Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE
Barbara OSWALD
OPTIMIZACIJA METODE ZA OCENJEVANJE
ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI Z UPORABO
BARVILA DCFH-DA NA CELIČNI LINIJI TLT
MAGISTRSKO DELO
Maribor, 2016
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE
VARNOST HRANE V PREHRAMBENI VERIGI
Barbara OSWALD
OPTIMIZACIJA METODE ZA OCENJEVANJE
ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI Z UPORABO
BARVILA DCFH-DA NA CELIČNI LINIJI TLT
MAGISTRSKO DELO
Maribor, 2016
POPRAVKI
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. III
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Komisijo za zagovor in oceno diplomskega dela so sestavljali:
Predsednik: izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO
Mentor: izr. prof. dr. Tomaž LANGERHOLC
Član: viš.pred. mag. Maksimiljan BRUS
Lektor: Ana Žagar
Magistrsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Datum zagovora: 05. januar 2017
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. IV
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti z uporabo barvila
DCFH-DA na celični liniji TLT
UDK: 577:577.164.2(043)=163.6
Na modelni makrofagni človeški celični liniji TLT smo optimizirali celično metodo z uporabo barvila
DCFH-DA (2´,7´-diklorofluorescin-diacetat) za določevanje pro- in antioksidativne aktivnosti modelnih
substanc vitamina C in troloksa. Ugotavljali smo najprimernejše število celic na vodnjak, optimalen
inkubacijski čas in koncentracijo testnih substanc ter najprimernejši vrstni red nanosa reagentov. Vrednost
fluorescence v testu z DCFH-DA je bila linearno odvisna od števila celic na vodnjak, vendar le v odsotnosti
oksidanta t-BuOOH (tert-butilhidroperoksid). Pri eksperimentih se lahko uporablja širok interval
koncentracije celic, saj so vse vrednosti izmerjene fluorescence še vedno bile v območju detekcije aparata.
Optimalen inkubacijski čas troloksa je od 1 do 2 uri, vitamina C pa 6 ur ali več. Visoke koncentracije tako
troloksa kot vitamina C lahko vplivajo na nastalo fluorescenco, če sta prisotna v fazi merjenja. Optimalna
vrstna reda nanosa reagentov sta bila testna substanca - DCFH-DA - t-BuOOH in t-BuOOH - testna
substanca – DCFH-DA.
Ključne besede: antioksidativna aktivnost / DCFH-DA / celice / vitamin C / troloks
OP: IX, 57 s., 6 sl., 9 pregl., 14 graf., 53 ref.
Method optimization for TLT cell line based antioxidant activity assay using DCFH-
DA fluorescent probe
We have optimized a TLT cell-based method using 2´,7´-dichlorofluorescin-diacetate (DCFH-DA) to assess
the pro- and antioxidative activity of model substances vitamin C and trolox. We tried to determine the most
appropriate number of cells per well, optimal incubation time and concentration of tested substances and the
most appropriate order of reagent application. The fluorescence value in DCFH-DA assay was linearly
dependent on the number of cells per well, but only in absence of the oxidant t-BuOOH. A wide range of cell
concentrations can be used in this assay, that were within limits of instrument sensitivity. Optimal incubation
time for trolox was 1 to 2 hours, while 6 or more hours are required for vitamin C. If those antioxidants are
present while the measurement is conducted, their high concentrations can influence the resulted
fluorescence. The most appropriate orders of reagent application were tested substance - DCFH-DA - t-
BuOOH and t-BuOOH - tested substance - DCFH-DA.
Key words: antioxidant activity / DCFH-DA / cells / vitamin C / trolox
NO: IX, 57 P., 6 Pic., 9 Tab., 14 Graph., 53 Ref.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. V
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Kazalo vsebine
1 UVOD 1
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 Reaktivne kisikove zvrsti ter oksidativni stres 3
2.2 Delovanje antioksidantov 4
2.2.1 Celični antioksidativni sistemi 5
2.3 Antioksidativne lastnosti vitamina C in troloksa 6
2.4 Metode za določevanje antioksidativne aktivnosti 9
2.4.1 Metode in vitro za določevanje antioksidativne aktivnosti 9
2.4.2 Celični testi za določevanje antioksidativne aktivnosti 10
2.4.3 Antioksidativni celični test z uporabo 2´,7´– diklorofluorescein diacetata
(DCFH-DA) 11
3 MATERIALI IN METODE 15
3.1 Kemikalije 15
3.1.1 Priprava raztopine DCFH-DA 15
3.1.2 Priprava tert-butil hidroperoksida (t-BuOOH) 15
3.1.3 Priprava raztopine vitamina C oz. askorbinske kisline 16
3.1.4 Priprava raztopine troloksa 16
3.1.5 Priprava HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) 16
3.2 Celična linija 17
3.2.1 Presajanje celic 17
3.3 Test za merjenje antioksidativne aktivnosti na celicah 18
3.3.2 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (Fluorescence quenching) 18
3.3.3 Optimizacija gostote / števila celic na posamezen vodnjak 19
3.3.4 Optimizacija inkubacijskega časa inkubacije celic s testnimi substancami 20
3.3.5 Optimizacija koncentracije testnih substanc 22
3.3.6 Optimizacija vrstnega reda nanosa reagentov 23
3.3.7 Obdelava rezultatov 23
4 REZULTATI Z RAZPRAVO 25
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. VI
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
4.1 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (fluorescence quenching
assessment) 25
4.2 Določitev optimalnega števila celic na vodnjak 28
4.3 Določitev optimalnega inkubacijskega časa testnih substanc 30
4.4 Določitev optimalne koncentracije testnih substanc 38
4.5 Določitev optimalnega zaporedja nanosa reagentov 40
5 SKLEPI 49
6 VIRI 51
ZAHVALA 56
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. VII
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Kazalo grafikonov
Grafikon 1: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od
koncentracije troloksa. ............................................................................... 26
Grafikon 2: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od
koncentracije vitamina C.. ......................................................................... 27
Grafikon 3: Grafični prikaz intenzitete fluorescence pri različnih koncentracijah
DCF v odsotnosti testnih substanc. ............................................................ 28
Grafikon 4: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na
vodnjak (brez dodatka t-BuOOH).. ............................................................ 29
Grafikon 5: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na
vodnjak (z dodatkom t-BuOOH).. ........................................................... 30
Grafikon 6: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%) po 1 uri inkubacije testnih substanc s celicami. ................................... 31
Grafikon 7: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%) po 2 urah inkubacije substratov s celicami. ......................................... 33
Grafikon 8: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%) po 3 urah inkubacije substratov s celicami.. ........................................ 34
Grafikon 9: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%) po 6 urah inkubacije substratov s celicami.. ........................................ 36
Grafikon 10: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo
(100 %).. ................................................................................................... 39
Grafikon 11: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-
BuOOH, testna substanca, DCFH-DA.. ................................................... 41
Grafikon 12: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-
BuOOH, DCFH-DA, testna substanca.. ................................................... 43
Grafikon 13: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: testna
substanca, DCFH-DA, t-BuOOH.. ........................................................... 45
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. VIII
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 14: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100
%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju:
DCFH-DA, testna substanca, t-BuOOH. .................................................. 47
Kazalo slik
Slika 1: Oksidacija askorbinske kisline (AH-) z dvema zaporednima korakoma
eno-elektronske oksidacije do askorbinskega radikala (A•-) in
dehidroaskorbinske kisline (DHA) (Carr in Frei 1999). ....................................... 7
Slika 2: Strukturna formula vitamina E (zgoraj) in troloksa (spodaj) (Wattamwar
in sod. 2010). ......................................................................................................... 8
Slika 3: Znotrajcelična redoks kemija 2′,7′-diklorofluorescin diacetata (DCFH-
DA) (Dikalov in Harrison 2012). ........................................................................ 11
Slika 4: Eksperiment optimizacije števila celic na vodnjak na mikrotitrski plošči
(sivo obarvani vodnjaki so prazni). .................................................................... 20
Slika 5: Prikaz nanosa testnih substanc na mikrotitrske plošče. ...................................... 21
Slika 6: Prikaz redčitev substanc na mikrotitrski plošči z začetno koncentracijo 10
mM in redčitvami v razmerju 1:4. ..................................................................... 22
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. IX
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 1 h inkubacije. .......... 32
Preglednica 2: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 2 h inkubacije. ........ 33
Preglednica 3: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 3 h inkubacije. ........ 35
Preglednica 4: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 6 h inkubacije. ........ 37
Preglednica 5: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami z začetno koncentracijo 10 mM. ............................ 40
Preglednica 6: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: t-BuOOH, testna substanca, DCFH-DA. ............................... 42
Preglednica 7: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: t-BuOOH, DCFH-DA, testna substanca. ............................... 44
Preglednica 8: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: testna substanca, DCFH-DA, t-BuOOH. ............................... 46
Preglednica 9: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: DCFH-DA, testna substanca, t-BuOOH. ............................... 48
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 1
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
1 UVOD
Reaktivne kisikove / dušikove zvrsti (reactive oxygen /nitrogen species - ROS / RNS)
igrajo ključno vlogo pri srčnožilnih boleznih, vnetjih, nevrodegenerativnih okvarah,
rakavih obolenjih in staranju (Girard-Lalancette in sod. 2009). Med ROS/RNS spadajo
superoksidni anionski radikal, hidroksil, alkoksilni in peroksilni radikali, dušikov oksid in
peroksinitrit (Pisoschi in Pop 2015). Te spojine lahko reagirajo in uničijo različne celične
komponente, kot so proteini, lipidi in DNK. Kadar se ROS/RNS tvorijo v živih sistemih (in
vivo), nastopijo različni antioksidanti (Halliwell 1996). Celica je razvila več
antioksidativnih encimatskih sistemov, ki jo ščitijo pred ROS/RNS. Glavni antioksidativni
encimi so SOD (superoksidna dizmutaza), katalaza in GPX (glutation preoksidaza) (Matés
in Sánchez-Jiménez 1999). V zdravi celici je poskrbljeno za ravnotežje med tvorbo
ROS/RNS (oksidanti) in uničenje le-teh z antioksidativnimi sistemi, medtem ko nagibanje
k oksidantom, imenovano tudi oksidativni stres, lahko vodi do uničenja celice (Sies 1997).
Širša definicija antioksidantov se glasi: antioksidant je vsaka snov, ki že v majhnih
koncentracijah v primerjavi s tistimi, ki substrat oksidirajo, preprečijo, ali zakasnijo
oksidacijo tega substrata (Halliwell 1996). Hrana, bogata z antioksidanti, kot sta sadje in
zelenjava, lahko pomaga preprečiti tovrstna obolenja (Girard-Lalancette in sod. 2009).
Zaradi tega je začelo naraščati zanimanje za raziskave o vlogi rastlinskih antioksidantov v
hrani in pri človekovem zdravju. Danes obstaja že več metod in vitro za določevanje
oziroma ocenjevanje antioksidativne aktivnosti sestavin hrane, ki temeljijo na spremembi
absorpcijskega koeficienta v vidnem delu spektra po kemijski redukciji
radikala/molekule/iona, ki jo antioksidant reducira. Najpogosteje uporabljene med njimi so
metoda ABTS (2,20-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina), metoda DPPH (2,2-
difenil-1-pikril-hidrazil), Fe3+ - Fe2+ transformacijski test, metoda FRAP (ferric reducing
antioxidant power – sposobnost aktioksidantov, da zreducirajo železo) in Folin - Ciocalteu
metoda (določanje skupnih fenolnih spojin s Folin - Ciocalteu reagentom (Gülçin 2012).
Vendar so vse naštete metode pogosto zelo specifične za en mehanizem delovanja (Girard-
Lalancette in sod. 2009) in ne upoštevajo fiziološkega stanja celice, biodostopnosti
molekule antioksidanta ter celotnega metabolizma celice (Liu in Finely 2005). Poleg tega
so antioksidanti v hrani heterogeni in multifunkcionalni (Frankel in Meyer 2000). Prav
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 2
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
zaradi teh razlogov je narastlo zanimanje za razvoj novih metod, ki temeljijo na merjenju
antioksidativne aktivnosti v živih celicah. Pri pregledu strokovne literature smo zasledili
nekaj podobnih raziskav, kjer so za določevanje antioksidativne aktivnosti uporabljali
DCFH-DA. Žal je število raziskovalcev, ki uporabljajo modele za ocenjevanje
antioksidativne aktivnosti v živih sesalčjih celicah, še vedno zelo nizko. Posledično je na
voljo zelo malo podatkov o protokolih in pristopih.
Namen magistrske naloge je bil optimizacija celične metode z uporabo barvila 2´,7´-
diklorofluorescin-diacetata (DCFH-DA) za določevanje pro- in antioksidativne aktivnosti
različnih spojin. Na modelni makrofagni človeški celični liniji TLT smo poskušali
optimizirati koncentracijo in čas inkubacije substratov (kot testni substanci smo uporabili
antioksidanta vitamin C in troloks) ter določiti najprimernejše število celic v
eksperimentalnem sistemu. Poleg tega smo poskušali določiti tudi najprimernejši vrstni red
nanosa reagentov, saj v literaturi glede tega še vedno vlada zmeda. Skratka, namen je bil
določiti sistem, ki bi podal najrelevantnejše rezultate in podal smernice za merjenje
antioksidativne aktivnosti naravnih ekstraktov.
Postavili smo tri hipoteze:
Hipoteza 1: Vrednost fluorescence v testu z DCFH-DA je linearno odvisna od števila celic
na vodnjak.
Hipoteza 2: Previsoka koncentracija antioksidantov vpliva na vrednost izmerjene
fluorescence (učinek »zadušitve« fluorescence).
Hipoteza 3: Prekratka ali predolga inkubacija antioksidantov zmanjša antioksidativni
učinek.
Hipoteza 4: Za meritve fluorescence je pomemben vrstni red nanosa reagentov peroksida,
testne substance (antioksidanta) in DCFH-DA.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 3
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
2 PREGLED OBJAV
2.1 Reaktivne kisikove zvrsti ter oksidativni stres
Reaktivne kisikove spojine (ROS) povezujemo s patologijami, kot so kardiovaskularne
bolezni, inflamatorne bolezni, nevrodegenerativne bolezni, rak in staranje (Stohs 1995).
Glavne reaktivne kisikove spojine, ki se oblikujejo v bioloških sistemih, so superoksidni
anioni, vodikov peroksid, peroksidni radikali in hidroksidni radikali (Bergendi in sod.
1999). Vse te oblike kisika so lahko rezultat normalne celične presnove ali posledica
dejavnikov okolja, kot so UV- in gama- žarčenje, toplotno sevanje, kajenje, onesnaževala v
okolju itd. Prosti radikal je vsak atom ali molekula, ki ima prost, nevezan elektron v eni ali
več orbitalah. Prosti radikali so po navadi rezultat homolitične cepitve molekul pod
vplivom svetlobe, toplote ali nastajajo v redoks reakcijah (Korošec 2000).
Znano je, da so ROS v bioloških sistemih glede na okolje lahko tako škodljive kot tudi
koristne (Glade 2003). Blagodejni učinki ROS so na primer fiziološka vloga v celičnih
odzivih kot obramba proti okužbam ter v funkciji številnih celičnih signalnih sistemov.
Nasprotno v visokih koncentracijah so ROS lahko posredniki poškodb celičnih struktur,
vključno z lipidi in membranami, proteini ter nukleinskimi kislinami (Poli in sod. 2004).
V normalni zdravi celici se vzpostavi ravnotežje med tvorbo ROS in odstranjevanjem le-
teh z antioksidativnim sistemom. Kadar je tvorba ROS večja od antioksidativne obrambne
zmožnosti celice ali če je antioksidativna obramba celice inhibirana, se pojavi
neravnotežje. Ta pojav imenujemo oksidativni stres, ki lahko vodi celični sistem do
patološkega stanja (Sies 1997).
Kljub prisotnosti celičnega antioksidativnega obrambnega sistema, ki preprečuje
oksidativne poškodbe s strani ROS, se oksidativne poškodbe nalagajo skozi ves življenjski
cikel in so odgovorne za staranje ter obolenja povezana s staranjem, kot so srčno-žilne
bolezni, rak, nevrodegenerativna obolenja ter druge kronične bolezni (Rahman 2003).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 4
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
2.2 Delovanje antioksidantov
Preprosta definicija pravi: »Antioksidant je snov, ki ščiti druge snovi pred oksidacijo«.
Oksidacija je verižna reakcija, ki jo povzročajo oksidanti in prosti radikali. Kako
antioksidanti preprečujejo oksidacijo, je odvisno od vrste antioksidanta. Pri oksidaciji
lahko odigrajo preventivno vlogo na dva načina (Abram 2000):
1. Najpogosteje antioksidant poseže v reakcijo avtooksidacije s tem, da hitro odda
vodikov atom radikalu, ki bi sicer povzročil tvorbo peroksidnih radikalov (reakcija
1). Nastali radikalski produkt mora biti bolj stabilen kot sam radikal (Raspor in sod.
2000).
R• + ArOH RH + ArO• ... (1)
2. Antioksidant lahko stabilizira prosti radikal s prenosom posameznega elektrona
(reakcija 2).
R• + ArOH R- + ArOH•+ ... (2)
Prenos vodikovega atoma in prenos posameznega elektrona potekata z različno hitrostjo
(Wright in sod., 2001).
Antioksidanti so del obrambnega mehanizma organizma, ki ščiti biološke molekule pred
poškodbami s prostimi radikali. Drugače povedano, to so spojine, ki imajo sposobnost
pretvorbe prostih radikalov v manj škodljive ali popolnoma neškodljive produkte s
sprejemanjem ali oddajanjem elektronov. V tem procesu antioksidanti postanejo radikali,
ki so običajno manj reaktivni. Nekatere organizem obnavlja, drugi pa se po nadaljnjih
pretvorbah izločijo iz telesa (Cornelli 2009).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 5
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
2.2.1 Celični antioksidativni sistemi
Škodljivi učinki ROS so uravnavani z delovanjem antioksidantov (Halliwell 1996). Idealen
antioksidant bi se moral takoj absorbirati in uničiti proste radikale ter kelirati redoks
kovine na ustrezen fiziološki nivo. Prav tako bi mogel delovati tako v vodnih kot
membranskih domenah ter vplivati na gensko izražanje na pozitiven način (Rahman 2007).
Skozi evolucijo človeka se je endogena obramba postopoma izboljšala tako, da je ohranila
ravnotežje med prostimi radikali in oksidativnim stresom. Antioksidativna aktivnost je
lahko učinkovita na različne načine: kot inhibitorji oksidacijskih reakcij prostih radikalov
(preventive oxidants - preventivni oksidanti) s preprečevanjem tvorbe prostih lipidnih
radikalov; s prekinitvijo propagacije avtooksidacijske verižne reakcije (chain breaking
antioxidants - antioksidanti, ki prekinjajo verige); kot singletni kisikovi dušilci (singlet
oxygen quenchers); skozi sinergizem z ostalimi antioksidanti; kot reducenti, ki pretvarjajo
hidroperokside v stabilne spojine; kot kovinski kelatorji, ki pretvarjajo kovinske
prooksidante (železove in bakrove derivate) v stabilne produkte ter kot inhibitorji
prooksidativnih encimov (lipooksigenaze) (Carocho in Ferreira 2013).
Antioksidativni sistem človeka delimo v dve glavni skupini, encimatski in neencimatski
antioksidanti. Encimatski antioksidanti se naprej razdelijo na primarne in sekundarne
encimske obrambne mehanizme. Primarni obrambni mehanizem je sestavljen iz treh
pomembnih encimov, ki preprečujejo tvorbo prostih radikalov ali jih nevtralizirajo:
glutation peroksidaza, ki odda dva elektrona in tako zreducira perokside s tvorbo selenolov
ter izloči perokside kot potencialne substrate za Fentonovo reakcijo; katalaza, ki pretvarja
vodikov peroksid v vodo in molekularni kisik ter ima eno najvišjih stopenj »prometa« kar
jih pozna človek (samo ena molekula katalaze lahko pretvori 6 bilijonov molekul
vodikovega peroksida v vodo in kisik na minuto); ter superoksidna dizmutaza, ki pretvarja
superoksidne anione v vodikov peroksid kot substrat za katalazo (Rahman 2007).
Sekundarna encimska obramba vključuje glutation reduktazo in glukoza-6-fosfat
dehidrogenazo. Glutation reduktaza reducira glutation (antioksidant) iz svoje oksidirane
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 6
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
oblike v reducirano, da ga reciklira za nadaljnjo nevtralizacijo še več prostih radikalov.
Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza obnavlja NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat
– koencim soudeležen pri anabolnih reakcijah), da ustvari reducirajoče okolje (Ratnam in
sod. 2006). Ta dva encima ne nevtralizirata prostih radikalov neposredno, ampak imata
podporno vlogo ostalim endogenim antioksidantom.
Obstaja veliko število ne-encimatskih endogenih antioksidantov, mednje sodijo vitamini
(A), encimski kofaktorji (Q10), dušikove spojine (sečna kislina) in peptidi (glutation)
(Carocho in Ferreira 2013). V isto skupino antioksidantov uvrščamo še druge naravne
spojine, kot so fenoli, galna kislina in njeni derivati ter flavonoidi (kvercetin, ramnetin,
kamferol, rutin, kavna kislina, rožmarinska kislina) (Korošec 2000).
Kljub njegovi izjemni učinkovitosti endogeni antioksidativni sistem sam po sebi ne
zadostuje, zato smo ljudje, da ohranimo koncentracijo prostih radikalov na nizkem nivoju,
odvisni od različnih vrst antioksidantov, ki se nahajajo v prehrani (Pietta 2000).
2.3 Antioksidativne lastnosti vitamina C in troloksa
Askorbinska kislina oziroma vitamin C je pomemben in močan vodotopen antioksidant,
zato tudi deluje v vodnih okoljih v telesu (Rahman 2007). Vitamin C vsebuje dve spojini:
L-askorbinsko kislino in L-dehidroaskorbinsko kislino, pri čemer se obe absorbirata skozi
gastrointestinalni trakt in se lahko in vivo encimatsko med seboj zamenjata. Askorbinska
kislina je učinkovita v lovljenju superoksidnih radikalnih anionov, vodikovega peroksida,
hidroksilnih radikalov, singletnega kisika in reaktivnega dušikovega kisika (Barros in sod.
2011). Primaren antioksidativni partner vitaminu C so tako encimatski antioksidanti kot
tudi karotenoidi in vitamin E. Vitamin C sodeluje z vitaminom E tako, da tvori α-tokoferol
iz α-tokoferolnih radikalov v membranah in lipoproteinih (Carr in Frei 1999). Poleg tega
zvišuje nivo znotrajceličnega glutationa, zato igra pomembno vlogo pri zaščiti tiolnih
skupin proteinov pred oksidacijo (Nazirog 2005).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 7
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Slika 1: Oksidacija askorbinske kisline (AH-) z dvema zaporednima korakoma eno-
elektronske oksidacije do askorbinskega radikala (A•-) in dehidroaskorbinske
kisline (DHA) (Carr in Frei 1999, str. 1008).
Vitamin E je sestavljen iz osmih izoform, s štirimi tokoferoli (α-, β-, γ- in δ-tokoferol) in
štirimi tokotrienoli (α-, β-, γ- in δ tokotrienol), pri čemer je α-tokoferol najmočnejša
izoforma v bioloških sistemih. Kromanska skupina prispeva k antioksidativni aktivnosti
tokoferolov, medtem ko fitilni rep nima vpliva. Ker sta aktivni strani α-tokoferola in
troloksa enaki, je sposobnost troloksa, da odda vodik podobna tisti od α-tokoferola (Hall in
sod. 2010). Vitamin E zaustavi lipidno peroksidacijo z oddajo svojega fenolnega vodika k
peroksidnim radikalom, tvorijo se tokoferolni radikali, vendar slednji, kljub temu da so
radikali, so nereaktivni ter nesposobni nadaljevati oksidativno verižno reakcijo. Vitamin E
je glavna maščobotopna molekula, ki je sposobna trganja radikalskih verig. Ta
antioksidant, najden v plazmi, rdečih krvničkah in tkivih, ščiti celovitost lipidnih struktur,
predvsem membran (Burton in Traber 1990).
Troloks je derivat α-tokoferola, pri katerem je hidrofobna fitilna skupina zamenjana s
hidrofilno karboksilno skupino, ki je topna v vodi (Priyadarsini in sod. 2001).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 8
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Slika 2: Strukturna formula vitamina E (zgoraj) in troloksa (spodaj) (Wattamwar in sod.
2010, str. 148).
Hall in sod. (2010) so preučevali antioksidativno aktivnost askorbinske kisline in troloksa
na oksidacijo riboflavina v mleku v prisotnosti svetlobe in ugotovili, da se je s
povečevanjem koncentracije obeh vitaminov znižala razgradnja riboflavina. Riboflavin,
troloks in askorbinska kislina so namreč med seboj tekmovali za reakcijo s singletnim
kisikom, ki se tvori v prisotnosti riboflavina na svetlobi. Podobno sta v svoji raziskavi
dokazala tudi Yettella in Min (2010) – tako askorbinska kislina, kot troloks sta zmanjšala
razgradnjo aromatičnih aminokislin fenilalanina, triptofana in tirozina, pri čemer je troloks
odigral boljšo vlogo antioksidanta kot askorbinska kislina.
Carr in sod. (1999) navajajo, da večina in vivo ter in vitro pregledanih študij kaže odvisnost
znižanja oksidativnih poškodb v DNK z vitaminom C, medtem ko nekatere raziskave niso
opazile nikakršnih sprememb ali povečane stopnje izbranih lezij DNK. V prisotnosti ali ob
dodatku kovinskih ionov vitamin C inhibira oksidativne poškodbe DNK v celicah (Fiala in
sod. 1996; Wei in sod. 1996; Noroozi in sod. 1998; Fischer-Nielsen in sod. 1993; Pflau in
sod. 1998). Od dveh in vivo študij, v katerih so živalim dodajali vitamin C, je ena pokazala
zaščito s strani vitamina C proti UV sproženi poškodbi DNK v očesu (Reddy in sod. 1998),
medtem ko druga ni pokazala sprememb v nivoju oksidativnih poškodb DNK v jetrih
(Cadenas in sod. 1997).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 9
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
2.4 Metode za določevanje antioksidativne aktivnosti
2.4.1 Metode in vitro za določevanje antioksidativne aktivnosti
Metode, ki se najpogosteje uporabljajo za določanje antioksidativnega potenciala, se
razlikujejo glede na delovanje in pogoje (Lucas-Abellán in sod. 2010). Glede na potek
reakcije v grobem delimo metode in vitro v dve skupini: metode, ki temeljijo na prenosu
vodikovega atoma (HAT - hydrogen atom transfer) in metode, ki temeljijo na prenosu
elektrona (ET - electron transfer). Večina metod, ki jih uvrščamo v prvo skupino, temelji
na tekmovanju antioksidanta in substrata (katerega oksidacijo antioksidant preprečuje) za
radikale. Te metode vključujejo zaviranje avtooksidacije lipoproteinov z nizko gostoto v
prisotnosti antioksidantov, preprečevanje oksidacije molekul, kot je fluorescein z metodo
ORAC (oxygen radical absorbance capacity) ali preprečevanje razbarvanja beta-karotena.
V drugo skupino uvrščamo metode, ki temeljijo na merjenju kapacitete antioksidanta, da
reducira oksidant/radikal, kateremu se spremeni barva v vidnem delu spektra. Sprememba
absorbance je v neposredni povezavi s koncentracijo antioksidantov v vzorcu. V to skupino
uvrščamo metode, kot so določitev skupnih fenolov s Folin-Ciocalteu reagentom, DPPH,
ABTS in FRAP (Huang in sod. 2005).
V praksi se za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti preiskovanih vzorcev izvajajo
različni protokoli omenjenih testov in vitro. Vendar antioksidativna aktivnost ne bi smela
biti podana na podlagi enega samega antioksidativnega testnega modela, saj se
antioksidativni testni modeli razlikujejo v različnih ozirih. Zaradi tega je težko v celoti
primerjati eno metodo z drugo. Raziskovalci morajo kritično overiti metode analiz, preden
prevzamejo tisto, ki jo potrebujejo za namen raziskave. Na splošno so antioksidativni testi
in vitro, ki uporabljajo t. i. pasti za proste radikale, relativno enostavni za izvedbo. V to
skupino testov uvrščamo metodo DPPH, ki je hitra, enostavna (ne vsebuje veliko korakov
in reagentov) ter poceni v primerjavi z ostalimi testnimi modeli. Po drugi strani je metoda
ABTS razbarvanja primerna tako za hidrofilne kot lipofilne antioksidante (Alam in sod.
2013).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 10
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
V zadnjem času so naravni antioksidanti v hrani, sadju, pijačah, začimbah in dodatkih
dobili pozornost prehranskih in kozmetičnih interesentov, čeprav so številni sintetični
antioksidanti bili pripravljeni s farmacevtskega stališča. Kapaciteta teh antioksidantov je
bila ocenjena v številnih raziskavah z različnimi metodami pod različnimi pogoji. Razvitih
in uporabljenih je bilo veliko število metod ter načinov za merjenje antioksidativne
kapacitete oziroma učinkovitosti, vendar zelo pogosto ni bilo korelacije med aktivnostmi,
izmerjenimi v enakem materialu z različnimi metodami in med aktivnostmi, izmerjenimi z
istimi metodami v različnih laboratorijih (Niki 2010).
2.4.2 Celični testi za določevanje antioksidativne aktivnosti
Eksperimenti na živalih so zaradi časovne dolžine izvedbe in visokih stroškov neprimerni
za ocenjevanje oz. vrednotenje antioksidantov v začetni stopnji raziskovanja antioksidanta
(Wan in sod. 2015). Poleg tega so sočasna nihanja hranil, hormonov ter kompleksnost tkiv
in organizacija organov med poskusom na modelih živih živali zelo otežila demonstracijo
molekularnih mehanizmov specifičnih uravnavanj (Goya in sod. 2009).
Alternativno se kot model za pojasnjevanje osnovnih mehanizmov oksidativnega stresa in
ocenjevanje zaščitnih učinkov antioksidantov proti različnim oksidativnim stresnim
dejavnikom pogosto uporabljajo kultivirane celice (Piga in sod. 2007). Vendar mora
celični model imeti močne antioksidativne obrambe, da so izmerjene spremembe v
antioksidativnem odzivu, opažene. Poleg tega morajo celice biti sposobne ostati v kulturi
stabilne daljše časovno obdobje, da bi lahko zagotovili konstanten in zanesljiv odgovor na
ponovljene pogoje (Goya in sod. 2009).
Prednost uporabe kultiviranih celic je, da več različnih dejavnikov stresa in tipov celic,
vključno z modelnimi sistemi za nekatera specifična obolenja, omogoča ocenitev
antioksidativnih učinkov (Niki 2010). Učinki antioksidantov se merijo na podlagi
oksidativnega stresa v kultiviranih celicah glede na zaviranje tvorbe ROS, oksidacije
lipidov, proteinov, DNK in celične smrti. Antioksidanti se lahko dodajo k mediju za
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 11
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
kultivacijo celic hkrati s stresnim dejavnikom ali v predinkubaciji predhodno vključenim v
celice (Piga in sod. 2007).
2.4.3 Antioksidativni celični test z uporabo 2´,7´ - diklorofluorescein diacetata (DCFH-
DA)
Celični test z uporabo 2´,7´ - diklorofluorescin diacetata (DCFH-DA) določa
antioksidativno aktivnost z merjenjem aktivnosti lovljenja prostih radikalov testiranega
antioksidativnega vzorca v celicah preko zaznavanja znotrajcelične fluorescence po
inkubaciji s fluorescentnim barvilom DCFH-DA, vzorcem antioksidanta in radikalov s
celicami (Wan in sod. 2015).
Slika 3: Znotrajcelična redoks kemija 2′,7′ - diklorofluorescin diacetata (DCFH-DA)
(Dikalov in Harrison 2012).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 12
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
S prvim opisom uporabe DCFH-DA, kot fluorometričnega testa za vodikov peroksid, se je
začel uporabljati DCFH-DA, kot barvilo za določevanje tvorbe znotrajceličnega
vodikovega peroksida s pretočno citometrijo (Wang in Joseph 1999). Teorija v ozadju
uporabe DCFH-DA je, da nefluorescentni fluorescinski derivati oddajajo fluorescenco po
oksidaciji s strani vodikovega peroksida. Intenziteta fluorescence je neposredno
proporcionalna koncentraciji vodikovega peroksida. Pri uporabi na nepoškodovanih
celicah, nepolarni DCFH-DA prečka celične membrane, kjer se encimatsko hidrolizira s
strani znotrajceličnih esteraz do nefluorescentnega diklorofluorescina (DCFH). V
prisotnosti ROS se DCFH-DA oksidira v visoko fluorescenten diklorofluorescin (DCF)
(LeBel in sod. 1992). Zaradi tega se lahko znotrajcelična fluorescenca DCF uporablja kot
indeks za kvantifikacijo skupnega oksidativnega stresa v celicah (Wang in Joseph 1999).
Kljub temu se porajajo vprašanja glede uporabe DCFH-DA za določanje znotrajceličnega
vodikovega peroksida in ostalih oksidantov, saj je znotrajcelična redoks kemija barvila
DCFH-DA kompleksna. Obstaja več omejitev in artefaktov, povezanih s testom DCFH-
DA za merjenje oksidativnega stresa. Ena izmed omejitev je, da DCFH-DA ne reagira
neposredno z vodikovim peroksidom do tvorbe fluorescentnega produkta DCF-ja, zaradi
tega se fluorescenca DCF ne more uporabljati za neposredno merjenje vodikovega
peroksida v celici kot enega izmed potencialnih oksidantov. Poleg tega, več eno-
elektronsko oksidirajočih spojin oksidira DCFH do DCF; to vključuje hidroksilne radikale
(•OH), spojine tvorjene iz peroksidaze ali hemske interakcije z vodikovim peroksidom, iz
sistema mieloperoksidaze / vodikovega peroksida / NO2 tvorjenega •NO2, hipoklorovo
kislino, ter razpad reaktivnih spojin, tvorjenih iz peroksinitrita (ONOO−/ONOOH). Razpad
peroksinitrita v prisotnosti bikarbonata tvori •OH ali karbonatne anionske radikale
(CO3•−). Citokrom c (hemski protein, ki se sprosti iz mitohondrija v citosol med
apoptozo), lahko oksidira DCFH do DCF neposredno ali posredno preko peroksidaznega
mehanizma. Povečanje fluorescence, ki se pojavi med apoptozo celic, je pogosto povezano
s povečano tvorbo oksidanta. Poleg tega redoks aktivne kovine (npr. Fe2+) v prisotnosti
kisika ali vodikovega peroksida spodbudijo oksidacijo DCFH (Kalyanaraman in sod.
2012).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 13
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Lalancette in sod. (2009) so razvili občutljiv celični test z uporabo DCFH-DA za
določevanje pro- in antioksidativne aktivnosti spojin in zmesi. Poskus je potekal tako, da
so najprej na črne mikrotitrske plošče z ravnim dnom (BD Falcon) nasadili sesalčje celice
(celična linija L-929) z gostoto 10.000 celic / vodnjak in jih 24 ur inkubirali pri 37 °C in 5
% CO2. Nato so jih sprali s 150 μL PBS (raztopina fosfatnega pufra s pH 7,4) ter ponovno
inkubirali s 100 μL 5 μM DCFH-DA v HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) s pH 7,4.
Ponovno je sledilo spiranje s 150 μL PBS in nato 1 h inkubacije z naraščajočimi
koncentracijami čistih spojin ali ekstraktov v prisotnosti ali odsotnosti 200 μM t-BuOOH
(tert-butil hidroperoksid). Fluorescenco (vzbujevalna valovna dolžina: 485 nm, emisijska
valovna dolžina: 530 nm) so prvič izmerili takoj po dodatku t-BuOOH, drugič po 90 min.
Rezultate so interpretirali z izračunom vrednosti IC50 tako, da so uporabili logaritmično
regresijo krivulje odvisne od koncentracije po odštetju obeh vrednosti fluorescence -
slepega ter vzorca čiste spojine oziroma ekstrakta brez DCF.
Wang in sod. (1999) so z uporabo DCFH-DA testa kvantificirali oksidativen stres v celicah
PC12. Celice z gostoto 10.000 celic / vodnjak so 1 dan pred poskusom nanesli na
mikrotitrske plošče, prevlečene s kolagenom. Nato so odstranili gojišče, sprali s pufrom
KRH (Krebs-Ringer bikarbonatni pufer) in celice 30 min inkubirali s 100 μM DCFH-DA v
mediju pri 37 °C ter 5 % CO2 / 95 % zraku. Sledila je odstranitev DCFH-DA, ponovno
spiranje in nato inkubacija z različnimi koncentracijami tvorcev prostih radikalov oziroma
sprožilcev oksidativnega stresa (H2O2, AAPH = 2,2-azobios (2-amidino-propan)
dihidroklorid, SIN-1 = 3-morfolinosidnonimin hidroklorid, SNP = natrijev nitroprusid) v
pufru KRH. Fluorescenco (vzbujevalna v. d.: 485 nm, emisijska v. d.: 530 nm) so merili 30
min v intervalih vsakih 5 min. S kvantifikacijo fluorescence so premo-sorazmerno
kvantificirali oksidativni stres v celicah.
Wan in sod. (2015) so razvili test s celično linijo Caco-2 za kvantitativno ocenjevanje
antioksidativne aktivnosti antioksidantov, pri čemer so optimizirali gostoto celic,
kultivacijski čas celic, inkubacijski čas in koncentracijo DCFH-DA ter detekcijski čas
fluorescence. Pri določanju optimalne gostote celic / vodnjak ter kultivacijskega časa celic
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 14
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
so poskus izvedli tako, da so celice z gostoto od 1×104 do 1×105 / vodnjak nanesli na črne
mikrotitrske plošče ter jih inkubirali 24 in 36 ur pri 37 °C in 5 % CO2. Rezultati so
pokazali, da je optimalna gostota Caco-2 celic pri inkubacijskem času 24 ur 5 × 104 – 6 ×
104 celic / vodnjak, medtem ko je pri inkubacijskem času 36 ur 3 × 104 – 4 × 104 celic /
vodnjak. Nižja gostota celic namreč vodi v nastanek velikih in redkih celic z nizko
konfluenco (20 - 80 %), višja gostota pa kljub 100 % konfluenci do skupkov celic.
Optimalna gostota celic in kultivacijski čas sta bila določena na podlagi pritrditve celic,
konfluence in statusa aktivnosti celic. Na podlagi določenega optimalnega kultivacijskega
časa in gostote celic so nato optimizirali inkubacijski čas DCFH-DA tako, da so celice
inkubirali s 15 μM DCFH-DA različno dolgo (5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 in 90
min), po odstranitvi medija in spiranju v vsak vodnjak dali 100 µL 500 μM AAPH
(oksidant). Fluorescenco (vzbujevalna v. d.: 485 nm, emisijska v. d.: 530 nm) so merili
vsega skupaj 120 min v intervalih vsakih 5 min. Ugotovili so, da se vrednost fluorescence
povečuje s časom, vendar doseže svojo maksimalno vrednost po 20 min. Ker po 20 min
DCFH-DA postane nestabilen, so kot optimalen inkubacijski čas DCFH-DA določili 20
min. Podobno kot optimalen inkubacijski čas so določili tudi optimalno koncentracijo
DCFH-DA, pri čemer so celice 20 min tretirali z različnimi koncentracijami DCFH-DA (1,
3, 5, 15, 29, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μM). Kot najbolj optimalna koncentracija
DCFH-DA se je izkazala 60 μM, saj je pri tej koncentraciji vrednost fluorescence dosegla
svoj maksimum. Ta pojav so pojasnili tako, da pri višjih koncentracijah nastanejo v celici
prosti peroksidni radikali, ki oksidirajo DCFH-DA. Raziskovalci so optimizirali tudi način
inkubacije DCFH-DA (60 μM) in substrata (10 μM kvercetin) s celicami. Preizkusili so tri
načine: 1) substrat se je posebej inkubiral pred inkubacijo DCFH-DA, 2) DCFH-DA se je
inkubiral pred substratom, in 3) DCFH-DA in substrat sta se sočasno inkubirala. Kot
najbolj optimalen način se je izkazala sočasna inkubacija DCFH-DA in substrata. Pri
drugem načinu so rezultati pokazali izgubo oziroma nestabilnost DCFH-DA med daljšo
inkubacijo.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 15
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
3 MATERIALI IN METODE
3.1 Kemikalije
Uporabljeni so bili reagenti 2’,7’ - diklorofluorescin-diacetat (DCFH-DA), 2’,7’-
diklorofluorescin (DCF), tert-butil hidroperoksid (t-BuOOH), 6-hidroksi - 2,5,7,8-
tetrametil-2-karboksilna kislina (troloks), askorbinska kislina (vitamin C), dimetil sulfoksid
(DMSO). Vsi omenjeni reagenti so bili od proizvajalca Sigma Aldrich. Celice smo gojili v
gojišču DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco, Paisley, Velika Britanija) in
FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, Paisley, Velika Britanija), reagente pa topili ter izvajali
poskuse v gojišču HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), katerega smo ga pripravili sami
(postopek opisan v poglavju 3.1.1). Kemikalije, ki niso vodotopne (DCFH-DA, DCF,
troloks) smo najprej raztopili v DMSO, nato jih razredčili s HBSS do želene koncentracije,
tako da je bil delež DMSO v vseh raztopinah manj kot 2 %.
3.1.1 Priprava raztopine DCFH-DA
Najprej smo pripravili 41 mM DCFH-DA založne raztopine v DMSO, naredili alikvote ter
jih shranili pri temperaturi -20 °C. Za vsak poskus posebej smo iz 41 mM DCFH-DA
založne raztopine pripravili 20 µM DCFH-DA delovne raztopine v HBSS.
3.1.2 Priprava tert-butil hidroperoksida (t-BuOOH)
Za celične poskuse smo uporabljali t-BuOOH v HBSS v končni koncentraciji 500 µM.
Delovno raztopino smo pripravili tako, da smo najprej 5 μL 80 % t-BuOOH dodali k 500
µL HBSS in dobili 80 mM raztopino t-BuOOH v HBSS, katero smo potem redčili s HBSS
do končne koncentracije 500 µM. Delovno raztopino smo pripravljali pred vsakim
poskusom posebej.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 16
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
3.1.3 Priprava raztopine vitamina C oz. askorbinske kisline
Delovno raztopino čistega vitamina C oziroma askorbinske kisline smo vedno za vsak
poskus posebej pripravili tik pred nanosom na celice, saj je znano, da askorbinska kislina v
vodnem mediju zaradi oksidacije hitro razpade. Delovno raztopino askorbinske kisline smo
pripravili tako, da smo natehtali 5 mg čiste askorbinske kisline in jo raztopili v 1 ml HBSS,
pri čemer smo dobili 28 mM raztopino askorbinske kisline v HBSS. Pridobljeno raztopino
smo nato redčili s HBSS do želene končne koncentracije in potrebnega volumna.
3.1.4 Priprava raztopine troloksa
Delovno raztopino analoga vitamina E oziroma troloksa smo prav tako vedno pripravili za
vsak poskus posebej. Zaradi netopnosti troloksa v vodnih medijih, smo najprej 10 mg
čistega troloksa raztopili v 100 µL DMSO, nato dodali 900 μL HBSS in tako dobili 40 mM
raztopino troloksa v HBSS z 10 % DMSO. Pridobljeno raztopino smo redčili s HBSS do
želene končne koncentracije in potrebnega volumna. Končna vsebnost DMSO v delovni
raztopini je bila vedno manjša od 2 %.
3.1.5 Priprava HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)
Čašo volumna 2000 ml smo dopolnili s 1600 ml destilirane vode (dH2O), nato vanjo
natehtali naslednje substance:
16,0 g NaCl
0,80 g KCl
2,0 g glukoze
0,212 g Na2HPO4×12H2O
0,108 g KH2PO4
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 17
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
0,704 g NaHCO3
Po dodatku vseh navedenih substanc smo vse dobro premešali, da smo dobili čisto
raztopino. Nato smo dodali še naslednji dve substanci:
0,508 g CaCl2×2H2O
0,948 g MgCl2×6H2O
Zopet smo vse dobro premešali in čašo dopolnili z dH2O do končnega volumna 2000 ml.
Sledilo je uravnavanje pH na 7,1 in nazadnje še sterilizacija s filtrom velikosti por 0,22
m. Pripravljeno raztopino HBSS smo hranili na temperaturi 4 °C, pred vsako uporabo za
celični poskus smo jo v inkubatorju ogreli na temperaturo celic - tj. 37 °C.
3.2 Celična linija
Za eksperiment smo uporabili celično linijo TLT (humani makrofagi), ki je bila vzgojena v
laboratoriju Katedre za mikrobiologijo, biokemijo, molekularno biologijo in
biotehnologijo, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, Univerza v Mariboru. Celice
smo gojili in izvajali eksperimente v visokoglukoznem gojišču DMEMAdv (Dulbecco's
Modified Eagle Medium Advanced, Gibco, Paisley, Velika Britanija) z dodatkom
neesencialnih aminokislin (glutamin), natrijevega piruvata, fenol rdečega ter 5 % FBS
(fetalni goveji serum - Fetal Bovine Serum, Gibco, Paisley, Velika Britanija). Gojišču sta
bila v standardni količini dodana tudi antibiotika penicilin in streptomicin. Celice smo
gojili v plastičnih T-flaškah T25 (Thermofisher, Nunclon) namenjenih za gojenje celic.
Celice smo inkubirali v vlažni atmosferi pri konstantni temperaturi 37 °C in 5 % CO2.
3.2.1 Presajanje celic
Ko so celice tvorile enakomeren monosloj, smo jih pripravili na tripsinizacijo. Ves
potreben material smo predhodno ogreli na 37 oC. S celic smo najprej odstranili staro
gojišče in jih sprali z 1 ml raztopine tripsina. Nato smo jim znova dodali 2 ml raztopine
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 18
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
tripsina ter jih inkubirali približno 15 minut. Ko so se celice povsem odlepile od podlage,
smo jih s pipeto dobro premešali in dodali 8 ml svežega gojišča DMEMAdv ter celotno
suspenzijo odpipetirali v centrifugirko. Centrifugirali smo 5 min na 100 g (Centrikon,
Tehtnica, Slovenija), da so se celice posedle na dno centrifugirke. Nato smo previdno
odstranili supernatant, dodali 10 ml svežega gojišča DMEMAdv in v njem ponovno
suspendirali celice. 2 ml raztopine celic smo vrnili v flaško T25, dodali 0,5 mL FBS in 7,5
ml svežega gojišča DMEMAdv ter celice naprej inkubirali. Ko so se celice razrasle in
tvorile monosloj, smo jih nasadili na mikrotitrske plošče s 96 vodnjaki (Thermo Fischer
Scientific-Nunclon 96 Flat Bottom Black Polystyrol).
3.3 Test za merjenje antioksidativne aktivnosti na celicah
3.3.1 Nanos celic na mikrotitrske plošče
Število celic smo določili tako, da smo 20 µL suspenzije celic prenesli na hemacitometer
znamke Neubauer in pod mikroskopom v 16 -ih kvadratkih prešteli celice. Koncentracijo
celic smo izračunali po naslednji formuli:
c (celic/mL) = število preštetih celic × 10.000
Po izračunanem številu celic v 1 ml suspenzije smo odpipetirali ustrezen volumen
suspenzije celic in dodali sveže gojišče DMEMAdv z dodatkom 5 % FBS. Na ta način smo
dobili celično suspenzijo v koncentraciji 5 × 104 celic/ml. V vsak vodnjak na mikrotitrski
plošči smo nanesli po 100 μl pripravljene suspenzije ter inkubirali preko noči, da so se
pritrdile.
3.3.2 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (Fluorescence quenching)
Občutljivost čitalca za merjenje fluorescence (Tecan i-control, vzbujevalna v. d.: 485 nm,
emisijska v. d.: 529 nm) smo določili z naraščajočimi koncentracijami DCF ter testnih
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 19
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
antioksidantov v HBSS. Območje koncentracij DCF je segalo od 3,9 pM do 4 μM, testnih
antioksidantov od 0,5 μM do 10 mM. Za vsak substrat smo izvedli dve ponovitvi, rezultate
pa podali kot srednjo vrednost obeh ponovitev.
3.3.3 Optimizacija gostote / števila celic na posamezen vodnjak
Za določitev optimalnega števila celic na vodnjak smo na mikrotitrsko ploščo nanesli 6
različnih koncentracij celic (določitev koncentracije celic je opisana v poglavju 3.3.1).
Začetna koncentracija je znašala 60.000 celic na vodnjak, sledilo je 5 serijskih dilucij v
razmerju 2:3, tako je zadnja koncentracija bila 4665,6 celic na vodnjak (Slika 4). Vsaka
dilucija je bila nanesena v 10 ponovitvah. Po nanosu celic na mikrotitrsko ploščo je sledila
4 urna inkubacija, da so se celice pritrdile. Nato smo s celic odlili gojišče in jih sprali z 200
μL HBSS. Sledil je nanos 20 μM DCFH-DA in 30 minutna inkubacija. Po inkubaciji smo
celice zopet sprali in s tem odstranili nevezan DCFH-DA. 5 ponovitev vsake koncentracije
celic smo tretirali s 500 μM t-BuOOH v HBSS, drugih 5 ponovitev pa s HBSS kot
kontrolo. Na večnamenskem čitalcu Tecan smo merili intenziteto fluorescence 360 min v
15 minutnih intervalih, pri čemer je vzbujevalna valovna dolžina znašala 495 nm,
emisijska pa 529 nm.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 20
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Slika 4: Eksperiment optimizacije števila celic na vodnjak na mikrotitrski plošči (sivo
obarvani vodnjaki so prazni).
3.3.4 Optimizacija inkubacijskega časa inkubacije celic s testnimi substancami
Po določitvi optimalnega števila celic na vodnjak smo določili tudi optimalen inkubacijski
čas testnih substanc (vitamina C in troloksa). Po nanosu optimalnega števila celic na
vodnjak smo celice inkubirali preko noči na 37 °C in 5 % CO2. Naslednji dan smo celice
sprali z 200 μM HBSS in nato pripravili začetni koncentraciji substratov, tj. 900 μM v
HBSS s 5 % FBS. Naredili smo redčitveno vrsto 900 μM, 300 μM, 100 μM, 33,3 μM, 11,1
μM, 3,7 μM. Vsaka redčitev je bila nanesena v treh ponovitvah. V mikrotitrski ploščici so
stolpci 2, 3 in 4 predstavljali redčitve vitamina C, stolpci 9, 10, 11 pa redčitve troloksa.
Stolpci 5, 6, 7 in 8 so bili brez testnih substanc, imenovani tudi kontrole (Slika 5). Sledila
je različno dolga inkubacija, in sicer 1 h, 2 h, 3 h ter 6 h. Po inkubaciji celic s substratom je
ponovno sledilo spiranje z 200 μM HBSS in nato nanos 20 μM DCFH-DA v HBSS v vsak
vodnjak ter 30 min inkubacija. Nato smo celice zopet sprali z 200 μM HBSS in dodali 500
μM t-BuOOH v HBSS v vse vodnjake, razen v stolpca 6 in 8, ki sta predstavljala negativno
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 21
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
kontrolo. Stolpca 5 in 7 sta predstavljala pozitivno kontrolo. Po 30 minutah smo izmerili
vrednost fluorescence (vzbujevalna v. d.: 495 nm, emisijska v. d.: 529 nm).
Slika 5: Prikaz nanosa testnih substanc na mikrotitrske plošče (PK 1, PK 2 - pozitivni
kontroli; NK 1, NK 2 – negativni kontroli; sivo obarvani vodnjaki so prazni).
Vse dobljene vrednosti fluorescence smo preračunali glede na pozitivno kontrolo po
naslednji formuli:
Relativna fluorescenca = (dejanska vrednost fluorescence*/ dejanska vrednost fluorescence
pozitivne kontrole**) × 100
*Povprečna vrednost treh ponovitev s testno substanco oziroma povprečna vrednost
dvanajstih ponovitev negativnih kontrol
**Povprečna vrednost dvanajstih ponovitev pozitivnih kontrol
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 22
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
3.3.5 Optimizacija koncentracije testnih substanc
Ko smo določili optimalen inkubacijski čas testnih substanc, smo poskušali določiti še
njihovo optimalno koncentracijo, to je tisto, pri kateri imajo substance največji
antioksidativni učinek. Pripravili smo 10 mM začetno koncentracijo vsake testne
substance. Po standardnem postopku nanosa celic in spiranja, smo naredili 5 serijskih
dilucij v razmerju 1:4. Vsaka redčitev je bila nanesena v treh ponovitvah. V mikrotitrski
ploščici so stolpci 2, 3 in 4 predstavljali redčitve vitamina C, stolpci 9, 10, 11 pa redčitve
troloksa. Stoplci 5, 6, 7 in 8 niso vsebovali testnih substanc, imenovani tudi kontrole (Slika
6). Celice s testnimi substancami smo inkubirali 2 uri, sledilo je spiranje s HBSS ter nanos
20 μM DCFH-DA. Po 30 min inkubaciji z DCFH-DA smo celice sprali in v vse vodnjake
razen v stolpcih 6 in 8 (negativna kontrola) dodali 500 μM t-BuOOH. Vodnjaki v stolpcih
5 in 7 so bili pozitivne kontrole. Po 30 minutah smo izmerili vrednost fluorescence
(vzbujevalna v. d.: 495 nm, emisijska v. d.: 529 nm).
Slika 6: Prikaz redčitev substanc na mikrotitrski plošči z začetno koncentracijo 10 mM in
redčitvami v razmerju 1:4 (PK 1, PK2 - pozitivni kontroli; NK 1, NK 2 –
negativni kontroli; sivo obarvani vodnjaki so prazni).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 23
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
3.3.6 Optimizacija vrstnega reda nanosa reagentov
Izvedli smo štiri poskuse, pri čemer smo testirali štiri različne načine nanosa testnih
substanc (začetna koncentracija je znašala 10 mM in pet redčitev v razmerju 1:4), t-
BuOOH (500 μM) in DCFH-DA (20 μM). Pri vseh štirih poskusih je bil standardni
postopek nanosa in spiranja celic enak. V prvem poskusu smo celice najprej inkubirali z
DCFH-DA, nato dodali substance in inkubirali 2 uri, v zadnji fazi pa dodali t-BuOOH v
HBSS ter po 30 min pomerili fluorescenco. V drugem poskusu smo celice najprej 30 min
inkubirali s t-BuOOH, nato dodali substance in 2 uri inkubirali. Sledil je dodatek DCFH-
DA in 30 min inkubacija, nato spiranje celic in merjenje fluorescence v HBSS po 30
minutah. Tretji poskus je vseboval postopek, ki smo ga uporabljali tudi za optimizacijo
časa in koncentracije substratov, in sicer najprej nanos substrata in inkubacija 2 uri, nato
dodatek DCFH-DA, v zadnjem koraku pa dodatek t-BuOOH v HBSS ter merjenje
fluorescence po 30 min. V četrtem poskusu smo v celicah najprej s 30 minutno inkubacijo
v t-BuOOH sprožili oksidativen stres, nato dodali DCFH-DA in šele v zadnji fazi dodali
testne substance ter takoj pričeli z merjenjem fluorescence, ki je trajala 105 minut. V tem
primeru substanc iz vodnjakov nismo odstranili. V vseh poskusih so negativne kontrole
namesto t-BuOOH vsebovale samo HBSS.
3.3.7 Obdelava rezultatov
Za določanje relativne fluorescence smo podatke iz čitalca za merjenje fluorescence
statistično obdelali. Pri tem smo uporabili programa Excel (Microsoft, verzija 2010, ZDA)
in SPSS Statistics (IBM, verzija 24, ZDA). V programu SPSS Statistics smo zaradi
nehomogenosti varianc med paralelnimi meritvami uporabili neparametrični statistični test
primerjave neodvisnih vzorcev (Kruskal-Wallisov test). Dobljene vrednosti smo pri
določeni koncentraciji testnih substanc parno primerjali samo s pozitivno kontrolo.
Statistične značilne razlike smo v post-hoc testu z Bonferronijem popravkom parno
primerjali s prilagojeno stopnjo značilnosti, ki je v našem primeru znašala p = 0,05/6 =
0,0083. Vse vrednosti, ki so bile manjše ali enake od prilagojene stopnje značilnosti
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 24
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
oziroma 0,0083, smo označili za značilno različne od pozitivne kontrole. V eksperimentu,
kjer smo določali stopnjo »zadušitve« fluorescence, je prilagojena stopnja značilnosti
zaradi večjega števila koncentracij testnih substanc bila manjša, in sicer p = 0,05/9 =
0,0055.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 25
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
4.1 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (fluorescence quenching
assessment)
»Zadušitev« fluorescence (fluorescence quenching) se nanaša na vsak proces, ki vzorcu
zniža intenziteto fluorescence. Različne molekularne interakcije lahko vodijo do t. i.
»zadušitve«. To vključuje reakcije v vzbujenem stanju, molekularne preureditve, prenos
energije, kompleksne formacije v nevzbujenem stanju ter »zadušitev« trka (collisional
quenching) (Lakowicz 2006).
Občutljivost čitalca za merjenje fluorescence oziroma stopnjo »zadušitve« fluorescence
smo določili z naraščajočimi koncentracijami DCF ter testnih substanc v HBSS. Rezultati
so pokazali, da so vrednosti fluorescence naraščale s koncentracijo DCF (Grafikon 1 in 2).
Poskus je bil izveden v dveh ponovitvah, na grafikonih so prikazane srednje vrednosti obeh
meritev. Vrednost fluorescence pri najvišji koncentraciji DCF (tj. 4 μM) je bila pri obeh
testnih substancah previsoka, da bi jo čitalec lahko izmeril, zato vrednosti na grafikonih
niso prikazane. Pri 1 μM DCF in najvišji koncentraciji obeh testnih substanc (še posebej
pri vitaminu C – Grafikon 2) je bila vrednost fluorescence v primerjavi s kontrolo precej
nižja. Pri nižjih koncentracijah DCF (od 0,0625 mM navzdol) in višjih koncentracijah
troloksa se je pokazal celo trend zvišanja fluorescence v primerjavi s kontrolo. Pri
koncentraciji vitamina C manjši od 3,3 mM, so vrednosti pri posamezni koncentraciji DCF
bile zelo podobne, kar pomeni, da v območju teh koncentracij testne substance ne pride do
motenja signala in posledično do lažnega znižanja ali zvišanja fluorescence. Rezultati
statističnega testa Kruskal Wallis so kljub temu pokazali, da vrednosti pri vseh
koncentracijah obeh testnih substanc (tudi najvišje, tj. 10 mM) niso bile značilno različne
od kontrole (brez testne substance). Glede na rezultate zaključimo, da so optimalni pogoji
za meritve pri koncentracijah testnih substanc pod 3,3 mM in odčitkih fluorimetra nad
1000 enot. Ti pogoji so predvsem pomembni v primeru vrstnega reda nanosa reagentov,
kjer pride kot zadnja dodana testna substanca in se fluorescenca meri v njeni prisotnosti.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 26
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 1: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od koncentracije
troloksa. Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.
80
800
8000
80000
Inte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce (
log
)
Koncentracija troloksa (mM)
DCF (1 µM)
DCF (0,25 µM)
DCF (0,0625 µM)
DCF (0,0156 µM)
DCF (0,0039 µM)
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 27
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 2: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od koncentracije
vitamina C. Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.
Ločeno smo naredili še graf fluorescence barvila DCF brez prisotnosti testnih substanc
(Grafikon 3). Rezultati testa so pokazali, da intenziteta fluorescence linearno narašča s
koncentracijo DCF, pri čemer je regresijski koeficient znašal 1.
10
100
1000
10000
100000
Inte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce (
log
)
Koncentracija vitamina C (mM)
DCF (1 µM)
DCF (0,25 µM)
DCF (0,0625 µM)
DCF (0,0156 µM)
DCF (0,0039 µM)
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 28
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 3: Grafični prikaz intenzitete fluorescence pri različnih koncentracijah DCF v
odsotnosti testnih substanc. Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in
napaka.
4.2 Določitev optimalnega števila celic na vodnjak
Na mikrotitrsko ploščo je bilo nanesenih 6 različnih koncentracij celic. Začetna
koncentracija je znašala 60.000 celic na vodnjak, sledilo je 5 serijskih dilucij v razmerju
2:3, tako je zadnja koncentracija bila 4665,6 celic na vodnjak. Vsaka dilucija je bila
nanesena v 10 ponovitvah. Vzporedno smo naredili poskus z različnimi koncentracijami
celic še ob prisotnosti t-BuOOH (postopek opisan v poglavju 3.3.3).
Rezultati so pokazali, da fluorescenca pri različnih koncentracijah celic brez prisotnosti
peroksida linearno narašča s časom (Grafikon 4).
R² = 1
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Inte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce
Koncentracija DCF (µM)
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 29
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 4: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na vodnjak (brez
dodatka t-BuOOH). Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.
Med točkami pri isti koncentraciji celic je narisana linearna trendna črta.
Ob prisotnosti peroksida naraščanje ni bilo več linearno s časom, ampak smo točke
najbolje povezali s polinomsko krivuljo drugega reda (Grafikon 5). Razlogov za nelinearno
naraščanje je lahko več, od časovno odvisne deaktivacije peroksida do progresivnega
naraščanja antioksidativnega odgovora v celicah. Pri enakem številu celic je bilo ob
prisotnosti peroksida naraščanje fluorescence veliko hitrejše kot ob njegovi odsotnosti. To
je bilo pričakovano, saj naj bi peroksid sprožil nastanek prostih radikalov v celici.
R² = 0,9996
R² = 1
R² = 0,9998
R² = 0,9998
R² = 0,9988R² = 0,9989
10
210
410
610
810
1010
1210
1410
1610
0 50 100 150 200 250 300 350
Inte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce
Čas (min)
60000
celic/vodnjak
36000
celic/vodnjak
21600
celic/vodnjak
12960
celic/vodnjak
7776
celic/vodnjak
4665,6
celic/vodnjak
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 30
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 5: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na vodnjak (z
dodatkom t-BuOOH). Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.
Med točkami pri isti koncentraciji celic je narisana polinomska trendna črta 2.
reda.
Določili smo, da se pri nadaljnjih eksperimentih lahko uporablja širok interval
koncentracije celic, saj so vse vrednosti izmerjene fluorescence še vedno bile v območju
detekcije instrumenta. Zaradi nelinearnosti krivulj fluorescence ob prisotnosti peroksida,
smo se odločili uporabljati kot reprezentativne le meritve pri krajših časih (30 min) od
dodatka peroksida.
4.3 Določitev optimalnega inkubacijskega časa testnih substanc
Za določitev optimalnega inkubacijskega časa testnih substanc smo izvedli 4 eksperimente
po standardnem protokolu, ki je opisan v poglavju 3.6. Eksperimenti so se med seboj
razlikovali le glede na inkubacijski čas celic s testnimi substancami. Vse dobljene
vrednosti fluorescence smo preračunali glede na pozitivno kontrolo.
R² = 0,9989
R² = 0,9941
R² = 0,9998
R² = 0,9995
R² = 0,9996R² = 0,9997
10
100
1000
10000
0 30 135 345
Inte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce (
log
)
čas (min)
60000
celic/vodnj
ak
36000
celic/vodnj
ak
21600
celic/vodnj
ak
12960
celic/vodnj
ak
7776
celic/vodnj
ak
4665,6
celic/vodnj
ak
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 31
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Rezultati se med seboj razlikujejo glede na dodano testno substanco oziroma antioksidant.
Po enourni inkubaciji celic z vitaminom C pri nobeni koncentraciji ni prišlo do znižanja
fluorescence, pač pa celo do nekaj odstotnega zvišanja le-te. Medtem ko so se vrednosti po
eni uri inkubacije s troloksom pri vseh koncentracijah znižale, pri čemer je do največjega
znižanja (za 66,14 % glede na pozitivno kontrolo) prišlo pri najvišji koncentraciji troloksa
t. j. 900 M (Grafikon 6, Preglednica 1).
Grafikon 6: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %) po 1 uri
inkubacije testnih substanc s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna
deviacija (PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so
značilno različne od pozitivne kontrole.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
a i
nte
zite
ta f
luo
resc
en
ce
(%)
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 32
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 1: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 1 h inkubacije.
Koncentracija testne substance
(µM)
P-vrednost*
vitamin C troloks
900
Ni statistično pomembnih razlik
0,000*
300 0,002*
100 0,108
33,3 0,268
11,1 0,085
3,7 0,108
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
Tudi po 2 urah inkubacije so se vrednosti fluorescence pri vseh koncentracijah troloksa
znižale, pri najvišji koncentraciji 900 M za 66,39 % glede na pozitivno kontrolo in celo
več kot je bila vrednost negativne kontrole. Pri vitaminu C je do znižanja fluorescence
glede na pozitivno kontrolo prišlo le pri najvišji koncentraciji, in sicer za 19,06 %, glede na
pozitivno kontrolo (Grafikon 7).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 33
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 7: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %) po 2 urah
inkubacije substratov s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija
(PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno
različne od pozitivne kontrole.
Preglednica 2: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 2 h inkubacije.
Koncentracija testne substance
(µM)
P-vrednost*
Vitamin C troloks
900
Ni statistično pomembnih razlik
0,000*
300 0,002*
100 0,108
33,3 0,268
11,1 0,085
3,7 0,108
(*P vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
a i
nte
zite
ta f
luo
resc
en
ce
(%)
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 34
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Po 3 urah inkubacije celic z vitaminom C prav tako nobena koncentracija ni privedla do
znižanja fluorescence, kvečjemu do zvišanja. Medtem so vrednosti pri treh najvišjih
koncentracijah troloksa (900, 300 in 100 μM) ostale nižje, pri ostalih koncentracijah pa
približno enake ali celo višje od pozitivne kontrole (Grafikon 8).
Grafikon 8: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %) po 3 urah
inkubacije substratov s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna
deviacija (PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so
značilno različne od pozitivne kontrole.
0
50
100
150
200
250
300
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
a i
nte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce
(%)
*
*
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 35
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 3: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 3 h inkubacije.
Koncentracija testne substance (µM) P-vrednost*
Vitamin C troloks
900 0,022 0,003*
300 0,016 0,024
100 0,005* 0,049
33,3 0,006* 0,977
11,1 0,005* 0,977
3,7 0,907 0,463
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
Pri dveh najvišjih koncentracijah (900 in 300 μM) obeh testnih substanc, so se vrednosti
relativne fluorescence glede na pozitivno kontrolo po 6 urah inkubacije, znižale. Največje
znižanje fluorescence glede na pozitivno kontrolo (za 62,63 %) je povzročila najvišja
koncentracija troloksa, sledila je najvišja koncentracija vitamina C (za 37,09 %) (Grafikon
9). Ker je pri vitaminu C prišlo do prvega znižanja fluorescence šele po 6 urah inkubacije,
sklepamo, da ta testna substanca v primerjavi s troloksom za antioksidativen učinek
potrebuje dlje časa.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 36
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 9: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %) po 6 urah
inkubacije substratov s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna
deviacija (PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so
značilno različne od pozitivne kontrole.
0
20
40
60
80
100
120
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM
90
0 μ
M
30
0 μ
M
10
0 μ
M
33
,3 μ
M
11
,1 μ
M
3,7
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
ain
ten
zite
tafl
uo
resc
en
ca
(%)
*
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 37
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 4: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami v različnih koncentracijah po 6 h inkubacije.
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
Optimalen čas inkubacije smo določili za vsako testno substanco posebej. Učinki (znižanje
fluorescence) pri vseh koncentracijah vitamina C so se pokazali šele po 6 urah inkubacije,
zato je optimalen čas inkubacije minimalno 6 ur. Medtem se je antioksidativna aktivnost
troloksa pokazala že po eni uri inkubacije. Podoben odstotek znižanja fluorescence je bil
tudi še po 2 urah inkubacije, nato se je učinek s časom zmanjševal. Optimalen inkubacijski
čas troloksa je od 1 do 2 ur. Takšno razliko med optimalnim inkubacijskim časom obeh
testnih substanc lahko pripišemo njuni hidrofilni oziroma lipofilni naravi. Lipidotopni
troloks, za svoj učinek potrebuje manj časa kot vodotopni vitamin C, saj do njegovih
antioksidativnih lastnosti po vsej verjetnosti pride že v membrani celice (lipofilni dvosloj),
medtem ko vitamin C za vstop v notranjost celice preko membrane in svoje delovanje
potrebuje nekaj ur več.
Koncentracija testne substance
(µM)
P-vrednost*
Vitamin C troloks
900 0,000* 0,003*
300 0,002* 0,015
100 0,010 0,066
33,3 0,670 0,528
11,1 0,202 0,758
3,7 0,038 0,587
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 38
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
4.4 Določitev optimalne koncentracije testnih substanc
Za določitev optimalne koncentracije vitamina C in troloksa, kjer bi dobili največji
antioksidativni učinek, smo izvedli eksperiment z uporabo še višje začetne koncentracije
testnih substanc do 10 mM (Grafikon 10, Preglednica 5). Pri tem smo uporabili postopek,
opisan v poglavju 3.7. Dobljene vrednosti eksperimenta smo prav tako preračunali glede na
pozitivno kontrolo, tako da smo dobili relativne vrednosti fluorescence. Rezultati so
pokazali, da so vrednosti relativne fluorescence pri višji začetni koncentraciji (10 mM) pri
obeh testnih substancah še nižje. Vendar glede na rezultate poskusa, kjer smo določevali
stopnjo »zadušitve« fluorescence, obstaja možnost, da je vrednost fluorescence pri poskusu
z začetno koncentracijo testnih substanc 10 mM lažno nizka, če imamo prisotne testne
substance med merjenjem (glej poglavje (4.1). Kjer testne substance pred meritvijo
odstranimo, pričakujemo nizke znotrajcelične koncentracije obeh substanc, ki posledično
ne bi mogle vplivati značilno na dušenje fluorescence. Kljub temu je potrebno poudariti, da
so koncentracije višje od 1 mM že zelo visoke, zato je vprašljiva tudi njihova biološka
pomembnost.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 39
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 10: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %). Na
stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK – pozitivna kontrola, NK –
negativna kontrola). *Vrednosti so značilno različne od pozitivne kontrole.
0
20
40
60
80
100
120
140
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
ain
tezi
teta
flu
ore
scen
ce
(%)
*
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 40
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 5: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami z začetno koncentracijo 10 mM.
Koncentracija testne substance
(mM)
P-vrednost*
vitamin C troloks
10 0,014 0,000*
2500 0,040 0,001*
625 0,577 0,004*
156,25 0,120 0,019
39,1 0,142 0,113
9,8 0,557 0,159
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
4.5 Določitev optimalnega zaporedja nanosa reagentov
Testirali smo štiri različna zaporedja nanosa testnih substanc (začetna koncentracija 10
mM in pet redčitev v razmerju 1:4), t-BuOOH (500 μM) in DCFH-DA (20 μM). Iz
medsebojne primerjave grafikonov 11, 12, 13 in 14 je razvidno, da se ti med seboj precej
razlikujejo, kar je dokaz, da je zaporedje nanosa reagentov pomemben dejavnik pri
določanju antioksidativne aktivnosti spojin ali ekstraktov.
Pri eksperimentu, kjer je bil k celicam najprej dodan t-BuOOH, nato testna substanca ter na
koncu DCFH-DA, je pri vseh koncentracijah prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s
pozitivno kontrolo, kar je dokaz antioksidativne aktivnosti oziroma »lovljenja« radikalov v
celicah (Garafikon 11). Poleg tega se je v tem primeru poleg troloksa pokazal
antioksidativni potencial tudi pri vitaminu C, ki je znižal vrednosti celo pod vrednost
negativne kontrole. To zaporedje nanosa reagentov se je pokazalo kot eno
najučinkovitejših.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 41
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 11: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %), pri
čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-BuOOH, testna
substanca, DCFH-DA. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK –
pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno
različne od pozitivne kontrole.
0
20
40
60
80
100
1201
0 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
ain
ten
zite
tafl
uo
resc
en
ce
(%)
* *
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 42
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 6: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: t-BuOOH, testna substanca, DCFH-DA.
Koncentracija testne substance
(mM)
P-vrednost*
vitamin C troloks
10 0,000* 0,060
2500 0,001* 0,030
625 0,097 0,411
156,25 0,092 0,089
39,1 0,123 0,030
9,8 0,023 0,060
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
V poskusu, kjer je bilo zaporedje nanosa reagentov sledeče: t-BuOOH, DCFH-DA, testna
substanca (Grafikon 12), je do večjega znižanja fluorescence prišlo le pri najvišji
koncentraciji antioksidantov. Ker je v tem primeru merjenje fluorescence potekalo v
prisotnosti testne substance, je pri višjih koncentracijah prišel do izraza tudi učinek dušenja
fluorescence. Kljub temu smo dobili rezultate, iz katerih bi sklepali na vprašljivo
antioksidativno učinkovitost testnih substanc v celicah. Zaradi težko razložljivih rezultatov
smo to zaporedje označili kot najmanj primerno.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 43
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 12: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %), pri
čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-BuOOH, DCFH-DA,
testna substanca. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK –
pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno
različne od pozitivne kontrole.
0
50
100
150
200
250
300
350
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
a in
tezi
teta
flu
ore
scen
ce
(%)
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 44
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 7: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: t-BuOOH, DCFH-DA, testna substanca.
Koncentracija testne substance
(10 mM)
P-vrednost*
vitamin C troloks
10 0,059 0,072
2500 0,572 0,003*
625 0,367 0,015
156,25 0,004* 0,066
39,1 0,041 0,433
9,8 0,122 0,676
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
Kadar je bil antioksidant celicam dodan na začetku, nato DCFH-DA ter šele na koncu t-
BuOOH (Grafikon 13), se je kot učinkovit antioksidant izkazal troloks, vitamin C pa le pri
najvišjih koncentracijah. Kljub temu je bila ta kombinacija manj učinkovita, kot t-BuOOH-
testna substanca-DCFH-DA. Razlika med kombinacijama je predvsem v času od sprožitve
oksidativnega stresa do meritve prostih radikalov. V primeru dodatka oksidanta na začetku
ima celica več časa za sprožitev lastnih antioksidativnih mehanizmov in videti je, da tako
troloks kot tudi vitamin C pri tem učinkovito pomagata. Po drugi strani pa dodatek
peroksida na koncu in takojšnje meritve nastale fluorescence, bolj odražajo učinkovitost
testnih substanc, da vstopijo v celico in takoj učinkujejo kot lovilci prostih radikalov že
sami po sebi.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 45
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 13: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %), pri
čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: testna substanca, DCFH-
DA, t-BuOOH. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK – pozitivna
kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno različne od
pozitivne kontrole.
0
20
40
60
80
100
120
140
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
a i
nte
nzi
teta
flu
ore
scen
ce
(%)
*
*
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 46
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 8: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: testna substanca, DCFH-DA, t-BuOOH.
Koncentracija testne substance
(10 mM)
P-vrednost*
vitamin C troloks
10 0,014 0,000*
2500 0,040 0,001*
625 0,577 0,004*
156,25 0,120 0,019
39,1 0,142 0,113
9,8 0,557 0,159
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
Pri eksperimentu, kjer je bil DCFH-DA dodan celicam pred antioksidantom ter šele na
koncu t-BuOOH (Grafikon 14), so bile relativne vrednosti fluorescence blizu ali celo višje
kot vrednosti pozitivne kontrole. Prav tako je bila majhna razlika med pozitivno in
negativno kontrolo. Ena izmed teorij za razlago takšnih rezultatov je ta, da se med daljšo
inkubacijo DCFH-DA iz celic izgubi/metabolizira ali pa postane nestabilen.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 47
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Grafikon 14: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %), pri
čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: DCFH-DA, testna
substanca, t-BuOOH (PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). Na
stolpcih je prikazana standardna deviacija. *Vrednosti so značilno različne od
pozitivne kontrole.
0
50
100
150
200
250
300
350
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM
10 m
M
25
00
μM
62
5 μ
M
15
6,2
5 μ
M
39
,1 μ
M
9,8
μM PK
NK
vitamin C troloks
Rel
ati
vn
a i
nte
zite
ta f
luo
resc
en
ce
(%)
*
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 48
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Preglednica 9: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in
testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem
zaporedju: DCFH-DA, testna substanca, t-BuOOH.
Koncentracija testne substance
(10 mM)
P vrednost*
vitamin C troloks
10 0,057 0,021
2500 0,457 0,021
625 0,007* 0,423
156,25 0,707 0,061
39,1 0,457 0,079
9,8 0,260 0,947
(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično
pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim
popravkom).
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 49
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
5 SKLEPI
Na modelni makrofagni človeški celični liniji TLT smo poskušali optimizirati celično
metodo z uporabo barvila DCFH-DA (2´, 7´-diklorofluorescin-diacetat) za določevanje
pro- in antioksidativne aktivnosti različnih spojin. Ugotavljali smo najprimernejše število
celic na vodnjak, optimalen inkubacijski čas in koncentracijo testnih substanc (kot model
smo uporabili antioksidanta vitamin C in troloks) ter najprimernejši vrstni red nanosa
reagentov.
Ugotovili smo, da je vrednost fluorescence v testu z DCFH-DA linearno odvisna od števila
celic na vodnjak, vendar je linearna povezava bistveno večja, če celicam ne dodamo t-
BuOOH kot, če jim ta oksidant dodamo; ob prisotnosti le-tega je bilo naraščanje bolj
podobno polinomski krivulji 2. reda. Hipotezo 1 lahko torej potrdimo le delno. Določili
smo tudi, da se pri eksperimentih lahko uporablja širok interval koncentracije celic, saj so
vse vrednosti izmerjene fluorescence še vedno bile v območju detekcije instrumenta.
Tudi drugo hipotezo lahko potrdimo le delno, saj previsoka koncentracija vitamina C (v
našem primeru je to bilo 10 mM) sproži učinek »zadušitve« fluorescence in s tem vpliva na
lažno nizke izmerjene vrednosti fluorescence. Vendar to velja samo za poskuse, kjer je
antioksidant prisoten med samo meritvijo. Hkrati to ne velja za troloks, kjer je stopnja
»zadušitve« fluorescence pri najvišji koncentraciji precej nižja, predvsem pa bolj odvisna
od koncentracije DCF.
Pri optimizaciji inkubacijskega časa testnih substanc smo opazili, da se rezultati med seboj
razlikujejo glede na dodan antioksidant. Za troloks velja, da se največji antioksidativen
učinek pokaže že po 1 - 2 uri inkubacije s celicami, nato se s časom ta učinek postopoma
zmanjšuje. Medtem ko se pri vitaminu C antioksidativna aktivnost pojavi šele po 6 urah
inkubacije s celicami, krajše inkubacije tega učinka niso pokazale. Tretjo hipotezo lahko
torej potrdimo za obe testni substanci. Te ugotovitve so bile osnovane na zaporedju nanosa
testna substanca - DCFH-DA – t-BuOOH.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 50
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Opazili smo, da je za meritve fluorescence vrstni red nanosa reagentov pomemben, zato
lahko četrto hipotezo v celoti potrdimo. Kombinaciji t-BuOOH - DCFH-DA - testna
substanca ter testna substanca - DCFH-DA - t-BuOOH sta neprimerni, saj pri prvi
kombinaciji pri višjih koncentracijah testnih substanc pride do »zadušitve« fluorescence,
medtem ko je pri drugi kombinaciji verjetno problem v izgubi DCFH-DA iz celic med
daljšo inkubacijo. Kot primerni sta se izkazali kombinaciji testna substanca - DCFH-DA -
t-BuOOH in t-BuOOH- testna substanca - DCFH-DA, pri čemer je slednja učinkovitejša,
saj je v primerjavi s pozitivno kontrolo do znižanja fluorescence prišlo prav pri vseh
koncentracijah testnih substanc.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 51
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
6 VIRI
Abram V. 2000. Antioksidativno delovanje flavonoidov. V: Antioksidanti v živilstvu. 20.
Bitenčevi živilski dnevi, 26. in 27. oktober 2000, Portorož. Žlender B, Gašperlin L (ur.).
Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 23-32.
Barros AIRNA, Nunes FM, Gonçalves B, Bennett RN, Paula A. 2011. Effect of cooking
on total vitamin C contents and antioxidant activity of sweet chestnuts ( Castanea sativa
Mill.). Food Chem., 128: 165–172.
Bergendi L, Benes L, Durackova Z, Ferencik M. 1999. Chemistry, physiology and
pathology of free radicals. Life Sci., 65: 1865–1874.
Burton GW and Traber MG. 1990. Vitamin E: Antioxidant activity, biokinetics, and
bioavailability. Annu. Rev. Nutr., 10: 357–382.
Cadenas S, Barja G, Poulsen HE, Loft S. 1997. Oxidative DNA damage estimated by
oxo8dG in the liver of guinea-pigs supplemented with graded dietary doses of ascorbic
acid and α-tocopherol. Carcinogenesis, 18: 2373–2377.
Carocho M and Ferreira ICFR. 2013. A review on antioxidants, prooxidants and related
controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and
future perspectives. Food Chem. Toxicol., 51: 15–25.
Carr A and Frei B. 1999. Does Vitamin C act as a pro-oxidant under physiological
conditions? FASEB J., 13:1007–24.
Cornelli U. 2009. Antioxidant use in nutraceuticals. Clin. Dermatol., 27: 175-194.
Dikalov SI and Harrison D. 2014. Methods for detection of mitochondrial and cellular
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 52
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
reactive oxygen species. Antioxid. Redox Sign., 20: 372-82.
Fiala ES, Sodum RS, Bhattacharya M, Li H. 1996. Epigallocatechin gallate, a polyphenolic
tea antioxidant, inhibits peroxynitrite-mediated formation of 8-oxodeoxy- guanosine and 3-
nitrotyrosine. Experientia, 52: 922–926.
Fischer-Nielsen A, Loft S and Jensen KG, 1993. Effect of ascorbate and 5-aminosalicylic
acid on light-induced 8-hy- droxydeoxyguanosine formation in V79 Chinese hamster cells.
Carcinogenesis, 14: 2431–2433.
Frankel EN and Meyer AS. 2000. The problems of using one- dimensional methods to
evaluate multifunctional food and biological antioxidants. J. Sci. Food Agric., 80: 1925–
1941.
Girard-Lalancette K, Pichette A, Legault J. 2009. Sensitive cell-based assay using DCFH
oxidation for the determination of pro- and antioxidant properties of compounds and
mixtures: Analysis of fruit and vegetable juices. Food Chem., 115: 720–726.
Glade MJ. 2003. The role of reactive oxygen species in Health and Disease Northeast
Regional Environmental Public Health Center University of Massachusetts. Amerst
Nutrition, 19: 401–3.
Goya Luis M, Martín A, Ramos S, Mateos R. 2009. A cell culture model for the
assessment of the chemopreventive potential of dietary compounds. Curr. Nutr. Food Sci.,
5: 56–64.
Gülçin I. 2012. Antioxidant activity of food constituents: An overview. Arch. Toxicol., 86:
345–391.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 53
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Hall NK, Chapman TM, Kim HJ, Min DB. 2010. Antioxidant mechanisms of Trolox and
ascorbic acid on the oxidation of riboflavin in milk under light. Food Chem., 118: 534–
539.
Halliwell B. 1996. Oxidative stress, nutrition and health: Experimental strategies for
optimization of nutritional antioxidant intake in humans. Free Radical Res, 25: 57–74.
Halpner AD, Handelman GJ, Belmont CA, Harris JM, Blumberg JB. 1998. Protection by
vitamin C of oxidant-induced loss of vitamin E in rat hepatocytes. J. Nutr. Biochem., 9:
355–359.
Huang D, Ou B, Prior R. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agri.
Food Chem., 53: 1841–1856.
Kalyanaraman B, Darley-Usmar V, Davies KJA, Dennery PA, Forman HJ, Grisham MB,
Ischiropoulos H. 2012. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent
probes: Challenges and limitations. Free Radical Bio. Med., 52: 1–6.
Korošec L. 2000. Prosti radikali in vloga antioksidantov v bioloških sistemih.V:
Antioksidanti v živilstvu. 20. Bitenčevi živilski dnevi, 26. in 27. oktober 2000, Portorož.
Lakowicz Joseph R. 2006. Quenching of Fluorescence. V: Principles of Fluorescence, 3rd
edition. Center for Fluorescence Spectroscopy, University of Maryland School of Medicine
(ed.), Springer United States: 277–330.
LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. 1992. Evaluation of the probe 2',7'-
dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative
stress. Chem. Res. Toxicol., 5: 227–231.
Liu RH and Finley J. 2005. Potential cell culture models for antioxidant research. J. Agri.
Food Chem., 53: 4311–4314.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 54
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Lucas-Abellan C, Mercader-Ros MT, Zafrilla MP, Gabaldon JA, Nunez-Delicado E. 2010.
Comparative study of different methods to measure antioxidant activity of resveratrol in
the presence of cyclodextrins. Food Chem. Toxicol., 49: 1225-1260.
Mates JM and Sanchez-Jimenez F. 1999. Antioxidant enzymes and their implications in
pathophysiologic processes. Front. Biosci., 4: 339–345.
Nazirog M and Butterworth PJ. 2005. Protective effects of moderate exercise with dietary
vitamin C and E on blood antioxidative defense mechanism in rats with streptozotocin-
induced diabetes. Can. J. Appl. Physiol., 30: 172–185.
Niki E. 2010. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free Radical Bio.
Med., 49: 503–515.
Norooz M, Angerson WJ, Lean MEJ. 1998. Effects of flavonoids and vitamin C on
oxidative DNA damage to human lymphocytes. Am. J. Clin. Nutr., 67: 1210–1218.
Pflaum M, Kielbassa C, Garmyn M, Epe B. 1998. Oxidative DNA damage induced by
visible light in mammalian cells: extent, inhibition by antioxidants and genotoxic effects.
Mutat. Res., 408: 137–146.
Pietta P. 2000. Flavonoids as antioxidants. J. Nat. Prod., 63: 1035–1042.
Piga R, Saito Y, Yoshida Y, Niki E. 2007. Cytotoxic effects of various stressors on PC12
cells : Involvement of oxidative stress and effect of antioxidants. Neurotoxicology, 28: 67–
75.
Pisoschi AM, Negulescu GP. 2011. Methods for total antioxidant activity determination: A
review. Biochem. Anal. Biochem., 1:106-114.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 55
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Poli G, Leonarduzzi G, Biasi F, Chiarpotto E. 2004. Oxidative stress and cell signaling.
Curr. Med. Chem., 11:1163–82.
Pisoschi AM, Pop A. 2015. The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: A
review. Eur. J. Med. Chem., 97: 55–74.
Priyadarsini KI, Kapoor S, Naik DB. 2001. One- and two-electron oxidation reactions of
Trolox by peroxynitrite. Chem. Res. Toxicol., 14: 567–571.
Rahman K. 2003. Garlic and aging: new insights into an old remedy. Aging Res. Rev., 2:
39–56.
Rahman K. 2007. Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors. Clin. Interv. Aging,
2: 219–236.
Raspor P, Kovač B, Batič M, Berglez D. 2000. Bioprocesi pridobivanja antioksidantov. V:
Antioksidanti v živilstvu. 20. Bitenčevi živilski dnevi. 26. in 27. oktober 2000, Portorož.
Žlender B, Gašperlin L (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 11-15.
Ratnam DV, Ankola DD, Bhardwaj V, Sahana DK, Kumar MNVR. 2006. Role of
antioxidants in prophylaxis and therapy : A pharmaceutical perspective. J. Control.
Release, 113: 189–207.
Reddy VN, Giblin FJ, Lin LR, Chakrapani B. 1998. The effect of aqueous humor ascorbate
on ultraviolet-B-induced DNA damage in lens epithelium. Invest. Ophth. Vis. Sci., 39:
344–350.
Sies H. 1997. Oxidative stress: Oxidants and antioxidants. Exp. Physiol., 82: 291–295.
Stohs SJ. 1995. The role of free radicals in toxicity and disease. J. Basic Clin. Physiol.
Pharmacol., 6: 205–228.
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 56
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Wan H, Liu D, Yu X, Sun H, Li Y. 2015. A Caco-2 cell-based quantitative antioxidant
activity assay for antioxidants. Food Chem., 175: 601–608.
Wang H and Joseph JA. 1999. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein
assay using microplate reader. Free Radical Bio. Med., 27: 612–616.
Wattamwar P, Mo Y, Wan R, Palli R, Zhang Q, Dziubla DT. 2010. Antioxidant activity of
degradable polymer poly (trolox ester) to suppress oxidative stress injury in the cells. Adv.
Funct. Mater., 20: 147–154.
Wei H, Cai Q, Tian L, Lebwohl M. 1998. Tamoxifen reduces endogenous and UV light-
induced oxidative damage to DNA, lipid, and protein in vitro and in vivo. Carcinogenesis,
19: 1013–1018.
Weingerl V, Štrlič M, Kočar D. 2010. Evaluation of the chemiluminometric method for
determination of polyphenols in wine. Anal. Lett., 44: 1310–1322.
Wright JS, Johnson ER, Di Labio GA. 2001. Predicting the activity of phenolic
antioxidants: theoretical method, analysis of substituent effects, and application to major
families of antioxidants. J. Am. Chem. Soc., 123: 1173–1183.
Yettella RR and Min DB. 2010. Effects of Trolox and ascorbic acid on the riboflavin
photosensitised oxidation of aromatic amino acids. Food Chem., 118: 35–41.
ZAHVALA
Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 57
Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016
Za vso pomoč, nasvete in potrpežljivost se zahvaljujem svojemu mentorju izr. prof. dr.
Tomažu Langerholcu ter asistentki mag. Maši Primec.
Zahvala gre tudi vodstvu Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede, ki je omogočila
nakup naprave ter ostalih pripomočkov, potrebnih za izvajanje eksperimentov.
Za vso razumevanje, in predvsem hitro odzivanje na moje prošnje, bi se želela zahvaliti
tudi vodstvu referata za študijske zadeve Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede, ter
članoma svoje študijske komisije, izr. prof. dr. Metki Šiško in mag. Maksimilijanu Brusu.
Posebej bi se rada zahvalila tudi svoji družini in prijateljem, ki so mi ob študijem stali ob
strani in me podpirali, ter vsem ki so mi kakorkoli pomagali pri oblikovanju dokončne
oblike magistrskega dela.