1

BIOTEHNOLOŠKA PRIMJENA BIOTEHNOLOŠKA PRIMJENA ŽIVOTINJSKIH I BILJNIH STANICAŽIVOTINJSKIH I BILJNIH STANICA

dr.sc. Ivana Radojčić Redovniković, doc.dr.sc. Ivana Radojčić Redovniković, doc.iradojci@pbf.hriradojci@pbf.hrj pj p

Laboratorij za tehnologiju i primjenu stanica i biotransformacijeLaboratorij za tehnologiju i primjenu stanica i biotransformacijeKačićeva 30Kačićeva 30

Zavod za biokemijsko inženjerstvoZavod za biokemijsko inženjerstvoPrehrambenoPrehrambeno--biotehnološki fakultetbiotehnološki fakultet

Sveučilište u ZagrebuSveučilište u Zagrebu

KULTURA BILJNIH STANICA I DOBIVANJE BIOMASE STANICA, ZAČETAK STANIČNIH KULTURA,

ODRŽAVANJE KALUSA I PRIPRAVA SUSPENZIJE STANICA

Vršni pup

Cvijet

Izdanak

Cvjetni pup

List

Pupoljak

•• odraslu biljku čine odraslu biljku čine različite specijalizirane različite specijalizirane stanice organizirane u stanice organizirane u tkiva i organetkiva i organe

•• tijelo vegetativne biljke tijelo vegetativne biljke činečine

3Vršak korjena

Pupoljak

list list (fotosinteza)(fotosinteza) izdanak izdanak (stabljika)(stabljika) korijen korijen (prihvaćanje, (prihvaćanje,

apsorpcija vode i apsorpcija vode i mineralnih tvari)mineralnih tvari)

lisni zametaklisni zametak (mjesto (mjesto prihvaćanja lista za prihvaćanja lista za peteljku)peteljku)

Glavno obilježje razvoja biljke je Glavno obilježje razvoja biljke je fleksibilnostfleksibilnost (odgovor na (odgovor na značajan utjecaj okolišnih uvjeta) teznačajan utjecaj okolišnih uvjeta) te TOTIPOTENTNOSTTOTIPOTENTNOST stanicastanica

specijalizirana biljna stanica bez obzira na svoju specijalizirana biljna stanica bez obzira na svoju zrelost može se zrelost može se dediferencirati,dediferencirati, a potom se ponovno a potom se ponovno rediferenciratirediferencirati u cijelu biljkuu cijelu biljku

vegetativna biljka

Tobacco plants from single cellsTobacco plants from single cells((VasilVasil & & HilderbrandtHilderbrandt 19651965))

kalussuspenzijska

kulturamikrokultura

kalusstvaranje izdanka i korijena

prijenos biljke u zemlju

biljka u cvatu

Karakteristike biljne staniceKarakteristike biljne stanice•• velikevelike (10(10--100100 mm))

•• sadrže vakuole koji čine sadrže vakuole koji čine 9090––

95%95% cijekupnog volumenacijekupnog volumena

•• teže agregacijiteže agregaciji

•• osjetljive na smične sileosjetljive na smične sile

•• podnose visoku gustoću podnose visoku gustoću stanicastanica(>(> 300300 gg LL--11))

•• mogu tvoriti viskoznu tekućinumogu tvoriti viskoznu tekućinu

j jj j

•• polagani rastpolagani rast

•• laka kontaminacijalaka kontaminacija

•• niska potreba za kisikom niska potreba za kisikom ((KKLLa=a=55--20)20)

•• nemogućnost rasta u nemogućnost rasta u anaerobnim uvjetimaanaerobnim uvjetima

“...“...BILJNA KULTURA TKIVA i BILJNA KULTURA TKIVA i STANICASTANICA je aseptični je aseptični in vitroin vitrouzgoj svih dijelova biljke, uzgoj svih dijelova biljke, bez obzira radi li se o bez obzira radi li se o protoplastuprotoplastu, , jednoj stanicijednoj stanici, , tkivutkivu ili ili organuorganu..U j bilj k lt d U j bilj k lt d Uzgoj biljne kulture pod Uzgoj biljne kulture pod određenim uvjetima može određenim uvjetima može rezultirati rezultirati umnažanjem umnažanjem stanicastanica, , regeneracijom regeneracijom pojedinih organa pojedinih organa ili ili cijele cijele biljkebiljke...”...”

2

1902. godina1902. godina (Haberlandt) – početak rada s kulturama biljnih stanica (uzgoj stanica izoliranih iz raznih biljnih tkiva na jednostavnim podlogama)

1950. 1950. –– 1960. godina1960. godina− propagacija (umnožavanje sobnog bilja)

Povijesni razvoj razvoja kulture biljnih stanica

p opagac ja (u o a a je sob og b ja)− razvoj jedinstvenih linija sa željenim karakteristikama− dobivanje bezvirusnih biljaka− sinteza različitih produkata

1956. godina1956. godina (Routien & Nickell) – prvi patentirali proizvodnju tvari u kulturi biljnoga tkiva

do 1970. godinedo 1970. godine

− u kulturi se proizvode: diosgenin, ginseng, saponini, harmin, visnagin

− razina tih proizvoda jednaka ili čak viša od matične biljke (greška: usporedbe rađene najčešće na temelju iskorištenja u dijelovima biljke koji akumuliraju najveću količinu željenog produkta – npr. morfinski alkaloidi iz kapsule maka)

1973. 1973. –– 1974. godina1974. godina

– preokret u tehnologiji kulture biljnih stanica– veće poznavanje biokemije i fiziologije staničnih kultura– pojava velikog broja publikacija– niz supstancija opaženih u kulturama svih tipova (kalus, organ ili

tkivo)– dramatično se proširio ogroman potencijal i svestranost biljnoga

carstva

1983. godina1983. godina (Mitsui Petrochemical Industries, Japan)– komercijalna proizvodnja šikonina u kulturi stanica u

suspenziji vrste Lithospermum erythrorhizon

21. stoljeće 21. stoljeće

– postgenomičko razdoblje– zadnjnih pet godina – 20 novih patenata i radova s

ključnim riječima ˝kultura biljnih stanica˝u bazi podataka SCOPUS broj znastvenih radova veći od 2 500

– komercijala proizvodnja berberina, paklitaksela, ginseng i biljnih polisaharida

– proizvodnja rekombinatnih proteina

Uporaba biljnih kulturaTehnike kulture biljnog tkiva i stanica postale suTehnike kulture biljnog tkiva i stanica postale su

••glavno oruđe u istraživanju mnogih neriješenih problema temeljnih i glavno oruđe u istraživanju mnogih neriješenih problema temeljnih i primijenjenih botaničkih znanosti na molekularnoj, staničnoj i razini primijenjenih botaničkih znanosti na molekularnoj, staničnoj i razini čitava organizmačitava organizma

••sastavni dio istraživanja oplemenjivanja poljoprivrednih, hortikulturnih sastavni dio istraživanja oplemenjivanja poljoprivrednih, hortikulturnih i drvenastih biljakai drvenastih biljaka

••važan dio biljne biotehnologije važan dio biljne biotehnologije istražuju i rabe se zaistražuju i rabe se za

reprodukciju biljne biomasereprodukciju biljne biomase

dobivanje novih i jedinstvenih organizamadobivanje novih i jedinstvenih organizama koji se ne mogu dobiti koji se ne mogu dobiti spolnim križanjemspolnim križanjem

komercijalnu primjenu kulture vegetacijskog vrška za komercijalnu primjenu kulture vegetacijskog vrška za razmnožavanje biljakarazmnožavanje biljaka

dobivanje novih varijanti biljakadobivanje novih varijanti biljaka uporabom somaklonske uporabom somaklonske promjenepromjene

poticanje genetičkih promjena poticanje genetičkih promjena -- genetičkog inženjerstva genetičkog inženjerstva

dobivanje dragocjenih, vrlo složenih biljnih proizvodadobivanje dragocjenih, vrlo složenih biljnih proizvoda((sekundarni metabolitisekundarni metaboliti) ) gume, mirisi, boje, lijekovi i dr.gume, mirisi, boje, lijekovi i dr.

proizvodnja rekombinatnih proteinaproizvodnja rekombinatnih proteina

očuvanje ugroženih rijetkih biljnih vrsta i biljnog genofondaočuvanje ugroženih rijetkih biljnih vrsta i biljnog genofonda

očuvanje zdravih matičnih biljkaočuvanje zdravih matičnih biljka, posebice zbirki biljaka , posebice zbirki biljaka koje su potrebne za biljno oplemenjivanje tzv. koje su potrebne za biljno oplemenjivanje tzv. kolekcije kolekcije klične plazmeklične plazme ((engeng. . germplasm collectionsgermplasm collections))

TIPOVI BILJNIH KULTURATIPOVI BILJNIH KULTURA

Postoji mnogo različitih tipova kulture Postoji mnogo različitih tipova kulture in vitroin vitro koje se imenuju koje se imenuju prema prema organuorganu ili tili tkivukivu koje se uvodi u kulturu.koje se uvodi u kulturu.

KULTURA MERISTEMA

KULTURA STANICA

KULTURA SJEMENA

KULTURA IZDANKA

KULTURA PROTOPLASTA

KULTURA ORGANA

KULTURA KALUSA

KULTURA EMBRIJA

BILJNA KULTURA

3

•• naziv naziv kultura biljnog tkivakultura biljnog tkiva rabi se kao općenit, rabi se kao općenit, zajednički naziv koji označava zajednički naziv koji označava manipulacijumanipulaciju, tj. , tj. kultiviranjekultiviranje bilo kojeg dijela biljke u bilo kojeg dijela biljke u sterilnimsterilnim((akseničnimakseničnim) uvjetima ) uvjetima in vitroin vitro

treba zapamtiti da se ovaj naziv upotrebljava sensu treba zapamtiti da se ovaj naziv upotrebljava sensu stricto samo za kulturu neorganiziranih nakupina stanica stricto samo za kulturu neorganiziranih nakupina stanica kalusnogakalusnoga tkivatkiva, često zvanog samo , često zvanog samo kaluskalus

•• dio biljke koji se izolira iz biljke dio biljke koji se izolira iz biljke i uvodi u kulturu, bez obzira i uvodi u kulturu, bez obzira na to od kojeg se tkiva sastoji, na to od kojeg se tkiva sastoji, naziva se naziva se eksplantat eksplantat početna kultura može se početna kultura može se zvati i zvati i kulturakultura eksplantataeksplantata

•• nakon uvođenja eksplantata u kulturu nakon uvođenja eksplantata u kulturu in vitroin vitro razlikuju se tri razlikuju se tri tipa rastatipa rasta

1.1. organiziraniorganizirani

kultura korijena

2.2. neorganiziranineorganizirani

3.3. neorganizirani/organiziranineorganizirani/organizirani

kultura kalusa

Organizirani rast

•• ovaj se tip rasta javlja kada se organizirani ovaj se tip rasta javlja kada se organizirani dijelovi biljke ili organa (dijelovi biljke ili organa (vršni meristemi vršni meristemi izdanka ili korijena, lisni zameci, mlađi izdanka ili korijena, lisni zameci, mlađi cvjetni pupovi i sitni plodovicvjetni pupovi i sitni plodovi)) uvedu u kulturu gdje nastavljaju svoj razvitak pri uvedu u kulturu gdje nastavljaju svoj razvitak pri uvedu u kulturu gdje nastavljaju svoj razvitak pri uvedu u kulturu gdje nastavljaju svoj razvitak pri

čemu sačuvaju svoju prvobitnu strukturučemu sačuvaju svoju prvobitnu strukturu

kad se te iste strukture ili organi stvaraju iznova, kad se te iste strukture ili organi stvaraju iznova, de de novonovo, u kulturi od prije neorganiziranog tkiva, u kulturi od prije neorganiziranog tkiva

•• proces stvaranja organa proces stvaranja organa de novode novo naziva se naziva se organogenezaorganogeneza ili ili morfogenezamorfogeneza ((razvitakrazvitakoblikaoblika) )

Organizirani rast -kultura organakultura organa

•• uključuje aseptično izdvajanje određenih uključuje aseptično izdvajanje određenih struktura (list, lisni zameci, nezreli plodovi i dr.) i struktura (list, lisni zameci, nezreli plodovi i dr.) i nastavak njihova razvoja u uvjetima nastavak njihova razvoja u uvjetima in vitroin vitro

•• prema vrsti eksplantata razlikuju se ovi tipovi prema vrsti eksplantata razlikuju se ovi tipovi kulture organakulture organa

kultura čitavihkultura čitavih intaktnih biljakaintaktnih biljaka

16

kultura čitavihkultura čitavih, , intaktnih biljakaintaktnih biljaka

kultura embrijakultura embrija

kultura korijenakultura korijena

kultura antera ()kultura antera ()

kultura meristemakultura meristema

kultura vegetacijskog vrška izdankakultura vegetacijskog vrška izdanka

kultura pojedinačnih nodijakultura pojedinačnih nodija

aksilarni ili bočni pup

Bočni ogranak

internodij

nodijlist

vršni izdanak s meristemom

aksilarni pup

bočni pup s meristemom

vrh korijena s meristemom

Neorganizirani rast

•• ovaj tip rasta ovaj tip rasta rijedakrijedak je u prirodi, ali je u prirodi, ali čestčest u kulturi u kulturi tkivatkiva

•• stvoreno tkivo stvoreno tkivo ne sadrži niti jednu prepoznatljivu ne sadrži niti jednu prepoznatljivu strukturu iz biljnog organizmastrukturu iz biljnog organizma i ima samo i ima samo ograničen broj različito diferenciranih, ograničen broj različito diferenciranih, specijaliziranih stanicaspecijaliziranih stanica

•• neorganizirano tkivo se može povećavati u neorganizirano tkivo se može povećavati u volumenu i ustaliti supkultiviranjem na krutoj ili volumenu i ustaliti supkultiviranjem na krutoj ili tekućoj podlozi tekućoj podlozi raste neograničeno dugoraste neograničeno dugo

4

•• tipovi neorganiziranoga rasta u kulturi sutipovi neorganiziranoga rasta u kulturi su

kultura biljnoga tkiva, kalusna kulturakultura biljnoga tkiva, kalusna kultura ili ili kalus kalus stanične nakupine koje se stvaraju stanične nakupine koje se stvaraju

neorganiziranim rastom sitnih biljnih organa ili neorganiziranim rastom sitnih biljnih organa ili prethodno kultiviranih stanicaprethodno kultiviranih stanica

kultura stanica u suspenzijikultura stanica u suspenziji populacija stanica i malih staničnih nakupina populacija stanica i malih staničnih nakupina

raspršenih u tekućoj podloziraspršenih u tekućoj podlozi

kultura pojedinačnih stanicakultura pojedinačnih stanica postiže se njihovom izolacijom postiže se njihovom izolacijom pomoću enzimapomoću enzima ili ili

mehaničkim izdvajanjemmehaničkim izdvajanjem iz kalusa ili kulture iz kalusa ili kulture stanica u suspenzijistanica u suspenziji

kultura protoplastakultura protoplasta kultura stanica kojima je kultura stanica kojima je odstranjena stanična odstranjena stanična

stijenkastijenka, najčešće enzimskim postupkom, tako da , najčešće enzimskim postupkom, tako da protoplasti ostanu očuvani i živiprotoplasti ostanu očuvani i živip pp p

Neorganizirane/organizirane kultureNeorganizirane/organizirane kulture

•• prisutna oba tipa rastaprisutna oba tipa rasta

•• stanice, izolirani organi i tkiva najprije se stanice, izolirani organi i tkiva najprije se d dif i jd dif i j (dij lj j t j tki ili l j (dij lj j t j tki ili l j dediferencirajudediferenciraju (dijeljenjem stvaraju tkiva ili sloj (dijeljenjem stvaraju tkiva ili sloj kalusnog tkiva) iz kojih se onda brzo razvijaju kalusnog tkiva) iz kojih se onda brzo razvijaju organi (korijenje i/il izdanci) ili čitavi organizmi organi (korijenje i/il izdanci) ili čitavi organizmi (proembriji ili embriji)(proembriji ili embriji)

Nužni zahtjevi pri uzgoju biljnih kulturaNužni zahtjevi pri uzgoju biljnih kultura

•• PRIKLADNO TKIVOPRIKLADNO TKIVO –– neka tkiva su pogodnija za neka tkiva su pogodnija za kultiviranje od drugihkultiviranje od drugih

•• POGODNA PODLOGA ZA UZGOJPOGODNA PODLOGA ZA UZGOJ –– mora sadržavati mora sadržavati izvor energije i anorganskih soli u količinama dovoljnim izvor energije i anorganskih soli u količinama dovoljnim da zadovolje stanične potrebe za rastda zadovolje stanične potrebe za rast

•• REGULATORI RASTAREGULATORI RASTA –– za biljke su ključni za biljke su ključni auksiniauksini i i citokininicitokinini

•• ASEPTIČNI UVJETI RADAASEPTIČNI UVJETI RADA –– obzirom da obzirom da mikroorganizmi rastu mnogo brže od biljnih i životinjskih mikroorganizmi rastu mnogo brže od biljnih i životinjskih stanica mogu prerasti kulturu kada su prisutni i u vrlo stanica mogu prerasti kulturu kada su prisutni i u vrlo malom brojumalom broju

•• ČESTA SUPKULTIVACIJAČESTA SUPKULTIVACIJA –– da bi se osiguralo da bi se osiguralo dovoljno nutrijenata i izbjeglo nakupljanje štetnih dovoljno nutrijenata i izbjeglo nakupljanje štetnih metabolitametabolita

PRIPREMA, SASTAV I IZBOR HRANJIVE PODLOGE

•• eksplantati biljaka uzgajaju se u uvjetima eksplantati biljaka uzgajaju se u uvjetima in vitro in vitro na na umjetnim hranjivim podlogama umjetnim hranjivim podlogama

•• uspješnost kulture stanica, tkiva ili organa ovisi o izboru uspješnost kulture stanica, tkiva ili organa ovisi o izboru pogodnoga sastava podloge koji će zadovoljiti pogodnoga sastava podloge koji će zadovoljiti prehrambene i fiziološke potrebe stanica u kulturiprehrambene i fiziološke potrebe stanica u kulturiprehrambene i fiziološke potrebe stanica u kulturiprehrambene i fiziološke potrebe stanica u kulturi

•• osnovni nutritivni zahtjevi kulture biljnih stanica su vrlo slični osnovni nutritivni zahtjevi kulture biljnih stanica su vrlo slični kao kod biljke koja raste u prirodnom okruženju, no sastav kao kod biljke koja raste u prirodnom okruženju, no sastav podloge ipak varira ovisno opodloge ipak varira ovisno o tipu stanicatipu stanica tipu tkiva i/ili organatipu tkiva i/ili organa porijeklu i biljnoj vrsti porijeklu i biljnoj vrsti

Sastav podloge odlučujući je za rast !!Sastav podloge odlučujući je za rast !!

•• bez obzira na različitosti između hranjivih podloga koje bez obzira na različitosti između hranjivih podloga koje

se danas upotrebljavaju, sve moraju sadržavati se danas upotrebljavaju, sve moraju sadržavati

mineralne solimineralne soli

ugljikohidrate kao izvor energije ugljikohidrate kao izvor energije (najčešće (najčešće

saharozu)saharozu)

vitaminevitamine

regulatore rastaregulatore rasta

5

Izbor podlogeIzbor podloge

•• podloge koje se rabe najčešće su slične podlogama koje podloge koje se rabe najčešće su slične podlogama koje su razvili su razvili Murashige i SkoogMurashige i Skoog (1962.) za (1962.) za kalusnu kulturu kalusnu kulturu duhanaduhana te te Gamborg i sur.Gamborg i sur. (1968.) za (1968.) za kultiviranje sojekultiviranje soje

•• razlike u sadržaju podloga u prvom su redu u razlike u sadržaju podloga u prvom su redu u anorganskim anorganskim makro/mikroelementima te dodacima vitamina, makro/mikroelementima te dodacima vitamina, regulatorima rasta, izvoru ugljika te različitim regulatorima rasta, izvoru ugljika te različitim g , g jg , g jaminokiselinamaaminokiselinama

•• najviše se primjenjuje najviše se primjenjuje 1616 podloga od kojih mnoge sadrže podloga od kojih mnoge sadrže visoke koncentracije kalija i dušikavisoke koncentracije kalija i dušika npr. npr. MSMS, , ERER, , SHSH, , LSLS, , HeHeili ili B5B5 kratice podloga najčešće potječu od prvih slova kratice podloga najčešće potječu od prvih slova prezimena znanstvenika koji su ih pripraviliprezimena znanstvenika koji su ih pripravili

•• mnoge svjetske tvrtke nude potpuno priređene podloge mnoge svjetske tvrtke nude potpuno priređene podloge koje sadrže sve komponente i samo ih treba izmiješati s koje sadrže sve komponente i samo ih treba izmiješati s određenom količinom vodeodređenom količinom vode

dlog

a za

uzg

oj

dlog

a za

uzg

oj

dnos

ti su

izra

žene

u

dnos

ti su

izra

žene

u

Sast

av h

ranj

ivih

pod

Sast

av h

ranj

ivih

pod

biljn

ih k

ultu

ra (v

rijed

biljn

ih k

ultu

ra (v

rijed

mg/

l):m

g/l):

Anorganske soliAnorganske soli

• optimalne koncentracije anorganskih soli u hranjivoj podlozi osiguravaju maksimalnu brzinu rasta kulture

• MAKROELEMENTI – nužni su u koncentraciji ć j d 0 l 1većoj od 0,5 mmol L-1

nužni makroelementi su: N, K, P, Ca, S, Mg

• MIKROELEMENTI – nužni su u koncentraciji manjoj od 0,5 mmol L-1

nužni mikroelementi su: Fe, Mn, Cu, Zn, I, Mo, Co

MAKROELEMENTI

•• NN -- sastavni dio aminokiselina, proteina, nukleinskih sastavni dio aminokiselina, proteina, nukleinskih kiselina, klorofila i ostalih biomolekula → u podlogu se kiselina, klorofila i ostalih biomolekula → u podlogu se dodaje u anorganskom obliku kao dodaje u anorganskom obliku kao KNOKNO33 i i NHNH44NONO33 te te organskom obliku (organskom obliku (aminokiselineaminokiseline i i hidrolizati proteinahidrolizati proteina))

•• SS -- sastavni dio aminokiselina (Cys, Met) sastavni dio aminokiselina (Cys, Met) koje su koje su prekursori za neke vitamine i kofaktore te Feprekursori za neke vitamine i kofaktore te Fe--S proteina S proteina (nehem željezo) koji sudjeluju u prijenosu elektrona u (nehem željezo) koji sudjeluju u prijenosu elektrona u (nehem željezo) koji sudjeluju u prijenosu elektrona u (nehem željezo) koji sudjeluju u prijenosu elektrona u respiratornom i fotosintetskom lancu respiratornom i fotosintetskom lancu →→ u podlogu se u podlogu se dodaje kao dodaje kao MgSOMgSO4 4 x 7 Hx 7 H22OO

•• PP -- sastavni dio nukleinskih kiselina, energijom bogatih sastavni dio nukleinskih kiselina, energijom bogatih fosfatnih nukelotida (npr. ATP) i fosfolipida u membrani fosfatnih nukelotida (npr. ATP) i fosfolipida u membrani → → u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao NaHNaH22POPO4 4 ili KHili KH22POPO44

•• CaCa -- važan modulator enzimskih reakcija → važan za važan modulator enzimskih reakcija → važan za sintezu i stabilizaciju staničnog zida → sintezu i stabilizaciju staničnog zida → u podlogu se u podlogu se dodaje kao dodaje kao CaClCaCl22 ili ili Ca(NOCa(NO33))22

•• MgMg –– centralni ion u molekuli klorofila → sudjeluje u centralni ion u molekuli klorofila → sudjeluje u agregaciji ribosomalnih podjedinica te kao kofaktor u agregaciji ribosomalnih podjedinica te kao kofaktor u

i i ki k ij i i ki k ij dl d d j dl d d j

MAKROELEMENTI

mnogim enzimskim reakcijama → mnogim enzimskim reakcijama → u podlogu se dodaje u podlogu se dodaje kao kao MgSOMgSO4 4 x 7 Hx 7 H22OO

•• KK –– sudjeluje u regulaciji osmotskog tlaka u stanici, sudjeluje u regulaciji osmotskog tlaka u stanici, stabilizaciji pH te kao kofaktor u mnogim enzimskim stabilizaciji pH te kao kofaktor u mnogim enzimskim reakcijama → reakcijama → u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao KNOKNO33

MIKROELEMENTI

•• Fe Fe -- nužan u sintezi klorofila (nužan u sintezi klorofila (sastavni dio Fesastavni dio Fe--S proteina S proteina koji sudjeluju u prijenosu elektrona u fotosintetskom koji sudjeluju u prijenosu elektrona u fotosintetskom lancu) → lancu) → u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao FeSOFeSO44, , FeFe22(SO(SO44))33 ili u ili u kompleksu sa etilendiamintetraoctenom kiselinom (kompleksu sa etilendiamintetraoctenom kiselinom (EDTAEDTA))

•• B B -- sastavni dio strukturnih kompleksa stanične stijenke sastavni dio strukturnih kompleksa stanične stijenke →→ u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao HH33BOBO33p g jp g j 33 33

•• Cu Cu -- sastavni dio proteina koji sudjeluju u redoks sastavni dio proteina koji sudjeluju u redoks reakcijama reakcijama →→ u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao CuSOCuSO44 x 5 Hx 5 H22OO

•• I I –– nije esencijalni mikroelement, ali potiče rast korijena i nije esencijalni mikroelement, ali potiče rast korijena i kalusakalusa

6

•• MnMn –– sastavni dio proteina koji sudjeluju u redoks sastavni dio proteina koji sudjeluju u redoks reakcijama (metaloproteini) → reakcijama (metaloproteini) → u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao MnSOMnSO4 4 x x 5 H5 H22OO

•• MoMo –– kofaktor nekoliko redoks enzima (npr. nitratkofaktor nekoliko redoks enzima (npr. nitrat--reduktaza) →reduktaza) → u podlogu se dodaje kao u podlogu se dodaje kao NaNa MoOMoO x 2 Hx 2 H OO

MIKROELEMENTI

NaNa22MoOMoO44 x 2 Hx 2 H22OO

•• Zn Zn –– potreban za aktivnost različitih enzima (npr. RNApotreban za aktivnost različitih enzima (npr. RNA--i DNAi DNA-- polimeraze, dehidrogenaze) polimeraze, dehidrogenaze) →→ u podlogu se u podlogu se dodaje kao dodaje kao ZnSOZnSO4 4 x 7 Hx 7 H22OO

Ugljik kao izvor energijeUgljik kao izvor energije

•• najčešće najčešće saharozasaharoza ili ili glukozaglukoza, ponekad fruktoza , ponekad fruktoza 22--5 %5 %

•• u većinu podloga za uzgoj biljnih kultura dodaje se i u većinu podloga za uzgoj biljnih kultura dodaje se i myomyo--inozitolinozitol djeluje povoljno na rast biljnih stanica (izvor djeluje povoljno na rast biljnih stanica (izvor energije i vitamin)energije i vitamin)

VitaminiVitamini t h ji dl bilj k lt ij k t h ji dl bilj k lt ij k •• u sastavu hranjive podloge za biljne kulture uvijek se mora u sastavu hranjive podloge za biljne kulture uvijek se mora

nalaziti nalaziti vitaminvitamin BB11 (tiamin) jer ga one ne mogu sintetizirati (tiamin) jer ga one ne mogu sintetizirati u potrebnoj količiniu potrebnoj količini

•• dodatak dodatak nikotinske kiselinenikotinske kiseline i i vitaminavitamina BB66 (piridoksin) (piridoksin) također može poboljšati rast biljnih kulturatakođer može poboljšati rast biljnih kultura

•• neke hranjive podloge, ovisno o specifičnim potrebama neke hranjive podloge, ovisno o specifičnim potrebama pojedinih kultura, mogu sadržavati i pojedinih kultura, mogu sadržavati i pantotensku kiselinupantotensku kiselinu, , biotinbiotin, , folnu kiselinufolnu kiselinu, , pp--aminobenzojevu kiselinuaminobenzojevu kiselinu, , riboflavinriboflavini i LL--askorbinsku kiselinuaskorbinsku kiselinu (vitamin C)(vitamin C)

Regulatori rasta = biljni hormoni (fitohormoni)Regulatori rasta = biljni hormoni (fitohormoni)

•• AUKSINIAUKSINI potiču diobu stanica, produljenje stanica, bubrenje potiču diobu stanica, produljenje stanica, bubrenje

tkiva, nastajanje kalusa, nastajanje adventivnog tkiva, nastajanje kalusa, nastajanje adventivnog korijenjakorijenja

inhibiraju stvaranje bočnih izdanakainhibiraju stvaranje bočnih izdanaka IAAIAA, , 2,42,4--DD, , NAANAA, , IBAIBA, , 2,4,52,4,5--TT, , ppCPACPA

•• CITOKININICITOKININI potiču stvaranje bočnih izdanaka i staničnu diobupotiču stvaranje bočnih izdanaka i staničnu diobu zeatinzeatin, , kinetinkinetin, , BABA, , 2iP2iP

•• GIBERELINIGIBERELINI potiču regeneraciju biljkepotiču regeneraciju biljke

•• ABSCISINSKA KISELINA (APSCIZINSKA KISELINA)ABSCISINSKA KISELINA (APSCIZINSKA KISELINA) potiče embriogenezupotiče embriogenezu

*

*

*

Citokinini derivati adenina

indol-3-octena kiselina (IAA)

indol-3-akrilna kiselina (IAcrA)

indol-3-maslačna kiselina (IBA)

4-klorindol-3-octena kiselina (4-Cl-IAA)

trans-zeatin

dihidrozeatin

N6-(2-izopentil)adenin (2-iP)

34

**

* *

indol-3-acetilaspartat glukobrasicin

2,4-diklorfenoksioctena kiselina (2,4-D)

naftalen-1-octena kiselina (NA)

dihidrozeatin

kinetin6-furfurilaminopurin

6-benzilaminopurin (BA)

zeatin-ribozid

6-(benzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil)-9H-purin (PBA)

Auksini koji se uobičajeno rabe za uzgoj kulture stanica (*)

•• odnos koncentracija auksina i citokinina određuje razvoj odnos koncentracija auksina i citokinina određuje razvoj biljne kulturebiljne kulture

↑↑ auksini auksini ↓↓citokinini citokinini razvoj korijenarazvoj korijena↑↑ citokinini citokinini ↓↓auksini auksini razvoj izdankarazvoj izdankaauksini = citokinini auksini = citokinini razvoj kalusarazvoj kalusa

Organogeneza korijena biljke duhana

citokinin citokinin

7

Organski dodaci hranjivoj podloziOrganski dodaci hranjivoj podlozi

•• dušik u obliku dušik u obliku aminokiselinaaminokiselina (glutamin, asparagin) i (glutamin, asparagin) i nukleotida (adenilna kiselina, AMP)nukleotida (adenilna kiselina, AMP)

•• organske kiselineorganske kiseline piruvat i kiseline citratnog ciklusa piruvat i kiseline citratnog ciklusa (citrat, malat, fumarat) (citrat, malat, fumarat)

•• složene komponentesložene komponente tj. razni prirodni sastojci tj. razni prirodni sastojci kvaščev kvaščev k t kt l d i k t kt k k lij k t i ki k t kt l d i k t kt k k lij k t i ki ekstrakt, sladni ekstrakt, kokosovo mlijeko, proteinski ekstrakt, sladni ekstrakt, kokosovo mlijeko, proteinski

hidrolizati, pulpa bananina ploda, riblja emulzija, sok hidrolizati, pulpa bananina ploda, riblja emulzija, sok rajčice, narančin sokrajčice, narančin sok

•• aktivni ugljenaktivni ugljen dodaje se kada prisutnost fenola i dodaje se kada prisutnost fenola i njemu sličnih tvari stvara probleme njemu sličnih tvari stvara probleme adsorbira toksične adsorbira toksične pigmente i stabilizira pHpigmente i stabilizira pH

•• za sprječavanje oksidacije fenola također se mogu za sprječavanje oksidacije fenola također se mogu dodati dodati polivinilpirolidonpolivinilpirolidon ((PVP)PVP), , LL--askorbinska kiselinaaskorbinska kiselina, , tioureatiourea ii LL--cisteincistein

STERILIZACIJA HRANJIVE PODLOGESTERILIZACIJA HRANJIVE PODLOGE••podloga se može sterilizirati na više načinapodloga se može sterilizirati na više načina

fizičkim uništavanjemfizičkim uništavanjem mikroorganizama suhim vrućim mikroorganizama suhim vrućim zrakom, vrelom parom ili zračenjem (UVzrakom, vrelom parom ili zračenjem (UV--svjetlom ili svjetlom ili --zračenjem)zračenjem)

kemijskim uništavanjemkemijskim uništavanjem mikroorganizama pomoću mikroorganizama pomoću različitih preparata (npr. etilenrazličitih preparata (npr. etilen--klorid, natrijev hipoklorit, klorid, natrijev hipoklorit, antibiotici i dr.)antibiotici i dr.)

fizičkim odstranjivanjemfizičkim odstranjivanjem mikroorganizama filtriranjem i/ili mikroorganizama filtriranjem i/ili pranjempranjem

••AUTOKLAVIRANJEAUTOKLAVIRANJE sterilizacija vrućom parom i povišenim sterilizacija vrućom parom i povišenim tlakomtlakom

•• uspješnost sterilizacije ovisi ouspješnost sterilizacije ovisi o trajanju sterilizacije trajanju sterilizacije tlakutlaku temperaturitemperaturivolumenu tvari koja se steriliziravolumenu tvari koja se sterilizira

PrednostiPrednosti sterilizacije autoklavomsterilizacije autoklavom•• brzinabrzina

•• jednostavnostjednostavnost

•• dodatno uništavanje virusnih česticadodatno uništavanje virusnih čestica

NedostaciNedostaci sterilizacije autoklavomsterilizacije autoklavom•• mogućnost promjene pH podloge mogućnost promjene pH podloge pH podloge se pH podloge se

snižava za 0,3 snižava za 0,3 -- 0,5 jedinica0,5 jedinicasnižava za 0,3 snižava za 0,3 0,5 jedinica0,5 jedinica•• razdvajanje sastojaka u podlozi razdvajanje sastojaka u podlozi taloženje soli i taloženje soli i

depolimerizacija agaradepolimerizacija agara•• razgradnja nekih komponenata podlogerazgradnja nekih komponenata podloge

saharoze na glukozu i fruktozusaharoze na glukozu i fruktozu giberelinske kiseline (gubi oko 90 % svoje aktivnosti)giberelinske kiseline (gubi oko 90 % svoje aktivnosti) vitamina Bvitamina B11, vitamina B, vitamina B1212, pantotenske kiseline, vitamina C, pantotenske kiseline, vitamina C antibiotikaantibiotika biljnih ekstrakata (gube svoju aktivnost)biljnih ekstrakata (gube svoju aktivnost) enzimaenzima

ulaz pare

cijev za odvod pare

unutarnja komora

u odvod para

Sterilizacija zračenjemSterilizacija zračenjem••sterilizacija podloge sterilizacija podloge --zračenjem rijetko se rabi u zračenjem rijetko se rabi u

kulturi tkivakulturi tkiva skuplji postupak od autoklaviranja skuplji postupak od autoklaviranja na ozračenoj na ozračenoj

podlozi biljno tkivo slabije rastepodlozi biljno tkivo slabije raste••uobičajeno se rabi za plastično uobičajeno se rabi za plastično

posuđeposuđe

Hladna sterilizacija membranskim Hladna sterilizacija membranskim filtrimafiltrima••za sterilizaciju tekućina, otopina ili tekućih za sterilizaciju tekućina, otopina ili tekućih

podloga koje sadrže termolabilne tvaripodloga koje sadrže termolabilne tvari••pore na membranama manje od 0,22 pore na membranama manje od 0,22 m m

zadržavaju sve veličine mikroorganizama (katkad zadržavaju sve veličine mikroorganizama (katkad i viruse)i viruse)

PRIKAZI LAMINARA

a) laminar s vertikalnim strujanjem

b) laminar s horizontalnim strujanjem

a)b)

8

•• kontaminanti kulture kontaminanti kulture •• izvor infekcije u kulturi izvor infekcije u kulturi in in it it ž bitiž biti

STERILIZACIJA BILJNOG MATERIJALASTERILIZACIJA BILJNOG MATERIJALA

••svi postupci u kulturi svi postupci u kulturi in vitroin vitro moraju se odvijati umoraju se odvijati ustrogo sterilnim uvjetimastrogo sterilnim uvjetima

••prije kultiviranja prije kultiviranja in vitroin vitro eksplantati i stanice morajueksplantati i stanice morajubiti biti sterilnisterilni

biljnog tkivabiljnog tkiva virusivirusi bakterijebakterije kvascikvasci plijesniplijesni crvićicrvići resokrilciresokrilci crveni paukcrveni pauk

vitro vitro može bitimože biti zaraženost biljnog zaraženost biljnog

materijala (vanjska ili materijala (vanjska ili unutrašnja)unutrašnja)

hranjiva podloga (nije hranjiva podloga (nije dovoljno sterilizirana)dovoljno sterilizirana)

kontaminacija zrakom kontaminacija zrakom zaraženost uzrokovana zaraženost uzrokovana

osobom koja radi osobom koja radi (nepažljiv rad)(nepažljiv rad)

Postupci s biljkama - davaocima

•• izvorni biljni materijal koji se upotrebljava za uvođenje u izvorni biljni materijal koji se upotrebljava za uvođenje u kulturu kulturu in vitroin vitro dijeli se u dijeli se u dvije grupedvije grupe

1)1) biljke koje rastu u kontroliranim uvjetima staklenika ili biljke koje rastu u kontroliranim uvjetima staklenika ili klimaklima--komorikomori

2)2) biljke koje rastu na otvorenome (ex vitro)biljke koje rastu na otvorenome (ex vitro)2)2) biljke koje rastu na otvorenome (ex vitro)biljke koje rastu na otvorenome (ex vitro)

•• prilikom prilikom izolacije i uspostavljnja kulture izolacije i uspostavljnja kulture in vitroin vitro treba paziti treba paziti da se eksplantati uzimaju samo odda se eksplantati uzimaju samo od zdravih i čvrstih zdravih i čvrstih biljakabiljaka

•• prije samog početka sterilizacije potrebno jeprije samog početka sterilizacije potrebno je odstraniti sve komadiće zaostale zemlje ili mrtvih odstraniti sve komadiće zaostale zemlje ili mrtvih

biljnih dijelovabiljnih dijelovamaterijal izvana dobro oprati vodommaterijal izvana dobro oprati vodom

Sterilizacija se provodiSterilizacija se provodi

1)1) uranjanjem tkiva od kojeg će se uzeti eksplantat u 70 %uranjanjem tkiva od kojeg će se uzeti eksplantat u 70 %--tni tni alkohol nekoliko sekundi (da se odstrane mjehurići zraka)alkohol nekoliko sekundi (da se odstrane mjehurići zraka)

2)2) uranjanjem tkiva u 1 %uranjanjem tkiva u 1 %--tni natrijev ili kalcijev hipoklorit tni natrijev ili kalcijev hipoklorit kojima je dodano nekoliko kapi detergenta tipa Tween kojima je dodano nekoliko kapi detergenta tipa Tween 2020R R ili Tween 80ili Tween 80R R tijekom 10 do 30 mintijekom 10 do 30 min

3)3) ispiranjem sterilnom vodom (3 puta po 2, 5 ili 15 min)ispiranjem sterilnom vodom (3 puta po 2, 5 ili 15 min)

Koncentracija Vrijeme/min

NaOCl 10-20 % v/v 10-20 Ca(ClO)2 10-20 % v/v 10-20 H2O2 1 % v/v 10 HgCl2 0,1 % w/v 10-30 AgNO3 1 % w/v 10-30

•vrijeme potrebno za sterilizaciju ovisi o

stupnju onečišćenja biljke

osjetljivosti biljnog tkiva koje se upotrebljava

46

Ako eksplantati izgube boju za vrijemesterilizacije ili nakon nekoliko dana,treba smanjiti vrijeme sterilizacije!!

IZOLACIJA, INOKULACIJA I SUPKULTIVIRANJEIZOLACIJA, INOKULACIJA I SUPKULTIVIRANJE

••izolacija eksplantata izolacija eksplantata izdvajanje dijela biljkeizdvajanje dijela biljke••inokulacija inokulacija sađenje na hranjivu podlogusađenje na hranjivu podlogu••supkultiviranje tkiva supkultiviranje tkiva prenošenje sa stare, prenošenje sa stare,

istrošene podloge nasvježuistrošene podloge nasvježu

Moraju se obaviti u jednakim sterilnim uvjetima (u komori sa Moraju se obaviti u jednakim sterilnim uvjetima (u komori sa sterilnim protokom zraka i uz sve mjere sterilnog rada)!!sterilnim protokom zraka i uz sve mjere sterilnog rada)!!

izolacija eksplantata i inokulacija izolacija eksplantata i inokulacija kaluskalussuspenzijska suspenzijska kulturakultura

regeneracija regeneracija biljkebiljke

9

•• izolacija eksplantataizolacija eksplantata

1)1) sušenje steriliziranih i vodom ispranih eksplantatasušenje steriliziranih i vodom ispranih eksplantata2)2) odstranjivanje suvišnog vanjskog tkivaodstranjivanje suvišnog vanjskog tkiva3)3) izrezivanje točno određene veličine i volumena izrezivanje točno određene veličine i volumena

tkivatkiva4)4) prijenos neposredno na steriliziranu podloguprijenos neposredno na steriliziranu podlogu

•• inokulacija tkiva na podlogu inokulacija tkiva na podlogu

metoda inokulacije ovisi o eksperimentalnom metoda inokulacije ovisi o eksperimentalnom materijalumaterijalu

eksplantati zadržavaju svoju polarnost i nakon eksplantati zadržavaju svoju polarnost i nakon isjecanja i inokulacije (fiziološki gornja strana mora isjecanja i inokulacije (fiziološki gornja strana mora biti i u kulturi gornjabiti i u kulturi gornja)

•• supkultiviranjesupkultiviranje potrebno iz sljedećih razlogapotrebno iz sljedećih razloga hranjiva se podloga istrošila (fenomeni deficijencije)hranjiva se podloga istrošila (fenomeni deficijencije)

podloga se osušila (posebno kada su u njoj velike podloga se osušila (posebno kada su u njoj velike koncentracije soli i šećera)koncentracije soli i šećera)

kultura je ispunila cijeli prostor epruvete ili tikvicekultura je ispunila cijeli prostor epruvete ili tikvice

materijal je potrebno dalje umnažatimaterijal je potrebno dalje umnažati

j đ ili b j ti dl k lt t j đ ili b j ti dl k lt t pojava smeđe ili crne obojenosti podloge kao rezultat pojava smeđe ili crne obojenosti podloge kao rezultat ispuštanja tvari (najčešće fenola), često toksičnih za ispuštanja tvari (najčešće fenola), često toksičnih za eksplantat (osobito tijekom prvih nekoliko tjedana) eksplantat (osobito tijekom prvih nekoliko tjedana) eksplantate potrebno često presađivatieksplantate potrebno često presađivati

katkada je materijal potrebno prenijeti na podlogu katkada je materijal potrebno prenijeti na podlogu izmijenjena sastavaizmijenjena sastava

podloga je postala tekuća zbog sniženja pH podloga je postala tekuća zbog sniženja pH uzrokovanog biljnim materijalomuzrokovanog biljnim materijalom

UTJECAJ FIZIČKIH ČIMBENIKA NA RAST KULTURA

•• uvjeti koji vladaju u klimauvjeti koji vladaju u klima--komori, a mogu utjecati komori, a mogu utjecati na rast kultura na rast kultura in vitro in vitro susu

svjetlostsvjetlost

duljina danaduljina dana (14 do 16 sati, kontinuirano ili u posebnim (14 do 16 sati, kontinuirano ili u posebnim slučajevima u potpunom mraku)slučajevima u potpunom mraku)

zračenjezračenje (osvijetljenost 8(osvijetljenost 8--15 W m15 W m--2 2 ili mnogo niže)ili mnogo niže)

sastav spektrasastav spektra (upotrebljavaju se gotovo uvijek (upotrebljavaju se gotovo uvijek fluorescentne cijevi fluorescentne cijevi -- hladna bijela svjetlost, a hladna bijela svjetlost, a ponekad i visokotlačne natrijske lampe)ponekad i visokotlačne natrijske lampe)

temperatura temperatura (obično je konstantna, od 24 do 26 (obično je konstantna, od 24 do 26 °°C)C)

vlažnostvlažnost (gotovo 100 %(gotovo 100 %--tna u epruvetama i drugim posudama)tna u epruvetama i drugim posudama)

raspoloživost voderaspoloživost vode

kisikkisik (dobro prozračivanje važan je čimbenik za rast stanica) (dobro prozračivanje važan je čimbenik za rast stanica) postiže se uporabom raznih uređaja (npr. tresilice, drmalice i postiže se uporabom raznih uređaja (npr. tresilice, drmalice i slične miješalice)slične miješalice)

UTJECAJ BILJNOG MATERIJALA NA RAST UTJECAJ BILJNOG MATERIJALA NA RAST U UVJETIMA U UVJETIMA IN VITROIN VITRO

Uspješnost kulture ovisi o:Uspješnost kulture ovisi o:

1.1. značajkama biljke značajkama biljke –– davaocadavaoca genotipgenotip biljke se izrazito razlikuju po svojim biljke se izrazito razlikuju po svojim

regenerativnim mogućnostima (dvosupnice se bolje regenerativnim mogućnostima (dvosupnice se bolje regeneriraju od jednosupnica i četinjača, koje imaju regeneriraju od jednosupnica i četinjača, koje imaju ograničen regeneracijski kapacitet)ograničen regeneracijski kapacitet)ograničen regeneracijski kapacitet)ograničen regeneracijski kapacitet)

dobdob mlađa embrijska tkiva obično imaju visoki kapacitet mlađa embrijska tkiva obično imaju visoki kapacitet za regeneraciju (npr. kod žitarica se pretežno za regeneraciju (npr. kod žitarica se pretežno upotrebljavaju embriji i sjemenke)upotrebljavaju embriji i sjemenke) mlado i neodrvenjelo mlado i neodrvenjelo tkivo prikladnije je za kulturu od starijega, drvenastog tkivatkivo prikladnije je za kulturu od starijega, drvenastog tkiva

fiziološko i zdravstveno stanjefiziološko i zdravstveno stanje biljke koje su u biljke koje su u vegetativnoj fazi regeneriraju se bolje nego dijelovi uzeti s vegetativnoj fazi regeneriraju se bolje nego dijelovi uzeti s biljke koja je u generativnoj fazi (cvat) biljke koja je u generativnoj fazi (cvat) ako je biljka ako je biljka snažna i zdrava u trenutku izolacije eksplantata snažna i zdrava u trenutku izolacije eksplantata kultura kultura in vitro in vitro uspješnija uspješnija

2.2. uvjetima u kojima je biljka rasla uvjetima u kojima je biljka rasla

djelovanje različitih godina i sezonadjelovanje različitih godina i sezona razlike u razlike u reakciji eksplantata uzetih od biljaka koje su rasle u reakciji eksplantata uzetih od biljaka koje su rasle u kišno ili sušno vrijeme, u hladnoći ili pri nedovoljnom kišno ili sušno vrijeme, u hladnoći ili pri nedovoljnom osvjetljenju osvjetljenju

uvjetimauvjetima razlike u reakciji eksplantata uzetih od razlike u reakciji eksplantata uzetih od biljaka koje su rasle pod prirodnim osvjetljenijem ili u biljaka koje su rasle pod prirodnim osvjetljenijem ili u stakleniku (biljke su izduženije i etiolirane)stakleniku (biljke su izduženije i etiolirane)

položaj eksplantatapoložaj eksplantata topofizis (položaj eksplantata topofizis (položaj eksplantata unutar biljnog organizma) utječe na ponašanje unutar biljnog organizma) utječe na ponašanje in vitro in vitro opaža se tzv. gradijent regeneracijeopaža se tzv. gradijent regeneracije

10

3. postupcima prije uvođenja eksplantata u kulturu postupcima prije uvođenja eksplantata u kulturu ininvitrovitro

ranjavanje pri rezanju eksplantata treba uzeti u obzir odnos ranjene površine prema neranjenoj

veličina eksplantata izolirani dijelovi biljke imaju vlastitu zalihu rezervne hrane i hormona pa će veći ekspalntati biljke lakše potaknuti rast i regeneraciju

način inokulacije eksplantati se mogu inokulirati (zasaditi) na hranjivu podlogu

polarno – sa svojom fiziološkom osnovicom uronjenom u podlogu

apolarno – s vršnom stranom uronjenom u podlogu

položeno horizontalno na podlogu

KULTURA KALUSAKULTURA KALUSA

•• ex vitro ex vitro odgovor biljke odgovor biljke na oštećenje tkivana oštećenje tkiva

•• in vitroin vitro razvija se iz razvija se iz biljnog eksplantatabiljnog eksplantata

k i dif i ih k i dif i ih •• nakupina nediferenciranih nakupina nediferenciranih i totipotentnih stanica koje i totipotentnih stanica koje se aktivno dijelese aktivno dijele

•• može se pripraviti izmože se pripraviti iz

-- različitih dijelova biljkerazličitih dijelova biljke-- biljnog sjemenabiljnog sjemena

Stanična proliferacija i rast kalusnoga tkiva

• kalus tkivo koje nastaje neorganiziranom proliferacijom stanica na segmentu biljnog organa – eksplantata

• kalusno tkivo razvija se u kulturi in vitro i morfološki je slično tkivu koje se pojavljuje u prirodnim uvjetima nakon ranjavanja biljke

• kultura kalusa bila je jedna od prvih metoda kulture biljnog tkiva danas je moguće postići razvitak kalusa in vitro od svih organa i tkiva

• veličina i oblik početnog eksplantata nisu posebno kritični, iako proliferacija može izostati ako je eksplantat presitan za postavljanje kalusne kulture rabe se listovi, stabiljke, prašnici, plodovi, sjemenke, vršni dijelovi(vegetativni i generativni) izdanaka i korijena

•• za održavanje aktivnog rasta kalusnih kultura potreban je za održavanje aktivnog rasta kalusnih kultura potreban je trajan i dovoljan dodatak trajan i dovoljan dodatak anorganskih solianorganskih soli, , vitaminavitamina, , šećerašećera i i regulatora rastaregulatora rasta

•• ako u podlozi ima svih ostalih potrebnih elemenata u ako u podlozi ima svih ostalih potrebnih elemenata u optimalnoj količini reakcija izrezana tkiva najviše će ovisiti o optimalnoj količini reakcija izrezana tkiva najviše će ovisiti o auksinimaauksinima i i citokininimacitokininima

•• kalus najčešće raste na krutim podlogoma, iako se mogu kalus najčešće raste na krutim podlogoma, iako se mogu t ij biti i t k ć dlt ij biti i t k ć dlupotrijebiti i tekuće podlogeupotrijebiti i tekuće podloge

•• na krutoj podlozi samo je dio kalusnog tkiva doista u dodiru s na krutoj podlozi samo je dio kalusnog tkiva doista u dodiru s površinom podloge, što izaziva neravnomjeran rastpovršinom podloge, što izaziva neravnomjeran rast

rast je uvjetovan rast je uvjetovan gradijentom hranjivih tvarigradijentom hranjivih tvari, , izmjenom izmjenom plinovaplinova i i nakupljanjem suvišnih produkatanakupljanjem suvišnih produkata koji se stvaraju koji se stvaraju između podloge i tkiva i mogu biti štetni za tkivoizmeđu podloge i tkiva i mogu biti štetni za tkivo

•• kalus treba periodično prenositi na kalus treba periodično prenositi na svježu podlogusvježu podlogu

kulture se uzgajaju pri 24kulture se uzgajaju pri 24--26 26 °°C C najčešće se supkultiviraju najčešće se supkultiviraju svakih 4svakih 4--6 tjedana6 tjedana

•• procjena kalusnog rasta najčešće procjena kalusnog rasta najčešće se temelji na se temelji na mjerenju prirasta mjerenju prirasta jj j jj jsvježe ili suhe tvari (mase)svježe ili suhe tvari (mase)

postoje i druga mjerenja kao postoje i druga mjerenja kao što su određivanje što su određivanje

broja stanicabroja stanicamitotskog indeksa kalusa mitotskog indeksa kalusa intenziteta disanjaintenziteta disanja

RAZVOJNI STADIJI KALUSNE KULTURERAZVOJNI STADIJI KALUSNE KULTURE

1)1) indukcijaindukcija

2)2) diobadioba

3)3) diferencijacijadiferencijacija

1) INDUKCIJA1) INDUKCIJA

stanice se pripremaju za diobu stanice se pripremaju za diobu aktivan aktivan metabolizam stanicametabolizam stanica

trajanje ove faze ovisi o trajanje ove faze ovisi o

samom eksplantatusamom eksplantatu tipu prisutnih stanicatipu prisutnih stanica uvjetima uzgojauvjetima uzgoja

11

2) DIOBA2) DIOBA

sinteza tvari nužnih za diobu stanicasinteza tvari nužnih za diobu stanica

stanična dioba prvo se zbiva u vanjskim slojevima stanična dioba prvo se zbiva u vanjskim slojevima

eksplantata, a porast u broju stanica je izrazito visok eksplantata, a porast u broju stanica je izrazito visok

(npr. nakon 7 dana uzgoja kalusa artičoke ili mrkve (npr. nakon 7 dana uzgoja kalusa artičoke ili mrkve

porast broja stanica može biti do 10x ) porast broja stanica može biti do 10x ) p j )p j )

3) DIFERENCIJACIJA3) DIFERENCIJACIJA

započinje u vanjskim slojevima eksplazapočinje u vanjskim slojevima eksplanntata, gdje je tata, gdje je

intenzivna stanična diobaintenzivna stanična dioba

daljnjim rastom kalusa dioba se počinje odvijati i u daljnjim rastom kalusa dioba se počinje odvijati i u

dubljim slojevima tkivadubljim slojevima tkiva

ArabidopsisArabidopsis DuhanDuhan33,,0 mg/L 2,40 mg/L 2,4--DD

Utjecaj genotipaUtjecaj genotipa na morfologiju kalusana morfologiju kalusa

kompaktni kalus rahli kalus

00,,1 mg/L kinetin1 mg/L kinetin33,,0 mg/L 2,40 mg/L 2,4--DD

22,,0 mg/L IAA0 mg/L IAA33,,0 mg/L 20 mg/L 2--iPiP

Utjecaj sastava podlogeUtjecaj sastava podloge na na morfologiju kalusa duhanamorfologiju kalusa duhana

rahlirahli kkalusalus kompaktnikompaktni kkalusalus

Uporaba kalusnih kulturaUporaba kalusnih kultura

•• proizvodnja sekundarnih proizvodnja sekundarnih metabolita i enzimametabolita i enzima

•• sinteza početnih supstrata koji se sinteza početnih supstrata koji se naknadno modificiraju do naknadno modificiraju do željenog produktaželjenog produkta

•• početni materijal za vegetativnu početni materijal za vegetativnu •• početni materijal za vegetativnu početni materijal za vegetativnu propagaciju biljakapropagaciju biljaka

•• osnova za dobivanje kultivara osnova za dobivanje kultivara visokog prinosavisokog prinosa

•• dobivanje kulture tkiva iz kalusa u dobivanje kulture tkiva iz kalusa u svrhu očuvanja biljnih sojeva bez svrhu očuvanja biljnih sojeva bez virusavirusa

KULTURA STANICA U SUSPENZIJI

•• sastoji se od sastoji se od raspršenih stanica i staničnih grudicaraspršenih stanica i staničnih grudica(nakupina) (nakupina) u tekućoj podlozi koja se miješau tekućoj podlozi koja se miješa

•• tijekom inkubacije stanica se dijele tijekom inkubacije stanica se dijele količina stanične količina stanične mase se povećava, dok kultura ne dosegne svoj mase se povećava, dok kultura ne dosegne svoj maksimalni prinos biljnog materijalamaksimalni prinos biljnog materijala

•• ako se u to vrijeme kultura razrijedi ponovit će se sličan ako se u to vrijeme kultura razrijedi ponovit će se sličan •• ako se u to vrijeme kultura razrijedi, ponovit će se sličan ako se u to vrijeme kultura razrijedi, ponovit će se sličan uzorak rasta i stanični se prinos ponavljauzorak rasta i stanični se prinos ponavlja

•• kultura stanica u suspenziji se uspostavljakultura stanica u suspenziji se uspostavlja prenošenjem rahloga kalusa u tekuću podloguprenošenjem rahloga kalusa u tekuću podlogu

miješanjem kulture miješanjem kulture pojedine se stanice otkidaju od pojedine se stanice otkidaju od većih nakupina i dijeljenjem oblikuju stanične lance ili većih nakupina i dijeljenjem oblikuju stanične lance ili nakupine u obliku grudicanakupine u obliku grudica

prosijavanje

Postupak inicijacije kulture stanica u suspenziji iz kalusa

suspenzije stanica (filter veličine pora 300-500 m)

2. nacjepljivanje1. nacjepljivanje

rahli kalus

12

•• stanice u suspenziji, koje bi se sastojale samo od stanice u suspenziji, koje bi se sastojale samo od raspršenih pojedinačnih stanica, do sada nisu raspršenih pojedinačnih stanica, do sada nisu dobivene dobivene stanična stjenka biljnih stanica stanična stjenka biljnih stanica prirodno teži zajedničkom povezivanju stanicaprirodno teži zajedničkom povezivanju stanica

•• stupanj stanične raspršenosti u suspenziji znatno stupanj stanične raspršenosti u suspenziji znatno ovisi o koncentraciji egzogenih regulatora rastaovisi o koncentraciji egzogenih regulatora rastaovisi o koncentraciji egzogenih regulatora rastaovisi o koncentraciji egzogenih regulatora rasta

auksin povećava specifičnu aktivnost enzima koji auksin povećava specifičnu aktivnost enzima koji razgrađuju središnje lamele stanične stijenkerazgrađuju središnje lamele stanične stijenke

•• za kultiviranje biljnih stanica u fermentorima i za kultiviranje biljnih stanica u fermentorima i bioreaktorima uspješno se upotrebljavaju bioreaktorima uspješno se upotrebljavaju bioraktori zapremine čak i do bioraktori zapremine čak i do 50005000 LL

Postrojenje za kultivaciju Postrojenje za kultivaciju biljnih stanica biljnih stanica proizvodnja vakcinaproizvodnja vakcina

Kultura stanica rajčice u suspenzijiKultura stanica rajčice u suspenziji•• prema načinu kultiviranja suspenzijske kulture prema načinu kultiviranja suspenzijske kulture

mogu se razvrstati u mogu se razvrstati u dvije velike skupinedvije velike skupineovisno o uređaju koji se upotrebljava za uzgoj ovisno o uređaju koji se upotrebljava za uzgoj i održavanje kulturei održavanje kulture

šaržne kulturešaržne kulture –– stanice se uzgajaju u stanice se uzgajaju u određenom konačnom volumenu hranjive određenom konačnom volumenu hranjive podloge dok ne prestane rastpodloge dok ne prestane rast

trajne kulturetrajne kulture –– stanični je rast ustaljen i stanični je rast ustaljen i održavan trajnim nadopunjavanjem održavan trajnim nadopunjavanjem svježom sterilnom podlogomsvježom sterilnom podlogom

•• za te kulture upotrebljavaju se kružne tresilice (brzine za te kulture upotrebljavaju se kružne tresilice (brzine gibanja 30gibanja 30--150 150 °°/min) na koje se učvršćuju /min) na koje se učvršćuju Erlenmeyerove tikvice (volumena 50 Erlenmeyerove tikvice (volumena 50 -- 2000 mL), a 2000 mL), a optimalna brzina trešnjeoptimalna brzina trešnje ovisi oovisi o

pojedinačnoj kulturipojedinačnoj kulturi sastavu podlogesastavu podloge tipu posude (obliku i veličini)tipu posude (obliku i veličini) l ti l k ltl ti l k lt relativnom volumenu kulturerelativnom volumenu kulture

•• veliki sustavi dalje su se razvijali kao veliki sustavi dalje su se razvijali kao kontinuirane kulture kontinuirane kulture u kojima je moguće kontroliratiu kojima je moguće kontrolirati

temperaturu podlogetemperaturu podloge pH podlogepH podloge istrošenost hranjivih sastojakaistrošenost hranjivih sastojaka i druge parametrei druge parametre

•• prednosti kontinuiranog uzgoja prednosti kontinuiranog uzgoja je je

sterilnost tijekom dugog razdoblja uzgojasterilnost tijekom dugog razdoblja uzgoja

izbjegavanje mehaničkih pogrešaka za vrijeme izbjegavanje mehaničkih pogrešaka za vrijeme dugotrajnog uzgojadugotrajnog uzgoja

stupanj automatizacijestupanj automatizacijep j jp j j

mogućnosti mijenjanja uvjeta uzgojamogućnosti mijenjanja uvjeta uzgoja

temperaturatemperatura prozračivanjeprozračivanje osvjetljavanjeosvjetljavanje razina koncentracije hranjivarazina koncentracije hranjiva razina koncentracije regulatora rastarazina koncentracije regulatora rasta

13

Rast i održavanje kulture stanica u suspenzijiRast i održavanje kulture stanica u suspenziji

Vrijeme od postavljanja kulture do ulaska u Vrijeme od postavljanja kulture do ulaska u stacionarnu fazu određeno jestacionarnu fazu određeno je

početnom gustoćom stanica u inokulumupočetnom gustoćom stanica u inokulumu kritična kritična početna koncentracija stanica je 9početna koncentracija stanica je 9--15 x 1015 x 1033

stanica/mLstanica/mL

trajanjem lagtrajanjem lag--fazefaze

brzinom rasta stanične linijebrzinom rasta stanične linije

••obično uzgoj kulture započinje velikim početnim obično uzgoj kulture započinje velikim početnim inokulumom (0,5inokulumom (0,5--2,5 x 102,5 x 1055 stanica/mL)stanica/mL)

••do ulaska kulture u stacionarnu fazu broj stanica se poveća do ulaska kulture u stacionarnu fazu broj stanica se poveća na 1na 1--4 x 104 x 1066 stanica/mL (svaka stanica iz početnog stanica/mL (svaka stanica iz početnog inokuluma prošla je kroz 4inokuluma prošla je kroz 4--6 staničnih dioba) 6 staničnih dioba)

Gottlieb Haberlandt(1854-1945)

Hvala na pažnji!