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I N V I T R O FERTILIZATION AND EMBRYO CULTURE 703H o w e v e r
, a p p l i c a t i o n o f i n v i t r o f e r t i l i z a t i ont
e c h n i q u e s t o f o l l ic u l a r o o c y t e s m a y b e p
r a c t i c a lf o r o b t a in i n g l ar g e n u m b e r s o f e
m b y o s e i t h e rfo r r e se a rc h purpose s o r fo r t r a ns
fe r . Fo l l i c u l a ro o c y t e s , f e r t i l i z e d a n d
c u l t u r e d i n v i t r o h a v ere su l t e d i n p re ga na
nc i e s i n ma mma l i a n spe c i e s .H o w e v e r , t h e c a
p a c i t y o f f o l l ic u l a r o o c y t e sf r o m f a r m a n
i m a l s t o b e f e r il iz e d a n d t o d e v e l o pn o r m a
l l y h a s n o t b e e n t h o r o u g h l y i n v e s t i g a t e
d .
I n v i t r o c u l t u r e t e c h n i q u e s h a v e a l l o
w e d t h es t u d y o f m a m m a l i a n e m b r y o s u n d e r
c o n t r o l l e de n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s .
T h i s h a s r e s u l t e d i nt h e c a p a b i li t y t o s t o
re e m b r y o s f r o m m o s t f a r ms p e c ie s , f o r s h o
r t p e r i o d s o f ti m e d a y s ) , b e f o r et r a n s f e r
t o r e c i p i e n t f e m a l e s. M o r e r e c e n t l y ,s o m
e s u c c e s s h a s b e e n r e p o r t e d i n t h e s t o r a g
eo f e m b r y o s b y f r e e z i n g a n d r e f r i g e r a t i
o n .E m b r y o s t o r a g e , e i t h e r f o r s h o r t o r l
o n g p e r i o d s ,i s c r i t i c a l fo r r e a l i z a t i on
o f t he be ne f i t s t o bea c h i e v e d t h r o u g h e m b r
y o t r a n s f e r .
n Vi tro e r t i l i z a t i onFe r t i l i z a t i on e nc om
pa sse s a s e r ie s o f e ve n t s
t h a t r e s u l t in t h e f u s i o n o f t h e m a l e a n d
f e m a l eg a m e t e s , s p e c i fi c a ll y : 1 ) c o n t a c
t w i t h a n d p e n e -t r a t i o n o f t h e c e ll u la r i n
v e s t m e n t s o f a n o o c y t eb y a s p e r m a t o z o o n
; 2 ) p e n e t r a t i o n o f t h e z o n ap e l lu c i d a ; 3 )
fu s i o n o f t h e s p e r m a t o z o o n a n do o c y t e e x t
er n a l m e m b r a n e s , a n d 4 ) p r o n u c l e if u s i o n
s y n g a m y ) a n d a li g n m e n t o f t h e i r r e s p e c-t
iv e c h r o m o s o m e s o n t h e f i r s t c l e av a g e s p i
n d le .U l t r a s t r u c t u r e s t u d i e s h a v e d o c u m
e n t e d e a c h o ft he se phy s i o l og i c a l . e ven t s Aus
t i n , 1968 ; B e d-f o r d , 1 9 7 0 ; Z a m b o n i , 1 9 7 1 ;
G o u l d , 1 9 7 5 ;G w a t k i n , 1 9 7 7 ) .C h a n g 1 9 5 9 )
c l e ar ly d e m o n s t r a t e d t h a tr a b b i t s p e r m a
t o z o a m u s t u n d e r g o c a p c i ta t io nb e f o r e a c
h i e v i n g t h e c a p a c i t y t o p e n e t r a t e a noo c y
t e . T he f i nd i ng t ha t t he so-c a l l e d c or t i c a la n
d z o n a r e a c t i o n s a c t t o b l o c k p o l y s p e r m
yA u s t i n , 1 9 6 8 ; J o h n s o n , 1 9 7 5 ; G w a t k i n ,
1 9 7 6 ;S o l t er , 1 9 7 7 ; Y a n a g a m a c h i , 1 9 7 7 ) ,
a l o n g w i t hd e t a i le d u h r a s t r u c t u r a l o b s e
r v a t io n s o f s p e r m a t o -z o o n a n d o o c y t e S z o
l lo s i a n d R i s, 1 9 6 1 ) , h a s e n -h a n c e d t h e u n
d e r s t a n d i n g o f t h e m o l e c u l a r , c e l-l u l a r
a nd phy s i o l og i c a l p roc e s se s o f f e r t i l i z a t
i on .
I n v i t r o f e r t il i z a ti o n h a s b e e n a t t e m p
t e d i nm a m m a l s f o r n e a r l y a c e n t u r y b u t h a
s b e e n s u c -c e s s fu l i n o n l y f i ve spe c ie s : r a
bb i t s , r a t s , mi c e ,h a m s t e r s a n d h u m a n s . P
r e g n a n c ie s o r li v e y o u n gf r o m o v u l a t e d o o
c y t e s f e r t i l i z e d i n v i t r o h a v eb e e n r e p o
r t e d i n s t u d ie s w i t h r a b b i t s C h a n g ,1 9 5 9 ;
T h i b a u l t a n d D a u z e i r , 1 9 6 1 ; B e d f o r d a n
dC h a n g , 1 9 6 2 ; F r a s e r a n d D a n d e k a r , 1 9 7 3
;Se ide l e t a l . 1 9 7 6 ) , ra t s T o y o d a a n d C h a n g
,
1 9 7 4 ) a n d m i c e P a v l o k , 1 9 6 7 ; W h i t ti n g h
a m ,1 9 6 8 ; H o p p e a n d P i tt s , 1 9 7 3 ) .
M a t u r e o o c y t e s u s e d f o r i n v i t r o f e r t i
l i z a t i onh a v e b e e n c o l l e c t e d f r o m p r e o v u
l a t o r y f o l l i c l e so f u n t r e a t e d o r g o n a d o
t r o p i n - t r e a t e d d o n o r s , inw h i c h c a se o o c
y t e m a t u r a t i o n h a s a l r e a d yo c c u r r e d i n v
i vo . A l t e r n a t i v e l y , i m m a t u r eo o c y t e s h a
v e b e e n c o l l e c t e d f r o m i m m a t u r e o rra ndoml y
se l e c t e d fo l l i c l e s , i n whi c h c a se t he ya r e m
a t u r e d i n v i t ro . F o l l ic u l a r o o c y t e s f e r t
il i z e di n v i t r o ha ve re su l t e d i n p re gna nc i e s i
n r a bb i t sB ra c k e t t , 1973 ) , mi c e C ross a nd B r ins
t e r ,1 9 7 0 ) a n d h u m a n s S t e p t o e a n d E d w a r d
s ,1 9 7 6 ) . P r e g n a n c i e s h a v e b e e n r e p o r t e
d i nr a b b i t s T h i b a u l t e t a l . 1 9 7 5 ) a n d s h e
e p C r a ne t a l . 1 9 7 6 ; M o o r a n d T r o u n s o n , 1 9
7 7 ) , a n dp o s s i b l y p i gs H a r m s a n d S m i d t , 1 9
7 0 ) , a f t e r t h et r a n s f e r o f f o l l i c u l a r o o
c y t e s t o t h e o v i d u c t s o fm a t e d r e c i p i e n t
s a n d f e r t i l i z a t i o n i n ~ i vo .T h e p u r p o s e o
f t h is s e c t io n i s t o r e v i ew t h el i t e r a t u r e o
n i n v i t r o f e r t il i z a ti o n a n d t h e u s e o ffo l l
i c u l a r ooc y t e s i n dome s t i c a n i ma l s , wi t hs p e
c ia l e m p h a s i s o n t h e m a j o r f a r m s p e c ie s . N
oa t t e m p t i s m a d e t o d e s c r i b e o r d e t a i l t h
e e v e n t sa s s o c ia t e d w i th o o c y t e m a t u r a t i
o n o r t h em o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c
a l e v e n t s i n v o l v e di n fe r t i l i z a t i on . Ma mma
l i a n fe r t i l i z a t i on ha sb e e n t h e s u b j e c t o f
m a n y r e v i e w s , a n d t h ef o l lo w i n g ar e r e c o m
m e n d e d : A u s t i n 1 9 5 1 ,1 9 6 1 ) , C h a n g a n d P i
n c u s 1 9 5 1 ) , S m i t h 1 9 5 1 ) ,A u s t i n a n d B i s h
o p 1 9 5 7 ) , C h a n g 1 9 5 7 , 1 9 6 8 ) ,T h i b a u l t a n
d D a u z i e r 1 9 6 1 ) , B r a c k e t t 1 9 6 9 ,1 9 7 1 ) , T
h i b a u l t 1 9 6 9 ) , B e tt e r id g e 1 9 7 7 ) a n dV a n B
l er k o m a n d M o t t a 1 9 7 9 ) .
I n V i t r o F e r t i l i z a t i o n i n C a t t le . T h e r
e a r e n op u b l i s h e d r e p o r t s o f l i ve b i r th s o
r p r e g n a n c i e sf r o m b o v i n e o o c y t e s w h e n f
e r t i l i z a t i o n h a sb e e n a t t e m p t e d e n t i r e
l y i n v i t ro . In se ve ra ls t ud i e s t a b l e 1 ), fo l l
i c u l a r oo c y t e s ha ve be e nh a r v e st e d f r o m u n t
r e a t e d a n d g o n a d o t r o p i n -t r e a t e d f e m a l
e s a n d t r a n s f e r r e d t o t h e o v i d u c t so f p r e
v i o u s l y i n s e m i n a t e d r e c i p ie n t s H u n t e r
e tal . 1 9 7 2 ; B a k e r a n d P o l g e , 1 9 7 6 ; N e w c o m
b e tal . 1 9 7 8 ) . N e w c o m b e t a L 1 9 7 8 ) r e p o r t e
d t h eb i r t h o f a c a l f f r o m a n o o c y t e f e rt i li
z e d u n d e rt he se c ond i t i ons . R e su l t s t a b l e 1 )
o f e xpe r i -m e n t s i n w h i c h f e r t i l i z a t i o n h
a s b e e n a t t e m p t e de n t i r e l y i n v i t r o w i t h
a v a r i e t y o f m e d i a a n dc o n d i t i o n s a r e le s s
e n c o u r a g i n g S r e e n a n , 1 9 7 0 ;B re gul l a e t a l
. 1 9 7 4 ; B a k e r a n d P o l g e , 1 9 7 6 ;I r i t a n i a nd
Ni wa , 1977) .I n o t h e r s t u d i e s , f e r t i l iz a t i o
n o f b o v i n eo o c y t e s h a s b e e n a t t e m p t e d i n
o v i d u c t s o fh e t e r o l o g o u s s p ec ie s . S r e e n
a n 1 9 7 0 ) a n dT r o u n s o n et a l . 1 9 7 7 ) o b s e r v e
d n o s p e r m
by on April 15, 2008.jas.fass.orgDownloaded from
permission.Copyright 1981 American Society of Animal Science.
All rights reserved. For personal use only. No other uses
without
http://jas.fass.org/http://jas.fass.org/http://jas.fass.org/
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7 0 4 W R I G H T , J R . A N D B O N D I O L I
o
Zo + ~
. .~ ..~ ..~ ~ ~ '~- ' a
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00 90 or~
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by on April 15, 2008.jas.fass.orgDownloaded from
permission.Copyright 1981 American Society of Animal Science.
All rights reserved. For personal use only. No other uses
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I N V I T R O FER TILIZATION AND EMB R YO C ULTUR E 707o p t i m
a l f o r s p e r m a t o z o o n a n d o o c y t e f u s i o na n
d t h e s e c o n d c o m p a t i b l e w i t h c le a v a g e o f
th ee m b r y o .
I n V i t ro Fe r t i l i za t i on i n P igs . Fe r t i l i z a
t i on inv i t r o o f p o r c i n e f o l l i c u l a r a n d o v
u l a t e d o o c y t e sh a s b e e n r e p o r t e d ( H a r m s
a n d S m i d t , 1 9 7 0 ) ,b u t t h e r e s u l t s h a v e n o
t b e e n c o n f i r m e d ( t a b l e3 ). H a r m s a n d S m i d
t ( 1 9 7 0 ) u s e d f o l li c u l arf l u i d f o r b o t h s p
e r m c a p a c i t a t i o n a n d o o c y t ei n c u b a t i o n
s . B a k e r a n d P o l g e ( 1 9 7 6 ) , u s i n ge s s e n t i
a l l y t h e s a m e s y s t e m , o b s e r v e d n op e n e t r
a t io n o f o o c y t e s b y s p e r m in v i t ro .H o w e v e r
, s p e r m p e n e t r a t i o n d i d o c c u r i f t h es p e r
m a t o z o a a n d o o c y t e m i x t u r e w a s tr a n s f e rr
e da f t e r 4 h r o f i n v i t ro i n c u b a t i o n t o t h e o
v i d u c t sof unma t e d e s t rus r e c i p i e n t s . Thus , r
e su l t so b t a i n e d i n v i v o sugge s t t ha t t he i n v i
t roi n c u b a t i o n c o n d i t i o n s w e r e n o t su i t a
b le f o rs p e r m c a p a c i t a t io n o r s o m e o t h e r u
n d e f i n e da spe c t o f f e r t i l i z a t i on i n p igs
.
P o l g e ( 1 9 7 7 a ) r e p o r t e d p e n e t r a t i o n o
f a h i g hp e r c e n t a g e o f o o c y t e s , m a t u r e d i
n v i t ro t h a tw e r e t r a n s f e r r e d t o t h e o v i d u
c t s o f i n s e m i n a t e de s t rus g i l t s . Howe ve r , no
ooc y t e s de ve l ope d t ot h e b l a s t o c y s t s ta g e a n
d a h ig h i n c i d e n c e o fp o l y s p e r m y w a s r e p o r
t e d . P o l g e ( 1 9 7 7 a )s u g g e s t e d t h a t b l o c k
s t o p o l y s p e r m y , w h i c hd e v e l o p i n v i v o c o
n c o m i t a n t l y w i t h n u c l e a rm a t u r a t i o n ( P
o l g e a n d D z i u k , 1 9 6 5 ) , w e r ea b n o r m a l in s o
m e o o c y t e s . I f f e r t il i z a ti o no c c u rs b e f o r
e o o c y t e m a t u r a t i o n is c o m p l e t e ,a b n o r m a
l f e r t i li z a t io n o r e m b r y o n i c d e v e l o p -m e
n t c o u l d r e s u l t ( B a k e r a n d P o l g e , 1 9 7 6 )
.L e m a n a n d D z i u k ( 1 9 7 1 ) , h o w e v e r , r e p o r
t e ds o m e n o r m a l e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t a
m o n go o c y t e s c o l l e c te d f r o m t h e o v a r i es o
f g i lt st r e a t e d w i t h h u m a n c h o r i o n i c g o n a
d o t r o p i n 1 2h r b e f o r e t h e e x p e c t e d t i m e o
f o v u l a t i o n .C e r t a in l y , t h e q u e s t i o n o f o
o c y t e n o r m a l i t yf o l l o w i n g i n v i t r o m a t u
r a t i o n , p a r t i c u l a r l y i np ig s, i n w h i c h a h
i g h i n c id e n c e o f c h r o m o s o m a la b n o r m a l i t
i e s i s f o u n d ( M c G a u g h e y a n d P o l g e ,1 9 7 1 ),
is a c o m p o n e n t o f i n v i t r o s tudies tha t i sd i f f
i c u l t t o e v a l ua t e .
n o t b e e n d u p l i c a t e d u n d e r p r e s e n t i n v
i t r oc ond i t i ons ; S t ud i e s i n whi c h fe r t i l i z a
t i on isc o m p l e t e d i n v i v o b y t h e t r a n s f er o f
o o c y t e s t oo v i d u c t s o r i n w h i c h s p e r m a t o
z o a a n d o o c y t e sa r e o n l y i n c u b a t e d i n v i t
ro fo r l e s s t ha n 12 hrc o n t r i b u t e l i tt l e t o w a
r d d e f in i n g t h e r e q u i re dc o m p o n e n t s o f i n
v it r o f e r t i l i z a t i on . In a dd i t i on ,t h e m e t h
o d s u s e d t o e v a l u a t e f e r t i l i z a t i o n i nv i
t r o s u ch a s o o c y t e p e n e t ra t io n , p o l a r b o d
ye x p u l s io n a n d p r o n u c le i f o r m a t i o n , m a y
n o ta c c ura t e l y r e f l e c t t he f e r t i l i z a t i on
ra t e . Fore x a m p l e , rh e s us m o n k e y e m b r y o s t h
a t a p p e a r e dm o r p h o l o g i c a ll y n o r m a l u n d e
r l o w m a g n if ic a -t i o n c o n t a i n e d a h ig h n u m b
e r o f u l t r a s t r u c t u r a la b n o r m a l i t i e s ( B
a t t a e t a l . 1978) .O o c y t e s h a v e b e e n c o l l e c
t e d f r o m o n e o ft h r e e s o u r c e s : ( 1 ) t h e o v i
d u c t , s o o n a f t e ro v u l a t i o n ; ( 2 ) m a t u r e f
o l l i c l e s , s h o r t l y b e f o r eovu l a t i on , o r (3
) i m m a t ur e o r a t r e t i c fo l li c le s ,u s u a l l y f
r o m a b a t t o i r m a t e r i a ls . S o m e r e -s e a r c h e
r s h a v e a t t e m p t e d t o d e f i n e t h e r o l e o fo o
c y t e m a t u r a t i o n in i n v i t ro f e r t i l i z a t i
on( T r o u n s o n e t al. 1 9 7 7 ) b y o b s e rv i ri g t h e s
h a p eof t he c um ul us c e ll s, a nd t he y ha ve ge ne ra l l
yob t a i ne d supe r i o r r e su l ts wi t h so-c a l l e d a c t
i -v a t e d . o o c y t e s . H o w e v e r , t h e o v e r a ll l
o w le v e lo f s u c c es s a n d t h e h i g h d e g r e e o f p
h y s i c a la b n o r m a l i t ie s i n o f f s p r i n g o f o t
h e r s p e c ie s( F r a s e r a n d D a n d e k a r , 1 9 7 3 ; T
o y o d a a n dC h a ng , 1 9 7 4 ) e m p h a s i z e t h a t m u c
h r e m a i n s t ob e l e a r n e d a b o u t t h e e f f e c t o
f o o c y t e q u a l i t yo n i n v i t ro f e r t i l i z a t i
on .
S p e r m c a p a c i ta t i o n m a y i n vo l v e r e m o v a
l o fs p e r m s u r f a c e a n t i g e n s ( O l i p h a n t a n
d B r a c k e t t ,1973a , b ) ; h ow e ve r , i t s ro l e i n f e
r t i l i z a t i on i nd o m e s t i c a n i m a l s i s n o t w e
l l u n d e r s t o o d .F e r t i l i z a t i o n o f o o c y t e
s a t t e m p t e d f o l l o w i n g inv i v o s p e r m i n c u b
a t i o n h a s g e n e r a ll y p r o v e ds u p e r i o r t o i n
v i t ro i nc uba t i on . C l e a r l y , a dd i -t i o n a l w o
r k i s n e e d e d t o d e f i n e n o t o n l y t h er o le o f c
a p a c i ta t io n , b u t o o c y t e m a t u r a t i o n ,f e r
t i l i z a t i o n m e d i a a n d i n c u b a t i o n c o n d i t
i o n s ,as well.
D i s c u s s i o nI t is c l e a r f r o m t h e l i m i t e d
n u m b e r o f s t u d i e sw i t h d o m e s t i c f a r m a n i
m a l s t h a t f e r t i l iz a t io n o fo o c y t e s w i t h i
n t h e o v i d u c t s o f t h e s a m e o r
d i f fe re n t spe c i e s y i e l ds r e su l t s supe r i o r
t o t hoseo b t a i n e d w i t h i n v i t r o s y s t e m s . T h
e r o l e s o fc a p a c i ta t io n o f s p e r m a t o z o a , o
o c y t e m a t u r a t i o na n d b i o c h e m i c a l c o m p o
n e n t s i n t h e f e r t i l i z a t i o np r o c e s s a r e s
ti ll la r g e l y u n k n o w n , a n d t h e y h a v e
E m b r y o C u l t u re in F a r m n i m a l sE a r ly c u l tu
r e s y s t e m s f o r t h e d e v e l o p m e n t
o f b o v in e , o v i n e a n d p o r c in e e m b r y o s w e
r e o ft w o k i n d s , d e s i g n e d t o m e e t t w o o b j e
c t i v e s .T h e f i r s t s y s t e m w a s l o n g - t e r m c
u l t u r e ( d a y s )w h e r e b y v a r i o u s m e d i a , a t
m o s p h e r e s a n de m b r y o h a n d l i n g t e c h n i q u
e s c o u l d b e s t u d i ed .T h e s e c o n d w a s a s h o r t
- t e r m c u l t u r e s y s t e m( h o u r s ) i n w h i c h e m
b r y o s c o u l d b e h e l d b e f o r eb e i n g t r a n s f e
r r e d t o r e c i p i e n t f e m a l e s.
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I N V I T R O F E R T I L I Z A T I O N A N D E M B R Y O C U L
T U RE 7 0 9M a n y s t u d i e s h a v e e x a m i n e d t h e r e
q u i r e -
m e n t s f o r c u l t u r e o f b o v i n e a n d o v i n e e
m b r y o st o g e t h e r , a n d , t h u s , i n th i s r e v i e
w t h e y a rec o m b i n e d i n a s i n g l e s e c t i o n , a n
d p o r c i n e a n dc a p r i n e e m b r y o s a r e d i s c u s
s e d s e p a r a t e l y . T h ef o l l o w i n g r e v ie w s d e
a l w i th e m b r y o c u l t u r e a n ds t o ra g e i n m a m m
a l s a n d a r e r e c o m m e n d e d :F o o t e a n d O n u m a
( 1 9 7 0 ) , M a u r er ( 1 9 7 6 ) ,S e id e l ( 1 9 7 7 ) a n d
K a n e ( 1 9 7 8 ) .
B o v i n e a n d O v i n e E m b r y o C u l t u r e L i k e t
h em e d i a u s e d f o r e m b r y o s o f l a b o r a t o r y s
p e c ie s ,t h e f i rs t c u l t u r e m e d i a t e s te d f o r
b o v i n e an do v i n e e m b r y o s u t i l i z e d p la s m a
s , se r a o r u n d e -f i n e d b i o l o g i c a l f lu i d s (
t ab l e s 4 a n d 5 ). D o w l i n g( 1 9 4 9 ) u s e d a n e gg -
sa li ne m e d i u m d e v e l o p e d b yH a m m o n d ( 1 9 49 )
f o r m o u s e e m b r y o c u l tu r ea n d f o u n d t h a t o n
e o f 1 4 e i g ht -c e ll b o v i n ee m b r y o s d e v e l o p e
d t o 1 6 ce lls . R o b i n s o n( 1 9 5 0 ) r e p o r t e d t h e
s u c c e s sf u l c u l tu r e o f o v i n ee m b r y o s i n w h
o l e o v i n e s er u m a t 3 7 C , b u tt r a n sf e r s w e r e
n o t m a d e a n d t h e s t a in i n gp r o c e d u r e w a s n o
t a d e q u a t e t o t e s t t h e v i a b il it ya n d d e v e l
o p m e n t o f t h e cu l t u r e d e m b r y o s .P i n c u s ( 1
9 5 1 ) , B r o c k a n d R o w s o n ( 1 9 5 2 ) a n dW i n t e n
b e r g e r et al ( 1 9 5 3 ) c u l t u r e d p r e m o r u l ab o
v i n e e m b r y o s i n s e r u m . D e v e l o p m e n t w a sl
i m i t e d t o . 8 t o 1 . 2 d i v i s i o n s p e r e m b r y o a
n d n od e v e l o p m e n t w a s n o t e d a f t e r 4 8 h r in
cu l t u r e.
H a n c o c k ( 1 9 6 3 ) a t t e m p t e d t o c u l t u r e p
r e -i m p l a n t a t i o n o v i n e e m b r y o s i n W h i t te
n ' s M e -d i u m ( T a r k o w s k i , 1 9 6 1 ) , w h i c h ha s
b e e n s h o w nt o s u p p o r t t h e d e v e l o p m e n t o f
m o u s e e m b r y o sf r o m t h e e i g h t - c el l t o t h e b
l a s t o c y s t s ta g e .
F r e s h e m b r y o s w e r e c o l l ec t e d i n W h i t t e
n ' sM e d i u m a n d t r a n s f e r r e d t o r e c i p i e n t
e w e s a f t e rn o t m o r e t h a n 5 h r o f s to r a g e i n a
ir a t 2 3 C .
S t o r e d e m b r y o s w e r e k e p t f o r 2 4 t o 4 8 h r
i nW h i t t e n ' s M e d i u m i n t h e d a r k a t 2 3 C i n a
i r .
C u l t u r e d e m b r y o s w e r e c o l l e c te d i n o v i
nes e r u m a n d t ra n s f e r r ed t o W h i t t e n 's M e d i
u m a n dc u l t u r e d f o r 2 4 t o 4 8 h r a t 3 7 C. F i f t e
e n o f 4 2e m b r y o s c l a ss i fi e d a s f r e s h s u r v i
v e d t r a n s f e rt o r e c i p i e n t e w e s , a n d 1 1 o f
23 s to r e d e m b r y o sw e r e d e v e l o p in g w h e n r e c
o v e r e d a t a u t o p s y .T h r e e o f 1 5 c u l t u r e d e
m b r y o s s u r v i v e d a f t e rt r a ns fe r .
S r e e n a n e t a L ( 1 9 6 8 ) c u l t u r e d o n e - t o e
ig h t -c e ll s t a g e b o v i n e e m b r y o s i n 1 - m l t u
b e s ( s e a le d )c o n t a i n i n g f o l l i c u l a r f l u i
d o r o t h e r m e d i a a n dh e l d a t 3 7 C i n a w a t e r b
a t h . T h e v a r i o u s m e d i au s ed w e r e a 5 0 : 5 0 m i
x t u r e o f h o m o l o g o u sb l o o d s e r u m a n d i s o t
o n i c N a C I , t w o t y p e s o ff o l l i c u l a r f lu i d (
A a n d B ) , E a g l e 's m e d i u m( E a g le , 1 9 5 5 ) , f e
t a l c a l f s e r u m a n d c h i c ke m b r y o e x t r a c t (
H a r n d e n a n d B r u n t o n , 1 9 6 5 ) .
T y p e A f o l l i cu l a r f lu i d w a s t h a t o b t a i n
e d b ys l i t t ing t h e fo l l i c le s . A c e r t a i n f r a
c t i o n o f t h i sf l u i d w a s v i s c o u s , a n d t h e f
l u i d g e l le d u n d e ri n c u b a t i o n . T y p e B f o l
li c u la r f l u id w a s o b t a i n e db y d r a w i n g o f f t
h e l iq u i d , c e n t r i f u g i n g a n du s i n g t h e s u p
e r n a t a n t . L i m i t e d d e v e l o p m e n t( te ss t h a
n o n e d i v i si o n p e r e m b r y o ) w a s o b s e r v e di n
t y p e B f o ll i c u l a r f l u i d a n d i n E a g l e ' s m e
d i u m( t a b l e 4 ) .
T e r v i t a n d M c D o n a l d ( 1 9 6 9 ) c u l t u r e s p
r e -m o r u l a o v i n e e m b r y o s i n h o m o l o g o u s s
e r u m a t3 6 C f o r 2 4 o r 4 8 h o u r s . E m b r y o s w e r
e c u l-t u r e d i n s t e r il i z ed d i a l y s is c h a m b e
r s b y t h em e t h o d o f A v e ri ll an d R o w s o n ( 1 9 5 8
) . O f 3 1 3o n e - t o e i g h t - c e l l o v i n e e m b r y o
s , 2 2 2 d i v i d e d i nc u l t u r e . F i v e ei g h t- c e ll
e m b r y o s w e r e tr a n s f e r r e di m m e d i a t e l y a f
t e r c o l l e c t i o n t o r ec i p i en t e w e s ,a n d t h e
s e s e r v e d a s c o n t r o l s . N o n e o f 1 8 a n dn o n e
o f 1 0 e m b r y o s s u r v i v ed t r a n s f e r t o r e ci p
i-e n t e w e s a f t e r 2 4 a n d 4 8 h r i n c u l t u r e , r e
s p e c -t i ve l y .
M o o r e ( 1 9 7 0 ) c u l t u r e d t w o - t o e ig h t -c e
llo v in e e m b r y o s i n m i c r o d r o p s o f m e d i u m (
.1 t o. 2 m l ) u n d e r l i g h t w e i g h t p a r a f f i n o i
l i n s m a l lp e t r i d i s h e s a t 3 7 C i n a n a t m o s p
h e r e o f 5 %C O 2 i n air . A t o t a l o f 3 0 7 e m b r y o s
w e r ec u l t u r e d i n t h e f o l l o w i n g m e d i a : ( 1
) b a s a ls a l t s o l u t i o n ( B S S ) b a s e d o n B r i n
s t e r 's ( 1 9 6 3 )f o m u l a t io n f o r t h e c u l t u re o
f m o u s e e m b r y o s ;( 2 ) B S S w i th 1 m g / m l b o v i n
e se r u m a l b u m i n( B S A ) ; (3 ) B S S w i t h 1 5 % o v i
n e s e r u m , a n d ( 4 )o v i n e se r u m . T w e n t y o f 4 2
e m b r y o s c u l t u r e d i nB S S c l e a v e d a f t e r 4 8
h r i n c u l t u r e , a n d n o n e o f2 7 e m b r y o s t r a n
s f e r r e d t o r ec i p i e n t e w e ss u r v i v e d a f t e r
2 4 t o 7 2 h r in c u l t u r e . S i x t e e n o f3 4 e m b r y o
s c u l t u r e d i n B S S w i t h 1 m g / m l B S Ac l e a v e d
a f t e r 4 8 h r i n c u l t u r e , a n d o n e o f 2 6e m b r y
o s s u r v iv e d f o l l o w i n g tr a n s fe r . T h i r t y -e
i g h t o f 5 7 e m b r y o s c le a v e d i n B SS + 15 %o v i n e
s e r u m a f t e r 4 8 h r i n c u l t u r e a n d f o u r o f3 0
e m b r y o s s u r v iv e d f o l l o w i n g t ra n s f er . T h
i r t y -f o u r o f 6 1 e m b r y o s d i v i d ed i n o v in e s
e r u m a f t e r4 8 h r in c u l t u re , a n d f o u r o f 3 0 e
m b r y o ss u r v i v e d t r a n s f e r a f t e r 2 4 t o 7 2 h
r i n c u l t u r e ,a n d f o u r o f 3 0 e m b r y o s s u r v i
v e d t r a n s f e r a f t e r2 4 t o 7 2 h r i n c u l t u r e .
T w e n t y e m b r y o s t h a td i v id e d i n c u l t u r e s h
o w e d g r o ss n u c le a r a b n o r -m a l i ti e s . H o w e v
e r , t h e i n c i d e n c e o f n u c l e a ra b n o r m a l i t
i e s w a s n o t i n f l u e n c e d b y e i t h e re m b r y o a
ge o r t y p e o f m e d i u m .
M o o r a n d C r a g le ( 1 9 7 1 ) i n v e s t i g a t e d t h
ee f f e c t s o f e m b r y o a g e a n d c u l t u r e m e d i u
m o ni n v i t r o d e v e l o p m e n t o f o v in e e m b r y o s
. E m -b r y o s r e c o v e re d f r o m s u p e r o v u la t ed d
o n o r e w e s7 2 o f 1 2 0 h r p o s t e s tr u s w e r e c u l t
u r e d b y t h e
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N V TRO F E R T I L I Z A T I O N A N D E M B R Y O C U L T U R
E 7
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71 2 WRIGHT JR. AND BONDIOLI
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