Jure Stojan

2. predavanje

termodinamične osnove,

encimske katalize

encimska kataliza

časovni potek encimske

reakcije

začetna hitrost

Matjaž Zorko

3. predavanje

vplivi na hitrost encimske

reakcije

vpliv substrata (Michaelisova

kinetika)

ravnotežno - stacionarno

stanje

VPLIV:- koncentracije substrata- koncentracije encima- pH- temperature

FFA: Laboratorijska medicina, Molekularna encimologija, 2010/2011 3.predavanje

kA + B → C

2

*

RT

G

eNh

RTk

∆−

⋅=2

A ↔ BK

Encimska kinetika

• Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti (substrati S) v produkte (P): S → P

• Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti(mol/s) V = -d(S)/dt = d(P)/dt

• Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za encimsko aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (SI sistem) = 1mol/s

• Specifična aktivnost encimskega pripravka: aktivnost/mg proteina; enote za specifično aktivnost: μmol/min/mg ali katal/min/mg

A B

•Masa proteinov (vse kroglice) je večja v čaši A kot v čaši B•Št. molekul encima (rdeče kroglice) je enako v obeh čašah – encimska aktivnost enaka v obeh čašah•Encimska aktivnost, izražena na mg proteinov (specifična aktivnost) je večja v čaši B kot v čaši A

Začetna hitrost in vpliv koncentracije substrata

S → P

v = ∆(P)/∆t

Koncentracija substrata se s časom zmanjšuje, zato se zmanjšuje tudi hitrost! → začetna hitrost (vo)……je hitrost pri t = 0

S4 > S3 > S2 > S1

V0=k[S]1

1. order reaction

V0=k[S]0

0. order reaction

Če so nanašali vo v diagram v odvisnosti od [S], so dobili krivuljo nasičenja

Krivulja nasičenja ���� nasičenje E s S

E

ES

S

][][

][

][

]][[

S

K

ES

EK

ES

SE Ss =→=

Henry (1903) in kasneje Michaelis in Mentenova (1913) so skušali na osnovi ravnotežja najti enačbo za popis eksperimentalno dobljene krivulje.

Pogoj: k2 mora biti zelo majhna (k2

sKES

SE=

][

]][[

KAJ SKUŠAMO NAREDITI:1. IZRAZITI [ES], ker vo=k2[ES]2.VPELJATI [Eo], ker je to merljiva količina!

[E] = [Eo] – [ES]

sKES

SESEo=

−

][

]])[[]([�

sKS

SEoES

+=

][

]][[][

sKS

SEoES

+=

][

]][[][

vo=k2[ES]upoštevamo:

sKS

SEokESk

+=

][

]][[][ 22pomnožimo s k2

s

oKS

SEokv

+=

][

]][[2

Vmax=k2[Eo]upoštevamo:s

oKS

SVv

+=

][

][max

[So]>>[Eo]upoštevamo:

zato je [S] = [So]

,in

so

oo

KS

SVv

+=

][

][max

so

oo

KS

SVv

+=

][

][max

1

1

k

kKS

−=

je Michaelis-Mentenova enačba

POZOR: (E) = konst.!

Ker pogoj ravnotežja ni bil v celoti izpolnjen, enačba ni imela splošne veljave – veljala je le za omejeno količino encimov!

Zato so iskali splošno rešitev. Briggs-Haldanov pristop:

STACIONARNO STANJE!

OPIŠI RAZLIKO MED RAVNOTEŽNIM IN STACIONARNIM STANJEM!

RAVNOTEŽNO STANJEZAČETNO STANJE

Višini vode v ‘sodih’ sta odvisni od dotoka in iztoka ter debeline prehodne cevi; pri konstantnem dotoku in iztoku se višini ne spreminjata: STACIONARNO STANJE

[S]o

E+S

E+P

ES

Če je koncentracija ES stalna, mora [ES] enako hitro nastajati kot razpadati!

)]([][][]][[ 21211 kkESESkESkSEk +=+= −−

MKk

kk

ES

SE=

+= −

1

21

][

]][[

Mo

oo

KS

SVv

+=

][

][max

Podobno kot M.- M. dobimo analogno enačbo, ki pa velja za STACIONARNO STANJE, takorekoč splošno:

nastajanje ES razpadanje ES razpadanje ES

)]([]][[ 211 kkESSEk += −

Pag

e 47

9

[ ][ ]SKSV

vM

o+

⋅= max

Michaelis–Mentenova enačba in krivulja

1

21

k

kkKM

+= −

Dvojno recipročni (Lineweaver–Burkov) diagramP

age

480

[ ] maxmax

111

VSV

K

v

M

o

+⋅=

0.2 21

Mo

oo

KS

SVv

+=

][

][max

KDAJ Michaelis-Mentenova ENAČBA VELJA:

1. KADAR SMO V RAZMERAH ZAČETNE HITROSTI

2. KADAR JE [S]>>[E]

3. KADAR IMAMO LE EN AKTIVNI CENTER ali

4. KADAR JE AKTIVNIH CENTROV VEČ, A SO NEODVISNI

PRI KONSTRUKCIJI M.-M. KRIVULJE ALI NJENIH DERIVATOV (L.-B. KRIVULJA) MORAMO DRŽATI [E]O KONSTANTNO!

Pomen Km

• Vmax , Km določimo eksperimentalno

• Km - odraža afiniteto encima do substrata- in tudi fiziološke razmere:

Km ≈ [S]physiol.

≈ = KS≈

POMNI: - velika Km ���� majhna afiniteta encima do substrata

- majhna Km ���� velika afiniteta encima do substrata

KM - odraža afiniteto encima do substrata in nam pove pri katerih koncentracijah substrata bo encim učinkovit!

Pomen KM v fiziologiji

primer: občutljivost Azijcev na alkohol

• Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci

• Reakcije razgradnje alkoholaCH3CH2OH + NAD

+ → CH3CHO + H+ + NADH encim: alkoholna

dehidrogenaza

CH3CHO + NAD+ → CH3COOH + H

+ + NADH encim: aldehidna

dehidrogenaza

• Azijci nimajo izoencimske oblike encima aldehidne dehidrogenazez nizko KM ; posledica: aldehid v krvi dolgo kroži po telesu

Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti

encimov: različna molekulska masa (Mr), različna encimska aktivnost (V0), različna

MM konstanta (Km); izoencime kodirajo različni geni!

kkat

• kkat = k najpočasnejše stopnje v desno! • kkat - pretvorbeno število (turnover number):

število molekul (molov) substrata, ki se pretvori

v produkt na eni molekuli (molu) encima v

časovni enoti (navadno sekundi).

Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število (turnover

number), kkat

Zakaj za mero učinkovitosti encima ne uporabljamo Vmax? Ker je odvisna od koncentracije encima, saj velja enačba:

Vmax=k2[E]o

kkat/Km

vo=kkat[ES]

Vmax=kkat[E]o

1

1

k

kkK katM

+= − Kadar je k2 = kkat!

Mo

oo

KS

SVv

+=

][

][max

A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E

E

QB P

E

EQEA

A

AB

EBEABEPQ

EP

Q P

-

A

EA FA F FB EQ E

P B Q

E - -

urejen sekvenčni mehanizem:

naključni sekvenčni mehanizem:

ping-pong mehanizem:

Bisubstratne reakcije:

Zelo različni mehanizmi!

A A

A

B

B

B

E

A A

A

B

B

B

E

Ping Pong mehanizem [B] = konstanten.

Ping Pong mehanizem [A] = konstanten.

Vsi sekvenčni mehanizmi imajo dvojne

recipročne diagrame, kjer se premice sekajo.

Vpliv koncentracije encima na aktivnost.

Dokler velja [S] >> [E] se s povečanjem [E]

proporcionalno poveča [ES].

Ker velja enačba vo= kkat[ES], velja linearna zveza med voin [E]: če se [E] dvakrat poveča, se tudi vo dvakrat poveča.

vo

[E]

Vpliv pH na aktivnost encima (fumaraza).

Zelo različne krivulje za

različne encime,

navadno so v skladu s

fiziološkim delovanjem

pH profil peptidaze – pomen skupin v

aktivnem mestu encima in v substratu

pKa!

KAJ PA POMEN SKUPIN DRUGJE V STRUKTURI ENCIMA?

Različni encimi – različni pH profili(zaradi različnih disociabilnih skupin v encimu in substratu)

pepsin glukoza-6-fosfataza

Učinek pH je lahko kompleksen –npr. kimotripsin

Cumulative pH effect

pH affects kcat pH affects KM

M

cat

K

kv ∝

pH optimum 17β-HSD

Krivulji temperaturne in pH odvisnosti sta si podobni

2

*

RT

G

eNh

RTk

∆−

⋅=

vo=k2[ES]

T narašča do Topt: več in močnejši trki, zato hitrost narašča!

ToptpHopt

T narašča nad Topt: encim se denaturira, zato hitrost pada!

Razpad IV., III. in II. strukture encima, zato encim ni več aktiven!

Navidezni temperaturni optimum 17β-HSD

Temperaturna stabilnost 17β-HSD

Jure Stojan

4. predavanje

Inhibicija - aktivacija -

modulacija encimske

katalize

hitre kinetične metode

matematično modeliranje -

analiza podatkov

Matjaž Zorko

3. predavanje

vplivi na hitrost encimske

reakcije

vpliv substrata (Michaelisova

kinetika)

ravnotežno - stacionarno stanje

VPLIV:

- koncentracije substrata

- koncentracije encima

- pH

- temperature