1

OPTIMASI LAMA FERMENTASI TEMPE SEBAGAI UPAYA

PEROLEHAN ISOFLAVON GENISTEIN

OPTIMIZATION OF TEMPEH FERMENTATION LENGTH

TO OBTAIN ISOFLAVON GENISTEIN

Oleh,

Rode Sukma Lewidharti

NIM: 652011006

TUGAS AKHIR

Diajukan kepada Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Matematika guna memenuhi

sebagian dari persyaratan untuk mencapai gelar Sarjana Sains (Kimia)

Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Matematika

Universitas Kristen Satya Wacana

Salatiga

2015

1

1

1

1

OPTIMASI LAMA FERMENTASI TEMPE SEBAGAI UPAYA

PEROLEHAN ISOFLAVON GENISTEIN

OPTIMIZATION OF TEMPEH FERMENTATION LENGTH

TO OBTAIN ISOFLAVON GENISTEIN

Rode Sukma Lewidharti*, Hartati Soetjipto

**, dan Silvia Andini

**

*Mahasiswa Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Matematika

**Dosen Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Matematika

Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga

Jln. Diponegoro no 52-60 Salatiga 50711 Jawa Tengah – Indonesia

rodesukma@yahoo.co.id

ABSTRACT

The aims of this research were to measure the amount of genistein and to determine

an appropriate time to produce the most optimal genistein. The observation of genistein

concentration started from the 0-day of tempeh production until the 9th

day of

fermentation. Genistein was gained through maceration, and was analyzed by using

Reserved Phase-High Performance Liquid Cromatography (RP-HPLC). The data from

the extraction was analyzed by non linier regression using the 20th

version of SPSS and

genistein data which was analyzed in graphic. The result showed that the genistein

concentration was unstable during the fermentation process and the highest amount of

genistein concentration was 324,27± 8,48 μg/g gained in 9 days.

Keywords: Fermentation, Genistein, RP-HPLC, Soybean, Tempeh

2

PENDAHULUAN

Kanker merupakan salah satu jenis penyakit ganas yang ada di sekitar kita.

Berdasarkan Data Global Burden Cancer tahun 2012 dalam Depkes (2014), jumlah

kasus kanker yang ditemukan hanya pada anak-anak dan dewasa mencapai 14,1 juta

kasus dengan 8,2 juta kematian. Data ini menunjukkan adanya peningkatan jika

dibandingkan dengan data tahun 2008, dengan 12,7 juta kasus baru dengan 7,6 juta

kematian. Selama ini penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang sangat

ditakuti oleh semua orang karena selain mematikan juga membutuhkan biaya

pengobatan yang sangat besar sehingga banyak orang yang tidak mampu menyelesaikan

pengobatan karena faktor biaya. Telah banyak dilakukan penelitian untuk

mengembangkan pengobatan kanker, salah satu bahan alam yang berpotensi sebagai

anti kanker adalah isoflavon yang banyak ditemukan dalam kedelai.

Menurut Winarsi (2005), isoflavon kedelai berfungsi sebagai pencegah kanker

(chemoprevention) dan penghambat kanker (cancer inhibition). Di dalam 1 gram

protein kedelai, mengandung 3,5 mg isoflavon. Lebih lanjut Winarni (2005),

menjelaskan kandungan isoflavon tertinggi terdapat pada produk kedelai yang

difermentasi seperti tempe. Isoflavon dalam kedelai terdiri dari genistein (60%) dan

daidzein (30%) dan sejumlah kecil glisitein (10%) (Lee et al., 2011). Menurut

Muchtaromah (2010), mekanisme kerja dari genistein yang menginduksi apoptosis sel

dan menghambat proliferasi sel mengindikasikan genistein sebagai agen kemopreventif.

Genistein merupakan isoflavon utama yang terdapat pada kedelai yang kemudian

mengalami peningkatan jumlahnya ketika telah menjadi tempe (Istiani, 2010). Tempe

merupakan produk olahan kedelai yang difermentasi yang mengandung aglikon tinggi

(Yaakob et al., 2011). Menurut data USDA (2008), kadar genistein pada kedelai 18,77

mg/100g sedangkan kadar genistein pada tempe 36,15 mg/100g.

Selama proses pengolahan, baik melalui proses fermentasi maupun proses non-

fermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami transformasi, terutama melalui proses

hidrolisis, sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglikon.

Senyawa aglikon tersebut adalah genistein, glisitein dan daidzein (Pawiroharsono,

2001).

Gambaran umum yang menunjukkan bahwa isoflavon berfungsi sebagai

antikanker adalah suatu realita bahwa di negara-negara ASEAN dan Jepang yang

3

konsumsi kedelainya relatif tinggi memiliki pasien penyakit kanker payudara, kanker

prostat, dan uterus lebih rendah dibandingkan dengan negara lain, misalnya Amerika

dan Australia (Muchtaromah, 2010). Selama ini tempe kedelai yang dikonsumsi oleh

masyarakat adalah tempe hasil fermentasi kedelai selama 36 – 48 jam (Istiani, 2010).

Lama waktu fermentasi ke 48 jam merupakan lama waktu fermentasi kedelai untuk

menghasilkan tempe yang paling optimum dari sisi cita rasa untuk dikonsumsi.

Sedangkan tempe kadaluarsa atau lewat fermentasi atau dikenal sebagai tempe busuk

merupakan tempe yang dianggap sudah tidak layak dimakan. Tempe dikatakan busuk

ketika lama fermentasi lebih dari 2-3 hari (Istiani, 2010). Siswani (2008) menduga

bahwa tempe busuk memiliki kandungan genistein yang lebih tinggi.

Tujuan

1. Menentukan kandungan genistein dalam tempe hasil fermentasi 0-9 hari.

2. Menentukan waktu fermentasi tempe yang tepat yang menghasilkan genistein

paling tinggi.

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Penelitian dilakukan pada bulan Desember 2014 hingga Maret 2015 di

Laboratorium Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Kristen Satya Wacana,

Salatiga.

Bahan dan Piranti

Sampel tempe diambil dari sebuah pengrajin tempe “X” di Domas, Salatiga, Jawa

Tengah. Senyawa standar yang digunakan adalah genistein (Sigma Chemical Co,

Amerika Serikat).

Bahan kimia yang digunakan antara lain metanol (teknis), kloroform (pro analysis,

Merck, Jerman), dan n-heksana (teknis). Untuk plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

digunakan plat silika gel 60 F254, Merck, Jerman. Piranti yang digunakan antara lain

neraca analitis 4 digit (Mettler H 80), neraca analitis 2 digit (Ohaus TAJ602), blender

(Philips HR-2108), moisture analyzer (Ohaus MB 25), rotary evaporator (Buchi

R0114), drying cabinet (Bengkel Rekayasa Wandi) dan High Performance Liquid

4

Chromatography (HPLC) (Knauer Smartline 5000, Smartline pump 1000, Smartline

UV Detector 2500).

Pembuatan Tempe (dilakukan wawancara dengan Pemilik Pabrik Tempe “X”)

Kedelai yang digunakan dalam pembuatan tempe merupakan kedelai import dari

Amerika Serikat. Kedelai kemudian direndam selama satu malam lalu direbus dan

ditiriskan. Setelah itu diberi ragi yang berasal dari Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI) dan dibungkus menggunakan plastik. Penyimpanan yang dilakukan di

tempat penyimpanan tempe kedelai milik pabrik tempe kedelai “X”.

Preparasi Sampel

Sampel tempe yang digunakan dari fermentasi hari ke- 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9

masing- masing dipotong tipis- tipis dan dikeringkan dengan drying cabinet pada suhu

50ºC selama 2 hari, kemudian dihaluskan menggunakan grinder.

Pengukuran Kadar Air

Pengukuran kadar air dilakukan dengan memasukkan secara teliti kurang lebih 1 g

sampel ke dalam moisture analyzer.

Ekstraksi Isoflavon (Purwoko, 2004, yang dimodifikasi)

Sebanyak 50 g tempe kering dimaserasi dalam metanol-80% selama 9 jam. Setelah

disaring, filtrat dievaporasi sampai kering. Ekstrak dilarutkan dalam 50 mL campuran

metanol-50% dan heksana (1:2, v/v) untuk menghilangkan lemak secara partisi. Hasil

separasi ekstrak fraksi polar dilarutkan dalam campuran metanol dan kloroform (1:1)

kemudian dilakukan pemisahan kembali. Fraksi kloroform dievaporasi menghasilkan

ekstrak kasar isoflavon.

Identifikasi Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Hessler et al., 1997,

yang dimodifikasi)

Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan dengan menggunakan fase

diam plat silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa campuran kloroform: metanol (5:1

v/v); (10:1 v/v); (20:1 v/v). Pengamatan dilakukan di bawah sinar ultra violet dengan

5

panjang gelombang 254 nm. Nilai Rf sampel diukur, kemudian dibandingkan dengan

nilai Rf senyawa standar genistein.

Identifikasi Isoflavon Menggunakan High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) (Cesar, 2006, yang dimodifikasi)

Identifikasi isoflavon dengan menggunakan metode HPLC dilakukan dengan

pengkondisian instrumen HPLC dan pembuatan larutan sampel. Larutan sampel dibuat

dengan mengambil 0,1 g ekstrak lalu dilarutkan dalam metanol 5 mL. Setelah larutan

disentrifuge, kemudian disaring dan diambil 20 μL dengan alat injeksi. Kemudian

sampel diinjeksikan ke dalam HPLC setelah pengkondisian HPLC selesai.

Kromatogram HPLC dianalisis dengan menggunakan pembanding kromatogram

isoflavon genistein standar.

Kondisi Operasional Instrumentasi

Fase diam : Euroshper RP C-18 (150 × 4,6 mm i.d., 5μm),

Knauer GmBH-Jerman

Fase gerak : Campuran metanol : asam asetat 0,1 N dengan

perbandingan 48 :52 (v/v)

Kecepatanalir : 1,2 mL/min

Volume injeksi (loop) : 20μL

Detektor : UV 254 nm

Analisis kuantitatif genistein dilakukan dengan menghitung luas area

kromatogram. Konsentrasi genistein dalam tempe dapat diketahui dengan menghitung

persamaan garis dari kurva standar genistein antara luas kromatogram terhadap

konsentrasi genistein.

Analisis Data

Data rendemen dianalisis menggunakan regresi non linier SPSS versi 20 dan

konsentrasi genistein dianalis secara grafik.

6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Isoflavon

Ekstraksi isoflavon dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol-

air. Metanol merupakan salah satu pelarut yang sesuai untuk mengisolasi senyawa-

senyawa organik polar. Ekstrak yang diperoleh pada berbagai waktu fermentasi

memiliki warna yang berbeda. Tempe hari ke- 0 diperoleh ekstrak berwarna coklat,

kemudian waktu awal fermentasi diperoleh ekstrak pekat berwarna kuning muda.

Semakin lama waktu fermentasi, intensitas warna kuning semakin meningkat sampai

ekstrak berwarna merah kecoklatan. Filtrat hasil maserasi diekstrak dengan heksana,

untuk membebaskan senyawa- senyawa non polar yang ada dalam filtrat, seperti asam

lemak, lemak dan minyak (Kusumaningsih, 2006).

Hasil Identifikasi Genistein dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Hasil KLT standar genistein pada masing-masing fase gerak disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Harga Rf Genistein Standar

Genistein

Standar

Pelarut CHCl3 : CH3OH (v/v)

5:1 10:1 20:1

Rf 0,12 0,43 0,58

Tabel 1 menampilkan nilai Rf standar genistein dengan berbagai fase gerak dan

dibandingkan dengan nilai Rf sampel ekstrak tempe untuk membuktikan bahwa noda

yang muncul adalah genistein seperti pada Gambar 1.

7

(5:1)

(5:1) (10:1) (20:1)

Gambar 1. Hasil Analisis Kromatografi Lapis Tipis Perbandingan Standar Genistein dengan

Ekstrak Isoflavon Tempe

keterangan :

fase gerak : CHCl3 : CH3OH (v/v)

fase diam : plat silika gel

1 : genistein standar

2 : ekstrak isoflavon tempe

Gambar 1 menunjukkan bahwa campuran kloroform:metanol = 10:1 (v/v)

memberikan hasil pemisahan yang relatif lebih baik. Pada campuran kloroform: metanol

= 5:1 ekstrak isoflavon tempe tidak mengalami pemisahan sedangkan pada campuran

kloroform:metanol = 20:1 pemisahannya kurang baik. Genistein yang bersifat kurang

polar larut pada kloroform sehingga dengan perbandingan kloroform:metanol 10:1

dapat mewakili eluen terbaik untuk memisahkan genistein. Fase gerak yang baik yaitu

bisa memisahkan senyawa yang ditandai dengan munculnya noda. Noda yang muncul

tidak berekor dan jarak antara noda satu dengan yang lainnya jelas (Harborne, 1987).

Namun untuk analisis lebih lanjut pada KLT preparatif sebaiknya lebih

mengoptimalkan pemisahan senyawa isoflavanoid karena masih terdapat tailing. Tailing

dapat disebabkan karena sampel yang terlalu pekat. Pada penelitian ini hanya dilihat

genistein yang ada pada sampel terpisah saat proses KLT. Hal ini menimbulkan asumsi

bahwa dalam tempe mengandung genistein dan dapat dianalis lebih lanjut menggunakan

HPLC sehingga dapat diketahui nilai kuantitatifnya.

8

Tabel 2. KLT ekstrak isoflavon tempe antar berbagai waktu fermentasi dengan fase

gerak kloroform: metanol = 10 : 1 (v/v)

Sampel Hari

Ke-

Rf Genistein

0 0,43

2 0,41

3 0,40

4 0,41

5 0,41

6 0,43

7 0,44

8 0,45

9 0,44

Adanya noda yang mempunyai harga Rf relatif sama dengan harga Rf standar

genistein merupakan indikasi adanya genistein pada tempe hasil fermentasi hari ke- 0

sampai ke- 9.

Hasil Analisis Genistein dengan (High Performance Liquid Chromatography)

HPLC

Analisis dengan HPLC bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan senyawa isoflavon

dalam sampel tempe pada berbagai waktu fermentasi. Seperti metode kromatografi yang

lain, analisis HPLC dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dari masing-

masing sampel dengan waktu retensi dari senyawa isoflavon standar. Adanya puncak-

puncak yang memiliki waktu retensi relatif sama dengan standar senyawa isoflavon

genistein menunjukkan bahwa dalam sampel tersebut terdapat kandungan isoflavon

genistein.

9

Gambar 2.Profil Kromatogram genistein(9) (tR 29,25 min) ekstrak tempe hari ke-9

Keterangan :

Parameter KCKT :

Fase diam : Eurosphere RP C-18 (150 × 4,6 mm,

5μm),Knauer GmBH-Jerman

Fase gerak : Campuran metanol : asamasetat0,1 N

denganperbandingan 44 : 52 (v : v)

Kecepatan alir : 1,2 mL/min

Volume injeksi (loop) : 20μL

Detektor : UV 254 nm

Kromatogram HPLC ekstrak isoflavon tempe fermentasi 9 hari disajikan pada

Gambar 2. Genistein muncul di waktu retensi 29,25 menit berdasarkan kromatogram

standar genistein. Sedangkan beberapa peak yang muncul di menit- menit pertama

diduga merupakan isoflavonoid glikosida.

Ekstrak isoflavon tempe dari hasil fermentasi pada hari ke 0-9 dan konsentrasi genistein

disajikan pada Tabel 3.

10

Tabel 3. Rendemen Isoflavon Tempe Selama Waktu Fermentasi Tempe 0-9 hari

dan Konsentrasi Genistein

Tabel 3 menunjukkan bahwa semakin lama waktu ekstraksi rendemen yang

dihasilkan berbeda dan bersifat fluktuatif dengan mengikuti persamaan

dan = 0.54. Isoflavon dapat dipisahkan dari protein,

dengan cara diekstraksi menggunakan alkohol, maka proteinnya akan terdenaturasi,

sehingga sejumlah isoflavon dapat terbebas dari protein (Winarsi, 2005). Hasil yang

berfluktuatif diduga karena masih ada isoflavon yang terikat dengan protein.

Dari rendemen dan konsentrasi genistein terlihat bahwa ketika persentase

rendemen yang didapatkan menurun maka menghasilkan genistein yang tinggi. Namun

sempat pada hari ke- 4 persentase rendemen mengalami kenaikan dari hari sebelumnya

dan menghasilkan genistein tinggi. Pada hari ke- 7 dan ke- 9 persentase rendemen turun

sedangkan genisteinnya tinggi. Untuk lebih jelas konsentrasi genistein yang

berfluktuatif ditampilkan pada Gambar 3.

Hari ke- % Rendemen

(b/b)

Konsentrasi Genistein

(μg/g tempe)

0 14,41 93,70

2 19,57 41,12

3 25,82 61,27

4 30,31 216,23

5 17,28 5,40

6 51,23 80,26

7 24,79 259.34

8 32,56 114,14

9 16,67 324,27

11

Gambar 3. Pengaruh Lama Waktu Fermentasi Terhadap Konsentrasi Genistein

Gambar 3 menampilkan hasil identifikasi genistein dengan HPLC yang

menunjukkan bahwa semakin lama waktu fermentasi, jumlah genistein yang dihasilkan

bersifat fluktuatif. Diawali dengan tempe hari ke-0 yang masih berupa kedelai dan

memiliki konsentrasi genistein sebesar 93,70 μg/g dan pada hari ke- 2 mengalami

penurunan menjadi 41,12 μg/g. Lalu pada hari ke- 3 dan ke- 4 mengalami kenaikan

menjadi 61,27 μg/g dan 216,23 μg/g secara berurutan. Namun pada hari ke- 5 terjadi

penurunan yang cukup drastis menjadi 5,40 μg/g. Namun demikian pada hari ke- 6 dan

ke- 7 kembali mengalami kenaikan menjadi 80,26 μg/g dan 259,34 μg/g. Pada hari ke- 8

genistein menurun sampai 114,14 μg/g sedangkan pada hari ke- 9 kembali mengalami

kenaikan menjadi 324,27μg/g. Pengamatan dihentikan pada hari ke- 9 karena pada hari

ke-10 tempe sudah 100% rusak dan busuk.

Kusumaningsih (2006), melaporkan bahwa kandungan genistein pada tempe

dengan lama waktu fermentasi 1- 4 hari, bersifat fluktuatif. Pada tempe hari ke- 1 dan

ke- 2 mengalami penurunan, di hari ke- 3 mengalami kenaikan namun pada hari ke- 4

turun kembali. Konsentrasi genistein tertinggi diperoleh pada hari ke- 3 yaitu 3,480

μg/g.

Bila dibandingkan dengan hasil penelitian Kusumaningsih (2006), penelitian ini

menghasilkan genistein jauh lebih tinggi yaitu 61,27 μg/g pada hari ke 3 dan 324,27

μg/g pada hari ke 9. Perbedaan ini diduga disebabkan karena perbedaan varietas kedelai

yang digunakan. Nakajima et al., (2005) melaporkan bahwa kandungan isoflavon pada

kacang- kacangan dipengaruhi oleh varietas, waktu panen dan lokasi.

12

Genistin yang terdapat pada kedelai dapat dihidrolis isoleh ß-glukosidase menjadi

genistein (5,7,4’- trihidroksi isoflavon) dan glukosa (Garlock, 2000). Fermentasi tempe

meningkatkan kandungan genistein melalui hidrolisis β-glukosidase (Iswandari,2006).

Enzim -glukosidase menjadi aktif dan membantu perubahan isoflavon terikat

(glukosida) menjadi isoflavon tidak terikat (aglikon) (Tagliaferri, 2007) seperti yang

disajikan pada Gambar 4.

Gambar4. Reaksi Hidrolisis Glukosida Isoflavon menjadi Aglikon Isoflavon (Istiani, 2010)

Genistin merupakan suatu glikosida sedangkan genistein adalah bentuk aglikonnya.

Penelitian yang dilakukan oleh Nakajima et al., (2005) melaporkan genistein yang ada

di tempe selama 24 jam fermentasi sebesar 32 g/ 100 g sedangkan genistin sebesar 21

g/100 g. Isoflavon yang dominan pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida,

sedangkan yang dominan pada produk kedelai yang mengalami fermentasi adalah

aglikon(Coward et al., 1993 dalam Istiani, 2010).

Produksi genistein yang tinggi terjadi pada fermentasi tempe hari ke 4, 7, dan 9.

Tampaknya terjadi fluktuasi yang nyata dimana genistein yang sudah terbentuk

kemudian mengalami penurunan. Naik turunnya konsentrasi genistein diduga karena

sifat genistein yang dapat mengalami transformasi membentuk senyawa baru yang

disebut faktor 2 (Pawiroharsono, 2001). Senyawa faktor-2 atau 6,7,4`trihidroksi

isoflavon hanya dijumpai pada kedelai yang difermentasi (Istiani, 2010). Faktor 2

adalah hasil biokonversi aglikon isoflavon selama proses fermentasi. Enzim yang

berperan dalam dalam proses biokonversi ini adalah enzim β-glukosidase. Mekanisme

terjadinya biokonversi daidzein dan genistein menjadi faktor 2 diduga diawali dari

konversi genistein menjadi daidzein, yang selanjutnya diikuti dengan konversi daidzein

menjadi faktor 2 (Gambar 5).

13

Pada umumnya jalur konversi isoflavonoid adalah dari bentuk glikosida menjadi

aglikon yang kemudian menjadi aglikon lainnya (Istiani, 2010). Oleh karena itu,

naiknya konsentrasi genistein di hari ke- 0hinggake-4 diduga karena konversi dari

glikon ke aglikon, sedangkan turunnya konsentrasi genistein pada hari ke- 5 diduga

karena terbentuknya isoflavon jenis lain. Namun genistein kemudian mengalami

kenaikan, hal ini menarik untuk diteliti lebih lanjut. Diduga dikarenakan mikroba

menghasilkan enzim yang bisa mengkonversi isoflavon lain menjadi genistein.

KESIMPULAN

1. Kandungan genistein dalam tempe hasil fermentasi 0- 9 hari berkisar dari 93,70

μg/g sampai 259,34 μg/g.

2. Pada fermentasi tempe hari ke- 4,7, dan 9 menghasilkan konsentrasi genistein

yang tinggi. Sedangkan konsentrasi genistein tertinggi pada hari ke9.

SARAN

1. Dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap isoflavon tempe hari ke- 4,7 dan 9

karena menghasilkan genistein paling tinggi.

2. Dilakukan penelitian lebih lanjut untuk isoflavon lainnya seperti daidzein,

glisitein, dan faktor 2.

3. Perlu diteliti aktifitas antioksidan dan genistein dibandingkan faktor 2.

Gambar 5. Reaksi Biokonversi Daidzein dan Genistein menjadi Faktor-2

(Kusumaningsih, 2006).

Dehidroksilasi

enzimatis

Hidroksilasi enzimatis

14

DAFTAR PUSTAKA

Depkes. 2014. Menkes Luncurkan Program Pengobatan Gratis Kanker Pada Anak Oleh

Tahir Foundation. (http://www.depkes.go.id/) [06 Oktober 2014].

Istiani, Y. 2010. Karakterisasi Senyawa Bioaktif Isoflavon dan Uji Aktivitas

Antioksidan dari Ekstrak Etanol Tempe Berbahan Baku Koro Pedang

(Canavaliaensiformis). Tesis. Program Studi Biosains. Universitas Sebelas Maret.

Surakarta.

Garlock, T. 2000. The Effect of Various Acidic Solutions on the Concentration of

Genistein in Tempeh.Tesis.The Graduate College University of Wisconsin-Stout

Menomonie.

Harborne, 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.

Bandung: Institut Teknologi Bandung.

Hessler, P., Larsen, P., Constantinou, 1997. Isolation of Isoflavones from Soy- Based

Fermentations of the Erythromycin- Producing Bacterium Saccharopolysspora

erythraea. Appl Microbiol Biotechnol, Vol. 47, pp. 398- 404.

Kusumaningsih, T., Retnos, S., Agustina, W. 2006. Profil Kandungan Daidzein dan

Genistein Pada Tempe Gembus Selama Proses Fermentasi. J.Alchemy, Vol.5, No

1, ISSN 1412-4092, pp.45-43.

Lee, J., H. Seung Kim., Y. Sang Song, 2011. Genistein As a Potential Anticancer

Agent Against Ovarian Cancer. Journal of Traditional and Complementary

Medicine, 2 (2), pp. 96-104.

Muchtaromah, B. 2010.BerbagaiManfaatIsoflavonBagiKesehatan. (http://blog.uin-

malang.ac.id/bayyinatul/2010/06/06/berbagai-manfaat-isoflavon-bagi-kesehatan-

bagian-1/) [16 September 2014].

Nakajima, N., Nobuyuki, N., Ishihara, K. 2005. Analysis of Isoflavone Content in

Tempeh, a Fermented Soybean, and Preparation of a New Isoflavone-Enriched

Tempeh. Journal Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, No. 6, pp. 685–687.

Pawiroharsono, S. 2001. Prospek dan Manfaat Isoflavon Untuk Kesehatan. Direktorat

Teknologi Bioindustri, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi.

Purwoko, T. 2004. Kandungan Isoflavon Aglikon pada Tempe Hasil Fermentasi

Rhizopusmicrosporus var. oligosporus: Pengaruh Perendaman. BioSMART, 6(2),

15

pp. 85-87.

Rusin, A., Z. Krawcz., 2010. Synthetic derivatives of genistein, their properties and

possible applications.The Journal of the Polish Biochemical Societyand of the

Committee of Biochemistry and Biophysics, 57(1), pp. 23–34.

Siswani.E., S. Atun., S. Handayani, 2008.Pelatihan Teknologi Pembuatan Kecap dari

Tempe Busuk Sebagai Alternatif Bahan Antikanker. Program Pengabdian

Masyarakat. Universitas Negeri Yogyakarta. Yogyakarta.

Tagliaferri. M., I. Cohen., D. Tripathy, 2007. KankerPayudara. Jakarta: PT. Indeks

USDA, 2008.USDA Database for the Isoflavone Content of Selected Foods.Nutrient

Data Laboratory. United States of America.

Winarsi, H. 2005. Isoflavon. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Yaakob, H., R. Abd Malek., M. Misson., M.F. Abdul Jalil, 2011. Optimization of

Isoflavone Production from Fermented Soybean Using Response Surface

Methodology. Food Sci. Biotechnol, 20(6), pp. 1525-1531.

16

LAMPIRAN

I

MAKALAH SEMINAR I

SN-KPK VII 2015

UNS, SURAKARTA

18 APRIL 2015

17

Genistein merupakan fitoestrogen yang

berpotensi mengurangi resiko kanker [10].

Mengingat pentingnya senyawa

genistein bagi kesehatan manusia maka

18

ingin diketahui pada fermentasi hari ke

berapa diperoleh kandungan genistein

paling tinggi. Jadi penelitian ini bertujuan

untuk menentukan pola dinamika

konsentrasi genistein dalam proses

pembusukan tempe kedelai.

Mengingat pentingnya senyawa

genistein bagi kesehatan manusia maka

ingin diketahui pada fermentasi hari ke

berapa diperoleh kandungan genistein

paling tinggi. Jadi penelitian ini bertujuan

untuk menentukan pola dinamika

konsentrasi genistein dalam proses

pembusukan tempe kedelai.

METODE PENELITIAN

Bahan dan alat

Tempe yang digunakan berasal dari

pengrajin tempe di daerah Salatiga. Waktu

fermentasi yang diukur 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9 hari. Bahan kimiawi yang digunakan

adalah metanol, kloroform, n-heksan, dan

standar genistein (Sigma Chemical Co.)

Piranti yang digunakan antara lain

neraca analitis 4 digit (Mettler H 80, Mettler

Instrument Corp, USA), neraca analitis 2

digit (Ohaus TAJ602, Ohaus Corp, USA),

blender (Philips, Belanda), rotary

evaporator (Buchi R0114, Swiss), drying

cabinet dan HPLC (Knauer Smartline 5000,

Smartline pump 1000, Smartline UV

Detector 2500, Jerman).

Preparasi sampel

Tempe dipotong tipis- tipis dan

dikeringkan dengan drying cabinet pada

suhu 50ºC selama 2 hari, kemudian

dihaluskan menggunakan grinder.

Ekstraksi Isoflavon dengan Metode

Maserasi ([11], dimodifikasi)

Sebanyak 50 g tempe kering

dimaserasi dalam metanol-80% selama 9

jam. Setelah disaring, filtrat dievaporasi

sampai kering. Ekstrak dilarutkan dalam 50

ml campuran metanol-50% dan heksana

(1:2, v/v) untuk menghilangkan lemak

secara partisi. Hasil separasi ekstrak fraksi

polar dilarutkan dalam campuran metanol

dan kloroform (1:1) kemudian dilakukan

pemisahan kembali. Fraksi kloroform

dievaporasi menghasilkan ekstrak kasar

isoflavon.

Identifikasi Isoflavon ([12], dimodifikasi)

Identifikasi isoflavon dengan

menggunakan metode HPLC dilakukan

dengan pengkondisian instrumen HPLC

dan pembuatan larutan sampel. Larutan

sampel dibuat dengan mengambil 0.1 g

ekstrak lalu dilarutkan dalam metanol 5 mL.

Setelah larutan disentrifuge, diambil 20 μL

dengan alat injeksi. Selanjutnya sampel

diinjeksikan ke dalam HPLC setelah

pengkondisian HPLC selesai.

Kromatogram HPLC dianalisis dengan

menggunakan pembanding kromatogram

isoflavon genistein standar.

Instrumentasi

Panjang kolom : 25 cm

Jenis kolom : Vertex, Euroshper 100-5

c18, 150x4,6 mm (AH201)

Fase gerak : metanol : asam asetat 0,1

(48% : 52%), isokratik

Kecepatan alir : 1,2 ml/menit

Tekanan : 13,3 MPa

Volume injeksi: 20 μL

Detektor : 254 nm

19

Analisis kuantitatif genistein dilakukan

dengan menghitung luas area

kromatogram. Konsentrasi genistein dapat

diketahui dengan menghitung persamaan

garis dari kurva standar genistein

(Lampiran 1).

Analisa Data

Data konsentrasi genistein dianalisis

secara grafik.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil identifikasi genistein dengan

HPLC menunjukkan bahwa semakin lama

waktu fermentasi, jumlah genistein yang

dihasilkan semakin meningkat (Gambar 1).

Gambar 1. Pengaruh Lama Waktu

Fermentasi

Diawali dengan tempe hari ke nol

yang masih berupa kedelai memiliki

konsentrasi genistein sebesar 93,70 μg/g

dan pada hari kedua mengalami penurunan

menjadi 41,12 μg/g. Namun pada hari

ketiga dan keempat mengalami kenaikan

menjadi 61,27 μg/g dan 216,23 μg/g secara

berurutan. Sedangkan pada hari kelima

terjadi penurunan yang cukup drastis

menjadi 5,40 μg/g. Namun demikian pada

hari keenam dan ketujuh kembali

mengalami kenaikan menjadi 80,26 μg/g

dan 259,34 μg/g. Pada hari kedelapan

genistein menurun sampai 114,14 μg/g

sedangkan pada hari kesembilan kembali

mengalami kenaikan menjadi 324,27μg/g.

Pengamatan dihentikan pada hari ke

sembilan karena pada hari ke sepuluh

tempe sudah 100% rusak dan busuk.

Gambar 1 menunjukkan bahwa

produki genistein yang tinggi terjadi pada

fermentasi tempe hari ke 4,7 dan 9.

Tampaknya terjadi fluktuasi yang nyata

dimana genistein yang sudah terbentuk

kemudian mengalami penurunan. Diduga

hal ini disebabkan karena sifat genistein

yang dapat mengalami transformasi

membentuk senyawa baru yang disebut

faktor 2 [13]. Senyawa faktor-2 atau 6,7,40-

trihidroksiisoflavon hanya dijumpai pada

kedelai yang difermentasi [9].

Pada umumnya jalur konversi

isoflavanoid adalah yaitu dari bentuk

glikosida menjadi aglikon yang kemudian

menjadi aglikon lainnya [9]. Oleh karena

itu, naiknya konsentrasi genistein di hari 0-

4 karena konversi dari glikon ke aglikon,

sedangkan turunnya konsentrasi genistein

pada hari ke 5 diduga karena terbentuknya

isoflavon jenis lain. Namun genistein

kemudian mengalami kenaikan, hal ini

menarik untuk diteliti lebih lanjut. Diduga

dapat dikarenakan mikroba menghasilkan

enzim yang bisa mengkonversi isoflavon

lain menjadi genistein.

Kromatogram HPLC ekstrak isoflavon

tempe fermentasi 9 hari disajikan pada

Gambar 2. Genistein muncul di waktu

retensi 29,25 menit. Sedangkan beberapa

peak yang muncul di awal diduga

merupakan isoflavonoid glikosida.

0

100

200

300

400

0 5 10

Ge

nis

tein

(μ

g/g)

Lama Fermentasi (Hari)

20

Gambar 2. Kromatogram HPLC tempe hari

ke-9

Genistin yang terdapat pada biji dapat

dihidrolisis oleh ß-glukosidase yaitu

genistein (5,7,4’-trihidroksi isoflavon) dan

glukosa [6] (Gambar 3). Fermentasi tempe

meningkatkan kandungan genistein melalui

hidrolisis β-glukosidase [14]. Enzim -

glukosidase menjadi aktif dan membantu

perubahan isoflavon terikat (glukosida)

menjadi isoflavon tidak terikat (aglikon)

[10].

Gambar 3. Reaksi Hidrolisis Glukosida

Isoflavon menjadi Aglikon Isoflavon [8].

KESIMPULAN

Berdasarkan penelitian yang telah

dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa:

Konsentrasi genistein dalam proses

pembusukan tempe kedelai (tempe bosok)

bersifat fluktuatif. Konsentrasi genistein

tertinggi pada fermentasi tempe hari ke 4,7,

dan 9. Sedangkan konsentrasi genistein

tertinggi pada hari ke 9. Konsentrasi

genistein terendah pada fermentasi hari ke

5.

DAFTAR RUJUKAN

[1] Nakajima, N., Nobuyuki, N.,

Ishihara, K. 2005. Analysis of

Isoflavone Content in Tempeh, a

Fermented Soybean, and

Preparation of a New Isoflavone-

Enriched Tempeh. Journal

Bioscience and Bioengineering, Vol.

100, No. 6, pp. 685–687.

[2] Winarsi, H. 2005. Isoflavon.

Yogyakarta: Gadjah Mada University

Press.

[3] Lee, J., H. Seung Kim., Y. Sang

Song, 2011. Genistein As a Potential

Anticancer Agent Against Ovarian

Cancer. Journal of Traditional and

Complementary Medicine, 2 (2), pp.

96-104.

[4] Kusumaningsih, T., Retnos, S.,

Agustina, W. 2006. Profil Kandungan

Daidzein dan Genistein Pada Tempe

Gembus Selama Proses Fermentasi.

J.Alchemy, Vol.5, No 1, ISSN 1412-

4092, pp.45-43.

[5] Yaakob, H., R. Abd Malek., M.

Misson., M.F. Abdul Jalil, 2011.

Optimization of Isoflavone

Production from Fermented Soybean

Using Response Surface

Methodology. Food Sci. Biotechnol,

20(6), pp. 1525-1531.

[6] Garlock, T. 2000. The Effect of

Various Acidic Solutions on the

21

Concentration of Genistein in

Tempeh. Tesis. The Graduate

College University of Wisconsin-

Stout Menomonie.

[7] USDA, 2008. USDA Database for

the Isoflavone Content of Selected

Foods. Nutrient Data Laboratory.

United States of America.

[8] Pawiroharsono, S. 2001. Prospek dan

Manfaat Isoflavon untuk Kesehatan.

Direktorat Teknologi Bioindustri,

Badan Pengkajian dan Penerapan

Teknologi.

[9] Istiani, Y. 2010. Karakterisasi

Senyawa Bioaktif Isoflavon dan Uji

Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak

Etanol Tempe Berbahan Baku Koro

Pedang (Canavalia ensiformis).

Tesis. Program Studi Biosains.

Universitas Sebelas Maret.

Surakarta.

[10] Tagliaferri. M., I. Cohen., D. Tripathy,

2007. Kanker Payudara. Jakarta: PT.

Indeks

[11] Purwoko, T. 2004. Kandungan

Isoflavon Aglikon pada Tempe Hasil

Fermentasi Rhizopus microsporus

var. oligosporus: Pengaruh

Perendaman. BioSMART, 6(2), pp.

85-87

[12] Cesar. I., Braga, F., Soares, C. 2006.

Development and Validation of a RP-

HPLC method for Quantification of

Isoflavone Aglycones in Hydrolyzed

Soy Dry Extracts. Journal of

Chromatography, 836, pp.74-78.

[13] Pawiroharsono, S. 2001. Prospek

dan Manfaat Isoflavon untuk

Kesehatan. Direktorat Teknologi

Bioindustri, Badan Pengkajian dan

Penerapan Teknologi.

[14] Iswandari, R. 2006. Studi

Kandungan Isoflavon Pada Kacang

Hijau (Vigna radiata L), Tempe

Kacang Hijau, dan Bubur Kacang

Hijau. Skripsi. Institut Pertanian

Bogor.

34

Lampiran 1 Kurva Standar Genistein

y = 38887x - 175167 R² = 0,9896

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

0 20 40 60 80 100 120

Luas

are

a

Konsentrasi standar genistein (ppm)

35