Cátedra de GenéticaUNLP FCNyM

Informe

Regulación de la expresión génica de ProcariontesEl operón Lactosa

Alumnas: Fernandez, Eva. Alcaraz, Élida.

Introducción.

La regulación de la expresión génica es crítica para todos los organismos, ya que no se necesitan todos los productos génicos simultáneamente ni en los mismos niveles. En los organismos multicelulares eucariontes, la regulación génica promueve la diferenciación celular.

En las bacterias, esta regulación mantiene la ductilidad interna mediante la activación e inhibición de genes en respuesta a cambios ambientales. Estos organismos tienen acoplados a los procesos de transcripción y traducción; y los genes funcionalmente relacionados se agrupan como una única unidad transcripcional u operón.Un operón incluye genes estructurales, un promotor para éstos y un sitio operador, donde interactúan las moléculas reguladoras. También habrá un gen regulador, necesario para el funcionamiento del operón pero que no forma parte del mismo.

Teniendo en cuenta el tipo de regulación que se presente, los operones se clasifican en: Inducibles: La transcripción se encuentra normalmente inhibida y se debe activar. Reprimibles: La transcripción se encuentra normalmente activada y se debe reprimir.

Operón Lactosa (Lac )

El operón Lac de E. coli controla la transcripción de tres genes necesarios para metabolizar la lactosa:

Lac Z, que codifica ß-galactosidasaLac Y, que codifica galactósido permeasaLac A, que codifica tiogalactósido transacetilasa.

El operón Lac es inducible negativo. El conjunto formado por los tres genes estructurales, el promotor y el operador constituye estructuralmente el operón Lac.

Objetivos:

1. Realizar la ligación del fragmento que contiene al gen ß- galactosidasa.

2. Aplicar el método de transformación bacteriana con la mezcla de ligación con bacterias competentes obtenidas por tratamiento con CL2Ca.

3. Detectar los clones recombinantes por medio de resistencia a antibióticos.

El objetivo de introducir un plásmido recombinante dentro de las bacterias es usar la maquinaria replicativa de las mismas para obtener grandes cantidades del ADN introducido.

Materiales:

Se utilizaron:

Cepa bacteriana de Escherichia coli topo.Medio LB (Luria- Bertoni); medio que contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano (carbohidratos, aminoácidos, sales, vitaminas, etc.) además de estar oxigenada.HieloBaño térmico a 42ºC.Placas con medio LB + agar (20 g/l de agar), con ATB y sin ATB.

Proceso de transformación:

Preparación de bacterias competentes mediante tratamiento con CL2Ca.

Añadir el plásmido recombinante pUC 19 (2 ɱl.) en tubos eppendorf.

Agitar la suspensión de bacterias competentes y agregar 25 ɱl (microlitros) de las mismas al tubo.

Incubar con los tubos en hielo 30 minutos (rotular los tubos). Esto disminuye la fluidez de la membrana celular.

Choque térmico: Se coloca el tubo a 42ºC, durante 1 minuto y transferir el tubo de nuevo al hielo por 5 minutos. El choque térmico incrementa la permeabilidad de la membrana celular. Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico.

Añadir 300 ɱl de medio LB e incubar a 37ºC, agitando 30 minutos. Con el medio LB se procede a la recuperación de las células.

Finalmente, se procede al armado de placas. Se siembra en una placa de los transformantes e incubación en placa selectiva (placas de Petri con y sin antibiótico, que será en este caso, ampicilina, ya que el plásmido usado confiere resistencia a este antibiótico), durante toda la noche.

Búsqueda de clones recombinantes.