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二菌種複合バイオフィルムを利用した エタノール発酵法
研究責任者 ： 森永 康 （日本大学 生物資源科学部 教授） 副責任者 ： 古川 壮一（日本大学 生物資源科学部 准教授）
コーディネータ： 渡辺 麻裕（日本大学 産官学連携知財センター（NUBIC））
新技術説明会 A-STEP探索タイプ
プレゼンテーション
2012年10月30日
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研究背景：酵母利用バイオプロセスの重要性
酒類 ３．２兆円
天然調味料 ０．３
パン ０．７
計 ４．２兆円
国内の酵母利用製品出荷額 （平成18年度バイオ産業創造基礎調査データより推定）
日経新聞2008.05.15
酵母利用プロセスはバイオ産業分野で最大規模 バイオエタノール生産の拡大でその重要性はますます高まる ⇒
酵母利用プロセスを抜本的に効率化できれば大きなインパクト
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3 3 アルコール協会資料より
研究背景：バイオエタノール製造技術の課題・問題点
＊
＊
＊特に重要なのは、連続化、雑菌対策、セルロース利用
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4
研究シーズ
酵母・乳酸菌の相互作用研究 複合バイオフィルムの発見
社会ニーズ
固定化酵母技術の重要性 バイオエタノールなど
複合バイオフィルムの 固定化微生物としての利用？
着眼点=微生物の自動固定化
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固体
バイオフィルム
液体
バイオフィルム（BF）とは
・ 固液界面に形成されるフィルム状の微生物集合体
・ 多種の微生物とその生成物（細胞外多糖など）から成る場合が多い
・ 伝統発酵福山酢製造工程から分離した乳酸菌Lactobacillus plantarum ML11-11は
酵母との共培養すると顕著な複合ＢＦを形成
酵母単独
ML11-11と酵母の複合バイオフィルム
微生物群集
バイオフィルム（ＢＦ）とは
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例：清酒造り
技術面 ・小規模 小投資 軽装備 省エネ ・不完全殺菌 オープン培養 ・高濃度エタノール発酵 社会面 ・地域農業との連携
地産地消 ・桶売り ・蔵元は地域コミュニティの中核 日本型バイオマス利用システム
日本の伝統発酵システム
酵母と乳酸菌の共存、優先化により発酵を安定化
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文政12年 (1829年) 頃から約180年間、 伝統的方法で製造されている米酢 福山酢
野外にて醸造
鹿児島霧島市福山町
研究開発成果：日本の伝統的発酵システムからの発見 （温故創新）
蒸米
米麹
振り麹
水
発酵管理を 一切行わない！
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複合ＢＦ形成菌の同定結果
18S rDNA配列より Y11-43：Saccharomyces cerevisiae
16S rDNA配列より ML11-11：Lactobacillus plantarum
ＢＦ形成量評価
バイ
オフィ
ルム
形成
量 (A 5
90)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Y11-43 ML11-11 共培養 走査型電顕でみたＢＦの形態
二菌種を一緒に培養するだけで 固定表面に菌体が固定化される
新規乳酸菌の複合ＢＦ形成能
共培養 複合ＢＦ
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浮遊細胞 酵母と乳酸菌がマンナンと 表層タンパクを介して接着
凝集・沈澱
酵母と乳酸菌が凝集・沈殿して 初期BFに接着し複合BFに成長
乳酸菌が担体に接着して 初期BFを形成
乳酸菌
酵母
タンパク マンナン
バイオフィルム（ＢＦ）形成モデル
細胞密度上昇
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固体（担体）
バイオフィルム（ＢＦ）は 固定化微生物
液体 微生物群集
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
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固体
液体 （油） 液体
気体 液体
バイオフィルムは界面の微生物反応を可能に ?
固体
気体 液体
醸造もろみ サイレージ
酢酸発酵 石油発酵
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未洗浄
複合
酵母単独
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
酵母
単独
酵母
（複
合）
乳酸
菌
（複合
）
生菌数
lo
g (C
FU
/m
l)
複合
洗浄後 未洗浄
複合ＢＦの安定性 酵母単独
洗浄後
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ＢＦを利用した反復回分発酵
使用培地：ＹＰＤ培地（グルコース濃度10％）
24 h毎に培地を入れ替え発酵試験を繰り返す
培養温度：３０℃
カラムリアクター：５０ｍｌ 容 担体：カラスビーズ or セルロースビーズ （4mmφ）
酵母活性低下
セルロースビーズ使用 ビーズ付着酵母の生菌数(10日目）
複合系 単独系
loｇ C
FU
/m
l
使用菌株：S.cerevisiae BY4741, L.plantarum ML11-11
アル
コール
％(w/v)
アルコール
％(w/v)
複合ＢＦ
複合ＢＦ
酵母単独
酵母単独
反復回数 反復回数
セルロースビーズ担体 ガラスビーズ担体
酵母剥離
培地
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複合ＢＦリアクターシステム
A-STEP
培地貯槽
ﾁｭｰﾌﾞﾎﾟﾝﾌﾟ
ﾊﾞｲｵﾌｨﾙﾑﾘｱｸﾀｰ 発酵液貯槽
ＢＦを利用した連続発酵システム
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pH
複合ＢＦ連続発酵の成績例 A-STEP
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連続（Glu 10%) 連続 連続 反復（Glu 2%) 反復
連続発酵の 再開は容易
アルコ
ール %(w/v)
複合ＢＦリアクターは非定常状態から容易に立ち直る
複合ＢＦ利用システムのロバスト性 A-STEP
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バイオマス利用の可能性 A-STEP
稲わらとセルロースビーズの複合BF担体としての比較例 （ML11-11とBY4741の複合BF系を使用）
担体 エタノール （w/v％）
変換率 （w/w%）
セルロースビーズ 4.18 42
稲わら 4.00 40
＊反復回分７～１０日目の４日間の平均値 使用培地：ＹＰＤ（10%w/v グルコース）
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抗菌物質を生産する複合BF形成菌の取得 A-STEP
HM23単独 HM23＋酵母 BY4741
バイオフィルム形成（A
590
)
複合BFの雑菌排除能を更に高めるため バクテリオシン生産能をもつ複合ＢＦ形成菌 Lactobacillus plantarum
HM23を取得
HM23の抗菌性（阻止円形成）
酵母とHM23による複合BF形成 酵母とHM23の複合BFによる反復回分発酵
L. plantarum HM23の使用で、無殺菌連続 培養の可能性が高まることが期待される ＊被験菌：P.
pentosaseus
20%ｸﾞﾙｺｰｽ 15%ｸﾞﾙｺｰｽ 10%ｸﾞﾙｺｰｽ
反復回数
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モデル雑菌混入試験 （BY・HM複合系に雑菌汚染）
酵母（BY)：大腸菌でわずかに阻害 大腸菌(MG)：酵母でも阻害されるが 乳酸菌HM が存在すると顕著に阻害
⇒ HMは優れた雑菌排除能を有す
A-STEP
酵母（BY）：枯草菌に全く影響されず 枯草菌（Bs）：酵母でも阻害されるが 乳酸菌が存在すると完璧に阻害
モデル雑菌＝大腸菌
モデル雑菌＝枯草菌
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従来法
回分 連続 半連続 反復回分
固定化 酵母
凝集性 酵母
本 法
乳酸菌と共培養するだけで・・・ 低コスト発酵システム
• 酵母菌体を自動的に固定化 ⇒ 小投資
• 菌体回収不要 ⇒ 軽装備
• 連続化で高い生産性 ⇒ 設備の小型化
• 雑菌排除能⇒メンテナンスフリーな省力システム
新技術の特徴，従来・競合技術との比較
設備投資大型遠心 分離機
固定化剤煩雑な 工程
低い 生産性 雑菌汚染
リスク
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想定される用途
共培養
バイオエタノールの連続発酵 酒類等の連続発酵
アルコール以外の有用物質の生産
連続化で高い生産性
単独微生物では できない有用物質
の生産
発酵や水浄化などの連続微生物処理
菌体回収不要
無殺菌・低殺菌発酵、
メンテナンスフリー生産
酵母菌体自動固定化 雑菌排除能
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菌体自動固定化能
雑菌 排除能
菌体回収工程不要
殺菌用 熱エネルギー削減
酵母を利用する バイオエタノール， アルコール飲料等の生産、有用物質生産プロセスの省エネ・効率化
想定される技術移転
省投資・省エネ・小型分散 システム ⇒農林業と連動した 地域バイオマス燃料生産
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集中精製プラント
農村A
複合微生物系 バイオフィルム
発酵槽
桶買い
桶買い
桶買い
桶買い
農村D 農村C
農村B
地域分散型バイオマスリファイナリーシステムの概要
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発明の名称 ：「バイオフィルムの生産方法」他２件
登録番号 ：登録4686791 他2件出願中
出願人 ：学校法人日本大学
特許関連情報
謝辞
科学技術振興機構 平成２２年度・平成２３年度 研究成果最適展開支援プログラム（A－STEP)
知財活用促進ハイウェイ大学特許価値向上支援
日本大学生物資源科学部 大型研究プロジェクト 「アジア地域における次世代バイオマス生産・利用開発のための基盤研究」
日本大学 生物資源科学部 食品微生物学研究室 阿部 侑、今井巧大、渡辺真哉、鈴木智弘、深瀬 栄、平山 悟 同学部
荻原博和教授
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御清聴ありがとうございました。
＜連絡先＞ 日本大学産官学連携知財センター（NUBIC） 〒102-8275 東京都千代田区九段南4-8-24 渡辺
麻裕（ﾜﾀﾅﾍﾞ ﾏﾕ） TEL：03-5275-8139 FAX：03-5275-8328
E-mail：[email protected]
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