ORGANOGENESE EM HUMANOS

O período principal da organogênese em humanos acontece entre a semana 3 e 8 do desenvolvimento, e pelo tanto é o período de maior sensitividade à teratógenos.

ORGANOGENESE EM HUMANOS: desenvolvimento de membros

Nessa aula vamos estudar o desenvolvimento dos membros…

Padrão do membro anterior

Eixos do membro anterior (asa) de galinha

Origem dos tecidos de membros em vertebrados: a mesoderme

Desenvolvimento de membros de vertebrados

http://www.youtube.com/watch?v=VpbdqGJ9LWk

A dermis:

Desenvolvimento dos dermatomas:

Nervos sensoriais da dermis (dermatomas):

Origem dos tecidos de membros em vertebrados: a mesoderme

Formação do broto de membro

Proliferação de c. mesenquimais da região somática da mesoderme do miotoma hipaxial (músculo) e da placa lateral (esqueleto) geram uma protuberância para formar o broto de membro.

Células myf5 migratórias em roxo (músculo em desenvolvimento):

Formação do broto de membro

O broto de membro (visão estéreo): Para ver a imagem estéreo acima, cruze os olhos ligeiramente até que um terceiro ponto branco apareça entre os dois. A nova imagem central deve ser observada em 3D.

Região prospectiva do campo do membro anterior na salamandra Ambystoma maculatum: região central (roxo) está destinada em formar o membro, as regiões circundantes formam o tecido do flanco peribrachial (rosa) e cintura escapular (verde), e o anel externo (cinza) é competente nos estágios embrionários para formar tecidos de membro das regiões interiores quando são extirpados.

A natureza regulativa do campo de membroA natureza regulativa do campo de membro

?Malformações representativas em Hyla regilla e outras espécies de sapos foram achadas em várias populações de América do Norte. Tomando em conta a natureza regulativa do campo de membro (slide anterior), quais seriam possíveis explicações da geração de multiplos membros nessas espécies?

A natureza regulativa do campo de membro

Understanding limb development: a legacy of John W. Saunders

Como tributo ao trabalho de Saunders, na próxima aula vamos acompanhar as explicações das descobertas de John Saunders, explicadas por ele mesmo (Vade Mecum 3, Dev. Biology Gilbert)

Expressão de Fgf10 e ação sobre o desenvolvimento dos membros em galinha

Expressão e ação do FGF10 no desenvolvimento do membro de galinha. (A) FGF10 se expressa na mesoderme da placa lateral precisamente nas posições onde os membros normalmente se formam. (B) Quando células geneticamente construídas para secretar FGF10 são colocadas nos flancos do broto de membro em embriões de galinha, o FGF10 pode causar a formação de um membro ectópico (seta).

Modelo molecular da iniciação do desenvolvimento do broto de membro de galinha

Embrião de 48 horas de incubação:

Antes da iniciação do broto de membro, Fgf-8 (roxo) é expresso na MI adjacente à área presuntiva do membro anterior. Fgf-10 (em amarelho) é expresso na MPL, e se co-localiza com Wnt-8c (em vermelho) na porção caudal. Wnt-8c estabiliza Fgf-10 nesta região.

Mesoderme da placa lateral (MPL)

Mesoderme intermediária (MI)

Mesoderme somítica (MS)

Modelo molecular da iniciação do desenvolvimento do broto de membro de galinhaEmbrião de 50 horas de incubação:

Ectoderme da superficie (ES)

Mesoderme da placa lateral

Mesoderme intermediária (MI)

Durante a indução do membro, tanto Fgf-8 (roxo) e Wnt-2b (em vermelho) são expressos na MI. Wnt-2b também é expresso na MPL na região presuntiva do membro anterior. WNT-2B sinaliza por meio de β-catenina para induzir e / ou manter Fgf-10 estável nessa região. Fgf-10 ainda se expressa na região caudal da MPL, e começa a ser observada uma lacuna ausente de expressão de Fgf-10 entre o broto prospectivo do membro anterior e posterior.

Embrião de 54 horas de incubação:

Modelo molecular da iniciação do desenvolvimento do broto de membro de galinha

A expressão de Wnt-2b e Fgf-10 está confinada a região presuntiva do broto anterior na MPL. Na região posterior do embrião, a expressão de Fgf-10 é confinada à região presuntiva do broto posterior. Na MPL das áreas presuntivas dos membros, o FGF-10 sinaliza para a ES para induzir Wnt-3a (azul), resultando na ativação de Fgf-8 (roxo). Fgf-8 se expressa na MI na região dos brotos de membro (anterior e posterior).

Crista ectodérmica apical (CEA)

CEA

Mesoderme intermediária (MI)

Ectoderme da superficie (ES)

Identidade do membro anterior e posterior:

O broto anterior e especificado pelo Tbx5.

O broto posterior e especificado pelo Tbx4.

A expressão de Tbx5 e Tbx4 são provavelmente regulados direta ou indiretamente pelo gradiente de ácido retinóico ou expressão regional de genes Hox.

Identidade do membro anterior e posterior:

Quando uma conta de Fgf é aplicado ao flanco entre o broto anterior e posterior, isso induz um broto ectópico. O membro que se desenvolve exibe o padrão anterior na margem anterior e o padrão posterior na margem posterior do membro.

Identidade do broto de membro: regulação de Hoxb8 por miR-196

Embrião de galinha (st. 16) Membro anterior da galinha (st. 22)

miR-196 Hoxb8 directed cleavage

Sequencias 3’UTR em bibliotecas génicas de broto anterior e posterior:

3’UTR: miR-196 directed cleavage

Hoxb8 Hoxb8Hoxb8 Hoxb8

Hoxb8 se expressa no broto anterior. O microRNA miR-196 atua por clivagem dirigida ao mRNA de hoxb8 e reduz a expressão de Hoxb8 no broto posterior.

other mRNAs (distinct from Hoxb8)

Hoxb8 truncated on other sites

Hornstein et al. 2005

RA

membro anterior

shh

membro anterior

extremidad posterior

Hornstein et al. 2005

shh

Identidade do broto de membro: regulação de Hoxb8 por miR-196Modelo de regulação: No broto anterior, o RA induz a expressão Hoxb8 que a su vez induz a expressão de Shh, ativando os genes de especificação do membro anterior.

(Shh)

(RA)

RA

membro anterior

shh

membro anterior

membro posterior

Hornstein et al. 2005

shh

Identidade do broto de membro: regulação de Hoxb8 por miR-196

(Shh)

(RA) (RA)

Modelo de regulação: No broto posterior, o miR-196 reprime a expressão Hoxb8 desativando os genes de especificação do membro anterior.

Broto cedo do membro anterior da galinha com a cresta ectodérmica apical (CEA)

Interações entre a CEA e o mesênquima subjacente no broto de membro de galinha

Fgf8

Interações entre a CEA e o mesmenquima subyacente no broto de membro são necessárias para induzir o desenvolvimento e identidade do membro.

Fgf8 é expresso na CEA e Fgf10 no mesénquima subyacente

Fgf10Fgf8

FGF8 da CEA sinaliza às células mesodérmicas do membro para continuar a proliferação de células do broto, e pela secreção de FGF10 na mesoderme do broto, a CEA mantem sua funcão de manter o estado mitóticamente ativo durante o crescimento distal do membro.

Dois modelos de especificação proximo-distal da mesoderma durante o desenvolvimento do membro

Entenda cada modelo e pense quais experimentos você faria para testar cada um dos modelos?

A CEA é necessária para o desenvolvimento do membro

[Nota para o professor: AER Vade mecum]

AER mantém a proliferação no mesênquima, a remoção sequencial de AER mostra progressivamente o desenvolvimento interrompido em vários estágios.

Control:

Após remoção da CEA em em vários estágios do desenvolvimento do membro:

(De Iten 1982; fotografias cortesia de L. Iten.)

Controle da especificação proximo-distal pela zona de progreso do mesénquima do broto

(A) Estruturas supranumerárias na região distal da asa após o transplante de uma zona de progresso de broto inicial para o broto tardio (que já havia formado ulna e rádio).

(B) Ausência de estruturas intermediárias observada quando uma zona de progresso de broto tardio foi transplantada para um broto de membro inicial. As dobradiças indicam a localização dos enxertos.

Anatomia da asa:

(Extraído de Summerbell e Lewis 1975; fotografias cortesia de D. Summerbell.)

Padronização do eixo proximo-distal: Deleção de elementos esqueléticos pela deleção de genes Hox

Hipótese de que os parálogos dos genes Hox 9-13 especificam regiões proximo-distais do membro anterior.

Membro anterior de camondongo

Expressão de genes Hox posteriores (Hox9 - Hox13):

Hoxa-11 -/- Hoxd-11 -/-

Hoxd-13 -/-

Síndrome de sinpolidactilia humana (muitos dedos unidos)

Exclusão de elementos ósseos de membros pela exclusão de genes Hox parálogos:

Padronização dos genes Hox e a evolução do autópode nos tetrápodos

Tetrápode:Peixe:

Expressão de genes Hoxd-9-13 no desenvolvimento do membro de tetrápode:

(A) Durante a formação do estilópode (fase I), Hoxd-9 e Hoxd-10 são expressos no broto de membro recém-formado.

(B) Durante a formação do zeugópode (fase 2), há uma expressão aninhada de genes Hoxd, mantendo a expressão dos genes Hoxd-11-13 na região posterior do membro.

(C) Expansão da expressão dos genes Hoxa-13 e Hoxd-13 (expressos inicialmente na região posterior) para a região distal e anterior durante a formação de autópodes -> “posteriorização” da região distal do membro.

Em peixes, apêndices de membro embrionários expressam Hoxd-11 e Hoxd-13 na região distal e posterior.

Em tetrápodes, a expressão de Hoxd-13 e Hoxd-11, e o eixo do membro se desloca anteriormente de sua orientação posterior-distal original. Os dígitos se originam dessa região “posteriorizada”.

Por mais informação, veia ao N. Shubin (U. Chicago): https://www.ibiology.org/evolution/hox-genes/

(Woltering et al. 2020)

Evolução do autópode nos tetrápodos

(Pulmonado)

Análise recente usando um sarcopterígeo (em lugar de actinopterígeos usados no passado) gerou novas evidências que soportam a ‘posteriorização’ progresiva da região distal em tetrápodes, assim como as hipóteses de homologia entre os dígitos de tetrápodes e os radiais posteriores de sarcopterígeos, e o dobramento do metapterigio nos tetrápodes.

Bending of the tetrapod metapterygial axis

Padronização antero-posterior: a zona de acção polarizante (ZAP)

Discovering the ZPA: Vade mecum

Quando uma ZAP é enxertado no mesoderma do broto de membro anterior, dígitos duplicados surgem como uma imagem espelhada dos dígitos normais.

(ZAP em portugués)

Padronização antero-posterior: a zona de acção polarizante (ZAP)

A ZAP expressa sonic hedgehog (shh):

Padronização antero-posterior e crecimento do broto de membro

Durante o crecimento do broto de membro anterior de galinha, o feedback entre a CEA e a ZPA e mantido.

A expressão dos genes Hox muda durante a formação do membro do tetrápode, sendo regulados pelo enhancer ELCR da região telomérica no inicio e pelo enhancer GCR da região centromérica depois.

Padronização antero-posterior: ZAP e genes Hox

Enhancer telomérico: ELCR

Enhancer centromérico: GCR

A mudança de regulação dos enhancers permite uma expansão na expressão dos genes Hox ‘posteriores’ (Hox 5’) e dHand, induzindo a região distal e formadora de dígitos.

Gli3 reprime aos genes Hox.

dHand envolvido no desenvolvimento de digitos.

Identidade de digitos: As células secretoras de Shh formam os dígitos 4 e 5 e contribuem para a especificação dos dígitos 2 e 3 no membro do camundongo

Padronização antero-posterior: especificação dos dígitos mediada por shh

Expressão ectópica de shh no camundongo por uma mutação em Hx (hemimelic extra toes) causa formação de dígitos extras no membro anterior.

Padronização antero-posterior: especificação dos dígitos mediada por shh

DV Patterning: Vade mecum

Padronização dorso-ventral: especificação mediada por wnt7a

(Niswander, 2003)

Galinha: Camondongo:

A padronização ao longo dos três eixos do membro:

Pr-D (eixo proximal-distal) está sob o controle dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs; azul) da crista ectodérmica apical (CEA)

A - P (eixo anterior-posterior) está sob o controle do Sonic hedgehog (SHH; vermelho) do mesênquima posterior

D - V (eixo dorsal-ventral) está sob o controle das proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e Engrailed1 (EN1; ambos em rosa) do ectoderma ventral e WNT7a (verde) do ectoderma dorsal.

Patterning through cell death: Vade mecum

Inhibição de morte celular pela inhibição de BMPs por Gremlin no pato

Apoptose durante a formação tardia dos digitos

Apoptose durante a formação tardia dos digitosPadrões de morte celular em primórdios de perna de (A) embriões de pato e (B) de galinha:

Inibição da morte celular pela inibição de BMPs no embrião de galinha:

Pesquisa legal em America Latina…

Se se interessa acompanhe as pesquisas do Botelho Lab (Brazilian researcher at PUC) e Vargas Lab (Universidad de Chile)

https://www.sciencedaily.com/releases/2016/03/160307153051.htm

Formando estruturas de dinosaurios em galinha:

RESPOSTA: Multiplos membros em sapos såo resultado de uma infestação de cistos de tremátodos durante o desenvolvimento dos broto de membro nos girinos