Uniwersytet w Biaymstoku

Wydzia Biologiczno-Chemiczny

Rozprawa doktorska

Opracowanie i charakterystyka elektrochemicznych

genoczujnikw przeznaczonych do wykrywania wirusa

ptasiej grypy typu H5N1

Kamila Dorota Malecka

Praca wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Jerzego Radeckiego

w Zakadzie Biosensorw Instytutu Rozrodu Zwierzt i Bada ywnoci Polskiej

Akademii Nauk i przedstawiona Radzie Wydziau Biologiczno-Chemicznego

Uniwersytetu

w Biaymstoku

Biaystok 2016

2

Praca bya realizowana w Instytucie Rozrodu Zwierzt i Bada

ywnoci Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie i wspfinansowana w

ramach:

Programu Innowacyjna Gospodarka, nr WND-POIG.01.01.02-00-007/08,

Projektu 679 / N-BELGIA / 2010/0,

Projektu COST Action CM10005 "Supramolekularna Chemia w Wodzie"

3

PODZIKOWANIA

Skadam serdecznie podzikowania

Panu Profesorowi Jerzemu Radeckiemu

oraz

Pani Profesor Hannie Radeckiej

za powicony czas oraz cenne wskazwki podczas wykonywania niniejszej

rozprawy

Koleankom i Kolegom z Zakadu Biosensorw i Pracowni Bioelektroanalizy

Instytutu Rozrodu Zwierzt i Bada ywnoci PAN w Olsztynie za pomoc,

wsparcie i atmosfer pracy

4

STRESZCZENIE

Wykrywanie wirusw jest bardzo istotne w wielu dziedzinach, m.in. w ochronie

zdrowia, procesach biotechnologicznych, produkcji ywnoci, monitoringu rodowiska

czy w ochronie rolin. Konwencjonalne metody, takie jak reakcja acuchowa

polimerazy (PCR) bd test immunoenzymatyczny (ELISA) czsto wymagaj obrbki

wstpnej analizowanej prby, wykwalifikowanego personelu, kosztownego sprztu oraz

drogich odczynnikw chemicznych. Nadal poszukiwane s szybkie, czue, proste

w zastosowaniu i stosunkowo tanie metody wykrywania patogenw w warunkach poza

laboratoryjnych. W ostatnich latach obserwuje si wzrastajce zainteresowanie

bioczujnikami chemicznymi bdcymi alternatyw dla dotychczas stosowanych metod

oznaczania. Wysoka czuo i selektywno wzgldem danego analitu oraz prostota

wykonania szybkiej analizy to gwne zalety, dziki ktrym czujniki mog zastpi

tradycyjne metody. Ponadto posiadaj one duy potencja miniaturyzacji, dziki czemu

oferuj moliwo prowadzenia analiz rodowiskowych (w miejscu poboru prbek)

w niewielkich objtociach. Ze wzgldu na rozwj produkcji masowej, mog uzyska

stosunkowo nisk cen jednostkow.

Przedmiotem niniejszej rozprawy byo opracowanie czuych genoczujnikw

elektrochemicznych i zastosowanie ich do selektywnego wykrywania specyficznych

sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1. Opracowano trzy bioczujniki

DNA za pomoc ktrych z powodzeniem udao si wykrywa sekwencje DNA i/lub

RNA. Do tego celu zastosowano zote elektrody dyskowe. Przedstawione bioczujniki

DNA oparte o warstwy Au/SH-ssDNA/6-MCH oraz Au/11-MUA+6-MCH/NH2-ssDNA

dziaay wedug mechanizmu jonokanaowego. Natomiast podstaw trzeciego bya

warstwa redoks-aktywna Au/AET/Phen-Epoksy/Fe(III)/Phen-Epoksy/NH2-ssDNA.

Czujniki typu kanau jonowego wymagay obecnoci zewntrznego znacznika

elektroaktywnego do obserwacji procesw hybrydyzacji. Z kolei bioczujnik posiadajcy

warstw redoks-aktywn posiada centrum odpowiadajce za generowanie sygnau

analitycznego na powierzchni elektrody. Kady z nich rni si sposobem przyczenia

sondy DNA do powierzchni elektrody zotej. Sonda SH-ssDNA bya bezporednio

przymocowana do powierzchni elektrody zotej za pomoc wizania kowalencyjnego

zoto siarka. Natomiast sond NH2-ssDNA unieruchamiano na dwa sposoby.

W przypadku czujnika typu kanau jonowego za porednictwem grupy karboksylowej

tiokwasu (11-MUA) poprzez wizanie amidowe utworzone przy wspudziale

5

pochodnych karbodiimidowych (EDC/NHS). Z kolei na warstwie redoks-aktywnej

sond aminow osadzono za pomoc reakcji click tj. nukleofilowego otwarcia

piercienia epoksydowego.

Przeprowadzono szereg bada, w wyniku, ktrych zoptymalizowano procedury

modyfikacji powierzchni zotych elektrod roboczych, a take warunki procesw

hybrydyzacji z poszczeglnymi kwasami nukleinowymi. Do pomiarw zastosowano

trzy techniki elektrochemiczne: woltamperometri cykliczn, woltamperometri fali

prostoktnej oraz elektrochemiczn spektroskopi impedancyjn w ukadzie

trjelektrodowym. Jako analitw uyto 20-merowych sekwencji DNA, ok. 180 pz

sekwencji DNA (PCR), a take ok. 280-merowych transkryptw RNA. W zalenoci

od dugoci testowanego analitu posiaday one 20-merowe sekwencje komplementarne

lub niekomplementarne, a take 20-merowe sekwencje komplementarne w dugim

acuchu DNA czy RNA znajdujce si w rnych pooeniach (na kocu 3, na kocu

5 lub na rodku).

Podjto rwnie prb miniaturyzacji najprostszego z zaproponowanych

genoczujnikw opartego o warstw Au/SH-ssDNA/6-MCH z zastosowaniem elektrod

sitodrukowanych z pracujc elektrod zot. Za jego pomoc udao si wykry m.in.

niewymagajce odwrotnej transkrypcji sekwencje RNA o dugoci okoo 280-mer,

co moe stanowi podstaw do aplikacji w warunkach poza laboratoryjnych.

Biorc pod uwag czuo i selektywno trzech przedstawionych genoczujnikw,

mona stwierdzi, e kady z nich z powodzeniem nadaje si do wykrywania materiau

genetycznego wirusa ptasiej grypy typu H5N1. Znaczcy walor stanowi rwnie

moliwo wykrywania fragmentw komplementarnych do sondy ssDNA znajdujcych

si w ok. 180-pz acuchach DNA oraz ok. 280-merowych transkryptach RNA.

Opracowane genoczujniki umoliwiay rwnie rozrnienie pooenia sekwencji

komplementarnych znajdujcych si w analizowanych oligonukleotydach.

Na podstawie aktualnie przenalizowanej literatury naukowej takie prace nie zostay

dotychczas opublikowane.

Ponadto, w przeciwiestwie do czsto pojawiajcych si w literaturze naukowej,

bioczujnikw zawierajcych znakowane oligonukleotydy DNA, zaproponowane

w rozprawie uniwersalne systemy (jonokanaowy i z warstw redoks-aktywn)

nie wymagaj skomplikowanych modyfikacji i znakowania sond DNA. Mona

je zastosowa do unieruchamiania rnych sond DNA posiadajcych jedynie grup

tiolow bd aminow na kocu 5.

6

SPIS TRECI

STRESZCZENIE ........................................................................................................... 4

WYKAZ SYMBOLI I SKRTW UYTYCH W ROZPRAWIE ......................... 10

WSTP .......................................................................................................................... 16

CEL PRACY .................................................................................................................. 18

CZ LITERATUROWA ......................................................................................... 19

1. Bioczujniki .................................................................................................................. 20

1.1. Wprowadzenie ......................................................................................................... 20

1.2. Bioczujniki oparte o kwasy nukleinowe .............................................................. 24

1.2.1. Budowa kwasw nukleinowych ........................................................................................ 24

1.2.2. Metody osadzania kwasw nukleinowych na podoach staych ..................................... 27

1.2.2.1 Adsorpcja ..................................................................................................................................... 29

1.2.2.2 Puapkowanie w matrycy ............................................................................................................. 31

1.2.2.3 Metody kowalencyjne .................................................................................................................. 31

1.2.2.4 Powinowactwo awidyna/streptawidyna biotyna ....................................................................... 35

1.2.3. Sposoby generowania sygnau w bioczujnikach elektrochemicznych opartych

o kwasy nukleinowe .......................................................................................................... 36

2. Metody wykrywania wirusw ptasiej grypy ............................................................... 44

2.1. Metody etiologiczne ............................................................................................... 46

2.2. Metody serologiczne .............................................................................................. 46

2.3. Metody molekularne ............................................................................................... 48

2.4. Bioczujniki przeznaczone do wykrywania wirusw ptasiej grypy .................. 49

3. Rodzaje bioczujnikw elektrochemicznych zaprezentowanych w niniejszej

rozprawie ................................................................................................................. 53

3.1. Czujniki typu kanau jonowego ............................................................................ 53

3.2. Czujniki oparte o warstwy redoks-aktywne ........................................................ 57

4. Charakterystyka technik pomiarowych stosowanych w niniejszej rozprawie ...... 59

4.1. Ukad pomiarowy ................................................................................................... 59

4.2. Woltamperometria cykliczna (z ang. Cyclic Voltammetry, CV) ...................... 60

4.3. Woltamperometria fali prostoktnej (z ang. Square Wave Voltammetry, SWV)

................................................................................................................................... 63

4.4. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna (z ang. Electrochemical

Impedance Spectroscopy, EIS) .......................................................................................... 65

7

CZ EKSPERYMENTALNA................................................................................ 68

5. Odczynniki i materia biologiczny .......................................................................... 69

5.1. Odczynniki ............................................................................................................... 69

5.2. Materia biologiczny ............................................................................................... 71

5.2.1. Sekwencje DNA ................................................................................................................ 71

5.2.2. Sekwencje RNA ................................................................................................................ 72

6. Aparatura ................................................................................................................ 74

6.1. Potencjostat/galwanostat ........................................................................................ 74

6.2. Mikrobipotentiostat/galwanostat .......................................................................... 74

7. Czujniki typu kanau jonowego przeznaczone do wykrywania specyficznych

sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 ........................................ 75

7.1. Przygotowanie elektrochemicznego genoczujnika opartego o modyfikacj

elektrod zotych poprzez wizanie kowalencyjne Au-S ................................................ 75

7.1.1. Przygotowanie powierzchni dyskowych elektrod zotych ................................................ 75

7.1.2. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 76

7.1.3. Przygotowanie powierzchni sitodrukowanych elektrod zotych ....................................... 76

7.1.4. Modyfikacja elektrod sitodrukowanych ............................................................................ 77

7.1.5. Oznaczanie kwasw nukleinowych za pomoc elektrod dyskowych ............................... 77

7.1.6. Oznaczanie kwasw nukleinowych przy pomocy elektrod sitodrukowanych .................. 78

7.1.7. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 78

7.1.7.1. Pomiary elektrochemiczne z zastosowaniem dyskowych elektrod zotych ................................ 78

7.1.7.2. Pomiary elektrochemiczne z zastosowaniem sitodrukowanych elektrod zotych ....................... 79

7.2. Przygotowanie elektrochemicznego genoczujnika typu kanau jonowego

opartego o modyfikacj elektrod zotych za pomoc wizania amidowego ............... 79

7.2.1. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 79

7.2.2. Oznaczanie sekwencji DNA ............................................................................................. 80

7.2.3. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 80

8. Bioczujnik zawierajcy warstw elektroaktywn przeznaczony do wykrywania

specyficznych sekwencji DNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 ........................... 82

8.1. Konstrukcja warstwy elektroaktywnej AET/Phen-Epoksy/Fe(III)/(Phen-

Epoksy/EA krok po kroku na powierzchni elektrody zotej .......................................... 82

8.1.1. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 82

8.1.2. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 82

8.2. Konstrukcja elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania

specyficznych sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1

8

z zastosowaniem warstwy redoks-aktywnej AET/Phen-Epoksy/Fe(III)/Phen-

Epoksy/NH2-NC3 ....................................................................................................... 83

8.2.1. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 83

8.2.2. Oznaczanie kwasw nukleinowych z wykorzystaniem elektrod dyskowych ................... 84

8.2.3. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 84

WYNIKI BADA I DYSKUSJA .............................................................................. 85

9. Opracowanie elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania

specyficznych sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 z

zastosowaniem sondy z grup tiolow SH ........................................................... 86

9.1. Optymalizacja modyfikacji elektrod zotych i procesu hybrydyzacji ............ 86

9.2. Optymalizacja zakresu ste analitu (20-merowych sekwencji DNA)

za pomoc CV ............................................................................................................ 89

9.3. Kontrola selektywnoci opracowanego genoczujnika z zastosowaniem

20-merowych sekwencji DNA za pomoc SWV ....................................................... 94

9.4. Zaleno pooenia sekwencji komplementarnej wzgldem sondy SH-NC3

- Sekwencje PCR1, PCR2, PCR3 oraz PCR4 ............................................................ 96

9.5. Oznaczanie transkryptw RNA .................................................................... 100

9.6. Miniaturyzacja genoczujnika na sitodrukowanych elektrodach zotych ...... 102

9.6.1. Optymalizacja osadzania sondy DNA ............................................................................. 102

9.6.2. Oznaczanie 20-merowych sekwencji DNA za pomoc techniki SWV........................... 103

9.6.3. Oznaczanie ok. 280-merowych transkryptw RNA........................................................ 104

10. Opracowanie elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania

specyficznych sekwencji DNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 z zastosowaniem

sondy osadzonej na elektrodzie zotej za pomoc wizania amidowego ............. 106

10.1. Charakterystyka poszczeglnych etapw modyfikacji elektrod zotych ...... 106

10.2. Oznaczanie 20-merowych sekwencji DNA za pomoc SWV ...................... 109

10.3. Oznaczanie 20-merowych sekwencji DNA za pomoc EIS ........................ 110

10.4. Oznaczanie produktw PCR za pomoc EIS ............................................... 112

11. Opracowanie elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania

specyficznych sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 z

zastosowaniem kompleksu Fe (III) z Tris(5,6-epoksy 5,6 dihydro [1,10]

fenantrolin) ......................................................................................................... 114

11.1. Opracowanie warstwy elektroaktywnej zawierajcej kompleks Fe(III)

z Tris(5,6-epoksy 5,6 dihydro [1,10] fenantrolin) ...................................... 114

9

11.2. Potwierdzenie obecnoci centrum redoks-aktywnego na powierzchni

elektrody zotej ...............................................................................................................

...................................................................................................................... 116

11.3. Potwierdzenie osadzania sondy NH2-NC3 na warstwie redoks-aktywnej

Au/AET/Phen-Epoksy/ Fe(III)/Phen-Epoksy/ ......................................................... 118

11.4. Oznaczanie sekwencji DNA ........................................................................... 120

11.5. Oznaczanie transkryptw RNA....................................................................... 122

PODSUMOWANIE ................................................................................................... 125

Podsumowanie genoczujnikw typu kanau-jonowego ....................................................... 125

Podsumowanie genoczujnika opartego o warstw elektroaktywn AET/Phen-Epoksy/

Fe(III)/Phen-Epoksy ............................................................................................................ 129

WNIOSKI.................................................................................................................... 133

SPIS ILUSTRACJI ..................................................................................................... 137

SPIS TABEL ............................................................................................................... 142

WYKAZ PUBLIKACJI I KONFERENCJI NAUKOWYCH .............................. 143

BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 146

10

WYKAZ SYMBOLI I SKRTW UYTYCH W ROZPRAWIE

SKRT PENA NAZWA

11-HUD 11-hydroksy-1-undekanetiol

11-MUA kwas 11-merkaptoundekanowy

6-MCH 6-merkaptoheksan-1-ol

Ae powierzchnia elektrody

A adenina

ACV woltamperometria prdu przemiennego

AET aminoetanotiol

AG aldehyd glutarowy

AGID immunodyfuzja na elu agarowym

AIV wirus ptasiej grypy (z ang. avian influenza virus)

AI ptasia grypa

AN acetonitryl

AQ-PNA peptydowy kwas nukleinowy znakowany antrachinonem

AuNPs nanoczsteczki zota

BRCA1 gen nowotworu piersi

BZT biochemiczne zapotrzebowania tlenu

C cytozyna

Ck cukier

C0 stenie depolaryzatora w gbi roztworu

Cdl pojemno warstwy podwjnej

CdSe nanostruktury selenku kadmu (z ang. cadmium selenide

nanostructure)

Ch chitozan

CMOS komplementarny pprzewodzcy tlenek metalu

(z ang. complementary metal oxide semiconductor)

c-NC3 sekwencja komplementarna do sondy NC3

CNT nanorurki wglowe

11

[Co(bpy)3]3+ tri(2,2-bipirydyl) kobaltu

CoPor porfiryna z kobaltem

CoPc ftalocyjanina kobaltu

Co(Phen)33+ nadchloran tris(1,10-fenantrolina) kobaltu (III)

CP sonda chwytajca (z ang. capture probe)

CV woltamperometria cykliczna

D wspczynnik dyfuzji

D-AgNP nanoczstki srebra znakowane doksorubicyn

DEZ dyskowe elektrody zote

DPV woltamperometria pulsowa rnicowa

DNA kwas deoksyrybonukleinowy

DPM dipirometen

dsDNA podwjna ni DNA (z ang. double stranded DNA)

E0 potencja piku dla czujnika w roztworze podstawowym bez

dodatku analitw

EDC chlorowodorek 1-etylo-3-(3-

dimetyloaminopropylo)karbodiimidu

EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy

EIS elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna

ELISA test immunoenzymatyczny

En potencja piku dla danej prbki

EPA potencja piku anodowego

EPK potencja piku katodowego

eSPR elektrochemiczny powierzchniowy rezonans plazmonw

ETA etanoloamina

ESW amplituda fali prostoktnej

F staa Faradaya

Fc ferrocen

G guanina

G4-PDR poliamidoaminowy dendrymer czwartej generacji

12

GCE elektroda z wgla szklistego (z ang. glassy carbon electrode)

Gr-VS2 mieszanina grafen-disiarczek wanadu

GW granica wykrywalnoci (z ang. limit of detection)

HA hemaglutynina

HBV wirus zapalenia wtroby typu B

His6-Qinghai histagowane odmiany (warianty) rekombinowanej

hemaglutyniny

HIT test zahamowania hemaglutynacji

HPAI wysokopatogenna ptasia grypa

(z ang. highly pathogenic avian influenza)

HPV wirus brodawczaka

I natenie prdu piku

I0 natenie prdu piku dla czujnika w roztworze podstawowym

bez dodatku analitu

Ic prd adowania pojemnoci warstwy podwjnej

If prd faradajowski

In natenie prdu piku dla danej prbki

Ip natenie prdu

IPA prd piku anodowego

IPK prd piku katodowego

ITO elektroda z tlenku indu domieszkowanego cynkiem

IUPAC Midzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej

(z ang. International Union of Pure and Applied Chemistry)

k staa charakteryzujca ukad elektrod

KN kwasy nukleinowe

LPAI niskopatogenna ptasia grypa

(z ang. low pathogenic avian influenza)

MB bkit metylenowy ( z ang. methylene blue)

MCB merkaptobutanol

MES kwas 2-morfolinoetanosulfonowy

MP mykoplazmatyczne zapalenie puc

13

MPA kwas merkaptopropionowy

mRT-PCR multipleksowa reakcja polimerazy acuchowej z odwrotn

transkryptaz

MWCNTs wielocienne nanorurki wglowe (z ang. multi-walled carbon

nanotubes)

n liczba elektronw biorcych udzia w reakcji elektrodowej

NA neuraminidaza

NASBA amplifikacja sekwencji kwasw nukleinowych

nc-NC3 sekwencja niekomplementarna do sondy NC3

NH2-NC3 sonda DNA z grup aminow

NHS imid kwasu N-hydroksybursztynowego

NIT test zahamowania neuraminidazy

nt nukleotyd

NT test neutralizacji

OIE wiatowa Organizacja Zdrowia Zwierzt

OWD odczyn wizania dopeniacza

Ox utleniacz

P reszta kwasu fosforowego (V)

PAMAM dendrymery poliamidoaminowe

PBS fizjologiczny bufor fosforanowy

PCR reakcja polimerazy acuchowej (z ang. polymerase chain

reaction)

PEG glikol polietylenowy

p-ELISA peptydowy test immunoenzymatyczny

PGE owkowa elektroda grafitowa

Phen-Epoksy 5,6-epoksy-5,6-dihydro-1,10-fenantrolina

PPNWs nanodruty polipirolowe

PPV wirus ospowatoci liwy (z ang. Plum Pox Virus)

pz para zasad

Q ilo adunku

R staa gazowa

14

R0 opr przeniesienia elektronu dla czujnika w roztworze

podstawowym bez dodatku analitw

Red reduktor

Ret opr przeniesienia elektronu

rGO-GDLE zredukowany tlenek grafenu

Ri opr przeniesienia elektronu dla danej prbki

RNA kwas rybonukleinowy

RTm temperatura pokojowa (z ang. room temperature)

RT-PCR reakcja polimerazy acuchowej z odwrotn transkryptaz

RRT-PCR reakcja polimerazy acuchowej z odwrotn transkryptaz

w czasie rzeczywistym

R opr roztworu

S nachylenie krzywej kalibracyjnej

SAMs samoorganizujce si monowarstwy (ang. self-assembled

monolayers)

scFV pojedynczy acuch zmiennego fragmentu przeciwcia (z ang.

single chain variable fragments of antibodies)

SEZ sitodrukowane elektrody zote

SH-NC3 sonda z grup tiolow

ssDNA pojedyncza ni dna (z ang. single stranded DNA)

SSC bufor cytrynianowy (z ang. saline sodium citrate)

SWV woltamperometria fali prostoktnej

T tymina

TFA kwas trifluorooctowy

Tm temperatura

TRIS 2-amino-2-hydroksymetylopropan -1,3-diol

U uracyl

VFDF anatoksyna-a (z ang. Very Fast Death Factor)

WHO wiatowa Organizacja Zdrowia (z ang. Word Health

Organization)

15

XPS rentgenowska spektrometria fotoelektronw (z ang. X-ray

photoelectron spectroscopy)

Z urojona skadowa impedancji

Z rzeczywista skadowa impedancji

ZA zasada azotowa

Zw element Warburga

wspczynnik przeniesienia elektronu

stopie pokrycia powierzchni elektrody

E rnica potencjaw

Ei amplituda impulsw

I wzgldne natenie prdu piku

szybko zmian potencjau

odchylenie standardowe odpowiedzi czujnika

16

WSTP

Wirus ptasiej grypy (AIV, z ang. Avian Influenza Virus), moe rozprzestrzenia

si wrd dzikiego i domowego ptactwa, powodowa epidemie, a nawet pandemie,

a take stanowi zagroenie dla ssakw, w tym ludzi. Forma wysokopatogenna (HPAI)

typu H5N1 staa si w dzisiejszych czasach bardzo niebezpiecznym, zagraajcym nie

tylko dla drobiu patogenem (Neumann i wsp., 2010). Mimo, e H5N1 jest wirusem

grypy ptakw i zwykle nie rozprzestrzenia si wrd ludzi, od 2003 roku do czerwca

2016 odnotowano i potwierdzono 851 zakae ludzi typem H5N1 w 16 krajach. Okoo

60% z nich zakoczyo si zgonem (WHO, 2016). Gdyby czowiek chory na gryp

sezonow zarazi si ptasi gryp, wwczas istnieje prawdopodobiestwo zmutowania

si materiaw genetycznych obu wirusw, a w konsekwencji moe wiza si

to z nabyciem zdolnoci wirusa H5N1 do przenoszenia si z czowieka na czowieka.

atwo przenoszone midzy ludmi szczepy H5N1 mog mie katastrofalne skutki.

W zwizku z powyszym istnieje zapotrzebowanie na czue, szybkie i tanie testy

do diagnozowania AIV, ktre pozwoliby jednoczenie na wczesne terapie

przeciwwirusowe. Kryteria te speniaj bioczujniki elektrochemiczne. Atrakcyjno

ich stosowania wynika gwnie z ich wysokiej czuoci i selektywnoci wzgldem

badanego analitu. Dziki tym waciwociom pozwalaj one w sposb prosty i szybki

oznaczy interesujcy skadnik nawet w zoonej mieszaninie. Opracowywanie

nowoczesnych bioczujnikw jest bardzo interesujcym zagadnieniem zarwno, jeeli

chodzi o badania podstawowe, jak i aplikacyjne. Stanowi one doskona alternatyw

dla obecnie stosowanych tradycyjnych technik, takich jak test immunoenzymatyczny

(ELISA) czy reakcja polimerazy acuchowej (PCR) (Wang i wsp., 2009).

Charakteryzuj si prost konstrukcj i niskim kosztem produkcji, a take szybk

detekcj. Moliwe jest rwnie ich zminiaturyzowanie.

Opracowywanie nowych technologii bioczujnikw to dynamiczna dziedzina

bada. wiadczy o tym sukcesywnie wzrastajca liczba publikacji naukowych

dotyczcych bioczujnikw DNA Rysunek 1. W ostatnich latach w wielu orodkach

naukowych na wiecie prowadzone s intensywne badania nad zastosowaniem

bioczujnikw w analizie ywnoci, kryminalistyce, ale take w diagnostyce klinicznej

czy rodowiskowej, np. do wykrywania wirusw i innych patogenw, zarwno

17

rolinnych, jaki i zwierzcych (Ahmed i wsp., 2008; Pedrero i wsp., 2012; Tam i wsp.,

2009a; Civit i wsp., 2010; Cagnin i wsp., 2009).

Rysunek 1. Liczba publikacji dotyczcych genoczujnikw w bazie Web of Knowledge

w latach 1990-2016.

18

CEL PRACY

Przedmiotem bada niniejszej rozprawy doktorskiej jest opracowanie

i zastosowanie nastpujcych elektrochemicznych genoczujnikw do wykrywania

specyficznych sekwencji oligonukleotydw wirusa ptasiej grypy typu H5N1:

Bioczujnika zawierajcego sond DNA zmodyfikowan grup tiolow

unieruchomion na powierzchni dyskowej elektrody zotej oraz na elektrodzie

sitodrukowanej (miniaturyzacja ukadu) dziaajcego w oparciu o mechanizm

jonokanaowy

Bioczujnika zawierajcego sond DNA zmodyfikowan grup aminow

unieruchomion na powierzchni dyskowej elektrody zotej dziaajcego w oparciu

o mechanizm jonokanaowy

Bioczujnika posiadajcego jako centrum redoks-aktywne kompleksy elaza

(III) z pochodn fenantroliny budowane na powierzchni dyskowej elektrody zotej

19

CZ LITERATUROWA

Co my wiemy, to tylko kropelka.

Czego nie wiemy, to cay ocean.

-Isaac Newton

https://cytaty.eu/cytat/co/my.htmlhttps://cytaty.eu/cytat/co/my.htmlhttps://cytaty.eu/autor/isaacnewton.html

20

1. Bioczujniki

1.1. Wprowadzenie

Zgodnie z nomenklatur Midzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej

(IUPAC) czujnik chemiczny to urzdzenie przeksztacajce informacj chemiczn

na sygna analitycznie uyteczny. Informacja chemiczna, o ktrych mowa powyej,

moe pochodzi z reakcji chemicznej element rozpoznajcy analit lub waciwoci

fizycznych badanego ukadu (Hulanicki i wsp., 1991). Podstaw dziaania czujnikw

chemicznych stanowi oddziaywania midzyczsteczkowe, ktre posiadaj charakter

niekowalencyjny (takie jak: siy elektrostatyczne, wizania wodorowe, siy van der

Wasala) i zachodz na granicy dwch faz (warstwa analitycznie aktywna/roztwr

badany). Oddziaywania te stanowi domen chemii supramolekularnej, za ktrej

rozwj Donald J. Cram, JeanMarie Lehn i Charles Pedersen otrzymali nagrod Nobla

w 1987 roku (Cram, 1992; Lehn, 1992; Pedersen, 1992).

Czujnik skada si z dwch podstawowych komponentw:

warstwy analitycznie aktywnej, gdzie nastpuje proces rozpoznania

midzyczsteczkowego utworzenie kompleksu gospodarz-go (element rozpoznajcy

analit), w trakcie ktrego informacja chemiczna o prbce jest przeksztacana w form

energii;

elementu przetwornikowego, dziki ktremu sygna otrzymany w warstwie

analitycznie aktywnej zostaje zamieniony na mierzalny parametr analityczny,

tzn. nadajcy si do obrbki

W zalenoci od natury zastosowanego materiau analitycznie aktywnego czujniki

mona zakwalifikowa do dwch grup:

czujniki chemiczne materiaem analitycznie aktywnym w tej grupie

s syntetyczne czsteczki zdolne do selektywnego rozpoznania czsteczek analitu.

bioczujniki nale do grupy czujnikw, w ktrych elementami rozpoznania

midzyczsteczkowego w warstwie aktywnej s czsteczki stanowice materia

biologiczny, np. DNA, biaka, enzymy, przeciwciaa lub cae komrki, unieruchomione

na odpowiednim noniku.

21

Schematycznie konstrukcj czujnika chemicznego przedstawiono na Rysunku 2.

Rysunek 2. Schemat budowy czujnika chemicznego.

Klasyfikacja bioczujnikw bazuje na dwch charakterystycznych parametrach

ich konstrukcji: systemie biodetekcji oraz typie elementu przetwornikowego. Pierwsze

kryterium opiera si na specyficznych reakcjach element rozpoznajcy analit,

np. przeciwciao-antygen, enzym-substrat oraz oddziaywaniach kwasw nukleinowych.

Natomiast ze wzgldu na zasad dziaania przetwornika mona dokona podziau

(Chambers i wsp., 2008) na: optyczne (Galyanin i wsp., 2015; Paliwal i wsp., 2015;

Patista i wsp., 2015), elektrochemiczne (Cagnin i wsp., 2009; Mc Caffrey i wsp., 2015;

Liu i wsp., 2015), masowe (Stoytcheva i wsp., 2013; Gltekin i wsp., 2014; Snchez-

Fraga i wsp., 2014), akustyczne (Jo i wsp.; 2013; An i Chen, 2015; Franois i wsp.,

2015) i termiczne (Reyes-Romero i wsp., 2014; Weber i wsp., 2014, Salek i wsp.,

2015). Drog prowadzc do otrzymania sygnau analitycznego schematycznie

zaprezentowano na Rysunku 3.

Prbka

analitycznaWarstwa

analitycznie

aktywna

Przetwornik Sygna

analityczny

22

Rysunek 3. Przebieg procesw prowadzcych do otrzymania sygnau analitycznych

z udziaem rnych przetwornikw i technik pomiarowych.

O praktycznej przydatnoci kadego czujnika analitycznego decyduje granica

wykrywalnoci, selektywno, powtarzalno wynikw oraz czas detekcji. Wikszo

tych parametrw zaley od warstwy analitycznie aktywnej danego czujnika (Radecki

i wsp., 2006).

Bioczujniki pozwalaj na wykrywanie biaek (Das i Kelley, 2011), DNA (Tosar

i wsp., 2010), identyfikacj szeregu metabolitw (Karim i Fakhruddin, 2012), wirusw

(Altintas i wsp., 2015) czy bakterii (Dong i Zhao, 2015; Webster i wsp., 2015), a take

skae chemicznych np. toksyn (Sharma i Mutharasan, 2013). Stosuje si je m.in. do

okrelania zawartoci metali cikich, pestycydw, zwizkw azotowych

i fosforowych, lotnych substancji organicznych, patogenw, substancji rakotwrczych

i toksycznych (pestycydw, mykotoksyn, antybiotykw), biochemicznego

zapotrzebowania tlenu (BZT) w powietrzu, wodzie czy glebie (Bahadr i Sezgintrk,

23

2015). Bioczujniki wykorzystuje si rwnie do kontroli ywnoci m.in. do

identyfikacji organizmw genetycznie zmodyfikowanych (GMO) (Radecki i wsp.,

2006; Manzanares-Palenzuela i wsp., 2015; Tam, 2015). Ponadto umoliwiaj one

detekcj ladowych iloci materiaw wybuchowych stosowanych w terroryzmie (Sun

i wsp., 2015).

Schematycznie przykadowe zastosowania bioczujnikw przedstawiono na Rysunku 4.

Rysunek 4. Przykadowe zastosowania bioczujnikw (opracowano na podstawie

http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Biosensory/).

W przypadku bioczujnikw DNA proces rozpoznania midzyczsteczkowego

odpowiedzialny za wytwarzanie sygnau analitycznego, realizowany jest przez proces

hybrydyzacji zachodzcej midzy pojedyncz nici DNA (sond, ssDNA) osadzon

na powierzchni elektrody a komplementarn sekwencj DNA lub RNA znajdujc si

w roztworze badanej prby (analitem) Rysunek 5. Jednym z najczciej stosowanych

przetwornikw w przypadku genoczujnikw jest przetwornik elektrochemiczny

(Gooding, 2002; Kerman i wsp. 2004; Liu i wsp., 2005a; Rivas i wsp., 2005; Degefa

i Kwak, 2008; Kukol i wsp., 2008; Park i Park, 2009; Zhu i wsp., 2009a; Yu i wsp.,

2014; Fernandes i wsp., 2015, Torkashvand i wsp., 2015).

24

Rysunek 5. Schemat budowy bioczujnika opartego o DNA.

1.2. Bioczujniki oparte o kwasy nukleinowe

1.2.1. Budowa kwasw nukleinowych

Kwasy nukleinowe (KN) s niezwykle przydatne w konstrukcji bioczujnikw

ze wzgldu na ich silne waciwoci rozpoznajce (Paleek, 2002; Paleek i Bartoik,

2012). W ostatnich latach nastpio due zainteresowanie wykorzystaniem kwasw

nukleinowych, jako narzdzia w biodetekcji (Berney i wsp., 2000; Vercoutere i wsp.,

2002; Sassolas i wsp., 2008).

Kwasy nukleinowe to zwizki wielkoczsteczkowe. We wszystkich komrkach

organizmw wystpuj dwa rodzaje kwasw nukleinowych: kwas

deoksyrybonukleinowy (DNA) oraz kwas rybonukleinowy (RNA). Kady z nich

zbudowany jest z trzech skadnikw (Rysunek 6):

cyklicznego piciowglowego cukru prostego (Ck) pentozy, w przypadku

DNA jest to deoksyryboza, a RNA ryboza (Rysunek 7)

jednej, dwch lub trzech reszt kwasu fosforowego (V) (P),

heterocyklicznej zasady azotowej (ZA), bdcej pochodn puryny adenina

(A), guanina (G) lub pirymidyny cytozyna (C), tymina (T), uracyl (U)

25

Rysunek 6. Budowa nukleotydu.

Rysunek 7. Cukry wchodzce w skad A) RNA ryboza oraz B) DNA deoksyryboza.

Zasady azotowe stanowice skadniki kwasw nukleinowych zawieraj w swojej

strukturze heterocykliczne piercienie aromatyczne z rnymi podstawnikami

Rysunek 8. S one kowalencyjnie poczone z piercieniem cukru pentoz tworzc

nukleozydy. Natomiast nukleozydy zwizane kowalencyjnie z jedn lub wicej grup

fosforanowych nosz nazw nukleotydw i stanowi jednostki monomeryczne tworzce

DNA lub RNA. Polimerowe czsteczki kwasw nukleinowych posiadaj adunek

ujemny pochodzcy od reszt fosforanowych.

Rysunek 8. Wzory strukturalne zasad nukleinowych tworzcych nukleotydy.

26

Przestrzenny model czsteczki DNA zosta opracowany w 1953 roku przez

Jamesa Watsona i Francisa Cricka. Zgodnie z nim czsteczk DNA tworz dwie nici

polinukleotydowe skrcone wok wsplnej osi w ksztat podwjnej helisy

prawoskrtnej, w ktrej zasady azotowe skierowane s do wntrza, a acuch cukrowo-

fosforanowy znajduje si na zewntrz powstaej w ten sposb struktury przestrzennej

(Stryer, 2003). W acuchu DNA czsteczki cukru uoone s na przemian z resztami

kwasu fosforowego (V), ktry czy ze sob dwa rne atomy wgla kolejnych

czsteczek cukru oznaczonych jako 5 i 3. Nici DNA w helisie biegn w przeciwnych

kierunkach (s antyrwnolege), co oznacza, e naprzeciwko siebie le dwa rne

koce koniec 5 jednej nici i koniec 3 drugiej nici. Jeden skrt helisy zawiera 10 par

nukleotydw (Turner i wsp., 2013; Allison, 2009).

Pod wzgldem budowy RNA rni si od DNA dwoma elementami. Po pierwsze,

cukrem w przypadku RNA jest ryboza, ktra zawiera grup 2-hydroksylow (grupa

ta nie wystpuje w DNA) (Rysunek 7A). Po drugie, jedn z zasad azotowych

budujcych RNA jest uracyl (nie wystpuje w DNA) (Rysunek 8). RNA jest rwnie

mniej odporny na dziaanie nukleaz (Stryer, 2003).

Utrzymanie staej odlegoci pomidzy dwiema nimi w helisie DNA lub

DNA/RNA jest moliwe dziki oddziaywaniom pomidzy zasadami azotowymi, ktre

cz si ze sob zgodnie z zasad komplementarnoci. Wedug niej wizania

wodorowe powstaj w przypadku helisy DNA-DNA pomidzy A, a T oraz

G i C. A czy si z T dwoma wizaniami wodorowymi, natomiast C z G trzema

wizaniami. Pojedyncze nici RNA i DNA o komplementarnych sekwencjach mog

utworzy podwjn helis RNADNA. Wwczas uracyle pochodzce z RNA cz si

z adeninami DNA, za adeniny RNA z tyminami DNA (Rysunek 9).

27

Rysunek 9. Fragment podwjnej nici DNA/RNA.

1.2.2. Metody osadzania kwasw nukleinowych na podoach staych

Wybr metody osadzania sondy na powierzchni elektrody ma kluczowe znaczenie

dla czuoci i selektywnoci konstruowanego genoczujnika. Generalnie metoda

ta powinna zapewni:

precyzyjn kontrol gstoci upakowania i przestrzennej orientacji

poszczeglnych sond DNA w osadzanej warstwie, aby nitki wzajemnie na siebie nie

oddziayway i nie blokoway dostpu analitu, nie straciy swojej aktywnoci

biologicznej zapewnienie moliwie najbardziej wydajnego przebieg procesu

hybrydyzacji (warstwa zbyt upakowana utrudnia ten proces ze wzgldu na moliwo

oddziaywania sond DNA midzy sob, blokujc do nich dostp dla analitu, natomiast

warstwa zbyt luna zwiksza prawdopodobiestwo niespecyficznej adsorpcji

na powierzchni elektrody, adsorpcja taka jest rdem wysokiego prdu ta);

utworzenie stabilnej warstwy analitycznie aktywnej w warunkach prowadzenia

eksperymentu;

powtarzalno i atwo procedury osadzania (de-los-Santos-lvarez i wsp.,

2004; Radecki i wsp., 2006)

28

Osadzanie kwasu deoksyrybonukleinowego moe by realizowane przez

oddziaywania niekowalencyjne lub tworzenie wiza kowalencyjnych (Paleek i Jelen,

2005). Pewne sposoby osadzania zapewniaj bezporedni styczno czsteczek kwasu

z powierzchni przetwornika, a w przypadku innych w kontakcie tym porednicz

dodatkowe ugrupowania chemiczne.

Obecnie w literaturze sposoby osadzania sond ssDNA na elektrodach

s niezwykle zrnicowane i nieustannie pojawiaj si nowe procedury wykorzystujce

coraz bardziej zoone ukady. Do najczciej opisywanych nale metody

schematycznie przedstawione na Rysunku 10A (Pividori i wsp., 2000; DSouza, 2001;

Wang, 2002a; Wang, 2002b; Paleek i Jelen, 2005; Di Giusto i King, 2006; Paleek

i Bartoik, 2012):

Adsorpcja fizyczna i adsorpcja przy okrelonym potencjale

Enkapsulacja (unieruchomienie w warstwie polimerowej)

Wizanie poprzez powinowactwo awidyny i biotyny,

Wizanie kowalencyjne - unieruchomienie z wykorzystaniem powinowactwa grup

tiolowych do zota lub z wytworzeniem wizania amidowego (poprzez tworzenie

samoorganizujcych si warstw tiolowych)

Najbardziej popularne sposoby osadzania DNA na powierzchniach elektrod staych

przedstawiono schematycznie na Rysunku 10B.

29

A)

B)

Rysunek 10. A) Sposoby osadzania DNA na powierzchniach staych. B) Najczciej

wykorzystywane techniki osadzania kwasw nukleinowych (Li i Lu, 2009).

1.2.2.1 Adsorpcja

Adsorpcja fizyczna jest najprostszym sposobem osadzania kwasw

nukleinowych. Stosuje si j w przypadku, np. pastowych elektrod wglowych, elektrod

grafitowych, z wgla szklistego, a sporadycznie rwnie ITO (z tlenku indu

domieszkowanego cynkiem), rtciowych, czy zotych (Pividori i wsp., 2000; Fojta,

2002; de-los-Santos-lvarez i wsp., 2004; Gherghi i wsp., 2004; Paleek i Jelen, 2005;

Wang i wsp., 2006; Pedano i Rivas, 2010). KN adsorbuj si w sposb trway

i nieodwracalny. Bioczujnik tego typu przygotowuje si poprzez nakroplenie

30

na powierzchni elektrody roboczej roztworu DNA i pozostawienie go do wyschnicia.

Skutkuje to utworzeniem cienkiej warstwy analitycznie aktywnej o przypadkowym

i nieuporzdkowanym uoeniu poszczeglnych acuchw DNA. W przypadku

tworzenia warstw analitycznie aktywnych przeznaczonych do konstrukcji bioczujnikw

metoda osadzania kwasw nukleinowych na drodze adsorpcji nie spenia oczekiwanej

roli. DNA adsorbujc si na powierzchniach elektrod moe czy si z ni

wielopunktowo, co znacznie ogranicza zmiany struktury przestrzennej nici DNA

nastpujce w wyniku oddziaywa np. hybrydyzacji DNA (Moser i wsp., 1997; Geng

i wsp., 2009; Li i Lu, 2009; Wu i wsp., 2011).

Na powierzchni elektrod wglowych mona rwnie osadza KN poprzez

adsorpcj elektrochemiczn (przy staym potencjale) (Pividori i wsp., 2000).

Ze wzgldu na hydrofilow powierzchni wgla (otrzyman na przykad przez

jej utlenienie) KN adsorbuj si za porednictwem szkieletu fosforanowego,

pozostawiajc zasady dostpne do hybrydyzacji. Naadowana dodatnio elektroda

wglowa przyciga elektrostatycznie ujemnie naadowany szkielet, co powoduje,

e adsorpcja jest jeszcze silniejsza (Paleek i Bartoik, 2012). Adsorpcj

elektrochemiczn ssDNA przeprowadza si w cigle mieszanym roztworze przy

dodatnim potencjale +0.2 V lub +0.5 V wzgldem elektrody odniesienia. Utrzymuje si

go przez okrelony czas, ktry zaley od stenia oligonukleotydu (okoo 2-5 minut)

(Marrazza i wsp., 1999; Pedano i Rivas, 2005; Bagni i wsp., 2006; Szpakowska i wsp.,

2006). Potencja ten zwiksza stabilno sond, oddziaujcych elektrostatycznie

pomidzy dodatnio naadowan powierzchni wgla a ujemnie naadowanym

hydrofilowym szkieletem cukrowo-fosforanowym. Wwczas zasady azotowe

zorientowane s w kierunku roztworu i gotowe do hybrydyzacji z analitem. Warunkiem

zajcia efektywnej adsorpcji oligonukleotydw na powierzchni elektrody jest

odpowiednio wysokie napicie. Jednoczenie nie moe przekracza pewnych wartoci,

by nie spowodowa utlenienia zasad azotowych. DNA adsorbuje si na powierzchni

elektrody wglowej dziki jej niejednorodnej i rozwinitej powierzchni, a uoenie

acuchw podobnie jak w przypadku adsorpcji fizycznej nie jest uporzdkowane

(Pividori i wsp., 2000). Przesunicie w kierunku potencjaw bardziej ujemnych

powoduje desorpcj DNA spowodowan elektrostatycznym odpychaniem (Paleek

i Bartoik, 2012).

31

1.2.2.2 Puapkowanie w matrycy

Alternatywn metod osadzania oligonukleotydw na powierzchni elektrody jest

ich wbudowanie w polimerow matryc (Ioannou i wsp., 2006; Dimitrov i wsp., 2011;

Velusamy i wsp., 2011). Pozwala ona na bardziej stabilne unieruchomienie KN ni

adsorpcja. W celu wytworzenia matrycy wykorzystuje si polimery kationowe (np.

chitosan lub poli(chlorek diallilodimetyloamonu)) (Zhang i Hu, 2007; Tiwari i Gong,

2009) bd polimery przewodzce (np. politiofenu czy polipirolu) (Ramanaviciene

i Ramanavicius, 2004; Rahman i wsp., 2015). Unieruchomienie oligonukleotydw

w matrycy polimerowej skutkuje powstaniem trjwymiarowej warstwy o duej gstoci.

Wad tej metody jest trudno kontrolowania wielkoci porw. Ruchliwo

(elastyczno) DNA i dostpno dla analitu jest w tym przypadku do mocno

ograniczona, co prowadzi do utrudnienia procesw hybrydyzacji (de-los-Santos-lvarez

i wsp., 2004; Galandov i Labuda, 2009; Li i Lu, 2009).

1.2.2.3 Metody kowalencyjne

Oddziaywania tiol-metal szlachetny s czsto stosowane do kowalencyjnego

wizania bioczsteczek na powierzchni metali. Silne powinowactwo grup tiolowych

do zota pozwala na tworzenie wiza kowalencyjnych pomidzy atomami siarki

i zota:

R-SH + Au RS-Au + e- + H+ (1)

Natur wizania S-Au, badano przy pomocy rentgenowskiej spektrometrii

fotoelektronw (XPS), spektroskopii oscylacyjnej, spektrometrii mas

i technik elektrochemicznych. Wykazano, e tiol adsorbuje si na powierzchni elektrody

zotej, tworzc silne wizanie kowalencyjne AuS (Labuda i wsp., 2010; Vericat i wsp.,

2010).

Kwasy nukleinowe nie tworz samoczynnie wiza kowalencyjnych

z powierzchni elektrody. W zwizku z tym niezbdna jest modyfikacja samych

skadnikw warstwy analitycznie aktywnej lub funkcjonalizacja powierzchni elektrody

(Li i Lu, 2009).

Powszechnym sposobem osadzania kwasw nukleinowych na powierzchniach

elektrod staych jest tworzenie wizania kowalencyjnego pomidzy grup funkcyjn

wprowadzon do sondy DNA a sfunkcjonalizowan bd niesfunkcjonalizowan

32

powierzchni elektrody zotej. Metoda ta zapobiega przede wszystkim wymywaniu

sond z warstwy analitycznie aktywnej do roztworu, co ma miejsce w przypadku

unieruchamiania oligonukleotydw w tzw. strukturach polimerowych). Ponadto z uwagi

na moliwo wyeliminowania niespecyficznej adsorpcji czsteczek warstwy

analitycznie aktywnej w znacznym stopniu redukowane s szumy oraz faszywe

odpowiedzi bioczujnika. Energia, jak naleaoby dostarczy, aby rozerwa wizanie

kowalencyjnego jest na tyle dua, e kilkukrotne odmywanie powierzchni elektrody

(usuwanie nieunieruchomionych czstek) nie powoduje wymywania si utworzonej

warstwy (Heise i Bier, 2006).

Oligonukleotydy na powierzchni elektrod zotych mona kowalencyjne osadzi

na dwa sposoby. Pierwszy z nich polega na unieruchomieniu na powierzchni elektrody

zwizkw tiolowych zaopatrzonych w odpowiednie grupy funkcyjne, ktre nastpnie

wi si z sondami DNA za pomoc wizania kowalencyjnego (Love i wsp., 2005).

Moe to by kowalencyjne wizanie amidowe (Ligaj i wsp., 2014; Malecka i wsp.,

2013, 2014; Donmez i wsp., 2015; Zhu i wsp., 2015a) lub fosforoamidowe (Xu i wsp.,

2006; Park i Park, 2009). Ten sposb osadzania KN wymaga funkcjonalizacji

powierzchni elektrody zotej poprzez osadzenie warstw alkilotioli zakoczonych

grupami NH2 lub COOH, a take wczeniejszej modyfikacji jednego

z kocw acucha oligonukleotydowego przez wprowadzenie np. acucha alkilowego

zakoczonego grup COOH lub NH2. Metoda ta zapewnia sondom DNA swobod

konformacyjn, co znacznie uatwia proces hybrydyzacji (Prashar, 2012).

Tego typu rozwizanie zostao wykorzystane w niniejszej rozprawie. Elektrod zot

zmodyfikowano mieszan warstw tioli posiadajcych grupy funkcyjne OH oraz

COOH. Pojedyncza ni DNA posiadajca na kocu 5 grup NH2 za porednictwem

mieszaniny EDC i NHS zostaa zwizana z grup COOH tworzc wizanie amidowe

(Malecka i wsp., 2013).

Drugi sposb opiera si na osadzeniu chemicznie zmodyfikowanej sondy DNA

(gwnie koca 5) cznikiem z grup SH. Najczciej stosuje si trzy- lub

szeciowglowe czniki merkaptoalkilowe. Sondy wyposaone w taki cznik su

do bezporedniego tworzenia monowarstw na powierzchni elektrod zotych. Pojedyncze

nici DNA zmodyfikowane grupami tiolowymi, bd zwizki alkilotiolowe

poredniczce w kowalencyjnym przyczeniu DNA do powierzchni elektrody,

s unieruchamiane na powierzchni zota tworzc samoorganizujce si warstwy (SAMs)

(Sassolas i wsp., 2008). Chemisorpcja czsteczek posiadajcych grupy tiolowe jest

33

to metoda polegajca na spontanicznej reakcji pomidzy powierzchni elektrody zotej

a czsteczk zawierajc grup merkaptoalkilow. Pionierskiego odkrycia

samoorganizujcych si monowarstw dokonali Nuzzo i Allara, dziki badaniom

powierzchni elektrod zotych zmodyfikowanych organicznymi sulfidami (Nuzzo

i Allara, 1983).

W pierwszym etapie przygotowania bioczujnika najczciej stosuje si warstwy

mieszane skadajce si z sondy DNA i wypeniacza. Taka strategia zostaa

zastosowana rwnie w niniejszej rozprawie. W celu eliminacji wolnych przestrzeni

na elektrodzie uywa si rozcieczalnika wypeniajcego miejsca pomidzy sondami

DNA (np. 6-MCH) (Gooding, 2002; Paleek i Jelen, 2005; de-los-Santos-lvarez

i wsp., 2004; Wong i wsp., 2005; Mannelli i wsp., 2005). Zapewnia to utworzenie

regularnej i uporzdkowanej warstwy, w ktrej czsteczki DNA stykaj si

z powierzchni elektrody tylko za porednictwem cznika tiolowego i nachylone

s do niej pod staym ktem, co zapewnia jednakow dostpno acuchw kwasu dla

substancji oddziaujcych z nimi (Pividori i wsp., 2000; de-los-Santos-lvarez i wsp.,

2004; Paleek i Jelen, 2005).

Kad z czsteczek, ktre stanowi budulec warstwy samoorganizujcej si

mona podzieli na trzy czci, co zademonstrowano na Rysunku 11:

grup gwn siarkow, ktra tworzy silne, wizanie kowalencyjne

z podoem;

acuch gwny (szkielet) wglowodorowy o rnej dugoci, ktry

stabilizuje SAM dziki niekowalencyjnym oddziaywaniom van der Waalsa; zapewnia

efektywne upakowanie monowarstwy i przyczynia si do stabilizowania struktury

ze wzrostem dugoci acucha;

kocow grup funkcyjn, ktra moe peni rne funkcje; niewielka zmiana

w grupie kocowej moe spowodowa zmiany waciwoci fizycznych i chemicznych

warstwy; grupy kocowe nadaj szczeglne waciwoci powierzchni (hydrofilowe,

hydrofobowe); mog by rwnie wykorzystywane do zamocowania rnych

bioczsteczek lub nanostruktur za pomoc sabych oddziaywa lub wiza

kowalencyjnych (Labuda i wsp., 2010; Vericat i wsp., 2010).

34

Rysunek 11. Schemat fragmentu monowarstwy samoorganizujcej si na powierzchni

elektrody zotej.

Metoda tworzenia monowarstw samoorganizujcych si posiada nastpujce

zalety:

umoliwia zorientowane pooenie sondy DNA w stosunku do powierzchni

elektrody

daje moliwo regulacji gstoci rozmieszczenia sondy na powierzchni

elektrody zotej poprzez stosowanie rozcieczalnika np. 6-MCH (Mannelli i wsp., 2005;

Wong i wsp., 2005)

zapewnia elastyczno osadzonej sondy DNA

umoliwia tworzenie tzw. warstw mieszanych zawierajcych oprcz sondy,

np. alkilotiole eliminujce niespecyficzn adsorpcj bioczsteczek pochodzcych

z analizowanej prby na powierzchni elektrody

Technika ta ze wzgldu na opisane zalety, a take relatywnie prost procedur

przygotowania jest najszerzej stosowana do konstrukcji bioczujnikw opartych

o procesy hybrydyzacji (Drummond i wsp., 2003; Liu i wsp., 2005b; Aryaa i wsp.,

2009).

35

1.2.2.4 Powinowactwo awidyna/streptawidyna biotyna

Metoda osadzania oligonukleotydw wykorzystujca naturalne powinowactwo

awidyny lub streptawidyny do biotyny jest rwnie szeroko stosowana w konstrukcji

bioczujnikw DNA. Ni DNA modyfikuje si poprzez kowalencyjne przyczenie

biotyny do jednego z jej kocw, a na powierzchni elektrody osadza si awidyn bd

streptawid (Sassolas i wsp., 2008).

Procedury unieruchomienia biotynylowanego kwasu nukleinowego w przypadku

tej metody przebiega wedug dwch schematw:

elektroda/ awidyna lub streptawidyna/ biotynylowany oligonukleotyd,

elektroda/ biotyna/ awidyna lub streptawidyna / biotynylowany oligonukleotyd.

Kada czsteczka awidyny lub streptawidyny moe wiza si z czterema

biotynylowanymi czsteczkami ssDNA, wic je niekowalencyjnie. Taka strategia

zwiksza ilo DNA na powierzchni przetwornika, zmniejsza niespecyficzn adsorpcj

i poprawia stosunek sygnau do szumu.

Uzyskana t metod warstwa cechuje si du trwaoci i stabilnoci,

porwnywaln z immobilizacj kowalencyjn. Daje ona rwnie moliwo kontroli

gstoci upakowania sond na powierzchni elektrody (de-los-Santos-lvarez i wsp.,

2004; Paniel i wsp., 2013).

W Tabeli 1 dokonano podsumowania przedstawionych metod osadzania kwasw

nukleinowych na powierzchniach staych. Nie wszystkie z przedstawionych metod

speniaj podane wymagania. Chemisorpcja, a przede wszystkim wizanie

kowalencyjne, a take powinowactwo chemiczne s obiecujcymi metodami osadzania

sond DNA ze wzgldu na moliwo jej przyczenia do powierzchni elektrody

w jednym punkcie. Jednak proces wytworzenia wizania kowalencyjnego, jest do

zoony, wymaga modyfikacji odpowiednimi grupami funkcyjnymi powierzchni

elektrody, sondy DNA lub obu tych elementw. Zatem, proste i tanie procedury

unieruchamiania kwasw nukleinowych, takie jak adsorpcja czy unieruchamianie

w matrycy polimerowej mog by rwnie brane pod uwag. W przypadku adsorpcji

fizycznej ani powierzchnia elektrody, ani DNA nie wymagaj modyfikacji. Fakt ten

potwierdza, e stanowi ona najprostszy i najtaszy sposb unieruchomienia kwasw

nukleinowych. Aczkolwiek, zdolno oddziaywa sondy z analitami jest w tym

wypadku ograniczona. Powodem tego zjawiska jest brak kontroli orientacji sondy,

36

zwizany z jej ograniczon elastycznoci spowodowan przez wielopunktowe

unieruchomienie sondy. Desorpcja w tym wypadku jest rwnie trudna do uniknicia.

Tabela 1. Ocena poszczeglnych metod unieruchomienia kwasw nukleinowych. + saba,

++ rednia, +++ dobra (de-los-Santos-lvarez i wsp., 2004)

Metoda osadzania

DNA

Gsto

upakowania

i kontrola

orientacji

Stabilno Zdolno

wizania

Prostota

wykonania

Brak

niespecyficznej

adsorpcji

Koszt

Adsorpcja fizyczna + + + +++ + +++

Adsorpcja

elektrostatyczna ++ + ++ ++ + +++

Unieruchamianie

w matrycy + ++ + ++ +++ ++

Elektrostatyczne

unieruchamianie

w matrycy ++ ++ ++ ++ +++ ++

Powinowactwo +++ +++ +++ + +++ +

Wizanie

kowalencyjne +++ +++ +++ + +++ ++

Podsumowujc, procedura osadzania sond DNA na powierzchni elektrody ma

istotny wpyw na proces jej hybrydyzacji z komplementarnymi sekwencjami DNA czy

RNA obecnymi w roztworze badanej prby. Kada z przedstawianych wyej metod

posiada wady i zalety, dlatego w literaturze wci spotykane s metody doskonalenia

ich tak, aby mogy gwarantowa jeszcze lepsz selektywno, trwao i wysok

czuo bioczujnika.

1.2.3. Sposoby generowania sygnau w bioczujnikach elektrochemicznych opartych

o kwasy nukleinowe

W ostatnim trzydziestoleciu elektrochemiczne techniki detekcji i analizy DNA

zyskuj coraz wiksz popularno jako metody molekularnej diagnostyki

w medycynie, ochronie rodowiska, kryminalistyce, czy farmacji. Metody te s

relatywnie tanie, proste i mog by stosowane poza laboratorium.

37

Po przeprowadzeniu interakcji sondy DNA z badanym analitem DNA czy RNA,

ukad detekcyjny ma na celu dokonanie analizy sprawdzajcej wytworzenie si hybrydy

na powierzchni elektrody. Do technik wykrywajcych procesy hybrydyzacji nale

techniki bezodczynnikowe (z ang. reagent-less). Nie wymagaj one zastosowania

dodatkowych odczynnikw w celu wywoania sygnau analitycznego. Stosuje si

rwnie metody bezwskanikowe (z ang. label-free), w ktrych nie ma potrzeby

chemicznej modyfikacji sond DNA, analitw czy innych substancji oddziaujcych

z oligonukleotydami (Lucarelli i wsp., 2008).

Jednym ze sposobw wykrywania hybryd kwasw nukleinowych osadzonych

na powierzchniach staych s metody oparte o naturalne waciwoci elektroaktywne

kwasw nukleinowych, wykorzystujce wskaniki redoks-aktywne (wice si z DNA

kowalencyjnie lub niekowalencyjne), a take oparte na aktywnoci katalitycznej

wybranych enzymw. Przegld technik wykrywania procesw hybrydyzacji

stosowanych w elektrochemicznych bioczujnikach DNA przedstawiono w Tabeli 2 na

podstawie raportu technicznego sporzdzonego przez Labud i wsppracownikw

(Labuda i wsp., 2010).

Tabela 2. Metody detekcji wykorzystywane w bioczujnikach elektrochemicznych DNA

wedug IUPAC (Labuda i wsp., 2010).

Zasada

wykrywania Przykady

Metoda

bezwskanikowa

(label-free)

Metoda

bezodczynnikowa

(reagent-less)

Elektroaktywno

kwasw nukleinowych

Utlenienie guaniny na

elektrodach wglowych

Tak

Tak (moe by poczona

z mediatorami redoks)

Tensametryczna

odpowied DNA na

elektrodach rtciowych

Tak

Wskaniki redoks

Elektrostatyczne (aniony

lub kationy)

Nie Interkalatory, zwizki

czce si z rowkami

DNA

Wskaniki redoks

wice si

kowalencyjnie (znaczniki)

Zwizki

metaloorganiczne,

zwizki chelatowe metali,

ugrupowania organiczne,

nanoczsteczki

Nie

Tak (moe zosta

zastosowany jako

mediator redoks przy

uyciu rozpuszczalnego

depolaryzatora)

Enzymy poczone z

DNA Fosfatazy, peroksydazy Nie

38

Powszechnie stosuje si dwie strategie generowania elektrochemicznego sygnau

analitycznego przez bioczujniki oparte na procesach hybrydyzacji: metod bezporedni

i metod poredni (de-los-Santos-lvarez i wsp., 2004; Radecki i wsp., 2006; Labuda

i wsp., 2010). Charakterystyka powyszych metod zostaa przedstawiona

na Rysunku 12.

Rysunek 12. Strategia opracowana w celu wygenerowania sygnau elektrochemicznego

w bioczujnikach przeznaczonych do wykrywania kwasw nukleinowych (de-los-Santos-

lvarez i wsp., 2004).

39

Metody bezporednie wykrywajce procesy hybrydyzacji opieraj si

na elektroaktywnoci KN osadzonych na powierzchni elektrody. Jest to moliwe dziki

katalitycznemu utlenianiu zasad i cukrw budujcych kwasy nukleinowe. Wszystkie

zasady azotowe wchodzce w skad DNA posiadaj zdolno do elektrochemicznego

utleniania si na powierzchniach elektrod wglowych. Do celw analitycznych jednak

najczciej wykorzystuje si sygna pochodzcy od guaniny, ktra wykazuje

najsilniejsze waciwoci elektroaktywne na rnych elektrodach staych (Paleek

i Fojta, 2005). Metody oparte na utlenianiu zasad azotowych s bezwskanikowe,

szybkie i proste, co niewtpliwie jest zalet. Niestety utlenianie guaniny na elektrodach

staych wymaga wysokich dodatnich potencjaw (okoo 1 V wzgldem

chlorosrebrowej elektrody odniesienia), co wie si ze znacznym sygnaem ta

powodujcym obnienie granic wykrywalnoci. Powyszy sposb wykrywania

KN umoliwia analiz procesw hybrydyzacji bez koniecznoci modyfikacji nici

kwasw nukleinowych, co z pewnoci upraszcza sam konstrukcj bioczujnika, a take

obnia koszty z tym zwizane. Jednak tego typu ukady s jednorazowe, a sam sygna

jest do saby i zaley od obecnoci guaniny w sekwencji sondy unieruchomionej

na powierzchni elektrody, co jak mona przypuszcza wyklucza go z wielu zastosowa.

Wykorzystanie znacznikw redoks-aktywnych uniezaleniajcych otrzymywany sygna

prdowy od sekwencji DNA przy jednoczesnym zwikszeniu jego intensywnoci

stanowi w tym przypadku uyteczne rozwizanie.

Wykrywanie procesw hybrydyzacji zachodzcych na powierzchni elektrod moe

odbywa si nie tylko w oparciu o bezporedni elektrochemi KN. Porednie metody

wykrywania hybrydyzacji DNA opieraj si na:

1. obserwacji zmian waciwoci na granicy fazy elektroda/ roztwr

2. wykorzystaniu znacznikw specyficznie oddziaujcych z pojedynczymi lub

podwjnymi nimi DNA obecnymi w warstwie detekcyjnej bioczujnika.

Procedury nalece do pierwszej kategorii bazuj na badaniu zmian nastpujcych

parametrw wywoanych procesami hybrydyzacji:

zmian natenia prdu faradajowskiego (Malecka i wsp., 2012; 2014; 2015;

2016; Gao i wsp., 2016)

przewodnictwa jonowego (Hianik i wsp., 2001; Tam i wsp., 2009b;

Gu, 2014)

elektrochemicznych waciwoci polimerw przewodzcych (Galandov

i Labuda, 2009; Peng i wsp., 2009; Ates, 2013; Ramanavicius i wsp., 2012)

40

pojemnoci elektrycznej (Berney i wsp., 2000; Hong i wsp., 2004; Kang

i wsp., 2010; Tsai i wsp., 2011)

impedancji badanej granicy faz (Labuda i wsp., 2010; Malecka i wsp., 2013;

Jarocka i wsp., 2016)

Znacznie czciej procesy hybrydyzacji zachodzce w warstwie detekcyjnej

bioczujnika obserwuje si z zastosowaniem znacznikw elektroaktywnych

posiadajcych zdolno wizania si z kwasami nukleinowymi w sposb

niekowalencyjny. Niekowalencyjne znaczniki redoks stosuje si do rozrniania sondy

ssDNA (wskazujc, e hybrydyzacja nie miaa miejsca) od dupleksu (wskazujc proces

hybrydyzacji). Wskaniki te mog odpowiada na zmiany iloci DNA na powierzchni

elektrody (wskaniki elektrostatyczne) lub rozpoznawa struktur DNA (wizanie

w duych lub maych rowkach helisy, czy te interkalacja) (Labuda i wsp., 2010).

Metoda ta wykorzystuje rne powinowactwo znacznikw elektrochemicznych

do pojedynczych i podwjnych nici DNA (Paleek i Fojta, 2005). Biorc pod uwag

zasad dziaania znacznikw elektroaktywnych wi si one z DNA przez

(Leszczyski i Duski, 2006):

elektrostatyczne oddziaywania na zewntrz helisy DNA

interkalacj do wntrza helisy

wizania w duych lub maych rowkach helisy (obszarach, w ktrych

wystpuj potencjalne donory oraz akceptory wodoru w wizaniach

wodorowych),

wizania kowalencyjne,

Sposoby wizania czsteczek z DNA przedstawiono schematycznie na Rysunku 13.

41

Rysunek 13. Sposoby wizania czsteczek z DNA (Leszczyski i Duski, 2006).

Niespecyficzne oddziaywanie elektrostatyczne na zewntrz helisy polega

na przyciganiu czsteczek obdarzonych adunkiem dodatnim przez ujemnie

naadowane grupy fosforanowe stanowice element skadowy szkieletu DNA (Rauf

i wsp., 2005; Ferapontova i wsp., 2011). Wskaniki elektrostatyczne odpowiadaj

na rnice w gstoci adunku ujemnego pomidzy pojedyncz nici DNA a hybryd.

Proces hybrydyzacji zachodzcy pomidzy sond unieruchomion na powierzchni

elektrody a analitem DNA skutkuje zwikszeniem gstoci adunku ujemnego przy

powierzchni elektrody. Wskaniki redoks, takie jak np. anionowy kompleks

heksacyjanoelazianu (III/II) [Fe(CN)6]3-/4- (s odpychane od powierzchni

zmodyfikowanej sond DNA) lub kationowy kompleks heksaaminorutenu

[Ru(NH3)6]3+/2+ (s przycigane do ujemnie naadowanej hybrydy) stosuje si

do monitorowania zmian gstoci adunku ujemnego za pomoc impedancji lub technik

woltamperometrycznych (Labuda i wsp., 2010; Paleek i Bartoik, 2012).

Unieruchomienie kwasw nukleinowych na powierzchni elektrody nie powoduje

zahamowania oddziaywa elektrostatycznych z w/w znacznikami redoks-aktywnymi

(McEwen i wsp., 2009).

Elektrostatyczne przyciganie lub odpychanie ujemnie bd dodatnio

naadowanych znacznikw redoks-aktywnych obecnych w roztworze przez helis DNA

unieruchomion na powierzchni elektrody, wykorzystywane byo przez profesora

42

Umezaw w tworzeniu elektrochemicznych czujnikw jonokanaowych opartych

o DNA (Aoki i Umezawa, 2002; 2003). Dokadnie czujniki tego typu zostay omwione

w Rozdziale 3.1.

W porwnaniu z oddziaywaniami elektrostatycznymi wiksz specyficzno

w odrnianiu jednoniciowego DNA od hybrydy wykazuj zwizku interkalujce

(Richards i Rodger, 2007; Neto i Lapis, 2009; Greschner i wsp., 2013; Rescifina i wsp.,

2014). Charakteryzuj si one zazwyczaj struktur, w skad ktrej wchodzi ukad

aromatyczny o minimum 3-4 piercieniach. Dziki tej budowie interkalatory wnikaj

pomidzy pary paskich zasad azotowych w podwjnej nici DNA (najczciej s to pary

GC) (Reynisson i wsp., 2003; Li i wsp., 2007). Czsteczki interkalatorw gromadz

si na powierzchni elektrody zmodyfikowanej hybryd w znacznie wikszym stopniu

ni w przypadku pojedynczej nici DNA (Paleek i Fojta, 2005). W bioczujnikach

elektrochemicznych jako interkalatory stosuje si np. daunomycyn (Cai i wsp., 2003;

Yang i wsp., 2007; Zhu i wsp., 2012), bromek etydyny (Elahi i wsp., 2012; Balvedi

i wsp., 2014; Honorato Castro i wsp., 2014), oran akrydyny (Siddiquee i wsp., 2011),

bkit metylenowy (Zhang i wsp., 2009; Radhakrishnan i wsp., 2013; Tavallaie i wsp.,

2014; Lin i wsp., 2015), czy proflawin (Gbala i wsp., 2009; 2010). Wymienione

powyej zwizki wykazuj wiksze powinowactwo wzgldem hybrydy ni pojedynczej

nici DNA.

Jednak najbardziej specyficznie wykrywaj helis DNA zwizki wice si z ni

w tzw. maych rowkach, typowych jedynie dla podwjnych nici DNA (McEwen i wsp.,

2009). Ten sposb oddziaywania substancji z DNA, w przeciwiestwie do interkalacji,

nie powoduje zmian w konformacji DNA. Bazuje on na mechanizmie podobnym

do modelu klucza i zamka obecnego w wizaniach pomidzy ligandem

a makroczsteczk. Zwizki wice si w mniejszym rowku DNA zbudowane

s z kilku pojedynczych piercieni zwykle aromatycznych typu pirol, furan czy benzen

poczonych midzy sob krtkim cznikiem. Substancjami wykazujcymi tego typu

oddziaywania z DNA s midzy innymi: berenil (Zhou i wsp., 2014), distamycyna

(Khedkar i wsp., 2007), Hoechst 33342 (Zhou i wsp., 2012), Hoechst 33258 (Safavieh

i wsp., 2012), netropsyna (Andac i wsp., 2011), czy pentamidyna (Szpakowska i wsp.,

2006).

Oprcz wizania w maym rowku, potencjalnym miejscem oddziaywa rnych

substancji w strukturze helisy DNA jest rwnie duy rowek. Tego typu wizanie

wystpuje rzadziej, gdy obszerna przestrze duego rowka uniemoliwia tworzenie

43

wielu pocze niekowalencyjnych przez mae czsteczki, jednoczenie udostpniajc

go dla wikszych moleku, np. biaek (Leszczyski i Duski, 2006). Jeli ju dana

substancja zwie si z DNA w duym rowku, czsto dochodzi do utworzenia formy

potrjnej helisy (Erdem i Ozsoz, 2002). Omawiany typ wizania dotyczy gwnie

zwizkw, w ktrych oprcz fragmentu struktury wicego si (przewanie sabo)

w duym rowku DNA, wystpuj inne struktury, pozwalajce na silne czenie

czsteczek z DNA (np. na drodze interkalacji lub wizania kowalencyjnego).

Wystpowanie dodatkowych grup funkcyjnych jest czsto kluczowe, gdy

oddziaywania wystpujce w duym rowku s zbyt sabe, by utrzyma tam ligand

(Leszczyski i Duski, 2006). Substancjami wicymi si z DNA w duym rowku

s na przykad: dimeryczne kaliksareny (Hu i wsp., 2012), norfloksacyna (Erdem

i Ozsoz, 2002), kompleksy chromu III i zasady Shiffa np.: [Cr(1,2-

bis(salicylidenoamino)etano(H2O)2]+ (Vijayalakshmi i wsp., 2000).

Wikszo wykorzystywanych zwizkw oddziaujcych z rowkami

dwuniciowych KN wykazywao wiksze powinowactwo do fragmentw zawierajcych

pary zasad A i T (Chaires, 1998; Haq, 2002).

Znaczniki czce si z DNA w sposb kowalencyjny s narzdziem czsto

stosowanym w bioczujnikach przeznaczonych do wykrywania specyficznych sekwencji

oligonukleotydw. Znakowanie polega na modyfikacji chemicznej sondy bd analitu

za pomoc zwizkw elektroaktywnych. Wprowadzenie do DNA kowalencyjnie

przymocowanego znacznika elektroaktywnego znacznie poprawia specyficzno

zwaszcza procesw hybrydyzacji, poniewa znakowane DNA mona atwo odrni

od nieznakowanego z powodu rnic potencjaw redoks skadnikw DNA

i znacznikw (na przykad znakowany analit DNA z nieznakowan sond, znakowana

sonda z nieznakowanym analitem, lub znakowany nukleotyd wprowadzony

w okrelonym pooeniu do innego nukleotydu w czsteczce DNA). Ponadto,

zastosowanie rnych znacznikw dla rnych sekwencji nukleotydowych pozwala na

analiz wielu analitw rwnolegle (Labuda i wsp., 2010). Do znacznikw

elektroaktywnych kowalencyjnie przyczajcych si do kwasw nukleinowych nale

m.in.: kompleksy tetratlenku osmu, pochodne ferrocenu, kompleksy rutenu,

antrachinon, grupy aminofenylowe i nitrofenylowe, wielocienne klastry boru,

znaczniki enzymatyczne (peroksydaza, alkaliczna fosfataza), nanoczsteczki/kropki

kwantowe, a take nanorurki wglowe (Paleek i Bartoik, 2012).

44

2. Metody wykrywania wirusw ptasiej grypy

Ptasi gryp wywouj wirusy grypy typu A nalece do rodziny

Orthomyxoviridae. Typ A spotyka si u rnorodnych gatunkw ptakw i ssakw.

Podzia wirusw grypy typu A jest oparty na waciwociach antygenowych zewntrz

powierzchniowych glikoprotein hemaglutyniny (HA) oraz neuraminidazy (NA),

podanych jako podtyp HxNy. Dotychczas zidentyfikowano 16 podtypw HA (H1-H16)

i 9 podtypw NA (N1-N9), co daje cznie 144 moliwe kombinacje segmentw

genowych i powoduje istnienie ogromnej rnorodnoci wirusw typu A, chocia nie

wszystkie kombinacje HxNy wystpuj naturalnie. Genom wirusa typu A zawiera

jednoniciowy kwas RNA o ujemnej polarnoci, podzielony na osiem segmentw (Lee

i Saif, 2009).

Wirus ptasiej grypy, podobnie jak inne szczepy wirusa grypy, rozprzestrzenia si

w organizmie ywiciela poprzez dwa biaka hemaglutynin (HA) i neuraminidaz

(NA). Umoliwiaj one wirusowi H5N1 atakowanie zarwno ptakw, jak i ludzi.

Symbol H5N1 oznacza, e na powierzchni wirusa ptasiej grypy znajduj si biaka:

hemaglutynina typu pitego i neuraminidaza typu pierwszego (Lee i Saif, 2009). HA

poredniczy w czeniu si wirusa z receptorami komrkowymi i w ten sposb pozwala

wirusowi wnika do komrek. Natomiast NA, znajdujca si w mniejszych ilociach

w otoczce wirusa, uwalnia nowopowstae czstki wirusa z zakaonej komrki w ten

sposb mog one infekowa kolejne komrki. Niewielkie zmiany tych biaek

umoliwiaj wirusowi zaraanie nowych gatunkw ywicieli. Zmiany mog powsta

wskutek mutacji lub podczas wymiany genw, gdy dwa rne typy wirusa zara

t sam komrk (Kukol i wsp., 2008).

Wirusy ptasiej grypy (AIV), w zalenoci od ich zjadliwoci, podzielono na dwie

formy: wysoko- (HPAI) i niskopatogenn (LPAI). Znane s dwa szczepy o wysokiej

patogenicznoci H5 i H7, ktre mog przyczynia si do duej miertelnoci wrd

drobiu. Szczepy te zazwyczaj jednak nie pojawiaj si wrd dziko yjcych ptakw.

Wystpuj one u drobiu przetrzymywanego w ogromnych, nienaturalnych

zagszczeniach. Dzikie ptaki mog zarazi si tymi szczepami przez bezporedni

kontakt z chorym drobiem. Zakaenia drobiu wysoce zjadliw ptasi gryp mog

spowodowa bardzo wysok miertelno zbliajc si nawet do 100%, podczas gdy

zakaenia niskimi szczepami patogennymi s agodniejsze. Spord wszystkich

45

podtypw ptasiej grypy wirus H5N1 ma szczeglne znaczenie z wielu wzgldw. H5N1

mutuje szybko i posiada skonno przyjmowania genw od wirusw zaraajcych inne

gatunki zwierzt. Ptaki, ktre przeyy zakaenie, wydzielaj wirusa w odchodach

i linie przez co najmniej 10 dni, przyczyniajc si do jego szybkiego

rozprzestrzeniania. W 16 krajach w okresie od 2003 roku do czerwca 2016 roku

zanotowano 851 przypadkw ludzkiego zakaenia ptasi gryp, w tym 450 zgonw

(WHO, 2016).

Pierwszy przypadek zakaenia czowieka wirusem H5N1 HPAI mia miejsce

w Hong Kongu w 1997 roku. W Polsce natomiast odnotowano dwie epidemie ptasiej

grypy (AI) w cigu ostatnich dwch dekad, ktre miay miejsce w roku 2006 i 2007.

Wiosn 2006 roku wykryto 64 przypadki wirusa H5N1, gwnie

w abdziach niemych. Z kolei w grudniu 2007 roku, 9 przypadkw HPAI H5N1

potwierdzono u drobiu handlowego i 1 u dzikich ptakw trzymanych w niewoli

(mietanka i Minta, 2014). Rozprzestrzenianie si zakaenia wrd ptakw zwiksza

moliwo bezporedniego zaraenia ludzi. Z biegiem czasu, ze wzrostem liczby

zaraonych ludzi, wzrasta rwnie prawdopodobiestwo, e w organizmie osoby,

jednoczenie zaraonej szczepami sezonowej i ptasiej grypy, powstanie nowy podtyp

wirusa, zawierajcy charakterystyczne dla ludzkiego wirusa geny, ktre zapewni mu

atwe przenoszenie midzy ludmi. Takie zdarzenie mogoby doprowadzi do pandemii

grypy (Charlton i wsp., 2009; Lin i wsp., 2009; Wang i wsp., 2013). Ze wzgldu

na fakt, e objawy ptasiej grypy nie s wystarczajco charakterystyczne, aby ustali

diagnoz wycznie na podstawie obrazu klinicznego wane jest, aby korzysta

z niezawodnych narzdzi diagnostycznych. Szybka identyfikacja wirusa ma istotne

znaczenie kliniczne, ekonomiczne i epidemiologiczne (Diouani i wsp., 2008).

Aktualnie rozwijane s rnorodne podejcia do wykrywania wirusw ptasiej

grypy. Cz z nich skupia si na ulepszaniu ju istniejcych metod, inne opieraj si

na cakiem nowych pomysach. Natomiast techniki rutynowej diagnostyki bazuj

gwnie na dobrze sprawdzonych metodach takich jak test ELISA, PCR czy

amplifikacja sekwencji kwasw nukleinowych (NASBA). Obecnie do wykrywania

wirusw ptasiej grypy stosuje si metody etiologiczne, serologiczne, a take

molekularne (Ping i wsp., 2015).

46

2.1. Metody etiologiczne

Do metod etiologicznych stosowanych do wykrywania wirusa ptasiej grypy

naley izolacja wirusa poprzez jego hodowl wirusa w zarodkach kurzych i dalsz

identyfikacj jego podtypw. Jest ona uwaana za zoty standard, poniewa jest

to metoda czua i dokadna, generujca wysokie miana wszystkich rodzajw wirusw

ptasiej grypy (Newton i wsp., 2000). Jednak hodowla, a nastpnie identyfikacja

wyizolowanego wirusa jest kosztowna, wymaga duego nakadu pracy

i znacznych iloci materiau biologicznego. Czas oczekiwania na wynik jest czsto zbyt

dugi (nawet do 2 tygodni), co znacznie ogranicza moliwo jej wykorzystania

w praktyce klinicznej. Ponadto, ze wzgldu na zakano i wysok zjadliwo wirusa,

moe zagraa bezpieczestwu rodowiska i zdrowia publicznego. W zwizku z tym

izolacja wirusa nie nadaje si do szybkiego wykrywania i rutynowej diagnozy. Moe

by stosowana w celu uzyskania ywych izolatw wirusa z przeznaczeniem do dalszej

szczegowej analizy laboratoryjnej. Inne techniki wykrywania, takie jak

immunodyfuzja na elu agarowym (AGID), rne testy immunologiczne

(immunofluorescencyjne, immunoenzymatyczne, np. ELISA czy immuno-

chromatograficzne) i reakcja polimerazy acuchowej w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

mog potwierdzi i sklasyfikowa izolaty wirusa (Ping i wsp., 2015).

2.2. Metody serologiczne

Przeciwciaa skierowane przeciwko HA i NA, nukleoproteiny i biako matrycowe,

wytwarzane po wystpieniu ptasiej grypy u drobiu, mona wykrywa za pomoc metod

serologicznych, takich jak: test zahamowania hemaglutynacji (HIT), test zahamowania

neuraminidazy (NIT), ELISA, AGID, odczyn wizania dopeniacza (OWD), oraz test

neutralizacji (NT) (Cox, 1999; El Zowalaty i wsp., 2013). Ze wzgldu na ich wysok

specyficzno, testy HIT i NIT s najczciej stosowane w identyfikacji podtypu wirusa

do pomiaru poziomw odpowiednich przeciwcia dla HA i NA w prbkach surowicy

(Prince i Leber, 2003). Zalet testu HIT jest niska cena, jednake, jest uwaany

za trudne narzdzie diagnostyczne, poniewa jest pracochonny i wymaga dwch

prbek surowicy pobranych w tym samym czasie. To samo dotyczy testu NIT. Jest on

47

rwnie do skomplikowan i drog metod, a wynik nie zawsze uzyskuje si w cigu

jednego dnia roboczego. Testy te s trudne do wczenia do zautomatyzowanych

procedur i wymagaj cigego rda odpowiednich czerwonych krwinek (Pikua i wsp.,

2011). Alternatywnie, testy ELISA stosowane s do wykrywania przeciwcia

specyficznych dla wirusa grypy. Do pomiaru specyficznych przeciwcia wirusa grypy

w surowicy krwi s bardziej czue ni testy HIT czy OWD (Voeten i wsp., 1998).

Test AGID suy rwnie do diagnostyki serologicznej wirusw ptasiej grypy

(Beard, 1970; Jenson, 2014). Charakteryzuje si wieloma zaletami, uywane do badania

odczynniki (antygeny i surowica kontrolna) s komercyjnie dostpne na rynku. Jest tani,

atwy w wykonaniu i nie wymaga specjalistycznej aparatury pomiarowej. Jednak

metod t cechuje do niska czuo w porwnaniu z testami ELISA i HIT. Ponadto

dodatni wynik tego testu dowodzi jedynie zakaenia wirusem grypy typu A, nie

wskazuje na podtyp hemaglutyniny. Konieczne s wic w takim przypadku dodatkowe

badania w celu potwierdzenia bd wykluczenia najgroniejszych podtypw H5 i H7

wirusa AI (Pikua i wsp., 2011; Jenson, 2014).

Testy ELISA s czsto wykorzystywanym narzdziem w wykrywaniu wirusw

i przeciwcia przeciwko wirusowi AI. S one komercyjnie dostpne i mona

je zautomatyzowa (Ping i wsp., 2015). S proste w wykonaniu i interpretacji,

a w zwizku z tym mniej zalene od umiejtnoci i dowiadczenia wykonujcej

je osoby. Testy ELISA charakteryzuj si umiarkowanymi kosztami i nadaj si

do masowych bada przesiewowych zakae wirusowych gryp typu A (Mendoza

i wsp., 1999). Tak wic, ta metoda jest odpowiednia do kontroli wirusw ptasiej grypy

na du skal np. na fermach drobiu. Jednak i ona posiada wady. Jedn z nich jest

stosunkowo niska czuo. W przypadku wykrywania wirusa grypy typu A ELISA

w porwnaniu do metod amplifikacji KN takich jak np. PCR charakteryzuje si

czuoci nisz nawet 6-7 rzdw wielkoci (Steininger i wsp., 2002). Natomiast

uycie metod elektrochemicznych pozwala na uzyskanie stosunkowo wysokich czuoci

wynoszcych 10 ng biaka/mL. Czuo taka wystarcza do wykrycia przeciwcia

przeciwko ptasiej grypie (Ohtsuka i wsp., 2008), jednak nadal moe by

niewystarczajca w przypadku wykrywania wirusa. W oparciu o doniesienia literatury

naukowej do wykrywania przeciwcia skierowanych przeciwko wirusowi ptasiej grypy

stosuje si rne testy ELISA np. p-ELISA (peptydowa) czy "Sandwich" ELISA test

podwjnego wizania (Du i wsp., 2009; Luo i wsp., 2009; Moreno i wsp., 2009;

Velumani i wsp., 2011; Zhu i wsp., 2014).

48

Porwnujc metody serologiczne z metodami izolacji w hodowli, mona

stwierdzi, e analizy serologiczne s znacznie szybsze i mniej kosztowne, jednak

czsto cechuje je mniejsza czuo i specyficzno (Pikua i wsp., 2011).

2.3. Metody molekularne

W ostatnich latach metody molekularne wykorzystujce amplifikacj

KN odgrywaj coraz wiksz rol w wykrywaniu lub diagnostyce wirusw ptasiej

grypy. PCR jest aktualnie jedn z najczciej wykorzystywanych do tego celu metod.

Szczeglnie warta polecenia jest ona w wykrywaniu maych iloci wirusa. Ze wzgldu

na fakt, e wirusy ptasiej grypy nale do grupy wirusw RNA, w przypadku

identyfikacji tego wirusa technika PCR musi zosta poprzedzona przepisaniem

informacji genetycznej na sekwencj DNA. W zwizku z tym metod PCR modyfikuje

si dodajc etap odwrotnej transkrypcji RT-PCR (Stefaska i wsp., 2012), aby

bezporednio wykrywa wirusa.

Obecnie klasyczny PCR jest coraz czciej wypierany przez PCR czasu

rzeczywistego (RRT-PCR), czyli PCR z analiz przyrostu produktu w czasie

rzeczywistym. Koszty pojedynczej analizy przewyszaj znacznie koszty

standardowego PCR. Aczkolwiek RRT-PCR charakteryzuje si znacznie wiksz

specyficznoci, czuoci detekcji oraz skrconym czasem analizy w porwnaniu

do hodowli wirusa. Jest on preferowany take ze wzgldu na znaczn automatyzacj

techniki. Jednak podstawow zalet tej metody jest jej ilociowy charakter,

w przeciwiestwie do klasycznej metody PCR zapewniajcej jedynie wynik jakociowy

(plus/minus). Metoda ta ma rwnie sabe strony. Nale do nich m.in., pracochonno,

do trudna optymalizacja metody, stosunkowo wysokie (lecz systematycznie

spadajce) koszty zakupu aparatury, potrzeba posiadania dobrze wyposaonego

laboratorium oraz zatrudnienia wyszkolonego personelu. Mimo ogranicze metoda

ta jest aktualnie jedn z najczciej stosowanych metod szybkiego wykrywania wirusw

ptasiej grypy (Stefaska i wsp., 2012; Shojaei i wsp., 2014).

W celu usprawnienia i obnienia kosztw badania coraz czciej wykorzystuje si

tzw. multipleks PCR (mRT-PCR) przeznaczony do identyfikacji wicej ni jednego

wirusa w pojedynczej reakcji. Najwiksze zalety reakcji multipleksowych to przede

49

wszystkim mniejsze zuycie odczynnikw (a tym samym niszy koszt analizy) oraz

oszczdno czasu, szczeglnie w przypadku koniecznoci badania duej liczby prbek

(Gavin i wsp., 2003; Stefaska i wsp., 2012).

Do wykrywania wirusw ptasiej grypy stosuje si rwnie metod opart

na amplifikacji sekwencji kwasw nukleinowych (NASBA). Ta metoda pozwala

na bardzo wydajn amplifikacj RNA, pozwalajc powieli materia genetyczny

w prbce nawet 109 - krotnie w czasie zaledwie 2 godzin (Compton, 1991).

Eksperymenty NASBA nie wymagaj uycia specjalistycznego sprztu, ca

reakcj mona przeprowadzi w ani wodnej w jednej temperaturze, niezalenie

od laboratorium czy wykwalifikowanego personelu. NASBA dostarcza dokadnych,

spjnych i wiarygodnych wynikw o wysokiej czuoci. Moe dorwna lub nawet

przewyszy PCR czasu rzeczywistego pod wzgldem czuoci. Co wicej, ze wzgldu

na izotermiczny charakter metody NASBA mog by atwo standaryzowane (Lau

i wsp., 2006).

Najbardziej powszechnie do diagnozowania wirusw ptasiej grypy stosuje si

RT-PCR (Starick i wsp., 2000; Lee i wsp., 2001; Munch i wsp., 2001), RRT-PCR

(Spackman i wsp., 2002; Dovas i wsp., 2010; Zeynalova i wsp., 2015), mRT-PCR (Xie

i wsp., 2006; He i wsp., 2009; Ma i wsp., 2015), a take NASBA (Chantratita i wsp.,

2008; Moore i wsp., 2008; 2010). Wszystkie wyej wymienione metody s zalecane

przez WHO i OIE do wykrywania, diagnozowania i nadzoru wirusw ptasiej grypy

u ludzi, drobiu i dzikiego ptactwa.

2.4. Bioczujniki przeznaczone do wykrywania wirusw ptasiej grypy

Klasyczne metody diagnostyczne z racji swojej pracochonnoci

i czasochonnoci s coraz czciej zastpowane nowoczesnymi metodami, ktre

oferuj znaczce skrcenie czasu diagnozy, zwikszenie czuoci i znacznie prostsze

procedury wykonywania bada.

Wrd sposobw wykrywania wirusw ptasiej grypy rozwijanych w ostatnich

latach znajduj si bioczujniki. Najbardziej popularne, ze wzgldu na nisk cen

i wysok czuo, stay si bioczujniki elektrochemiczne. Metody opierajce si

50

na pomiarze sygnau elektrycznego maj znacznie wiksze moliwoci miniaturyzacji

ukadu pomiarowego.

Parametry, takie jak pojemno (Guiducci i wsp., 2004), natenie prdu czy oporno

(Liu i wsp., 2012) mog si zmienia w wyniku rozpoznania sekwencji

komplementarnej KN (genoczujniki) czy antygenu (immunoczujniki) w badanej prbce.

Immunoczujniki s to bioczujniki, ktre zawieraj w warstwie analitycznie

aktywnej lub wykrywaj przeciwciaa (lub ich fragmenty). Wykorzystuj one zdolno

przeciwcia (bd ich fragmentw) do rozpoznania waciwych sobie antygenw nawet

w bardzo zoonych matrycach. W wyniku takiego rozpoznania powstaj kompleksy

immunologiczne, ktre wpywaj na waciwoci powierzchni zmodyfikowanych

elektrod (Luppa i wsp., 2001). W ostatnich latach w wielu orodkach naukowych

na caym wiecie prowadzone s intensywne badania nad zastosowaniem

immunoczujnikw do wykrywania wirusw ptasiej grypy. Przykadowe

elektrochemiczne immunoczujniki zestawiono w Tabeli 3. W zalenoci od konstrukcji,

rodzaju badanej substancji i matrycy mog one osiga czuo wahajc si

w granicach od 0.43 pg/mL do kilkunastu tysicy 104 pg/mL.

Tabela 3. Przykadowe elektrochemiczne immunoczujniki przedstawione w literaturze

naukowej przeznaczone do wykrywania AIV.

Modyfikacja

elektrod

Technika

pomiarowa Analit

Granica

wykrywalnoci

[pg/mL]

Referencje

Au/16-MHA/Ab EIS H7N1 5.0 Diouani i wsp.,

2008

Au/OT+BDDT/NV/Ab EIS AIV 8 000 Hassen i wsp.,

2011

Au/Con A/HRP/BSA DPV H9N2 1 000 Zhou i wsp.,

2013

Au/OT/OGaL/BSA EIS H1N1 10 000 Wicklein i wsp.,

2013

Au/HDT/AuC/Fab/BSA EIS His6-

Qinghai 2.2

Jarocka i wsp.,

2014

Au/MCB+DPM/

Cu(II)/HA/BSA EIS

anty-

HA 2.4

Jarocka i wsp.,

2015

GCE/AuPd/Ab/BSA DPV wirus

grypy 0.43

Yang i wsp.,

2015

GCE/EDA/AG/Ab/BSA LSV H7N9 6.8 Wu i wsp.,

2015

Au/TBBT/AuC/scFv/BSA EIS His6-

Qinghai 0.6

Jarocka i wsp.,

2016

Skrty: Au elektroda zota; Ab przeciwciao; 16-MHA kwas 16-

merkaptoheksadekanowy; OT oktanotiol; BDDT biotynylowany dodekanotiol; NV

neutrawidyna; Con A konkanawalina A; HRP peroksydaza chrzanowa; BSA surowicza

albumina bydlca; DPV woltamperometria pulsowa rnicowa; Fab fragmenty przeciwcia

wicych; GCE elektroda z wgla szklistego; SA kwas sialowy; OGal oktylo-

galaktozyd; AuPd nanoczsteczki zota i palladu; AuC zoto koloidalne; EDA

etylenodiamina; AG aldehyd glutarowy, LSV woltamperometria liniowa, TBBT 4,4-

tiobisbenzenotiol, scFV pojedynczy acuch zmiennego fragmentu przeciwcia, HDT 1,6-

heksanoditiol, His6-Qinghai histagowane odmiany (warianty) rekombinowanej

hemaglutyniny, MCB merkaptobutanol, DPM dipirometen, HA hemaglutynina

Genoczujniki zawieraj w warstwie analitycznie aktywnej sondy DNA

pozwalajce na wykrywanie specyficznych fragmentw kwasw nukleinowych. Istot

dziaania genoczujnikw, bdcych tematem tej rozprawy, jest oddziaywanie sekwencji

DNA lub DNA/RNA midzy sob, czyli reakcja hybrydyzacji. Jest to zjawisko

spontanicznego parowania si zasad pochodzcych z rnych nici kwasw

nukleinowych. Moe zachodzi pomidzy dwiema czsteczkami DNA, RNA lub DNA

i RNA, o cakowitej lub czciowej komplementarnoci. W literaturze naukowej mona

spotka bardzo zrnicowane przykady genoczujnikw przeznaczonych

do wykrywania specyficznych sekwencji DNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1.

52

Przykady przedstawiono w Tabeli 10. Dokadniej temat ten zostanie omwiony

w dalszej czci rozprawy.

Za pomoc genoczujnikw mona wykrywa wirusy bardziej specyficznie

i z lepsz czuoci ni za pomoc immunoczujnikw, ktre z kolei s szybsze i bardziej

niezawodne (Qasim i wsp., 2014).

W literaturze naukowej przedstawione s rwnie doniesienia opisujce

zastosowanie optycznych (Bai i wsp., 2012; Suenaga i wsp., 2012; Wang i wsp., 2013;

Diltemiz i wsp., 2013) i masowych (Br