Oncogenic CSF3R mutations in chronic neutrophilic leukemia and atypical CML.

N Engl J Med. 2013 May 9; 368:1781Speaker: CR 呂學儒醫師

Moderator: VS 蕭樑材醫師

Definition of CNL and atypical CML

Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011;2011:250-6

CNL: neutrophils in both periphreal and BM blood (segmented neutrophils and band forms > 80% of WBC)Atypical CML : granulocytic dysplasia, increased neutrophil precursors in both peripheral and BM blood (typically, ≥10% of white cells) 

Leukocytosis and hypercellularity of BM, predominantly of granulocytic cellAbsence Ph chromosome , absence of rearrangements of PDGFR A/B and FGFR1

Clinical, hematological and cytogenetic characteristics of aCML

• Background: – an infrequent chronic MPN– leukocytosis, absence of Ph/BCR-ABL, marked myeloid dysplasia– immature granulocytes > 15%, some with absolute monocytosis, D/D 

CMML

• Result:– median age: 65 years– 55% had moderate anemia and 36% had thrombocytopenia– Most with marked dysplasia, particularly in the granulocytic lineage– Cytogenetic data: trisomy 8, 5q-, 13q-, 17p-, 12q-, and 11q-, t(6;8)

(p23;q22)– median survival: 14 months

Ann Oncol. 2000;11:441

Histopathology of peripheral blood and BM of CNL

N Engl J Med. 2013;368:1781

G-CSF and its receptor in myeloid malignancy

• Granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF/CSF3): – major regulator of neutrophil production – granulopoiesis during infections and enhances multiple neutrophil functions– inducing proliferation and survival of myeloid progenitor cells

• The receptor for CSF3 (CSF3R)– 17 exons and its protein 813 amino acids– Activation with Jak/STAT, Ras/Raf/MAP kinase, and PKB/Akt pathways

• Colony-stimulating factor 3 receptor gene (CSF3R)– mapping to chromosome 1p– provides the proliferative and survival signal for granulocytes– contributes to their differentiation and function

• CSF3R mutations: – severe congenital neutropenia, secondary developed at AML (1%)

Blood. 2010;115:5131Leukemia 2013. doi: 10.1038

Use of Hematopoietic Growth Factors in the Survival and Differentiation of Hematopoietic Cells

NEJM 2013;368:1131

Hematopoietic Growth Factor Signaling

NEJM 2006;354:2034

Sequential gain of mutations in severe congenital neutropenia (SCN) progressing to acute myeloid leukemia (AML)

Blood. 2012;119:5071

Model for Activation and Signaling of CSF3R MutationsTwo different classes of CSF3R mutations

N Engl J Med. 2013;368:1781

The mutations in CSF3R are a defining molecular abnormality of CNL/atypical CMLTesting for CSF3R mutations could aid in the diagnosis of these diseases

5 patients: both membrane proximal and truncation mutations

AML(SCN progression): Q741X mutationETP-T-ALL: one of T618I

CSF3R deep sequencing

CNL, CSF3R (S783fs mutation)

Dependence on SRC Family-TNK2 or JAK Kinases(Truncation mutations)

small interfering RNAs (siRNAs) silencing of TNK2 and FGR (an SFK)inhibited by dasatinib

CNL, CSF3R (S783fs mutation) for 66 kinase inhibitorHypersensitive to dasatinibInsensitive to JAK kinase inhibitorsIC50: 50% inhibitory concentration; SFK: SRC family kinase; TNK2: tyrosine kinase nonreceptor 2

Dependence on Src Family-TNK2 or JAK Kinases(membrane proximal mutations)

CLL, CSF3R (T618I mutation) for 66 kinase inhibitorInsensitive to dasatinibSensitive to JAK kinase inhibitors

Two different classes of CSF3R mutations

• Truncation mutations(S783fs)– Dysregulation of SRC family–TNK2 kinases– sensitivity to dasatinib but not to JAK kinase inhibitors

• Membrane proximal mutations(T618I)– Dysregulation of JAK family kinases– sensitivity to JAK kinase inhibitors but not to dasatinib

Distinct signaling-pathway dysregulation To test the relative transforming capacity

Over a 10-day periodCSF3R mutations were capable to induce transformationMembrane proximal mutations faster 

Expressing wild-type CSF3R, membrane proximal mutations, or truncation mutations 

Infected with murine retrovirus

The potential signalingdifferences between the two classes of CSF3R

• Immunoblot analysis for JAK–STAT phosphorylation

• T618I mutant induced high levels of STAT3 -JAK2 phosphorylation; S783fs mutant was low

• Two classes of CSF3R mutations have different transformation potential and downstream signaling consequences

Use of tyrosine kinase inhibitorsthe sensitivities of CSF3R, mice

Clinical efficacy of Ruxolitinib in a patient with CSF3R T618I

CNL vs.atypical CML• CNL and atypical CML

– separate neoplasms by the WHO– But challenging for clinicians and hematopathologists

•  The categorization relies on arbitrary thresholds– Total WBC ( ≥25,000 for CNL; ≥13,000 for atypical CML)– immature granulocytes (<10% for CNL; ≥10% for atypical CML)– the presence or absence of dysgranulopoiesis (absent in CNL and 

characteristic of atypical CML)• CSF3R mutations : 

– a biologically unifying feature of CNL and atypical CML– the molecular classification of MPD and MDS/MPD

• Sequenced CSF3R in 54 cases– CNL (n=35) or atypical CML(n=19)– WHO defined: 12 patients diagnosed CNL; 5 monoclonal gammopathy 

(MG)-associated CNL; 9 aCML • 14 CSF3R mutations detected in 13 patients

– CSF3R T618I is the most mutation: 10/13– CSF3R T618I frequency: 83% (10/12) in WHO-defined CNL – CSF3R mutations not in aCML or MG-associated CNL

• CSF3RT618I also absent in PMF(n=76) and CMML(n=94)• CSF3RT618I

– highly sensitive and specific molecular marker for CNL– should be incorporated into current diagnostic criteria

Leukemia 2013. doi: 10.1038

Leukemia 2013. doi: 10.1038

Genetically Informed Therapy in LeukemiaJerald Radich, M.D.

Fred Hutchinson Cancer Research Center/Seattle Cancer Care Alliance

NEJM 2013;368:1838

• Julia E. Maxson– A TK mutation which play a major role in myeloid cancer– Identified a novel mutations in CSF3R– Tested in vitro with kinase inhibitors– Different types sensitivity to different therapeutic agents– Treated a patient with dramatic improved in WBC, Neutrophil, and PLT

• Therapeutic benefit in these rare disorders– power of genetic screening to uncover new potential drug targets

• This is how we will beat cancer, one gene, one disease at a time.

Take home message• CSF3R mutations: identified in >50% CNL/aCML

– Consider as a diagnostic criteria• The oncogenic CSF3R mutations

– Truncation mutations or membrane proximal mutations– sensitivity to inhibitors of SRC family–TNK2 and JAK kinases

Thank you for your attention