은 탈이온수에 분산(vortex)과 원심분리를

3반복하여 미생물 주변에 존재하는 은나노 입자를 제거하였다. 최종적으로

얻어진 미생물에 초기 부피의 탈이온수를 더한 후, 질산 처리를 한 다음

ICP-AES를 이용하여 축적된 은나노 양을 정량하였다.

5. OECD 작업반 활동 및 연구동향

현재 제조나노물질의 안전성에 대한 활동이 활발하게 진행되고 있는 OECD

를 중심으로 2010년에 수행된 유선회의, 전자토의 그룹, 운영위원회 및 대면

회의에서 논의된 결과를 바탕으로 추진 결과를 정리하였다.

주요 내용은 제조나노물질 안전성시험 사업 국가 지원물질 선정 결과, OECD

은나노 안전성시험 지원사업, 나노물질 위해성평가 운영그룹 워크숍 결과, 노출

평가 사업 운영그룹 활동 등 4개 연구분야로 구분하여 정리하였다.

제조나노물질의 안전성에 대한 전반적인 국내·외 연구동향에 대한 자료는

국제적인 학회지에 발표된 연구논문의 주제를 분석하여 정리하였다.

Ⅲ. 연구결과 및 고찰❚

13

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1. 어류, 물벼룩, 조류, 박테리아에 대한 급만성 독성

가. 어류 독성 시험(1) 급성독성 시험

송사리(Oryzias latipes) 성어를 이용하여 은나노물질의 급성독성을 시험한

결과, <표 1>과 같이 96시간 LC50값이 0.78 mg/L로 나타났다. ECOTOX

DB(US EPA)에서는 은이온(AgNO3)물질의 LC50값이 0.17 mg/L로 보고되어

있으므로 본 연구에서 사용한 citrate 코팅 은나노물질의 독성이 은이온에 비하여

낮은 것을 알 수 있었다.

Age Exposure period Endpoint LC50

Adults(2~3 cm) 96 h Lethal 0.78 mg/L

Embryos 10 d Lethal 0.37 ± 0.05 mg/L

14 d Lethal 0.33 ± 0.07 mg/L

<표 1> Acute toxicity on embryo and adult of Oryzias latipes

(2) 배아 및 난황단계 치어독성 시험

부록의 <그림 5>는 은나노물질 노출농도에 따른 송사리 배아의 치사율을

나타냈다. 은나노물질 농도가 높고, 노출기간이 증가할수록 치사율이 높아졌다. 1

mg/L의 농도에서는 7일째모든개체가치사하였으며, 부화전(10 d) LC50값이 0.37 ± 0.05

mg/L, 시험종료시점(14 d)의 LC50값은 0.33 ± 0.07 mg/L로 나타났다. 부록의 <그림

5>와 같이 시험기간 동안 발생된 치사 현상은 주로 배아(embryo) 단계에서

일어났으며, 이는 나노물질이 난막을 쉽게 통과하여 부화율이 감소한 것으로

판단된다. 부화는 노출 10일 경과 후에 모두 완료되었으며, 대조군에서의 부화율

은 90% 이상으로 나타났다. 시험물질 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 mg/L 노출군에서의


14

Chemicals21d-LC50

1)

(μg/L)

21d-EC502)

(μg/L)

21d-NOEC2)

(μg/L)

21d-LOEC2)

(μg/L)

AgNPs2.43

(1.70-3.53)*

3.61

(3.29-3.95)*1.00 2.00

AgNO3 4.70-6.573)

5.51-6.963)

2.374)

3.794)

<표 2> Comparison of toxicity between AgNPs and AgNO3

부화율은 각각 83, 77, 33, 13%로 나타나 농도증가에 따라 부화율이 감소하는

것을 확인하였다.

노출기간에 따른 심박동수의 변화는 부록의 <그림 6>에 나타냈다. 7일째에서

0.1 mg/L을 제외한 모든 농도군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하는 것으

로 나타났다. 부록의 <표 5>는 노출종료 후 모든 개체에 대하여 전장을 측정한

결과, 0.25, 0.5 mg/L의 농도에서 유의하게 성장저해가 일어난 것을 보여준다.

성장에 따른 은나노물질의 최저관찰영향농도(LOEC)와 무영향관찰농도(NOEC)

는 각각 0.25, 0.1 mg/L로 관찰되었다.

나노입자의 경우 사육수 내의 이온과의 영향 또는 나노입자간 영향으로 응집이

일어나므로 노출용액의 교환주기 또는 노출방법에 따른 연구와 검토가 추가로

필요하다. 어류배아 및 난황단계 치어 독성시험에서는 심박동수에 영향을 미치는 것

으로 나타났다. 심박동수의 영향이 발달단계에 일시적으로 나타나는 현상인지

지속적인 현상인지에 대하여 추후 고려되어야 할 것으로 사료된다.

* 95% Confidence interval, 1)mortality, 2)reproduction, 3)Naddy, R.B. et al., Aquat. Toxicol.

84(1):1-10, 2007, 4)Bianchini, A., and C.M. Wood, Ecotoxicol. Environ. Saf. 71:32-40, 2008

나. 물벼룩 만성독성 시험만성독성 영향을 평가하기 위해 종말점을 모체에서 생산된 신생개체수

(offspring)를 기준으로 생식능 장애를 일으키는 농도를 산출하여 부록의 <그림 7>,

<그림 8>에 나타냈다. 은나노물질에 노출된 물벼룩으로부터 생산된 개체수 및

크기는 부록의 <표6>에 나타낸바와 같이 2.0 μg/L 이상의 농도에서 대조군과

유의한 차이를 나타냈다. 또한 만성독성 시험결과 LC50, EC50, NOEC, LOEC는

2.43, 3.61, 1.0, 2.0 μg/L로 각각 산출되었다. 물벼룩의 급성독성 시험결과 48시간


15

EC50 및 LC50은 5.78, 8.69 μg/L로 보고된 바와 있는데(2009, 국립환경과학원),

만성독성 시험결과가 급성독성 보다 더 민감하게 나타났다. 위의 <표 2>와 같이

은나노물질이 은이온(AgNO3)보다 높은 독성을 나타내고 있으므로 향후, 나노

물질의 이온화와 같은 분해현상으로 독성의 증감에 미치는 영향평가도 필요할

것으로 사료된다.

다. 조류 성장저해 시험(1) 노출 시험

은나노물질을 조류(P. subcapitata)에 노출시켰을 때 1 μg/L 이상의 은나노물질

노출군에서 조류 생물량은 대조군에 비하여 감소하였으며, 저농도보다 고농도의

노출군에서 생물량이 감소하여 은나노물질에 의한 조류성장저해가 확인되었다.

부록의 <그림 9>와 같이 예비시험 결과, 은나노물질 농도가 10 μg/L 이상의 농도

에서는 조류가 전혀 성장하지 않았고, 1 μg/L에서는 50% 이하로 성장률이 감소

하였다. 본 실험에서는 시험의 안정성을 고려하여 최고농도를 5 μg/L로 설정하여

수행하였다.

본 실험은 0.3, 0.6, 1.2, 2.5, 5.0 μg/L까지 농도군으로 노출하였으며, 부록의

<표 7>과 <그림 10>과 같이 은나노물질의 농도 증가에 따라 조류성장률이 감소

하였다. 또한 노출시간(72시간)이 증가할수록 대조군과 처리군 사이의 성장율

차이가 점차 커져 노출시간과 성장률 저해 사이의 상관성을 확인할 수 있었다.

통계프로그램(Probit program)을 이용하여 계산한 결과 반수영향농도 EC50은

0.466 μg/L(95% 신뢰한계 0.182 ~ 0.737 μg/L), 최소영향농도 LOEC값은 0.31

μg/L로 나타났다.

(2) 시험 타당성 확인

OECD TG 201과 같이 수행하였으며, 광조건과 교반이 조류성장에 미치는

영향을 확인하기 위하여 대조군의 생물량 증식이 적절한지를 특이성장률 평균

변동계수로 확인하였다. 부록의 <표 8>과 같이 대조군의 구간별(0~1일, 1~2

일, 2~3일) 특이성장률의 평균변동계수(coefficient of variation)는 32.9%로 나

타나 한계기준인 35%를 초과하지 않는 적정한 범위를 나타냈다. 또한 대조군의


16

72시간 특이성장률 평균변동 계수가 10%를 초과하지 않아야 하는데 본 실험

에서 부록의 <표 9>에서 보듯이 6.3%로 적합한 것으로 판정되었다. 1976년

Nimbargi와 Rodgi의 연구에서는 질산은(AgNO3)의 IC10값이 4.70 μg/L, IC25값

을 7 μg/L로 보고하였다. 본 연구의 결과와 비교했을 때 은나노물질의 경우 IC10

값이 0.1 μg/L로서 은이온에 의한 영향보다 더 독성이 높게 나타났다.

라. 발광박테리아 발광율 저해시험은나노물질에 노출된 발광박테리아의 발광도는 노출농도와 시간의 증가에

따라 감소하는 경향을 나타냈다. 발광박테리아에 대한 은나노의 반수영향농도

의 변화는 노출 후 15분과 30분에서 측정하였으며, 부록의 <그림 11>과 같이

농도의 증가에 따라 점차 감소하였고, 노출시간이 증가할수록 독성이 증가되는

것을 확인할 수 있었다. 통계프로그램(Probit program)을 이용한 IC50(15 min)

은 40.7 mg/L(95% 신뢰한계 34.2 ~ 50.0 mg/L), IC50(30 min)은 21.2

mg/L(95% 신뢰한계 18.3 ~ 24.7 mg/L)로 노출시간이 증가함에 따라 독성이

증가되었다.

2. 설치류의 급성, 아급성, 아만성 경구독성시험

가. 경구급성독성 시험본 연구에서는 OECD TG 423(독성등급법)을 이용하여 은나노 물질에 대한

급성경구 독성시험을 수행하였다. 노출 후 관찰기간 동안 모든 개체에서 사망

사례 및 특이한 임상증상은 관찰되지 않았다. 또한, 부검 결과 모든 개체에서

특이한 육안적 소견은 관찰되지 않았다. 부록의 <표 10>에 나타낸 바와 같이

은나노 물질은 GHS 카테고리 5에 해당하는 것을 알 수 있었고, LD50값은 2000

mg/kg bw 이상으로 나타났다.

나. 경구아급성독성 시험은나노물질 25, 100, 400 mg/kg bw 용량으로 28일 동안 노출하여 경구아급성


17

독성시험을 수행한 결과, 랫드는 노출기간 동안 모든 개체에서 사망사례 및

특이한 증상의 변화는 없었다. 부록의 <표 11>과 같이 노출기간 동안 모든

개체에서 순조로운 체중증가가 관찰되었다. 부검 결과 모든 개체에서 특이한

육안적 소견은 관찰되지 않았고, 대조군과 비교하여 각 장기별 평균 무게 및

표준편차에서도 각 개체별 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다.

혈액의 생화학적 분석결과는 부록의 <표 12>에 나타내었다. 간세포 이상

과 관련 있는 ALP, GPT, GGT 중 암컷에서 GPT 값은 부록의 <그림 11>과 같이

용량에 따라 증가하였다. GPT는 ALT라고도 하며 간 염증발생 시 증가되는

항목으로 은나노 물질이 간독성을 야기할 수 있다고 판단된다. 신장 이상과 관련

있는 BUN, Creatine에서는 혈중 요소질소인 BUN이 암컷의 중농도 군과 고농도

군에서 감소하였다. 나머지 항목에서는 대조군과 비교 시 유의적인 차이를 보이지

않았다.

다. 경구아만성독성 시험은나노물질 25, 100, 400 mg/kg bw 용량으로 90일 동안 노출하여 경구아만성

독성시험을 수행한 결과, 노출기간 동안 모든 개체에서 사망사례 및 특이한

임상증상은 관찰되지 않았다. 노출기간 동안 모든 개체에서 순조로운 체중증가가

관찰되었다. 부검 결과 모든 개체에서 특이한 육안적 소견은 관찰되지 않았고,

대조군과 비교하여 각 장기별 평균무게 및 표준편차는 각 개체별 유의성 있는

변화가 관찰되지 않았다.

혈액의 생화학적 분석결과는 부록의 <표 13>에 정리하였으며, 간세포 이상과

관련 있는 ALP, GPT(ALT), GGT와 신장이상과 관련 있는 BUN, Creatine의

양은 대조군과 비교하여 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 부록의 <그림 13>

과 <그림 14>와 같이 혈액 내 중성지방인 Triglyceride(TG)가 감소하였고, 총빌

리루빈(T-BIL)이 증가하였다. Triglyceride의 감소는 간질환, 만성질환, 영양장해

등에서 나타날 수 있고, T-BIL의 증가는 용혈, 간 장애, 황달 등에서 나타날 수

있다. 그 외 나머지 항목에서는 대조군과 비교 시 유의적인 차이를 보이지 않았

다.


18

3. 토양과 퇴적물에 대한 거동

가. 흡착․탈착 시험(1) 흡착 평형

규사(White quartz sand, Sigma-aldrich, Cat. No. 274739)를 포함하여 토양시료는

한국화학시험연구원에서 제공되었다. 토양 #1(TAK11228), #2(TAK11229),

#3(TAK11230), #4(TAK11230), #5(TQS9451), 퇴적물(국립환경과학원 제공)의

구성성분은 부록의 <표 14>와 같다. SEM-EDS 분석결과 입경이 규사보다 훨씬

작고 불균일하였으며, 시료의 표면은 C, O, Al, Si, K, Ti, Fe의 다양한 원소로

구성되어 있었다. 대표적으로 토양 #1의 결과를 부록의 <그림 15>에 나타냈다.

부록의 <그림 16>은 은나노입자의 흡착평형 시험 결과로서 대부분의 토양

및 퇴적물 시료에 있어서 5시간 후에는 더 이상 흡착되지 않았다. 5시간 이상

흡착반응을 진행시키고 난 뒤에는 흡착평형에 도달하였으며, 7종의 토양 및 퇴적

물에 대한 시험은 최대 36시간 동안 흡착 반응을 진행하였다.

(2) 흡착율 평가

부록의 <표 14>는 은나노물질과 토양시료의 혼합비율을 나타냈으며, 은나노

용액농도는 ICP-AES로 정량하였다. 규사에 대한 은나노물질의 농도별 흡착율

(%)은 15 ~ 35%가 흡착되었다. 부록의 <그림 17>을 보면 토양시료에 대한

흡착율(%)은 시료 #1(50 ~ 90%), #2(98 ~ 100%), #3(40 ~ 70%), #4(99.7 ~

100%), #5(95 ~ 98%), 퇴적물(99.7 ~ 100%)로 나타나, 대부분 나노물질이 흡착

되는 것을 알 수 있었다. 규사는 순수하게 Si와 O로 구성되어 NOMs 등의

유기물이 없으므로 흡착율이 낮았다. 부록의 <그림 18>은 은나노 용액농도에서

흡착된 농도(mg/L)와 흡착된 은나노 입자의 총량(g)을 계산한 결과로서 은나노

물질의 농도증가에 따라 흡착된 은나노 질량이 선형적으로 증가하였다.

(3) 토양의 탈착율 평가

흡착 후 탈착실험을 수행한 결과 흡착된 농도에 따른 탈착비율은 일정하지


19

않았다. 규사는 흡착량의 20 ~ 45% 범위 내에서 탈착되었다. 부록의 <그림 19>

에서 알 수 있듯이 각 시료별 탈착률은 #1(5 ~ 30%), #2(0 ~ 10%), #3(0 ~ 40%),

#4(0.15 ~ 0.35%), #5(3 ~ 6%), 퇴적물(0.1 ~ 0.5%)이었다. 정확한 정량화를 위해서

탈착된 은나노입자의 총질량을 계산하였다. 은나노물질의 초기농도에 비례하여

탈착된 질량은 선형적으로 증가하였으며 흡착된 양에도 비례하였다. 그러나

부록의 <그림 20>과 같이 선형성이 낮은 이유는 토양의 이온과 천연유기물질

에 의해 은나노 입자의 물리화학적 변화, 특히 응집 현상에 따른 퇴적

(deposition)현상으로 인해 변동이 컸던 것으로 판단된다. 시료#4와 퇴적물은

탈착율이 1% 이하로 매우 낮게 나타나, 대상시료의 은나노 흡착성이 매우 뛰어

난 것을 알 수 있었다.

(4) 현미경에 의한 토양입자 관찰

규사 및 토양 중의 은나노물질을 명시야와 암시야 현미경으로 관찰한 사진

을 부록의 <그림 21>에 나타냈다. 토양 내의 은나노 입자의 모습을 관찰한

결과 규사 및 토양 자체의 성분으로부터 빛이 산란하여 은나노 입자의 측정이

불가능하였다.

나. 흡착․탈착 계수 산정(1) 분산계수 Kd

토양, 퇴적물, 규사 시료 7종에 대한 흡착·탈착을 분석한 결과, 모든 시료에서

대체로 흡착·탈착이 초기농도에서 선형적으로 증가하였고, 흡착 추세선과 탈착

추세선 사이의 면적이 클수록 해당 시료의 은나노 입자에 대한 흡착력이 강한

것으로 해석된다.

단위질량의 토양 당 흡착된 은나노 입자를 나타내는 분산계수(distribution

coefficient, Kd)값은 토양과 용액에 분포하는 은나노물질의 비율을 의미한다. 흡착반

응을 5시간 이상 진행 한 뒤에 단위질량당 시료와 단위 부피의 용액에 존재하는

은 나노입자의 질량 비율을 아래와 같은 수식으로 계산하였다. 이때 사용된 수식의

기호 정의와 단위는 부록의 <표 16>에 나타냈다. 분산계수 값이 클수록 시료에 대한

흡착 성질이 크다는 것을 의미하며, 각 시료의 결과는 부록의 <표 17>에 나타냈다.


20

·

(2) 탈착계수 Kdes

탈착계수(apparent desorption coefficient, Kdes)는 탈착실험에서, 토양에 남아

있는 은농도와 용액에 탈착된 비율을 의미한다. 흡착반응과 마찬가지로 탈착

반응을 5시간 이상 시킨 뒤 단위질량당 시료와 단위부피의 용액에 존재하는

은나노입자의 질량 비율을 아래의 수식으로 계산하였다. 탈착계수 값이 크면

클수록 탈착 성질이 작다는 것을 의미하며, 각 시료의 결과는 부록의 <표 18>에

나타냈다.

SampleDistribution Coefficient

(Kd)

Apparent Desorption Coefficient

(Kdes)

Quartz sand 1.45 ± 0.27 9.10 ± 1.34

Soil #1 13.65 ± 3.26 14.39 ± 2.72

Soil #2 226.05 ± 38.14 47.57 ± 4.03

Soil #3 5.10 ± 1.03 8.93 ± 0.99

Soil #4 2242.02 ± 323.71 2147.61 ± 283.01

Soil #5 86.10 ± 6.63 187.07 ± 36.15

Sediment 5309.89 ± 3897.85 1399.47 ± 287.70

<표 3> Distribution coefficient(Kd) and apparent desorption coefficient(Kdes) of

silver nano particles in soils and sediment

다. 흡착․탈착 등온식 적용(1) Freundlich 흡착등온식

Freundlich 흡착 등온식은 흡착평형 상태에서 용액의 시료농도에 대해 흡착된

시료의 양과 관련이 있으며 다음의 수식과 같이 선형으로 나타낼 수 있다.


21

· , log

log · log

부록의 <그림 22>에 Freundlich 흡착 선형그래프를 나타냈으며, 이때의

흡착계수, 회귀상수, 상관계수는 부록의 <표 17>에 나타냈다. Freundlich 흡착

등온식의 적용은 회귀상수(n)값이 1 이상일 때 유효하다. 토양 #1, #2, #3은

Frendlich 흡착등온식으로 해석이 가능하였으므로, 3개 시료의 흡착상수를 비교

한 결과 토양 #2 > #1 > #3 순서로 흡착이 강하게 일어남을 알 수 있었다. 그러나,

토양 #2는 상관계수 값이 0.5로 낮아 신뢰성이 떨어진다. 퇴적물 시료는 저농도와

고농도 상관없이 100% 흡착되었으며, 이외의 시료는 회귀상수 값이 1 이하로서

값을 도출할 수 없었다.

(2) Freundlich 탈착등온식

Freundlich 탈착등온식은 탈착평형 상태에서 액체상에 존재하는 은나노입자

의 농도와 흡착된 은나노입자 농도와 관련 있으며 다음의 수식으로 표현된다.

· , log

log · log

부록의 <그림 23>은 Freundlich 탈착그래프를 나타냈으며, 이때의 시료별

Freundlich 탈착계수, 회귀상수 및 상관계수는 부록의 <표 18>에 나타냈다.

은나노 입자가 흡착된 시료가 증류수에 노출되었을 경우 탈착이 흡착보다 빠르게

진행되었다.

4. 생물학적 및 비생물학적 분해 특성

가. 생물학적 분해 시험(1) 배양액 중의 은나노물질의 안정성 변화

부록의 <그림 24>에서 보이듯이 미생물 배양액에 은나노 용액이 10 mg/L로

존재할 때 은나노 입자의 응집이 일어나 은나노의 고유색이 사라지는 것을


22

관찰할 수 있었다. 이것은 배양액 중에는 다양한 염이 포함되어 이온과 은나노 입자

와 반응하기 때문이다. 이와 관련하여 배양액의 pH에 따른 은의 종 분포(10 mg/L)

를 MINEQL 프로그램을 이용하여 알아본 결과, 부록의 <그림 25>와 같이 은이온

은 pH 13이하의 영역에서 침전물인 염화은(AgCl) 형태로 존재하는 것이 확인되

었다. 따라서 은이온은 배양액, 활성오니 상층액, 영양배지 등에서 이온상태로

는 거의 존재하지 않으므로 은나노물질의 분해를 확인할 수 있도록 탈이온수에

서 실험하였다.

(2) 생물학적 분해

미생물 및 은나노물질의 적정 시험농도를 설정하기 위하여 예비실험을 수행한

결과, 부록의 <그림 26>과 같이 미생물 초기농도 조건이 107 CFU/mL, 108 CFU/mL

인 경우 모두 은나노물질 농도가 10 mg/L 에서부터 독성이 나타났으며, 1 mg/L의

경우 시험이 가능한 것으로 확인되었다.

부록의 <그림 27>과 같이 108

CFU/mL의 미생물에 1 mg/L의 은나노 입자를

24시간 노출하면 약 0.03 mg/L (3%)의 은이온이 존재하는 것을 확인하였다.

대조 실험으로써 은이온 1 mg/L을 24시간 동안 미생물에 노출시키면, 대부분

의 은이온이 미생물 내에 흡착 또는 축적되어 8% 정도의 은이온만 용액 중에

분산되어 있는 것을 확인하였다. 또한 부록의 <그림 28>은 108 CFU/mL의 미생물

에 10 mg/L의 은나노 입자를 5일간 노출시키면서 분해산물인 은이온 양의 변

화를 나타낸 것이다. 은이온이 분해되어 나오는 양은 없었으며, 초기 용액에 있

던 0.9 mg/L의 은이온이 오히려 감소되는 경향을 보였다. 은이온은 분해되지

않는 것으로 나타났으므로, 이 결과는 대조시험 결과에서와 같이 미생물 내에

흡착 또는 축적에 의한 것으로 보였다. 생물을 처리하지 않은 은나노 용액의 경우 2

일째최고 0.2 mg/L 정도가해리되어나오는것과 비교하면, 미생물 존재 시에는 오히려

분해되는 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 이용하여 생분해

또는 이분해도를 계산한 결과는 부록의 <그림 29>에 나타내었다. 은나노입자의

분해산물인 은이온은 미생물에 축적 또는 흡착되어 은나노 용액에 포함되어 있는

은이온을 오히려 제거하게 되므로 생분해성은 음의 값을 나타냈다.


23

(3) 생물학적분해 시험 결론

MITI(I) test에 이용되는 기초배양액은 은나노의 응집을 유발하므로 탈이온수

에서 시험을 수행하였고, 은나노 입자는 미생물에 독성이 매우 높아서 미생물

초기농도를 높여(≅108 CFU/mL)시험을 수행하였다. 또한 은나노입자의 분해

산물인 은이온은 미생물에 축적 또는 흡착되므로, 은나노 용액에 포함되어

있는 은이온을 오히려 제거하여 분해성은 음의 값을 나타냈다. 본 연구를 통하여

기존 시험법을 은나노입자에 적용 시 물리화학적 성상 변화가 발생하는 것으로

확인되어, 수정방법에 의한 은나노입자의 생분해성은 거의 없는 것으로 확인

되었다.

나. 비생물학적 분해 시험(1) 염에 의한 은나노입자의 거동

염화나트륨의 농도에 따른 은나노입자의 표면전하는 -50 mV 내외에서 염의

노출로 -5 mV 이하까지 감소했다. 음전하를 가지는 안정화된 은나노입자는

양이온이 풍부한 염 존재 하에서 양이온이 표면에 흡착되어 입자의 표면전하가

줄어들기 때문이다. 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘(MgSO4), 염화마그네슘

(MgCl2)의 다양한 농도에서 은나노입자의 노출시간에 따른 흡광도 결과, 부록의

<그림 30>에서 볼 수 있듯이 420 nm 영역의 흡광도가 감소하였다. 이와 같이 염

에 의하여 은나노입자의 표면전하가 줄어들고 안정성이 감소하면서 응집이 유발

되므로, 염이 적은 양이 존재하여도 입자의 응집과 침전이 유발되는 것을 알 수

있다. 염 농도가 증가할수록 입자 표면에 작용하는 염의 량이 많아지게 되고,

결과적으로 흡광도가 감소하였다. 따라서 수계에 염이 존재 할 경우, 은나노입자

는 벌크입자로 성장하여 나노독성을 발현하지 못할 것으로 예상된다. 벌크입자

는 다시 광분해 등으로 이온화 가능성으로 인하여 독성발현 가능성이 있다.

염의 노출시간에 따른 은이온 농도 측정결과는 부록의 <그림 31>에 나타

냈다. 초순수에 분산된 은나노 농도를 pAg 미터와 ICP AES로 분석한 결과,

은나노 물질 10.09 mg/L 중 9.19 mg/L가 은나노 입자이고 0.9 mg/L가 은이온

으로 나타났다. 염 농도가 높고 노출 시간이 길수록 은이온의 농도가 감소하였

으며, 3차 증류수에서 해리된 염의 양이온은 은나노 입자를 응집시키고, 음이온


24

은 은이온과 반응하여 이온간 흡착 및 결합을 유도하는 것으로 사료된다.

염이 있으면 은나노 입자는 분해되지 않고, 응집되며, 은이온은 제거된다.

낮은 염 농도에서 은이온의 용출이 느리게 일어나는 결과를 얻을 수 있지만,

부록의 <표 19>에서 알 수 있듯이 음이온과 반응하여 은이온의 농도가 줄어들었

음을 확인하였다. 따라서 수계에 존재하는 염은 은나노 입자의 분해를 유발시키

기보다, 입자의 안정성을 감소시켜 나노특성을 잃게 만들고, 나노독성을 발현하

지 못하게 만드는 요소가 된다. 환경 중 이온상태로 존재하는 은이온 물질은

다양한 음이온과 결합하여 세포독성이 발현되지 못하는 것으로 예상된다.

(2) 천연유기물에 의한 은나노입자의 거동

천연유기물인 휴믹산과 펄빅산의 존재하에서 은나노 용액의 노출시간에

따른 은이온 농도를 측정하여 부록의 <그림 32>에 나타냈다. 천연유기물의

존재로 은나노용액 내 존재하는 은이온 농도가 감소되었으나, 천연유기물의

농도와 노출시간에 의해서는 은이온 농도변화는 크게 없었다. 천연유기물의

복잡한 분자구조와 특성은 표면에 다양한 기능기를 가지므로(Bae et.al, 2011)

은나노 입자 및 은이온은 천연유기물 표면에 흡착되고 거대한 은나노입자

덩어리로 성장함을 예상 할 수 있다. 따라서 천연유기물질은 은나노입자의 성장

및 은이온의 흡착을 유도하며 나노독성을 줄여주는 역할을 한다.

부록의 <표 20>은 천연유기물에 노출된 은나노 입자의 분해율을 나타낸 것으

로 초기 농도에 비해 은이온의 농도가 줄어들었기 때문에 음의 값을 나타낸다.

은나노입자에서 용출된 은이온 량은 측정할 수 없으나 천연유기물에 의해 용액

내 존재하는 은이온의 농도가 줄어들었음을 통해 은이온에 의한 독성이 줄어들

것으로 생각할 수 있다.

(3) 빛에 의한 은나노입자의 거동

구연산을 이용하여 안정화된 은나노 입자는 빛에 의해 광산화 반응이 일어나면

표면의 COO-기는 CO2로 분해되고, 정전기적 반발력으로 안정화된 은나노

입자는 분산 안정성이 떨어져 입자간 응집이 유발된다. 구연산의 분해는 은나노

입자 에너지 상태의 변화를 유발하게 되고 안정한 에너지 준위로 돌아가기 위해


25

입자간 응집이 촉진된다. 부록의 <그림 33>에서 알 수 있듯이 빛에 노출된

시간이 길수록 광산화 반응이 많이 일어나므로 시간에 따라 은나노 용액의 색이

노란색에서 회색으로 변하는데, 이것은 입자의 응집에 의한 결과로 예측된다 .

빛 노출로 은나노입자의 상태를 간접적인 확인을 위해 시간에 따른 흡광도를

부록의 <그림 34>에 나타냈다. 시간에 따라 은나노입자의 특성피크의 세기가

줄어들었고 장파장의 흡광도 피크의 증가도 일어났다. 특정피크의 감소는 은나노

입자의 수가 감소되었음을 의미하며, 장파장의 세기증가는 큰 입자의 개수가

증가한 것을 의미한다. 즉, 광산화를 거친 은나노입자는 분산안정성이 감소하면

서 입자간 응집이 일어난 것으로 판단된다.

<그림 2> Concentration of Ag ion with exposure time of A(left) and B(right) filter.

<그림 2>는 빛에 노출시킨 은나노 용액의 은이온 농도 변화를 조사한 결과로

서 광산화로 은이온이 용출되는 것을 나타낸다. A필터(>400 nm)를 사용할

경우, 0.06 mg/L․h의 속도로 은이온이 용출되었고, B필터(>300 nm)는 0.11

mg/L․h의 속도로 은이온이 용출되어 광산화 반응이 가속화되었다. 이것은 빛에

의해 은나노입자의 응집이 유발되어 나노특성이 변하지만, 단파장의 세기가 센

경우에는 응집 후 은이온의 용출이 유발되어 은이온에 의한 독성이 나타날 수

있음을 시사한다.

부록의 <그림 35>는 은나노입자의 빛에 의한 분해율을 측정한 결과로서

광산화로 7.97 ~ 15.23%까지 은이온이 용출되었다. 특히 단파장의 빛에 의한


26

은나노 입자의 용출이 더욱 많이 일어남을 알 수 있었다. 위에서 얻은 은이온

용출량의 근사식을 통해 A필터는 약 8일, B필터는 약 4일 정도 노출되면

은이온으로 모두 산화되는 것으로 나타났다.

결론적으로 본 실험에서 사용한 염, 천연유기물, 빛의 비생물적 요소는 은나노

입자의 안정성을 저해하고 상태변화를 유발시켜 나노특성으로 인한 독성을

줄이는 것으로 판단된다. 그러나 형태학적 변화가 일어난 이후 빛에 노출 될

경우에는 응집된 입자로부터 은이온이 용출되어 은이온으로 인한 독성이 발현

될 수 있을 것으로 예측된다.

다. 생물축적성 시험(1) 노출조건 확인

생물분해성 시험에서 은나노 용액은 낮은 농도의 미생물에 대해서는 독성을

나타냈으므로 미생물 초기농도 108 CFU/mL에서 0.5, 1.0, 10 mg/L 은나노

농도로 시험하였다. 24시간 동안 10 mg/L 은나노 입자의 생물축적량을 측정

하였으며, 교반 (100 rpm), 정치조건 그리고 미생물 분리시의 초음파처리의

영향을 비교하였다. 부록의 <그림 36>에 나타낸 바와 같이 교반 조건에서 시험오

차 범위 내에 있었으나 미미하게 축적량 증가가 확인되었다. 초음파 처리로

세포 외부에 부착한 은나노를 제거하려 하였으나 제거된 양은 거의 없는 것으

로 확인하였다. 따라서 본 시험에서는 교반조건에서 시험을 수행하였고, 초음파

처리 없이 원심분리 및 급속교반만을 통하여 미생물을 세척 및 분리하였다.

본 시험에서 측정된 생물축적량은 미생물 바깥에 부착된 은나노 입자도 포함

될 수 있지만, 이는 3분 이상의 급속교반에도 떨어지지 않는 강하게 부착된

은나노 입자를 포함하는 것이기 때문에 이 또한 생물축적량으로 간주할 수 있

다고 사료된다.

(2) 생물축적성 시험

부록의 <그림 37>과 같이 1 mg/L 농도의 은나노 용액에서는 생물축적량이

시간경과에 따라 크게 변하지 않았으며, 0.2 ~ 0.3 mg/L의 은나노가 미생물 내

로 축적되었다. 10 mg/L 농도의 은나노 용액에서는 1 ~ 3일 동안 생물축적량이


27

점차 증가하는 추세를 보이다가 5일째에는 축적량이 급격히 감소함을 확인하였

다. 이는 미생물 내로 은나노입자의 축적되는 양은 한계점을 가지며, 축적되었

던 은나노 입자가 세포 밖으로 배출 된 것으로 판단된다.

투과전자현미경(TEM) 분석을 통하여 미생물 내(10 mg/L, 1 d) 존재하는

은나노는 <그림 3>에 나타내었다. TEM 사진에서 볼 수 있듯이 상당한 양의

나노입자가 미생물 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 대체로 10 nm 이하

의 작은 크기의 은나노입자가 미생물 내에 분포하는 것을 확인하였으나, 왼쪽

그림에서 볼 수 있는 수십 nm의 크기를 가지는 입자도 미생물 내에 존재할 수

있음을 확인하였다. 큰 크기의 나노입자가 미생물 내로 들어갔을 수도 있으나,

작은 입자들이 미생물 내에서 응집했을 것으로 판단된다. 미생물 내 은나노물

질의 크기분포와 입자수는 부록의 <그림 38>과 <그림 39>에 나타내었다. 은나

노 입자는 생물 노출 후, 축적도가 증가하다가 5일 후에는 생물축적정도가 조금

낮아지는 것을 확인하였는데, 이는 미생물 내 축적된 은나노 입자가 배출된 것으

로 사료된다. 본 연구를 통하여 환경중의 나노입자는 상당량이 미생물 내에 존재

할 수 있음을 확인하였고 이는 미생물에 많은 영향을 줄 수 있음을 시사한다.

<그림 3> TEM image of microorganisms exposed to AgNPs.


28

5. OECD 작업반 활동 및 연구동향

OECD 제조나노물질 작업반회의(WPMN), 운영그룹회의(SG), 전자토의그룹

회의, 유선회의 등의 적극 참여를 통해 제조나노물질 안전성시험 지원사업

관련 지침서 작성 및 지원대상 물질 선정에 있어 국가 의견을 반영하였다. 또한

제조나노물질 관련 연구 및 관리 관련 국가 활동 상황을 OECD에 보고하였으

며, 이를 위하여 식약청 등 8개 기관의 의견을 서면 및 부처간 회의를 통해 수렴

하여 국가의견에 반영하였다.

가. OECD 활동 및 안전성시험사업 대표물질 목록 수정OECD 회원국 및 OECD 제조나노물질 안전성 사업 참여 이해당사자는 제7회

OECD 제조나노물질 작업반회의에서 총괄국이 없는 카본 블랙 및 폴리스티렌

을 목록에서 삭제하고 금나노물질을 추가하는 것에 합의하였다. OECD와 화학

물질의 적정관리에 관한 국제기관간 프로그램(Interorganization Programme

for the Sound Management of Chemicals, IOMC)은 수정된 대표물질 목록 및

시험 항목 작성하여 공개하였다.

※ 제조나노물질 안전성사업 대상 물질 : 은나노, MWCNT, SWCNT, 플러렌,

TiO2, SiO2, ZnO, Al2O3, CeO, 철나노, 덴드리머, 나노클레이, 금나노

나. 시험계획서(Dossier development plan, DDP) 작성 및 검토우리나라는 미국과 공동으로 은나노물질 안전성시험사업 지원사업의 주무국

(lead-sponsor)으로 참여하고 있다. 주무국로서 국내 연구기관 및 사업 참여국

의 은나노물질 연구현황 및 계획을 수렴하여 DDP를 미국과 공동으로 작성하

였다.

다. 시험지침 검토시험지침 제ㆍ개정사업 운영그룹(SG4)은 분야별 4개의 세부그룹을 구성하고

기존의 OECD 시험지침이 제조나노물질에 적용 가능한가를 검토하였으며 현재


29

까지 진행 중인 상태이다. 물리화학적 성질 분야의 경우, 시험지침의 적용성 및

한계에 대한 검토를 마쳤으며, 인체 건강 영향 분야의 경우, 검토 결과 보고서

최종안이 작성 되었다. 또한 OECD 운영그룹 4는 기존의 OECD 시험 지침의

나노물질 시험에 대한 적용성에 대한 설문조사를 실시하였으며 국내 연구기관

의 의견을 수렴하여 설문 답변서를 OECD에 제출하였다(’10.10월).

라. 국내·외 연구동향 조사나노물질에 대한 초기의 독성 연구로는 산화스트레스, 과산화지질 증가, 단백

질 손상, 막결합 단백질 손실 등이 보고되었다(Zhen et al. 2007). 현재는 나노물

질의 독성연구가 in vitro인 세포 수준에서도 활발히 진행되고 있으나, 나노입자

에 의한 세포에서의 소핵증가 및 세포사멸, 염증, 콜라겐성 육아종 유발 등의

연구결과도 꾸준히 보고되고 있다. 또한 나노입자가 면역계의 작용을 촉진하거나

저해하여 전반적인 면역체계에 영향을 준다는 연구도 발표되고 있다(Zolnik et

al. 2009). 2010년 5월 미국에서 개최된 제5차 나노입자 및 나노물질의 환경영향

에 관한 국제학술대회(Nano 2010)에서 Allison Rick(2010) 등이 은나노물질은

그람음성 박테리아 뿐만 아니라 1 ~ 5 mg/L 노출로 토양, 수질 환경 중 질산화

-탈질 미생물 사멸에 영향을 끼쳐 질소순환계의 영향을 보고했다. B.D.

Johnston(2009) 등은 어류에서 나노입자 TiO2, CeO2, Ag의 독성에 미치는 천연

콜로이드의 영향을 보고하였다. Y. Wu (2010) 등은 송사리 생육초기독성 시험

에서 AgNPs를 100 ~ 1000 µg/L 범위에서 70 일간 노출시험 결과, 송사리의 급성

독성(48 시간)인 LC50은 1.03 mg/L이었으며, LC100은 2.0 mg/L로 보고했다.

나노물질의 흡입에 의한 영향은 주로 마우스나 랫드와 같은 설치류를 사용하

여 시험을 수행한다. 은나노 입자(AgNPs)를 랫드에 0.5 ~ 61 µg/m3 농도범위

로 흡입노출 시켰을 때, 입자 크기에 따라 비강 내 세포에서 조직병리학적 독성

이 나타났으며, AgNPs의 농도 증가에 따라 노출군에서 점액분비세포인 배상

세포(goblet cell)의 크기와 숫자가 유의하게 증가하는 것으로 보고하였다(Hyun

JS et al. 2008). 또한 사람의 질병유전자 60% 이상을 가지는 초파리에 AgNPs를

노출시킨 후 Hsp70 단백질 발현량으로 나노입자의 독성을 평가하였다. 생리학

적 스트레스의 유용한 지표로 사용되는 Hsp70 단백질은 대조군과 비교하여


30

AgNPs에 노출된 파리에서 높게 나타났다(Posgai R. et al. 2009). 지금까지 밝혀진

랫드에 대한 나노물질의 흡입독성 증상으로는 만성폐렴(Chronic pulmonary

inflammation), 대식세포와 상피세포 증식(Hyperplasia of macrophages and

epithelial cells), 폐 정화 변화(Altered pulmonary clearance), 폐 입자침적

(Large pulmonary burdens of particles), 간질화 증가(Increased

interstitialization of deposited particles), 간질성 폐질환(Interstitial lung

disease), 폐종양 유발(Production of lung tumers) 등이 있다.

Ⅳ. 결 론❚

31

Ⅳ. 결 론

제조나노물질로부터 야기될 수 있는 위해성으로부터 인체 및 환경의 안전성을

확보하고자 본 연구에서는 은나노물질(평균크기 12 nm)의 수생태독성, 포유

류독성 및 환경거동 3개 분야에서 11항목에서 OECD시험법을 수행하였다.

아울러 현재 국제공인시험법에 대한 나노물질의 적용성 검토를 목적으로 하였다.

이상의 은나노물질에대한독성과환경거동연구를통하여도출한결과는다음과같다.

1. 물벼룩 급성, 만성, 생물분해성 3항목에 대해서 OECD 시험법에서 개선이 필요한

사항을 도출하였으며, 조류성장저해 1항목은 적용이 불가능하였다.

영양염류에 의한 나노물질의 응집영향을배제하는 시험법을 제안(3항목)하였으나,

조류성장시험법은 빛에 의한 나노물질 분해가 촉진되어 개선이 필요하였다.

2. 수생태 시험종에서 은나노(AgNPs)가 은이온(AgNO3)보다 독성이 높은 경우가

많았으나, 송사리에 대한 독성의 경우에는 오히려 반대였다.

물벼룩 만성독성 LC50(21d) 2.43 μg/L (※ AgNO3는 LC50(21d) 4.7 μg/L)

송사리 급성독성 LC50(48h) 0.78 mg/L (※ AgNO3는 LC50(48h) 0.17 μg/L)

3. 설치류에 대한 급성독성이 매우 낮았고(LD50값 2,000 mg/kg·bw이상),

아급성독성(28d), 아만성독성(90d) 시험에서는 체중변화, 뇨분석, 혈액분석

및 조직관찰에서 유의성 있는 영향은 없었다.

4. 은나노물질은 용액에서 미생물에 의한 분해보다는 주로 생물체로 흡착되며,

토양 및 수환경 중에서 염, 천연유기물질과 결합되어 입자가 표면전하, 크기

등의 나노물질 특이적인 성질이 줄었다.

토양과 퇴적물에서는 은나노 입자의 99.9%까지 매질에 흡착되고, 토양에

존재하는 염과 천연유기물질이 독성을 완화시키는 것으로 판단된다.

Ⅳ. 결 론❚

32

이상의 결과로부터 은나노물질은 수생태 시험종에 대하여 ppb 수준으로

독성을 유발하였으나 토양, 퇴적물, 유기물 등과 쉽게 흡착, 응집 반응을 일으

키므로 독성이 감소될 것으로 판단된다. 다만, 나노물질에 대한 완전한 유해성

판단을 위해서는 표준시험법에 대한 추가적인 적용성 검토, 이온물질과의 비교

독성 연구 및 표준 조류성장 저해시험법 등의 연구가 필요하다.

참 고 문 헌❚

33

참 고 문 헌

Allison Rick(2010). Effects of manufactured silver nanoparticles on microbial

denitrification. 5th International Conference on the Environmental

Effects of Nanoparticles and Nanomaterials, Aug. 21-24, 2010, USA.

B. D. Johnston, P. Cole, R. Goodhead, T.M. Scown, O. Osborne, M.

Baalousha, J.R. Lead, & C.R. Tyler(2009). Effect of natural colloids on

the uptake and toxicity of TiO2, CeO2 and Ag nanoparticles in fish.

4th International Conference on the Environmental Effects of

Nanoparticles and Nanomaterials, Sep. 6-9, 2009, Austria.

Claudio Petterino, Alberta Argentino-Storino(2006). Clinical chemistry and

haematology historical data in control Sprague-Dawley rats from

pre-clinical toxicity studies. Experimental and Toxicologic Pathology 57

(2006) 213–219.

E. Bae et al. Cell uptake of silver nanoparticles correlated with humic acid.

Korean Journal of Chemical Engineering, (2011) In press.

G.S. Travlos, R.W. Morris, M.R. Elwell, A. Duke, S. Rosenblum, M.B.

Thompson(1996). Frequency and relationships of clinical chemistry and

liver and kidney histopathology findings in 13-week toxicity studies

in rats. Toxicology 107 (1996) 17-29.

Hartmann, N.B. F. Von der Kammer, T. Hofmann, M. Baalousha, S.

Ottofuelling, A. Baun(2010). Algal testing of titanium dioxide

nanoparticles—Testing considerations, inhibitory effects and

modification of cadmium bioavailability. Toxicology, 269(2-3) (2010)

190-197.

Hyun JS, Lee BS, Ryu HY, Sung JH, Chung KH and Yu IJ.(2008). Effects of

repeated silver nanoparticles exposure on the histological structure and

mucins of nasal respiratory mucosa in rats. Toxicology Letters 182(1-3)

(2008) 24~28.

참 고 문 헌❚

34

I. Blinova, A. Ivask, M. Heinlaan, M. Mortimer, A. Kahru(2010). Ecotoxicity

of nanoparticles of CuO and ZnO in natural water. Environmental

Pollution, 158(1) (2010) 41-47.

James F. Ranville(2010). Nanomaterial in the Environment. 5th International

Conference on the Environmental Effects of Nanoparticles and

Nanomaterials, Aug. 21-24, 2010, USA.

Lysandro Pinto Borges, Ricardo Brandão, Benhur Godoi, Cristina W.

Nogueira, Gilson Zeni(2008). Oral administration of diphenyl

diselenide protects against cadmium-induced liver damage in rats.

Chemico-Biological Interactions 171 (2008) 15–25.

Nimbargi, P.M. and S.S. Rodgi(1976). Toxicity Studies of Dimecron to the

Freshwater Prawn, Cairdina sp.. Marathwada Univ.J.Sci. 15(8) (1976) 45-49.

OECD(1995). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Repeated

Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents 407.

OECD(1998). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Repeated

Dose 90-day Oral Toxicity Study in Rodents 408.

OECD(1992). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Fish, Acute

Toxicity Test 203.

OECD(1992). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Ready

Biodegradability Test No. 301 C Modified MITI test(I).

OECD(1996). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Bioconcentration:

Flow-though Fish Test No. 305

OECD(1998). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Fish, Short-term

Toxicity Test on Embryo and Sac-fry Stages Test No. 212

OECD(2000). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Adsorption

-Desorption Using a Batch Equilibrium Method Test No. 106.

OECD(2001). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Acute Oral

Toxicity – Acute Toxic Class Method 423.

OECD(2004). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Daphnia sp.,

참 고 문 헌❚

35

Acute Immobilisation Test No. 202.

OECD(2006). Development of an OECD nanosafety database : potential

project. ENV/CHEM/NANO/M(2006)5.

OECD(2006). Draft summary record of the 1st working party on

manufactured nanomaterials. ENV/CHEM/NANO/M(2006)1.

OECD(2006). Manufactured nanomaterials : Work Programme 2006-2008.

ENV/JM(2006)49/REV1.

OECD(2007). Draft summary record of the 2nd working party on

manufactured nanomaterials. ENV/CHEM/NANO/M(2007)1.

OECD(2008). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Daphnia magna

Reproduction Test No. 211.

OECD(2008). OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Phototransformation

of Chemicals in Water-Direct Photolysis Test No. 316.

Posgai R, Ahamed M, Hussain SM, Rowe JJ and Nielsen MG.(2009).

Inhalation method for delivery of nanoparticles to the Drosophila

respiratory system for toxicity testing. Science of The Total

Environment 408(2) (2009) 439~443.

Sinan çãglar, Dùrdane Kolankaya(2008). The effect of sub-acute and

sub-chronic exposure of rats to the glyphosate-based herbicide

Roundup. Environmental Toxicology and Pharmacology 25 (2008) 57–62.

Stephen J. Klaine(2010). Nanoparticles Characterization. 5th International

Conference on the Environmental Effects of Nanoparticles and

Nanomaterials, Aug. 21-24, 2010, USA.

T.L. Metcalfe, P.J. Dillon and C.D. Metcalfe(2008). Effects of formulations of

the fungicide, pentachloronitrobenzene on early life stage development

of the Japanese medaka (Oryzias latipes). Chemosphere, 71(10) (2008)

1957-1962.

Wu Y, Zhou Q, Li H, Liu W, Wang T and Jiang G.(2010). Effects of silver

nanoparticles on the development and histopathology biomarkers of

참 고 문 헌❚

36

Japanese medaka (Oryzias latipes) using the partial-life test. Aquatic

Toxicology, 100 (2010) 160-167.

Zhen Hu, Wenchao Guan, Wei Wang, Lizhen Huang, Haiping Xing and Zhou

Zhu.(2007). Synthesis of β-alanine C60 derivative and its protective

effect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat

pheochromocytoma cells. Cell Biology International 31(8) (2007) 798-804.

Zhong Huang, Yuansheng Jang, Xiuying Yang, Weiliang Cao, Jingchang

Zhang(2010). The synthesis and photoelectric study of

6,13-bis(4-propylphenyl)pentacene, and its TiO2 nano-sized composite

films. J. of Physics and Chemistry of Solids, 71(3) (2010) 296-302.

국립환경과학원(2007). 제조나노물질의 위해성 평가를 위한 DB 구축 및 위해성

평가기술관련 연구(I), NIER NO.2007-77-933.


평가기술관련 연구(II), NIER NO.2008-57-1008.


평가기술관련 연구(III), NIER NO.2009-22-1078.

환경부(2007). 나노기술백서. 환경부 11-1480000-000877-01.

부 록❚

37

부 록

부 록❚

38

AgNP Conc.

(μg/L)

Adult Survival

(%)

Days to First

Brood

Number of Young

per AdultGrowth (mm)

Control 100 7 61.10±2.64 3.30±0.05

0.25 100 7 62.10±4.98 3.27±0.04

0.50 100 7 59.20±3.88 3.24±0.06

1.00 80 7 61.75±3.69 3.24±0.06

2.00 70 7 46.00±8.89* 3.11±0.13*

4.00 30 7 36.67±3.21* 3.11±0.15*

8.00 0 - - -

<표 6> Chronic toxicity test of AgNPs with D. magna

Contents Concentration(M)

Dipotassium hydrogen phosphate

Potassium acid phosphate

Dibasic sodium phosphate dodecahydrate

Ammonium chloride

Magnesium sulfate heptahydrate

Calcium chloride

Ferric chloride hexahydrate

4.6 x 10-4

1.9 x 10-4

3.7 x 10-4

9.5 x 10-5

2.7 x 10-4

7.4 x 10-4

2.9 x 10-6

<표 4> Mineral medium contents for biotic degradation test

Exposure Conc.(mg/L) Control 0.1 0.25 0.5 0.75

Total length (mm) 4.843 4.678 4.669 4.502 4.51

std. 0.327 0.349 0.267 0.233 0.509

t-test 0.0854 0.049 0.001 0.523

<표 5> Total length of O. latipes at 14 day upon exposure to different AgNPs

concentrations. Values are presented as mean ± standard deviation

mean±standard deviation, *significant(p<0.05) difference from the control

부 록❚

39

Norminal conc.

of test

substance(μg/L)

rep.Biomass (cells/mL)

0h 24h 48h 72h

1 10000 90000 367500 915000

control 2 10000 65000 290000 855000

3 10000 67500 445000 950000

avg 10000 74167 367500 906667

1 10000 35000 190000 497500

0.3125 2 10000 52500 152500 592500

3 10000 37500 182500 542500

avg 10000 41667 175000 544167

1 10000 25000 97500 465000

0.625 2 10000 17500 112500 432500

3 10000 27500 95000 417500

avg 10000 23333 101667 438333

1 10000 17500 27500 120000

1.25 2 10000 7500 17500 117500

3 10000 10000 30000 120000

avg 10000 11667 25000 119167

1 10000 5000 32500 97500

2.5 2 10000 7500 27500 107500

3 10000 10000 20000 120000

avg 10000 7500 26667 108333

1 10000 7500 25000 5000

5 2 10000 10000 15000 10000

3 10000 10000 17500 7500

avg 10000 91667 11667 7500

<표 7> Biomass change of P. subcapitata during the definitive test

부 록❚

40

No.Specific growth rate of control group

μ(0-24) μ(24-48) μ(48-72) avg std CV(%)

(0-72hr) 0.08 0.07 0.04 0.06 0.02 32.87

<표 9> Area under ASGR during the definitive test

Conc.(µg/L) ASGR(24h) ASGR(48h) ASGR(72h)

0 0.08 0.08 0.06

0.3125 0.06 0.06 0.06

0.625 0.04 0.05 0.05

1.25 0.01 0.02 0.03

2.5 -0.01 0.02 0.03

5 -0.00 0.00 -0.00

<표 8> Average Specific Growth Rate (ASGR) during the definitive test

Group /

Step /

Dose

(mg/kg)

No. of

animals

Day after treatmentMortality

(dead/total)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

G1

Step 1

300

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00%

(0/3)

G2

Step 2

300

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00%

(0/3)

G3

Step 3

2000

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00%

(0/3)

G3

Step 4

2000

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00%

(0/3)

<표 10> Mortality after AgNPs administration in acute oral toxicity test

부 록❚

41

　 28 day 90 day

투여 시 부검 전 투여 시 부검 전

F control 159.9 247.3 141.1 265.7

F25 167.1 246.2 144.9 290.4

F100 162.3 258.6 146.5 288.5

F400 162.8 245.9 140.7 265.1

M control 238.9 422.6 223.4 601.1

M25 237.1 388.8 228.8 599.6

M100 233.4 383.3 229.6 592.8

M400 233.4 413.8 231.1 576.2

<표 11> Body weight change in rat after oral toxicity test

부 록❚

42

Item

Dose

ALP

(U/l)

LDH

(U/l)

NH3

(ug/dl)

GLU

(mg/dl)

T-CHO

(mg/dl)

Fcont 496.75 525.00 240.00 134.25 87.25

F25 342.80 822.40 448.00 74.00 84.00

F100 450.20 622.00 269.80 167.20 91.80

F400 496.20 812.40 442.60 148.80 90.80

Mcont 489.20 638.80 344.60 151.40 66.40

M25 855.25 875.75 279.25 102.05 84.75

M100 730.40 416.40 284.40 193.20 102.60

M400 427.00 900.00 490.25 127.50 93.50

Item

Dose

GOT

(U/l)

TG

(mg/dl)

GPT

(U/l)

BUN

(mg/dl)

CA

(mg/dl)

Fcont 68.00 92.25 19.50 16.93 11.48

F25 105.40 56.00 22.80 15.34 10.74

F100 71.40 71.40 29.00 10.76 10.92

F400 103.80 61.20 31.80 8.92 10.80

Mcont 101.00 87.00 23.40 15.66 11.12

M25 94.00 56.00 43.25 15.18 10.80

M100 57.80 120.80 33.40 10.10 11.86

M400 132.25 75.00 21.75 15.58 11.13

Item

Dose

IP

(mg/dl)

GGT

(U/l)

ALB

(g/dl)

TP

(g/dl)

CRE

(mg/dl)

T-BIL

(mg/dl)

Fcont 7.83 9.25 4.28 6.53 0.13 0.45

F25 9.24 11.00 4.32 6.54 0.22 0.66

F100 7.54 9.00 3.94 6.14 0.26 0.50

F400 8.94 11.00 3.94 5.96 0.26 0.88

Mcont 10.22 10.80 4.04 6.42 0.20 0.56

M25 8.90 8.50 3.95 6.05 0.20 0.50

M100 10.46 9.00 4.08 6.18 0.22 0.38

M400 11.43 11.50 4.28 6.63 0.30 0.90

<표 12> Biochemical serum values in SD rats after oral administrated AgNPs for 28 days

부 록❚

43

Item

Dose

ALP

(U/l)

LDH

(U/l)

NH3

(ug/dl)

GLU

(mg/dl)

T-ChO

(mg/dl)

Fcont 409.90 900.00 486.30 121.10 92.70

F25 175.40 900.00 500.00 55.00 90.10

F100 174.56 900.00 500.00 43.90 104.20

F400 515.60 849.40 498.60 80.80 102.00

Mcont 491.40 811.50 454.70 160.67 102.70

M25 398.00 900.00 500.00 144.50 104.80

M100 463.00 827.60 474.30 176.50 106.20

M400 478.56 852.11 482.78 157.11 120.22

Item

Dose

GOT

(U/l)

TG

(mg/dl)

GPT

(U/l)

BUN

(mg/dl)

CA

(mg/dl)

Fcont 115.80 166.70 29.00 12.44 12.36

F25 126.00 85.50 13.00 14.53 11.54

F100 119.70 76.90 13.30 16.39 11.66

F400 128.40 101.60 26.40 13.85 11.74

Mcont 104.20 181.30 35.40 14.29 12.46

M25 126.80 131.20 32.00 17.63 12.19

M100 100.00 116.00 32.80 15.77 12.18

M400 102.78 107.11 43.00 18.12 11.64

Item

Dose

IP

(mg/dl)

GGT

(U/l)

ALB

(g/dl)

TP

(g/dl)

CRE

(mg/dl)

T-BIL

(mg/dl)

Fcont 10.82 29.00 4.87 6.97 0.28 0.72

F25 12.43 14.33 5.35 8.02 0.38 2.64

F100 12.25 13.30 5.05 7.46 0.38 2.11

F400 12.19 26.40 4.83 7.15 0.34 1.93

Mcont 12.30 10.60 4.29 6.69 0.30 0.76

M25 12.81 20.60 4.57 7.11 0.30 1.38

M100 10.89 10.90 4.40 6.88 0.29 0.78

M400 9.03 9.78 4.23 6.54 0.29 0.63

<표 13> Biochemical serum values in SD rats after oral administrated AgNPs for 90 days

부 록❚

44

Sample pHsoil texture

(sand/silt/clay, %)

C/N

ratio

Nitrogen

content

(%)

Organic

carbon

content

(%)

Organic

matter

content

(%)

Cation

exchange

capacity

(mmol/kg)

Soil for

plant6.8

sandy loam

(72.96/17.4/9.64)96.3 0.13 12.31 21.23 2.3

Quartz

sand7.53

sand

(95.36/1.80/3.85)3.85 0.0078 0.03 0.06 0.94

Soil

#17.21

silty clay loam

(19.44/46.44/34.12)12.10 0.1314 1.59 2.74 18.66

Soil

#26.92

sandy loam

(69.84/22.44/7.72)5.66 0.0106 0.06 0.10 6.39

Soil

#36.94

sandy loam

(71.96/19.80/8.24)10.38 0.0106 0.11 0.18 7.45

Soil

#47.22

loam

(51.56/29.60/18.84)15.09 0.0338 0.51 0.89 14.15

Soil

#56.77

silt loam

(4.04/69.32/26.64)10.07 0.0457 0.46 0.79 17.01

Sedim

ent7.20

loam

(47.36/33.60/19.04)17.89 0.1308 2.34 4.03 14.00

<표 14> Physicochemical property of soil samples for adsorption and desorption test

부 록❚

45

SamplesConcentration

(mg/L)AgNPs (mL)

Sand, Soil &

Sediment (g)

Quarts

sand

AgNPs (Conc. #1) 4.68 15 5

AgNPs (Conc. #2) 11.61 15 5

AgNPs (Conc. #3) 23.01 15 1

AgNPs (Conc. #3) 23.01 15 5

AgNPs (Conc. #3) 23.01 15 15

AgNPs (Conc. #3) 35.89 15 5

AgNPs (Conc. #5) 41.58 15 5

Soils and

Sediment

AgNPs (Conc. #1) 6.97 15 5

AgNPs (Conc. #2) 17.37 15 5

AgNPs (Conc. #3) 24.47 15 5

AgNPs (Conc. #4) 54.32 15 5

AgNPs (Conc. #5) 72.21 15 5

<표 15> The volume and concentration of AgNPs and mass of quarts sand, soil and

sediment sample for adsorption and desorption test

부 록❚

46

Symbol Definition Unit

adsorption percentage at the time %

adsorption percentage at adsorption equilibrium %

mass of the test substance adsorbed on the soil at the time μg

∆ mass of the test substance adsorbed on the soil during the time interval ∆ μg

mass of the test substance adsorbed on the soil at adsorption equilibrium μg

mass of the test substance in the test tube, at the beginning of the adsorption test μg

mass of the test substance measured in an aliquot at the time point μg

mass of the substance in the solution at adsorption equilibrium μg

quantity of the soil phase, expressed in dry mass of soil g

mass concentration of the stock solution of the substance μg

initial mass concentration of the test solution in contact with the soil μg

mass concentration of the substance in the aqueous phase at thetime that the analysis is performed μg

content of the substance adsorbed on soil at adsorption

equilibrium an equilibrium μg

mass concentration of the substance in the aqueous phase at adsorption equilibrium μg

initial volume of the aqueous phase in contact with the soil

during the adsorption test

volume of the aliquot in which the test substance is measured

distribution coefficient for adsorption

Freundlich adsorption coefficient

1/n Freundlich exponent

desorption percentage at a point time %

∆ desorption percentage corresponding to a time interval ∆ %

apparent desorption coefficient

Freundlich desorption coefficient

mass of the test substance desorbed from soil at the time μg

∆ mass of the test substance desorbed from soil during the time ∆ μg

mass of the substance determined analytically in the aqueous

phase at desorption equilibriumμg

total mass of the test substance desorbed at desorption equilibrium μg

∆ mass of the substance remaining adsorbed on the soil after the time interval ∆ μg

content of the test substance remaining adsorbed on the soil at desorption equilibrium μg

mass concentration of the test substance in the aqueous phase at desorption equilibrium μg

<표 16> Definitions and units of symbols for adsorption equation

부 록❚

47

SampleFreundlich desorption

coefficient(KFdes)

Regression

constant(n)

Correlation coefficient

(r2)

Quartz sand 6.1066 0.7115 0.9145

Soil #1 12.4709 1.0027 0.5618

Soil #2 53.7898 1.1659 0.8873

Soil #3 11.0357 1.0998 0.7658

Soil #4 1773.781 1.0352 0.7601

Soil #5 131.674 1.3648 0.5218

Sediment 468.3818 1.5408 0.5620

<표 18> Freundlich desorption coefficient, regression constant, correlation coefficient

SampleFreundlich adsorption

coefficient(KFads)

Regression

constant(n)

Correlation coefficient

(r2)

Quartz sand 0.1958 0.6074 0.9608

Soil #1 42.7366 2.22 0.8197

Soil #2 160.8052 1.6611 0.5541

Soil #3 5.5259 1.177 0.9071

Soil #4 2490.577 0.9469 0.8063

Soil #5 85.5067 0.7485 0.8125

Sediment N/A N/A N/A

<표 17> Freundlich adsorption coefficient, regression constant, correlation coefficient

부 록❚

48

ItemExposure

time (hr)

Abiotic degradation (%)

1 strength 1/10 strength1/100

strength

1/1000

strength

NaCl

(27100

mg/L)

0 0.00 0.00 0.00 0.00

3 -7.03 -4.70 1.41 0.51

6 -7.26 -5.90 -3.51 0.67

9 -4.80 -6.52 -5.22 2.32

12 -6.82 -7.05 -6.73 -3.07

MgCl2

(3800

mg/L)

0 0.00 0.00 0.00 0.00

3 -7.20 -5.72 0.22 -0.63

6 -7.27 -5.68 -3.73 -0.98

9 -7.38 -5.71 -3.04 -2.49

12 -7.31 -5.67 -2.33 -1.22

MgSO4

(1700

mg/L)

0 0.00 0.00 0.00 0.00

3 -8.34 -7.03 -0.42 -0.69

6 -6.07 -6.86 -0.14 -1.25

9 -5.16 -6.79 -0.92 -1.47

12 -6.76 -6.43 -0.89 -1.78

<표 19> Abiotic degradation of AgNPs with salts

ItemExposure

time (hr)

Abiotic degradation (%)

20 mg/L 60 mg/L 100 mg/L

Humic acid

0 0.00 0.00 0.00

3 -4.79 -4.87 -4.24

6 -4.73 -4.35 -5.44

9 -4.66 -3.88 -6.09

12 -4.61 -4.49 -5.11

Fulvic acid

0 0.00 0.00 0.00

3 -6.75 -4.79 -4.24

6 -6.64 -4.79 -5.44

9 -7.18 -6.86 -6.09

12 -7.25 -6.31 -5.11

<표 20> Abiotic degradation of AgNPs with NOMs

부 록❚

49

<그림 4> Sampling sites of soil and sediment for Adsoprtion and Desorption test.

<그림 5> Hatching rate of O. latipes embryos/larvae at 14 day

upon exposure to different concentrations of AgNPs(0, 0.1, 0.25,

0.5, 0.75 and 1 mg/L). Values are presented as mean ± standard

deviation.

부 록❚

50

<그림 6> Heart beat of O. latipes embryos at 3, 5 and 7 day upon exposure

to 0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 and 1 mg/L AgNPs. Values that are significantly different

from the control are indicated by asterisks(one-way ANOVA, followed by a post

hoc test: *p<0.05). Values are presented as mean ± standard deviation.

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

Control 0.25 0.5 1 2 4 8

Fecu

ndity

Concentration (μg/L)

*

*

*

<그림 7> Fecundity of D. magna exposed to AgNPs for

21 days. mean±standard deviation,

*significant(p<0.05) difference from the control.

부 록❚

51

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

Control 0.25 0.5 1 2 4 8

Gro

wth

(mm

)

Concentration (μg/L)

*

*

*

<그림 8> Growth of D. magna exposed to AgNPs

for 21 days. mean±standard deviation,

*significant(p<0.05) difference from the control.

<그림 9> Growth rate of P. subcapitata test.

부 록❚

52

<그림 10> Changed growth rate for exposure time during the

definitive test.

<그림 11> Inhibition curve of vibrio fischeri at 15 min and 30 min.

부 록❚

53

Female

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

Fcont F25 F100 F400group

(U/l)

Glutamic pyruvic transaminase

<그림 12> GPT values in SD rats after oral administrated AgNPs

for 28 days.

부 록❚

54

Female

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0


(mg/dl)

Triglyceride

Male

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

Mcont M25 M100 M400group

(mg/dl)

Triglyceride

<그림 13> TG values in SD rats after oral administrated AgNPs for 90 days.

부 록❚

55

Female

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0


(mg/dl)

Total bilirubin

Male

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Mcont M25 M100 M400group

(mg/dl)

Total bilirubin

<그림 14> T-BIL values in SD rats after oral administrated AgNPs for 90 days.

부 록❚

56

<그림 15> SEM-EDS analysis of Soil #1.

<그림 16> Adsorption test for soil/sediment sample as

function of time.

부 록❚

57

Soil #1 Soil #2

Soil #3 Soil #4

Soil #5 Sediment

<그림 17> Adsorption percentage of AgNPs(soil#1~#5 and sediment).

부 록❚

58

#1

#2

#3

#4

<그림 18> Adsorbed concentration(left) and mass(right) of AgNPs as

function of initial AgNPs concentration(#1~#4).

부 록❚

59

Soil #1 Soil #2

Soil #3 Soil #4

Soil #5 Sediment

<그림 19> Desorption percentage of AgNPs(soil#1~#5 and sediment).

부 록❚

60

Soil #1 Soil #2

Soil #3 Sediment

<그림 20> Desorbed Ag mass as function of initial AgNPs concentration

(#1~#3 and sediment).

부 록❚

61

#1

#2

#3

#4

<그림 21> Dark field(left) and bright field(right) image of Soil #1 ~ #4.

부 록❚

62

<그림 22> Linearized Freundlich adsorption plot.

<그림 23> Linearized Freundlich desorption plot.

부 록❚

63

<그림 24> AgNPs in DW(left) and culture medium(right).

pH

0 2 4 6 8 10 12 14

Total Concentration (%

)

0

20

40

60

80

100

120

Ag+

Ag2OCerargyrite (AgCl)

<그림 25> Ag species in mineral medium (10 mg/L of Ag ion).

부 록❚

64

AgNP Concentration (mg/L)

Survival Population (Log CFU

/mL)

0

2

4

6

8

10

0 1 10

<그림 26> Microbial inactivation by AgNPs (initial

population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

Ag+ Concentration (m

g/L) 0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

AgNP 1 mg/L Ag+ 1 mg/L

<그림 27> Ag ion concentration in the presence of

microorganisms (initial population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

부 록❚

65

Time (day)

0 1 2 3 4 5

Ag+ C

oncentration (mg/L) 0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

BiodegradationAbiotic control

<그림 28> Biodegradation concentration of 10 mg/L

AgNPs (initial population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

Time (day)

0 1 2 3 4 5

AgNP D

egradation (%)

-15

-10

-5

0

5

10

BiodegradationAbiotic control

<그림 29> Biodegradation percentage of 10 mg/L

AgNPs (initial population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

부 록❚

66

<그림 30> UV/vis spectra of AgNPs with concentration of salts; NaCl (A) 27.1

and (B) 27100, MgCl2 (C) 2.8 and (D) 2800, and MgSO4 (E) 1.7 and (F) 1700 mg/L.

부 록❚

67

<그림 31> Concentration of Ag ion with exposure time of NaCl(left) and MgCl2(right).

<그림 32> Concentration of Ag ion with exposure time of humic acid(left) and fulvic acid(right).

<그림 33> Image of AgNPs solution with exposure time of light.

부 록❚

68

<그림 34> UV/vis spectra of AgNPs with exposure time of light >400

nm(left) and >300 nm(right).

<그림 35> Abiotic degradation of AgNPs in the presence of light.

부 록❚

69

No sonication Sonication

Bioaccumulation (m

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Static Stirring

<그림 36> Bioaccumulation of AgNPs (initial

population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

Time (day)

0 1 2 3 4 5

Bioaccumulation (m

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

1 mg/L10 mg/L

Time (day)

0 1 2 3 4 5

Bioaccumulation (%

) 0

10

20

30

40

50

1 mg/L10 mg/L

<그림 37> Bioaccumulation concentration and percentage of AgNPs

(initial population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

부 록❚

70

<그림 38> Size distribution of AgNPs in

microorganism.

Time (day)

0 1 2 3 4 5

Particle Num

ber / Cell

0

10

20

30

40

50

60

1 mg/L10 mg/L

<그림 39> AgNP numbers uptaken by microorganism

(Initial population of microbes ≅ 108 CFU/mL).

Documents

제조은나노 물질에 대한 유해성 연구webbook.me.go.kr/DLi-File/NIER/06/001/5256594.pdfⅡ. 연구내용 및 방법 6) * B