PAPEL DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE EN EL … · 2011-01-20 · papel del sistema endocannabinoide en el alcoholismo: estudio en modelos animales irene sánchez vera mÁlaga, 2007

PAPEL DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE EN EL

ALCOHOLISMO: ESTUDIO EN MODELOS

ANIMALES

Irene Sánchez Vera

MÁLAGA, 2007

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR, GENÉTICA Y

FISIOLOGÍA

UNIDAD DE INVESTIGACIÓN HOSPITAL CIVIL

A la memoria de mi abuela Encarna,

A mi madre,

A mi familia

“La vida sólo se puede comprender mirando hacia atrás

pero sólo puede vivirse mirando hacia delante”

Kierkegaard

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

1. LA ADICCIÓN A ALCOHOL.................................................................................1

1.1. PROBLEMAS CLÍNICOS Y SOCIALES..................................................1

1.2. FARMACOLOGÍA DEL ALCOHOL ........................................................2

1.2.1. Metabolismo del Etanol en el Cerebro ......................................2

1.2.2. Interacciones del Etanol con los Sistemas de

Neurotransmisión ......................................................................3

1.2.2.1. Efectos del Etanol sobre el Sistema de

Neurotransmisión GABAérgico ..................................5


Neurotransmisión Glutamatérgico...............................7


Neurotransmisión Dopaminérgico.............................10


Neurotransmisión Opioide.........................................11


Neurotransmisión Serotoninérgico............................12

1.2.2.6. Efectos del Etanol sobre el

Neuromodulador Adenosina......................................14

1.3. SISTEMAS NEUROBIOLÓGICOS IMPLICADOS EN LA

ADICCIÓN A ALCOHOL........................................................................15

1.4. MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO: líneas msP y

AA/ANA....................................................................................................20

1.5. PERSPECTIVAS DE TRATAMIENTO DE LA ADICCIÓN

A ALCOHOL ............................................................................................22

2. EL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE ..............................................................25

2.1. HISTORIA ................................................................................................25

2.2. LIGANDOS EXÓGENOS ........................................................................26

2.3. LIGANDOS ENDÓGENOS .....................................................................27

2.3.1. Biosíntesis de Anandamida .....................................................29

2.3.2. Biosíntesis de 2 araquidonilglicerol ........................................31

2.4. RECEPTORES CANNABINOIDES ........................................................33

2.4.1. Mecanismos de Transducción de Seńales ...............................35

2.5. NEUROFARMACOLOGÍA DEL SISTEMA

ENDOCANNABINOIDE .........................................................................37

3. ALCOHOL Y SISTEMA ENDOCANNABINOIDE ...........................................43

3.1. Efectos Agudos del Alcohol sobre el Sistema

Endocannabinoide .....................................................................................43

3.2. Efectos Crónicos del Alcohol sobre el Sistema

Endocannabinoide .....................................................................................43

3.3. Interacción de Cannabinoides y Alcohol: una Nueva Diana

para el Tratamiento....................................................................................45

OBJETIVOS

MATERIALES Y MÉTODOS

1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN..............................................................55

1.1. RATAS WISTAR......................................................................................55

1.2. MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO......................................55

1.2.1. Ratas AA .................................................................................55

1.2.2. Ratas msP ................................................................................56

1.3. ADMINISTRACIÓN DE ALCOHOL......................................................57

1.3.1. Tratamientos Intraperitoneales de Etanol ................................57

1.3.2. Entrenamiento Operante y Autoadministración de

Alcohol ....................................................................................58

1.4. CIRUGÍA ..................................................................................................60

1.5. ADMINISTRACIÓN DE DROGAS ........................................................60

1.6. MICRODIÁLISIS IN VIVO .....................................................................61

1.7. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA Y LA

TEMPERATURA CORPORAL ...............................................................62

1.8. DISECCIONES DE CEREBROS DE RATA...........................................63

2. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA DEL SISTEMA

ENDOCANNABINOIDE........................................................................................65

2.1. PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL .............................................65

2.1.1. Puesta a Punto de la PCR cuantitativa.....................................66

2.1.1.1. Diseño de los Cebadores .....................................66

2.1.1.2. Determinación de la Temperatura de

Alineamiento de los Cebadores ...........................66

2.1.1.3. Secuencia de los Cebadores y

Temperatura de Alineamiento .............................67

2.1.1.4. Producción y Purificación del

Estándar ..............................................................68

2.1.2. Extracción de ARN total..........................................................69

2.1.3. Limpieza del ARN total...........................................................69

2.1.4. Cuantificación del ARN ..........................................................70

2.1.5. Electroforesis de ARN.............................................................70

2.1.6. Transcripción Reversa ...........................................................171

2.1.7. PCR Cuantitativa a Tiempo Real...........................................172

2.2. HIBRIDACIÓN in situ DEL ARNm DEL RECEPTOR

CANNABINOIDE CB1 EN MODELOS ANIMALES DE

ALCOHOLISMO (líneas AA y msP) .......................................................75

2.2.1. Procesamiento de los Cerebros................................................75

2.2.2. Producción de la ribosonda de CB1 ........................................76

2.2.3. Hibridación in situ ...................................................................76

2.2.4. Obtención de datos ..................................................................77

3. CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN PROTEICA

MEDIANTE INMUNOHISTOQUÍMICA............................................................78

3.1. Procesamiento del Tejido ..........................................................................78

3.2. Inmunohistoquímica ..................................................................................79

3.3. Cuantificaciones ........................................................................................80

4. ANÁLISIS DE LA FUNCIONALIDAD PROTEICA..........................................83

4.1. Extracción de Membranas .........................................................................83

4.2. Cuantificación de Proteínas .......................................................................83

4.3. Ensayo de la Actividad Enzimática de la Amidohidrolasa de

Ácidos Grasos (FAAH) .............................................................................85

4.4. Ensayo de la Actividad Enzimática de la Transferasa de grupo

N-acilo (NAT) ...........................................................................................86

4.5. Ensayo de Unión del receptor CB1 ...........................................................86

4.6. Ensayo de Acoplamiento del receptor CB1...............................................87

5. MEDIDAS BIOQUÍMICAS ...................................................................................87

5.1. MEDIDA DE LOS NIVELES DE ETANOL EN PLASMA....................87

5.2. ANÁLISIS DEL CONTENIDO ENDOCANNABINOIDE .....................88

5.2.1. Ratas Wistar.............................................................................88

5.2.2. Ratas AA y ANA.....................................................................89

5.3. ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE GLUTAMATO ...............................90

6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO....................................................................................92

7. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES ................................................................93

7.1. Extracción de ARN total ...........................................................................93

7.2. Purificación del ARN total ........................................................................94

7.3. Transcipción Reversa ................................................................................95

7.4. PCR Cuantitativa a Tiempo Real...............................................................96

7.5. PCR para la determinación de la Temperatura de Alineamiento

de los Cebadores........................................................................................97

7.6. Producción del Estándar mediante PCR....................................................97

7.7. Purificación del Estándar...........................................................................98

7.8. Inmunohistoquímica de CB1.....................................................................99

7.9. Inmunohistoquímica de FAAH ...............................................................100

7.10. Inmunohistoquímica de MAGL ..............................................................101

7.11. Inmunohistoquímica de NAPE-PLD.......................................................101

7.12. Ensayo de la Actividad Enzimática FAAH .............................................102

7.13. Ensayo de la Actividad Enzimática NAT................................................103

7.14. Ensayo de Unión del receptor CB1 .........................................................104

7.15. Ensayo de Acoplamiento del receptor CB1.............................................105

7.16. Medida de Etanol en ...............................................................................105

7.17. Soluciones de Uso Común.......................................................................106

RESULTADOS

1. TRATAMIENTO AGUDO DE ETANOL ..........................................................111

1.1. Medida de los Niveles de Etanol y Anandamida en Plasma y

Tejidos Periféricos...................................................................................111

1.2. Medida de los Niveles de Endocannabinoides en Cerebro......................112

1.3. Medida de la Actividad Enzimática FAAH.............................................115

1.4. Medida de la Actividad Enzimática NAT ...............................................117

1.5. Medida de los niveles de ARNm del Sistema

Endocannabinoide ...................................................................................117

1.6. Inmunohistoquímica de CB1 y FAAH ....................................................119

1.7. Medida de los niveles de Anandamida y Glutamato en

Estriado Ventral.......................................................................................129

1.8. Medida de la Temperatura Corporal y Actividad Locomotora ...............131

2. TRATAMIENTO CRÓNICO DE ETANOL......................................................132

2.1. Medida de los niveles de ARNm del Sistema

Endocannabinoide ...................................................................................132

2.2. Inmunohistoquímica de CB1 y FAAH ....................................................134

3. DISCUSIÓN PARCIAL........................................................................................144

4. MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO ...............................................145

4.1. Ratas AA y ANA.....................................................................................145

4.1.1. Medida de los niveles de ARNm del Sistema

Endocannabinoide .................................................................145

4.1.2. Medida de la Actividad Enzimática FAAH...........................146

4.1.3. Medida de los Niveles de Endocannabinoides ......................147

4.1.4. Estado Funcional del Receptor Cannabinoide CB1 ..............147

4.1.5. Medida de la Expresión Génica del Receptor CB1

mediante Hibridación in situ .................................................148

4.1.6. Efecto del antagonista SR141716A sobre la

Autoadministración de Alcohol.............................................150

4.2. Ratas msP y Wistar..................................................................................152

4.2.1. Medida de los niveles de ARNm de CB1 mediante

Hibridación in situ .................................................................152

4.2.2. Medida de los niveles de ARNm del Sistema


4.2.3. Medida de la Expresión Proteica del Sistema


DISCUSIÓN

1. Papel General del Sistema Endocannabinoide en el Alcoholismo ....................161

2. Acciones Agudas del Etanol y Adaptación Crónica ...........................................163

2.1. Acciones Agudas del Etanol....................................................................163

2.2. Acciones Crónicas del Etanol..................................................................165

3. Selección de Preferencia Alcohólica y Sistema Endocannabinoide ..................168

4. Implicaciones Terapéuticas ..................................................................................173

4.1. Dependencia Severa a Alcohol y Sistema Endocannabinoide ................173

4.2. Recaídas y Sistema Endocannabinoide ...................................................173

4.3. Futuro: Tratamiento del Alcoholismo con Fármacos del

Sistema Endocannabinoide......................................................................177

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

ABREVIATURAS

A: adenina

ADH: alcohol deshidrogenasa

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ADN complementario

AEA: anandamida o araquidoniletanolamida

AM404: N-araquidonoilfenolamina; inhibidor del transportador de anandamida

AMPA: ácido α-amino 3-hidroxi 4-metil 5-ixazol propiónico

1-AG: 1-araquidonilglicerol

2-AG: 2-araquidonilglicerol

ALDH: aldehído deshidrogenasa

AMPc: 3’,5’-adenosínmonofosfato cíclico

AT: transportador de anandamida

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ARNt: ácido ribonucleico transferente

ATP: trifosfato de adenosina

ATV: área tegmental ventral

AP: antero-posterior

BAC: concentración de alcohol en sangre

BZD: benzodiacepinas

C: citosina

Ca2+: ión calcio

CB: receptor cannabinoide

CB1: receptor cannabinoide tipo 1

CB2: receptor cannabinoide tipo 2

Cl- : iones cloro

Cpm: cuentas por minuto

CP-55,940: 3-(2-hidroxi-4-(1,1-dimetil heptil)fenil)-4-(3-hidroxipropil)ciclohexanol; agonista de los receptores cannabinoides

CPF: corteza prefrontal

CPu: núcleos caudado y putamen

CT: ciclo umbral

CYP450: citocromo P450

DA: dopamina

DAB: tetracloruro de diaminobenzidina

DAG: diacilglicerol

DAGL: lipasa de diacilglicerol

dATP: desoxiadenosina trifosfato

dCTP: desoxicitosina trifosfato

DEPC: dietil pirocarbonato

dGTP: desoxiguanosina trifosfato

DMSO: dimetil sulfóxido

dNTP: dinucleótidos trifosfato

D.O.: densidad óptica

Dpm: desintegraciones por minuto

DSE: supresión de la excitación inducida por despolarización

DSI: supresión de la inhibición inducida por despolarización

DTT: ditiotreitol

dTTP: desoxitimidina trifosfato

DV: dorso-ventral

2E1: subtipo 2E1 del citocromo P450

FAAH: amidohidrolasa de ácidos grasos

G: guanina

GABA: ácido γ-aminobutírico

GABAA: subtipo A del receptor del ácido γ-aminobutírico

GABAB: subtipo B del receptor del ácido γ-aminobutírico

GAPDH: deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato

Gi/o: proteína G inhibidora/estimuladora

Glu: glutamato

GTPγS: guanosina 5’(γ-tio)trifosfato

GUS: β-glucuronidasa

HB-β-CD: hidroxipropil-β-ciclodextrina

HCl: ácido clorhídrico

HEPES: ácido N-2-hidroxietil-piperazin-N’-2-etanosulfónico

HRP: peroxidasa de rábano

5-HT1A: subtipo 1A del receptor de 5-hidroxitriptamina o serotonina

5-HT1B: subtipo 1B del receptor de 5-hidroxitriptamina o serotonina

5-HT2: subtipo 2 del receptor de 5-hidroxitriptamina o serotonina

5-HT3: subtipo 3 del receptor de 5-hidroxitriptamina o serotonina

HU-210: (6aR,10aR)-3-(1,1’-dimetilheptil) -6a,7,10,10a-tetrahidro-1-hidroxi-6,6-dimetil-6H-dibenzo[b,d]piran-9-metanol; agonista de receptores cannabinoides

i.p.: intraperitoneal

K+: ión potasio

LTD: depresión a largo plazo

LTP: potenciación a largo plazo

Lyso-PLD: lyso fosfolipasa D

MAGL: lipasa de monoacilgliceroles

MAPK: proteína quinasa activada por mitógeno

MeOH: metanol

MEOS: sistema microsomal de oxidación de etanol

Mg2+: ión magnesio

ML: medio-lateral

Na+: ión sodio

NADH: dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido

NAPE: N-araquidonilfosfatidiletanolamida

NAPE-PLD: fosfolipasa D de N-araquidonilfosfatidiletanolamida

NAT: transferasa de grupo N-acilo

NMDA: N-metil D-aspartato

pb: pares de bases

PB: tampón fosfato

PBS: tampón fosfato salino

PC: fosfatidilcolina

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

PE: fosfatidiletanolamina

PEA: palmitoiletanolamida

PES: polietersulfona

PKA: proteína quinasa A

Ratas AA: ‘Alko-Alcohol’, ratas con preferencia al alcohol

Ratas ANA: ‘Alko, Non-Alcohol’, ratas con aversión al alcohol

Ratas sP: ‘Sardinian alcohol-Preferring’; ratas con preferencia al alcohol

Ratas msP: ‘Marchigian Sardinian alcohol-Preferring’; ratas con preferencia al alcohol

Rpm: revoluciones por minuto

RT: transcripción reversa

RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa mediante transcripción reversa

SCC: tampón citrato sódico salino

SDS: dodecilsulfato sódico

SEC: sistema endocannabinoide

SEM: error estándar de la media

SNC: sistema nervioso central

SR141716A ó Rimonabant: N-(piperidin-1-il) -5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-carboxamida hidroclorida; agonista inverso del receptor cannabinoide CB1

SR147778: [5-(4-bromofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-etil-N-(1-piperidinil)-1H-pirazol -3-carboxamida]; antagonista del receptor cannabinoide CB1

T: timina

TBE: tampón Tris-EDTA-Borato

TE: tampón Tris-EDTA

Δ8THC: delta-8 tetrahidrocannabinol

THC ó Δ9THC: delta-9 tetrahidrocannabinol

Tm: temperatura de fusión

URB597: [3-(3-carbamoilfenil)fenil] N-ciclohexilcarbamato; inhibidor de la enzima FAAH

UTP: uridintrifosfato

WIN 55,212-2: (R)-(+)-[2,3-dihidro-5-metil-3-(4-morfolinilmetil)pirrolo-[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-il]-1-naftalenil-metanonemesilato; agonista de receptores cannabinoides

INTRODUCCIÓN

Introducción

- 1 -

1. LA ADICCIÓN A ALCOHOL

1.1 - PROBLEMAS CLÍNICOS Y SOCIALES

La adicción podría definirse como la pérdida de control sobre la droga de abuso

o como la búsqueda y consumo compulsivo, a pesar de sus consecuencias adversas

(Nestler, 2001).

El consumo de alcohol es una de las principales causas que generan problemas

de salud en los países desarrollados (Mokdad et al., 2005). La mayoría de los efectos

adversos a la salud son resultado de un consumo crónico, consecuencia de la

dependencia al alcohol (alcoholismo). El alcoholismo es un desorden clínicamente

definido donde el individuo que lo padece pierde el control de su comportamiento, de

modo que tiende a perpetuar el consumo, desarrollando a su vez tolerancia a medida que

consume más y abstinencia cuando deja de consumir.

El consumo agudo se refiere a los primeros contactos con la droga, en los cuales

se dan tanto los efectos a corto plazo del etanol, que llevan al estado de embriaguez,

como los que activan al sistema de recompensa, que van a promover un consumo

posterior más frecuente. No obstante, el consumo crónico de alcohol expone también al

individuo diariamente a las consecuencias agudas de su consumo, esto es, sedación,

hipnosis, euforia, alteración de la conducta motora y de la memoria, etc. Estos efectos

son de una enorme importancia pues afectan a la actividad diaria del sujeto (su

capacidad para conducir, la relación con su entorno familiar y laboral,…). La

exposición prolongada y/o excesiva al alcohol lleva además a padecer problemas de

salud secundarios (alteraciones neurológicas y cardiovasculares, hepatitis, cáncer,

síndrome de alcoholismo fetal, etc.).

Las condiciones que llevan al consumo excesivo de alcohol en unos individuos y

no en otros son complejas ya que implican interacciones entre factores genéticos y

ambientales (Enoch y Goldman, 2001). Existe el convencimiento de que determinados

factores genéticos pueden contribuir a la predisposición al alcoholismo, y que diferentes

subtipos de alcohólicos estarían afectados, a diferentes niveles, por los factores

genéticos y ambientales (Cloninger, 1987).

Introducción

- 2 -

Al contrario que la mayoría de drogas de abuso, el alcohol actúa sobre una gran

variedad de sistemas receptores y neuroquímicos (Glutamato, GABA, Glicina, Serina,

etc.), tanto para provocar la sintomatología típica del consumo agudo como para actuar

de reforzante positivo e inducir dependencia.

1.2 - FARMACOLOGÍA DEL ALCOHOL

El alcohol se metaboliza en el organismo en una reacción en dos pasos: una

inicial en la que se genera acetaldehído, proceso catalizado por la enzima alcohol

deshidrogenasa (ADH) y otra secundaria que transforma el acetaldehído en ácido

acético, proceso catalizado por la enzima acetaldehído deshidrogenasa (ALDH). En la

presente tesis se analizarán las acciones farmacológicas del alcohol en cerebro.

1.2.1 – Metabolismo del Etanol en el Cerebro

En el cerebro la enzima ADH clase I, que en el hígado es la principal oxidante

del etanol a concentraciones bajas y moderadas, posee una actuación muy limitada

(Raskin y Sokoloff, 1972). En el cerebro de humanos y ratones, la isoforma más

abundante es la clase III (Rout, 1992), aunque tiene baja afinidad por el etanol y

Mitocondria

Ácido Acético

NADH

Etanol Acetaldehído

NADH

1

Metabolismo del etanol. El etanol es oxidado a acetaldehído por acción de la ADH (alcohol deshidrogenasa) (1) en el citosol, reacción en la que se genera NADH. El acetaldehído difunde al interior de la mitocondria donde es sustrato de la enzima ALDH (acetaldehído deshidrogenasa) (2) que lo convierte en ácido acético generándose en dicha reacción NADH.

2

Introducción

- 3 -

difícilmente es activada por éste ya que, incluso en intoxicaciones etílicas severas, no se

alcanzan las concentraciones necesarias para que su contribución sea relevante.

Se ha descrito también la presencia de citocromos pertenecientes al complejo

enzimático Meos y se ha demostrado que el CYP450 cerebral es inducido por el etanol,

como ocurre en el hígado (Upadhya et al., 2000). La presencia e inducción de esta

enzima en cerebro reviste mucha importancia ya que, al existir evidencias de que el

subtipo 2E1 hepático es normalmente inducido por los sustratos que metaboliza, su

inducción cerebral es una prueba indirecta para la hipótesis de la oxidación cerebral del

etanol a acetaldehído. De esta forma, aunque sólo sean oxidadas cantidades muy

pequeñas de alcohol en el cerebro, la generación local de acetaldehído podría tener

consecuencias funcionales importantes: esta inducción ha sido asociada con los efectos

tóxicos el etanol y la alteración de las membranas neuronales (Montoliu et al., 1994).

Finalmente, existe un gran número de pruebas que constatan que el sistema

catalasa-peróxido de hidrógeno se halla presente y activo en el Sistema Nervioso

Central (SNC; Zimatkin y Deitrich, 1995). Algunas investigaciones han presentado

pruebas indirectas de la oxidación de etanol a acetaldehído en el cerebro de rata, vía este

sistema enzimático (Aragón et al., 2002). Estos datos nos sugieren que, aunque la

cantidad total de acetaldehído que pueda producirse en el encéfalo a través de la catalasa

sea pequeña, existe la posibilidad de que se produzcan acumulaciones de acetaldehído

suficientes para provocar cambios en la fisiología y la actividad de determinados grupos

neuronales (Aragón et al., 2002).

1.2.2 – Interacciones del Etanol con los Sistemas de Neurotransmisión

Antes de los años ’70, se aceptaba que el etanol ejercía sus efectos centrales a

través de una fluidificación inespecífica de las membranas neuronales (Seeman, 1972)

ya que se consideraba dudoso, dada la simplicidad de su estructura química, que pudiera

existir un receptor. Esta hipótesis se basaba en el hecho de que el etanol es soluble tanto

en agua como en lípidos y proponía que los efectos agudos del etanol serían debidos a

un aumento de la fluidez de la membrana neuronal mientras que el consumo crónico, de

Introducción

- 4 -

manera compensatoria, aumentaría la rigidez de la membrana con la consiguiente

alteración de las funciones (Tabakoff y Hoffman, 1996).

A medida que empezaron a comprenderse el papel de los neurotransmisores y

receptores en el SNC, comenzó a admitirse que el etanol podría llegar a alterar la

neurotransmisión central. Ahora está claro que el etanol no sólo afecta a un sistema de

neurotransmisión sino que tiene, de hecho, múltiples dianas en el SNC (tabla 1).

A partir de los años ’80 muchos estudios se centraron en definir, para los

neurotransmisores aminoacídicos, el papel inhibidor y excitador de las acciones

centrales del etanol. En la actualidad se sabe que el etanol interactúa con determinadas

proteínas situadas en la membrana neuronal y que son responsables de la transmisión de

señales. Entre las dianas sobre las que el etanol actúa se encuentran canales iónicos,

transportadores, receptores, proteínas G y proteínas-quinasas.

La administración forzada, en ratas, de dosis intoxicantes de etanol está asociada

con cambios neuroadaptativos en muchos sistemas de neurotransmisores y mecanismos

de transducción (Diamond y Gordon, 1997). Los sistemas de GABA y glutamato sufren

estas alteraciones funcionales, siendo éstos los dos mayores neurotransmisores

inhibitorios y excitadores respectivamente, y las neuronas que los utilizan constituyen

más del 80% de las neuronas del cerebro.

Sistema Efecto Farmacodinámico Efecto Clínico

NMDA - Sedación, amnesia

GABAA + Sedación, activación, euforia, ansiólisis

5- HT3 + Ansiólisis, náuseas

DA + Activación, euforia

OPIOIDE + Euforia

MUSCARÍNICO + Amnesia

ADENOSINA - Incoordinación, sedación

Tabla 1. Efectos agudos del etanol sobre diferentes Sistemas de Neurotransmisión a nivel farmacodinámico y clínico. (-) = inhibidor; (+) = activador.

Introducción

- 5 -

1.2.2.1 - Efectos del Etanol sobre el Sistema de Neurotransmisión GABAérgico

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibidor en el

cerebro y actúa a través de dos receptores (GABAA y GABAB) los cuales están

ampliamente distribuidos en cerebro, cerebelo y tronco cerebral.

Las neuronas sensibles a GABA generalmente también tienen receptores de

glutamato en su membrana, de forma que GABA regula la liberación de glutamato

permitiendo así un equilibrio que mantiene la excitabilidad neuronal en general (Fadda

y Rosseti, 1998).

El receptor GABA es un canal de iones cloro que contiene múltiples sitios de

unión destacando: el sitio al que se une GABA, el sitio donde interaccionan

benzodiacepinas (BZD) y un tercero donde actúan, entre otros, los barbitúricos. Aún no

se ha descubierto la existencia de un sitio específico de unión para el etanol. Este

receptor está formado por diferentes subunidades proteicas, cada una de la cuales tiene

entre 1 y 6 variantes, cuya combinación genera las diferentes isoformas existentes.

En la intoxicación aguda por etanol se potencia la acción del GABAA, lo cual

favorece el flujo masivo de aniones Cl- en el interior de las neuronas. Ello conlleva una

hiperpolarización neuronal y disminución de la excitabilidad, que explicaría en parte los

efectos depresores del alcohol sobre el SNC.

El etanol actúa sobre el receptor GABAA potenciando el efecto de cualquiera de

los compuestos que interaccionan con este último (BZD, barbitúricos), aunque por

Esquema del receptor GABAA donde se muestran los sitios de unión a GABA y a benzodiacepinas.

Introducción

- 6 -

mecanismos diferentes. Esto explicaría la tolerancia cruzada que se observa entre ellos,

su capacidad de paliar la sintomatología de abstinencia así como, en el caso del alcohol,

los efectos ansiolíticos, la ataxia, disminución de reflejos y, con dosis mayores, la

amnesia y el coma (Nutt, 1999). Buen ejemplo de ello es que las BZD pierden su

capacidad de incrementar los efectos producidos por GABA en ratones continuamente

expuestos a alcohol (Buck y Harris, 1990). El incremento de GABA, por inhibición de

su degradación, también incrementa los efectos que tiene sobre el comportamiento del

etanol y, de acuerdo con esto, la reducción de la actividad de GABAA reduciría los

signos de intoxicación del alcohol así como sus efectos ansiolíticos (Grobin et al.,

1998).

Sin embargo, debido a la heterogeneidad de las subunidades del receptor

GABAA, el efecto estimulante del etanol varía según la región del cerebro estudiada.

Así, en cerebelo, el etanol interacciona con las células de Purkinje, encargadas de la

posición corporal en el espacio y la coordinación motora, y con las células granulares

concretamente con un subtipo de receptor GABAA que posee la subunidad a6. La

inhibición, debida a la potenciación que el etanol ejerce sobre GABA, induce los

síntomas cerebelosos de intoxicación alcohólica como aumento del balanceo corporal e

incoordinación motora.

El consumo crónico de alcohol tiene el efecto opuesto al del consumo a corto

plazo (Devaud, 2001) ya que lleva a una disminución de la hiperpolarización por

GABA, reduciendo la inhibición neuronal, lo que podría contribuir a la aparición de

tolerancia a etanol. Esta regulación a la baja se da tras exposiciones prolongadas a los

ligandos de este receptor y el grado de dicha regulación depende de la dosis y duración

de la exposición.

Diversos estudios han demostrado que el consumo crónico altera

diferencialmente la expresión del receptor GABAA en la corteza cerebral y el cerebelo

(Devaud et al., 1995). Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la tolerancia a etanol

implica la reducción en el número o función del receptor GABAA, lo que conlleva a una

disminución en la sensibilidad hacia los neurotransmisores. Dichas alteraciones podrían

contribuir a los síntomas de la abstinencia como hiperexcitabilidad y temblores

(Dahchour y De Witte, 2000).

Introducción

- 7 -

1.2.2.2 - Efectos del Etanol sobre el Sistema de Neurotransmisión Glutamatérgico

El glutamato es el principal neurotransmisor excitador en el SNC y ejerce su

acción a través de tres subtipos de receptores: el receptor metabotrópico kainato y los

receptores ionotrópicos N-metil D-aspartato (NMDA) y ácido α-amino 3-hidroxi 4-

metil 5-ixazol propiónico (AMPA).

Los receptores NMDA están compuestos por la subunidad NR1 y al menos una

subunidad NR2, siendo las subunidades identificadas en dicho receptor: NR1, NR2 (A-

D) y NR3 (A y B). Estos receptores están acoplados a canales iónicos sensibles a voltaje

permeables a iones Ca2+ y cationes monovalentes como Na+ y K+. La unión del

glutamato al receptor NMDA promueve la entrada de calcio en la célula, cuya

activación da lugar a un aumento en la permeabilidad de Na+, K+ y Ca2+, lo cual se

traduce en una despolarización de la membrana neuronal. Al igual que en el caso del

receptor GABAA, existe una gran variabilidad local y regional en las acciones del etanol

Receptor GABAA

Exposición Crónica a Etanol

Intracelular

Extracelular

No Alcohol Exposición Aguda a Etanol

Los receptores GABAA, en presencia de GABA, se abrirán para permitir la entrada de iones Cl-, hiperpolarizando la membrana (figura de la izquierda). La administración aguda de etanol aumenta lo efectos del GABA, permitiendo una mayor entrada de Cl- hacia la célula (figura del centro). Tras exposición prolongada a etanol, disminuyen los efectos sobre el receptor, disminuyendo la inhibición y el flujo de Cl- (figura derecha). De esta forma, el tono inhibitorio de la neurona aumenta agudamente con etanol pero se reduce tras la exposición prolongada a etanol.

Introducción

- 8 -

sobre el receptor NMDA. Parte de esta diferente sensibilidad depende de las

subunidades que componen el receptor.

El receptor NMDA es el más afectado por el alcohol, inhibiendo la entrada de

iones calcio, lo cual puede contribuir a la liberación de otros neurotransmisores tales

como la dopamina o noradrenalina. Esta acción antagónica del etanol es responsable, en

parte, de sus efectos sedantes.

La actividad de los receptores NMDA está implicada en el aprendizaje

asociativo y juega un importante papel en el daño cerebral producido por un golpe o una

excesiva actividad glutamatérgica tras continuados ataques. Dichos receptores también

participan en otros efectos del alcohol como la pérdida de memoria asociada con la

intoxicación, el daño cerebral tras el consumo crónico y el efecto rebote responsable del

comportamiento hiperactivo durante la retirada.

El etanol reduce la liberación de glutamato en el hipocampo alterando la

memoria espacial. La pérdida de efectividad en los receptores y la disminución de

liberación de neurotransmisores podrían generar pérdida de memoria transitoria durante

la intoxicación (Diamond y Gordon, 1997).

Esquema del receptor ionotrópico NMDA donde se muestran los sitios de unión de glutamato, glicina y Zn2+

así como el lugar donde se une el ión Mg2+ gracias al cual se bloquea el flujo de iones a través del canal.

Introducción

- 9 -

No se sabe exactamente cómo se produce el efecto del etanol sobre el receptor

NMDA, ya que la acción bloqueante no parece ejercerse ni en el sitio de unión del

glutamato ni en ninguno de los sitios moduladores hasta ahora conocidos, como son el

de la glicina o el de la poliamina. El etanol tampoco interacciona con el lugar donde el

Mg2+ bloquea el canal y por sí mismo no es capaz de cerrar los canales abiertos. No

obstante, algunos autores describen el dominio M3 de la subunidad NR1 y el dominio

M4 de la subunidad NR2A como posibles lugares de acción del alcohol (Ren et al.,

2003, 2007; Honse et al., 2004).

Durante el tratamiento crónico, los cambios en la neurotransmisión excitadora

son importantes en el desarrollo de dependencia, tolerancia y síndrome de abstinencia.

En adultos el consumo crónico conduce a un incremento en el número de receptores

NMDA en respuesta a la bajada en la actividad del glutamato, observándose en áreas

cerebrales como hipocampo y cerebelo. Estudios con ratas muestran que la liberación de

glutamato, normalmente inhibida por etanol, incrementa drásticamente tras 10 horas del

cese a la exposición a etanol (Fadda y Rossetti, 1998). Estos hechos explicarían los

ataques y la hiperexicitabilidad que tienen los alcohólicos durante la retirada. Un exceso

de la actividad de glutamato, durante la retirada, contribuye a la muerte celular lo cual,

frecuentemente, conlleva daños cerebrales irreversibles.

Por otro lado, existen evidencias que implican a los receptores metabótropicos

en el consumo y comportamiento de búsqueda de etanol ya sea mediante la activación

de determinados subtipos de receptores (mGlu2/3 y mGlu8) o por su inhibición

(mGlu5) (Cowen et al, 2005; Bäckström e Hyytiä, 2005; Adams et al., 2007). Está

descrito también que la potenciación de los receptores AMPA revierte los efectos

centrales de la intoxicación aguda del etanol (Jones et al., 2007).

Todo ello lleva a pensar que los cambios neuroadaptativos en el sistema

glutamatérgico podrían tener relevancia en las alteraciones neuropatológicas, inducidas

por la exposición crónica a etanol, en el cerebro de animales de experimentación y en

humanos. Por estas razones el alcoholismo se ha considerado como un desorden

neuropsiquiátrico causado por el glutamato (Fadda y Rossetti, 1998).

Introducción

- 10 -

1.2.2.3 – Efectos del Etanol sobre el Sistema de Neurotransmisión Dopaminérgico

Existen varias evidencias que convergen en demostrar que el sistema

mesolímbico dopaminérgico interviene de manera significativa en los mecanismos

motivacionales y de refuerzo relacionados con el comportamiento (Dulawa et al., 1999;

Giros et al., 1996). De hecho, el efecto reforzador positivo de las sustancias psicotropas

está relacionado con su capacidad de activar a este sistema. Parte de él pertenece a la

red cerebral que integra las emociones, mediante respuestas hormonales, y a la actividad

del sistema nervioso simpático. El core del núcleo accumbens es una de dichas

estructuras (Heimer et al., 1997) encargada de modular el movimiento y de combinar

procesos implicados en los estados de motivación, contenido emocional y respuestas

motoras (DiChiara, 1997). El papel de esta área en producir el refuerzo, que conduce a

la repetida ingestión de drogas, ayuda a explicar la naturaleza adictiva del alcohol.

El etanol aumenta la liberación de dopamina en áreas como el núcleo accumbens

(DiChiara, 1997) y, administrado de manera aguda, actúa sobre el ATV incrementando

la frecuencia de descarga de las neuronas dopaminérgicas mediante la atenuación de las

interneuronas GABAérgicas. En este sentido, se ha demostrado que la inyección de

inhibidores de dopamina disminuye la autoadministración de alcohol en ratas.

Un posible mecanismo responsable del significado anormal de los incentivos

asociados al alcohol sería la naturaleza no adaptativa de la estimulación dopaminérgica,

accionada por el alcohol, en el núcleo accumbens. Los reforzadores naturales (como la

comida) inducen rápidamente habituación y la presencia repetida de estímulos

relacionados no provoca un aumento de la dopamina. Por el contrario, tras el consumo

repetido de etanol, no ocurre habituación y como resultado de la persistente liberación

de dopamina, en el núcleo accumbens, los estímulos asociados adquirirían un

significado emocional y motivacional anormal que resultaría en un control excesivo

sobre la conducta del bebedor (DiChiara, 1997).

Por el contrario, durante la retirada, en ratas que consumen crónicamente

alcohol, disminuye la tasa de disparo y la liberación de dopamina en el core del núcleo

accumbens (Diana et al., 1993) lo que conduce al típico bajo estado anímico en

personas alcohólicas. De hecho, la retirada de alcohol se relaciona con emociones

negativas como el malestar y depresión, demostrable sólo mediante la elevación de los

umbrales de autoestimulación intracraneal en ratas (Schulteis et al., 1995).

Introducción

- 11 -

Diversos estudios describen que la abstinencia a etanol está asociada a una

denervación temporal dopaminérgica, tal y como lo demuestran los signos de catatonia

y temblores que acompañan al síndrome de abstinencia en ratas (Lal et al., 1998). De

hecho, en alcohólicos, existen evidencias de que puede estar asociada a síntomas

parkinsonianos que desaparecen tras varios meses de abstinencia (Fadda y Rossetti,

1998).

La destrucción de los terminales mesolímbicos dopaminérgicos no anula

completamente la autoadministración de alcohol en ratas, lo cual sugiere la existencia

de otros mecanismos independientes de la dopamina que contribuirían a las propiedades

reforzadoras del alcohol. Uno de esos mecanismos podría ser el sistema opioide.

1.2.2.4 – Efectos del Etanol sobre el Sistema de Neurotransmisión Opioide

El sistema opioide de neurotransmisores peptídicos lo constituyen endorfinas y

encefalinas las cuales son sustancias endógenas que modulan el dolor, la alimentación,

el humor, el control de la voluntad y las respuestas ante el estrés. El etanol y los

opiáceos presentan efectos farmacológicos y adictivos similares por lo que podrían tener

un sustrato neurobiológico común. De hecho, las endorfinas y encefalinas están también

relacionadas con el refuerzo al alcohol (Froelich, 1997).

La administración de alcohol incrementa la actividad opioide endógena tanto en

ratas como en humanos, mostrando una mayor liberación en sangre y en secciones

cerebrales así como un incremento de la expresión génica de encefalinas y endorfinas en

cerebro (Guardia, 2001).

En bebedores ocasionales la liberación de dopamina, inducida por el alcohol,

podría producir refuerzo debido a que tal liberación está regulada por opioides (Herz,

1997). A su vez, se piensa que la activación del sistema opioide podría estar relacionada

con la recompensa.

Por el contrario, el consumo crónico suele conducir a una reducción de los

niveles de endorfinas en cerebro lo que se percibe como abstinencia opioide. Ello lleva

a desarrollar estados emocionales negativos, que se dan en la retirada de alcohol, y

promueve su consumo.

Introducción

- 12 -

La disminución de la respuesta opioide en el núcleo accumbens refleja la

existencia de una respuesta neuroadaptativa al aumento de liberación de dopamina

mientras que el aumento de respuesta de los receptores opioides, en la amígdala, está

asociado a las acciones ansiolíticas inducidas por el alcohol (Bodnar y Hadjimarkou,

2002).

Se ha demostrado que el bloqueo de los receptores opioides disminuye

significativamente la autoadministración en animales. En humanos, que abusan del

alcohol, las sustancias que interfieren con la actividad opioide disminuyen la ingesta, la

recaída, el fuerte deseo de consumo y la euforia subjetiva producida por el alcohol

(Meyer y Quenzer, 2005).

Por último, las cepas genéticas de animales que difieren en su preferencia por el

alcohol también lo hacen en sus sistemas opioides. Las cepas con preferencia por el

alcohol tienen sistemas opioides que responden más ante el alcohol. A bajas dosis de

morfina incrementan el consumo de alcohol, teóricamente a través de un efecto

principal, mientras que con dosis de moderadas a altas de morfina producen una

disminución del consumo de alcohol debido a que se anularía la función de los opioides

endógenos (Herz, 1997).

1.2.2.5 – Efectos del Etanol sobre el Sistema de Neurotransmisión Serotoninérgico

La serotonina juega un importante papel en la regulación del humor, la

alimentación, excitación, sueño, dolor, entre muchos otros comportamientos (Carlson,

1998).

Muchas neuronas serotonérgicas están localizadas en el núcleo del raphe el cual

está implicado en funciones como la atención, emoción y motivación. Los axones de las

neuronas de dicho núcleo se proyectan a numerosas regiones del cerebro como la

amígdala y el núcleo accumbens (Guerri, 2000).

El consumo agudo de alcohol incrementa la liberación de serotonina en el

sistema nervioso lo que tiene efectos a nivel comportamental (emociones, humor y

pensamientos) además de tener un efecto reforzador relacionado con el alivio de estados

Introducción

- 13 -

emocionales desagradables, disforia, trastornos afectivos y control de impulsos (Guerri,

2000).

Existen varios subtipos de receptores de serotonina cada uno de los cuales tiene

una influencia específica sobre el comportamiento relacionado con el consumo de

alcohol (Lovinger, 1999). Uno de estos receptores (5-HT1A) podría controlar la

conducta consumidora, incluyéndose la de alcohol, mientras que otro subtipo (5-HT1B)

podría no sólo contribuir a los efectos intoxicantes del alcohol sino también influir en el

desarrollo de tolerancia. Un tercer receptor (5-HT2) juega un papel en los efectos

placenteros del alcohol y, por consiguiente, contribuiría al desarrollo del síndrome de

abstinencia. Por último, el subtipo 5-HT3 estaría implicado en regular el consumo de

alcohol (tabla 2).

La exposición aguda de etanol aumenta las señales eléctricas generadas por el

receptor 5-HT3 lo cual, probablemente, causa una excesiva estimulación en neuronas

que reciben información de las neuronas serotoninérgicas. Ello llevaría a un aumento de

la liberación de los neurotransmisores que participan en la intoxicación etílica.

La serotonina también afecta a otros neurotransmisores como, por ejemplo, al

sistema GABA, implicado en la toma de decisiones (Samson y Harris, 1992). De

manera similar, la serotonina también estimula la producción de dopamina y, así,

aumenta el comportamiento emocional (Campbell et al., 1996).

El consumo crónico de etanol produce una disminución de los niveles de

serotonina en el cerebro lo cual está asociado con trastornos de control de impulsos,

trastornos afectivos y agresividad (Guerri, 2000).

Se ha descrito que ratas con preferencia por el alcohol tienen menores niveles de

serotonina en sus cerebros en comparación con las que no tienen dicha preferencia

(Zhou et al., 1994). Esta observación apoya la noción de que, en los grandes

consumidores, se podrían intentar normalizar los niveles de serotonina en regiones

cerebrales claves ya que, durante los consumos agudos de alcohol, se elevan dichos

niveles.

Introducción

- 14 -

Receptor Posible Papel

5-HT 1A Conducta consumidora, incluyendo el consumo de alcohol.

5-HT 1B Efectos intoxicantes del alcohol. Desarrollo de tolerancia.

5-HT2 Desarrollo de síntomas de abstinencia a

alcohol. Efectos reforzadores del alcohol.

5-HT3 Regulación del consumo de alcohol.

Contribución a sus efectos reforzadores.

1.2.2.6 - Efectos del Etanol sobre el Neuromodulador Adenosina

La adenosina altera la actividad neuronal afectando a la conducta aunque no

reúne todos los requisitos como neurotransmisor ya que, por ejemplo, no excita o inhibe

por sí misma a células postsinápticas sino que regula o modula la actividad de neuronas

en respuesta a otros neurotransmisores.

Diversas evidencias indican que la adenosina media muchos de los efectos del

alcohol. El alcohol puede aumentar sus niveles extracelulares, por un lado, inhibiendo

su recaptación y aumentando, por otro, su producción en el organismo como resultado

del metabolismo del alcohol en el hígado.

Se cree que muchos de los efectos agudos y crónicos del alcohol en el SNC están

mediados por este neuromodulador. Por ejemplo, estudios realizados con ratones han

demostrado que la adenosina modula la incapacidad de coordinar movimientos

musculares voluntarios inducidos por el alcohol (ataxia) (Dar, 1990). Es más, el

agonista del receptor de adenosina aumenta y el antagonista disminuye la

descoordinación inducida por etanol.

Tabla 2. Subtipos de receptores serotoninérgicos y sus potenciales papeles en el desarrollo del abuso de alcohol. Tomado de Lovinger, 1997.

Introducción

- 15 -

1.3 - SISTEMAS NEUROBIOLÓGICOS IMPLICADOS EN LA ADICCIÓN A

ALCOHOL

Las drogas adictivas presentan una gran diversidad molecular y actúan sobre

diversos receptores y estructuras existiendo un factor común a las mismas: la activación

de la vía mesocorticolímbica dopaminérgica (también denominado sistema de

recompensa), crítica en el proceso de dependencia y adicción (Leshner, 1997;

Shippenberg y Elmer, 1998; Melichar et al., 2001).

Existen numerosos trabajos neurofarmacológicos (Goeders y Smith, 1983;

Gardner et al., 1988) que implican al sistema dopaminérgico en los efectos reforzadores

positivos de las drogas de abuso.

El circuito cerebral de recompensa está estrechamente relacionado con la vía

ascendente dopaminérgica mesocorticolímbica, originada en el área tegmental ventral

(ATV), y que proyecta a estructuras corticales anteriores y subcorticales del sistema

límbico (Corbett y Wise, 1980). Este sistema está compuesto por dos proyecciones

principales:

- la nigroestriatal, que desde la pars compacta de la substancia nigra proyecta

al núcleo caudado de los ganglios basales y

- la mesocorticolímbica, que desde el ATV proyecta al núcleo accumbens,

tubérculo olfatorio, córtex frontal y amígdala.

El sistema dopaminérgico mesolímbico (que incluye las áreas de proyección del

núcleo accumbens, amígdala e hipocampo) ha estado tradicionalmente asociado a las

propiedades reforzadoras de la administración aguda de las drogas de abuso así como

con los procesos de memoria necesarios para el desarrollo de respuestas condicionadas

(o aprendidas) que, a su vez, determinan el deseo por la droga. Los cambios, inducidos

por las drogas, sobre la homeostasis de este sistema determinan los cambios

emocionales y motivacionales que se ponen de manifiesto en la abstinencia.

El circuito dopaminérgico mesocortical (corteza prefrontal, corteza orbitofrontal

y cíngulo anterior) parece estar involucrado en la experiencia consciente de la

intoxicación aguda pero también en primar la droga como incentivo y, por consiguiente,

en el deseo por la sustancia y en su administración compulsiva.

Introducción

- 16 -

Mediante la interacción de ambos circuitos nerviosos se configura un sustrato

neurobiológico que explicaría las propiedades reforzadoras de las drogas (área

tegmental ventral, núcleo accumbens, tálamo, corteza prefrontal), tras su ingesta aguda,

su integración como experiencia consciente (corteza prefrontal), la implicación de la

memoria y las respuestas condicionadas (amígdala, hipocampo), la expectación o el

deseo por la droga (circunvolución del cíngulo, corteza prefrontal), el desarrollo y

percepción de los síntomas de la abstinencia (disminución de actividad en los circuitos

límbicos y alteración del control superior de la corteza prefrontal), conduciendo así a

perpetuar el consumo de la droga.

La activación del sistema de recompensa, durante el consumo agudo, induce un

incremento en la tasa de liberación de dopamina, en el ATV y áreas de proyección, y

una regulación al alza en los niveles de AMPc en el núcleo accumbens y amígdala

extendida, áreas que se relacionan decisivamente con la recompensa y con el

aprendizaje para el consumo (Nestler y Aghajanian, 1997; Wise, 2000).

Se cree que la vía mesocorticolímbica dopaminérgica participa, a nivel

fisiológico, en la creación de hábitos de conducta tras estímulos reforzadores naturales

(comida, bebida, sexo) modulando el circuito córtico-estriato-palidal donde se generan

los patrones motores. Este circuito incluye a la corteza prefrontal, al núcleo accumbens

o estriado ventral, al estriado dorsal y al globo pálido. La adicción sería, por tanto, una

perturbación crónica de la vía mesocorticolímbica inducida por la droga, creándose un

hábito patológico cuyo fin es el consumo de la droga.

En presencia de un reforzador natural, por ejemplo, se sabe que el ATV cambia

su disparo desde una frecuencia irregular a “ráfagas” regulares. Se postula que la

estimulación de esta vía ha de ejercer un efecto placentero en los animales (Olds, 1956)

y que las drogas potencian los efectos reforzadores de la estimulación eléctrica, en esta

vía, como si acrecentaran el placer producido por un nivel determinado de estimulación

cerebral (Wise et al., 1992). La asociación de este estímulo con una sensación es un

proceso que Berridge denomina relevancia incentiva o exaltación del incentivo

(Gardner, 1997; Wise, 1981; Robbins y Everitt, 1999).

El alcohol actúa como un reforzador positivo activando los circuitos locales

opioides de encefalinas del ATV, estimulando a las neuronas dopaminérgicas del área

tegmental ventral y actuando sobre receptores tipo GABAA en el núcleo accumbens, en

el núcleo central de la amígdala y en la corteza prefrontal. A su vez, los sistemas

Introducción

- 17 -

glutamatérgicos y serotoninérgicos parecen participar también en el refuerzo positivo

que produce el etanol.

Se ha observado que, tras un consumo crónico de drogas, hay cambios críticos a

nivel celular, conocidos como neuroadaptaciones, en los que se desarrolla una

sensibilización en la liberación de dopamina mesocorticolímbica y se dan cambios

permanentes en el circuito cortico-estriato-palidal, hechos que son de gran importancia

en el establecimiento de la dependencia crónica y de la abstinencia tras el cese del

consumo. Ello se debe a que generan un refuerzo negativo al cese de la administración

de la droga.

El refuerzo positivo parece ser el responsable del inicio al consumo y el refuerzo

negativo, que se desarrolla como consecuencia de las neuroadaptaciones, del

Centros y circuitos nerviosos claves en la adicción a drogas. Las líneas de puntos indican las aferencias límbicas hacia el núcleo accumbens (NAc). Las líneas azules representan las eferencias desde el NAc. Las líneas rojas indican las proyecciones del sistema mesolímbico dopaminérgico, sustrato crítico para la recompensa. Las neuronas dopaminérgicas se originan en el área tegmental ventral (VTA) y proyectan hacia el NAc y otras estructuras límbicas, que incluyen al tubérculo olfatorio (OT), los dominios ventrales del caudado-putamen (C-P), la amígdala (AMG) y la corteza prefrontal (PFC). Las líneas verdes indican las neuronas que contienen péptidos opioides, implicadas en la recompensa de los opiáceos y etanol. Estos sistemas de péptidos opioides incluyen a los circuitos locales de encefalinas (segmentos cortos) y al circuito hipotalámico de las β-endorfinas (segmento largo). El sombreado azul indica la distribución aproximada del receptor GABAA que contribuiría a la recompensa del etanol. ARC: núcleo arqueado; Cer: cerebelo; DMT: tálamo dorsomedial; IC: colículo inferior; LC: locus coeruleus; LH: hipotálamo lateral; PAG: sustancia gris periacueductal; SC: colículo superior; SNr: substancia nigra pars reticulata; VP: pálido ventral.Modificado de Nestler, 2001.

Introducción

- 18 -

mantenimiento en el consumo. Esto produce comportamientos motivados que conducen

a la ingesta de la droga, cursando con impulsividad, compulsividad y ansiedad.

A nivel de integración superior, parece ser que la adicción produce cambios en

el punto de ajuste del procesamiento hedónico de modo que la experiencia diaria sin

presencia de la droga se percibe, en ese estado, como negativa.

El estriado es una región importante para el control motor y la generación de

planes motores, presentando una zona ventral o núcleo accumbens y otra dorsal o

caudado-putamen. Ambas poseen neuronas GABAérgicas espinosas de mediano

tamaño como neuronas de proyección que se interconectan con diferentes áreas.

El núcleo accumbens se considera una interfase límbico-motora pues recibe

información de áreas límbicas, como la amígdala y la corteza prefrontal además del

hipocampo, y la envía al pálido ventral y tálamo integrándose en los circuitos motores.

A su vez, su actividad está modulada por neuronas dopaminérgicas procedentes del

ATV.

Las drogas afectan a la actividad del núcleo accumbens a través de los cambios

en la vía mesocorticolímbica ya comentados y también a través de acciones más

directas sobre las aferencias de la corteza prefrontal y sobre las propias neuronas

GABA estriatales. Inicialmente los cambios agudos por la acción de las drogas se

localizan , entre otras regiones, en el núcleo accumbens.

El desarrollo de LTP (potenciación a largo plazo) o LTD (depresión a largo

plazo) en estriado parece estar relacionado con la consolidación de la dependencia y, en

estos efectos, estarían involucrados cambios en la actividad dopaminérgica de origen

nígrico y la acción glutamatérgica de origen cortical. Ambos fenómenos modifican, de

modo permanente, la actividad sináptica ya que también subyacen a los cambios

neuronales relacionados con el aprendizaje.

La formación hipocampal es una estructura cerebral compuesta de diversas áreas

como el giro dentado, el hipocampo y el subiculum, existiendo en todas ellas tres capas

neuronales.

El flujo de información es, en gran parte, unidireccional y se sabe que participa

en los fenómenos de consolidación de la memoria. No parece ser el lugar de

almacenamiento de la memoria pero sí donde se genera la memoria a largo plazo o

memoria declarativa (hechos, imágenes y nombres que se aprenden). Al menos parte

Introducción

- 19 -

del mecanismo de consolidación de la memoria recae en los procesos de LTP, que se

producen en la formación hipocampal. Dicha estructura cerebral forma parte del

sistema límbico junto con la corteza de asociación límbica, la amígdala, el estriado

ventral y algunos núcleos diencefálicos y mesencefálicos. Dicha macroestructura está

implicada en el procesamiento de la información emocional y de los comportamientos

motivados. Además participa activamente en el procesamiento de señales reforzadoras,

positivas y negativas, asociadas al consumo de drogas o al cese de éste tras un consumo

crónico.

El alcohol interacciona con sistemas receptores como los de glutamato y GABA,

entre otros. Las neuronas de proyección del hipocampo (las neuronas piramidales) y del

giro dentado (las células granulares) utilizan al glutamato como neurotransmisor y las

interneuronas (las células polimórficas) de estas regiones, GABA. Por tanto, estas

neuronas de la formación hipocampal son dianas del alcohol participando, al menos

parcialmente, en los efectos de la inhibición de la consolidación de la memoria que

provoca la ingesta aguda de etanol.

Por otro lado, el refuerzo positivo, que provoca posteriores ingestas de alcohol,

hasta hacerlas crónicas, y el alivio al refuerzo negativo, que provoca la retirada, necesita

de un soporte de memoria que permita la asociación del estímulo con su efecto de

recompensa. De esta manera se deduce que la formación hipocampal juega también un

papel en la ingesta crónica de etanol.

El cerebelo es una estructura cerebral cuya corteza se encuentra plegada y

organizada en capas neuronales. En la porción medular se encuentran los denominados

núcleos profundos que reciben aferencias de la corteza. Gran parte de las neuronas

cerebelares son GABAérgicas y están implicadas en la coordinación de movimientos y

en el aprendizaje motor. La interferencia del alcohol en las neuronas GABAérgicas

provoca los síntomas típicos de incoordinación psicomotora y de marcha, imprecisión

de gestos y vértigo que aparecen tras la ingesta aguda de alcohol. Pese a que el cerebelo

no participa en el proceso de adicción, el consumo crónico de etanol puede tener efectos

farmacológicos en esta estructura aunque no está claro el papel que pueden jugar dichos

cambios.

Introducción

- 20 -

1.4 - MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO: líneas msP y AA/ ANA

En la presente tesis doctoral se ha planteado usar modelos animales de

alcoholismo que permitiesen realizar estudios bioquímicos y neurofarmacológicos. Los

modelos analizados han sido los correspondientes a líneas de roedores seleccionados en

base a su preferencia alcohólica.

Los requisitos mínimos establecidos (McMillen, 1997) para la aceptación de un

modelo animal ideal de alcoholismo humano son:

Alcanzar niveles farmacológicos de concentración de alcohol en

sangre (BAC: blood alcohol concentration).

Mantener dichos niveles de BAC.

Desarrollar dependencia física.

Mantener la dependencia mediante autoadministración oral de etanol.

El problema básico es que los animales no beben voluntariamente suficiente

etanol como para intoxicarse y, en consecuencia, no se vuelven dependientes.

Algunas especies animales, como los hamsters “Syrian Golden” y las ratas

“Fawn-Hooded”, beben espontáneamente grandes cantidades de etanol aunque, al tener

un elevado metabolismo de etanol, no se convierten físicamente dependientes a etanol a

pesar de estar sometidos a largas exposiciones (McMillen y Shore, 1997). Por tanto, el

desarrollo de preferencia por etanol no se puede considerar un criterio para un modelo

animal de dependencia alcohólica.

Los modelos animales seleccionados y criados durante generaciones, por su

excesiva ingesta de etanol, han demostrado ser de gran utilidad para la identificación y

validación de nuevos tratamientos (McBride y Li, 1998).

Las crías de ratas que eligen voluntariamente consumir grandes cantidades de

alcohol llegan a ser consumidores consolidados respecto a aquellas crías que tienden a

evitarlo. Esta cría selectiva de animales, durante muchas generaciones, se ha usado para

desarrollar, desde 1963, la línea de ratas AA (Alko Alcohol), las cuales prefieren una

solución de alcohol al 10% frente al agua, y la línea de ratas ANA (Alko Non-Alcohol),

que prefieren agua (Eriksson, 1968). Además de su preferencia por el alcohol, las líneas

AA y ANA presentan desviaciones bidireccionales respecto a las ratas Wistar,

genéticamente heterogénas, en relación a rasgos del comportamiento que son anormales

Introducción

- 21 -

en humanos alcohólicos con una elevada carga genética como, por ejemplo, una

elevada impulsividad (Möller et al., 1997).

Las líneas de ratas AA y ANA son los modelos mejor establecidos y

seleccionados. Estas líneas se han usado para demostrar el posible papel de los factores

genéticos en el consumo de alcohol y establecer las correlaciones neuroquímicas,

metabólicas y de comportamiento que pudieran explicar las diferencias en la ingesta de

alcohol. Algunas de las diferencias encontradas están implicadas en los efectos

reforzadores del etanol, factores nutricionales y cambios producidos en el consumo por

privación del alcohol, las reacciones de las monoaminas adrenales y cambios de

comportamiento frente a un estrés severo, el desarrollo de tolerancia, la acumulación de

acetaldehído durante el metabolismo del etanol y, a nivel de sistema nervioso, en los

niveles cerebrales de serotonina (Sinclair et al, 1989), del sistema opioide y elevaciones

en los niveles de dopamina en ratas AA respecto a las ANA (Gianoulakis et al., 1992;

Nylander et al., 1994; Soini et al., 1997). Las ratas ANA poseen un metabolismo del

etanol, en hígado y ciertas áreas cerebrales, disminuido respecto a las ratas AA lo que

les lleva a tener mayores niveles de acetaldehído responsable del rechazo de la ingesta

de alcohol.

Otro modelo animal seleccionado durante generaciones son la línea de ratas msP

las cuales tienen una preferencia natural por el etanol. Han sido criadas a partir de la 13ª

generación de las ratas sP (sardinian alcohol-preferring) procedentes del Departamento

de Neurociencias de la Universidad de Cagliari (Agabio et al., 1996; Colombo, 1998;

Lobina et al., 1997).

Se caracterizan por beber espontáneamente y de manera exagerada lo cual les

lleva a presentar niveles de alcohol en sangre farmacológicamente significativos. Esta

línea es muy vulnerable a la recaída y al estrés mostrando un fenotipo de ansiedad con

síntomas, semejantes a los de la depresión, que desaparecen tras el consumo de etanol

(Ciccocioppo et al., 2006).

Introducción

- 22 -

1.5 - PERSPECTIVAS DE TRATAMIENTO DE LA ADICCIÓN A ALCOHOL

Los principales objetivos del tratamiento de la adicción son la facilitación de la

abstinencia y la prevención de la recaída. Tales objetivos han dificultado el tratamiento

de muchas formas de adicción.

El tratamiento farmacológico que se utiliza habitualmente es útil para reducir los

síntomas de abstinencia aunque no es efectivo en la prevención de la recaída. La

potencialidad de recaída dura más que los síntomas de abstinencia e implica a

mecanismos complejos como el aprendizaje asociativo. De esta manera, los

medicamentos que bloquean los efectos reforzantes de las drogas o la plasticidad

inducida por la droga, podrían reducir el deseo por la droga y la recaída. Dichos

medicamentos serían efectivos si pudiesen actuar sin producir, por sí mismos, efectos

reforzadores o de anhedonia, ejerciendo sus efectos beneficiosos sin interferir en las

respuestas del organismo hacia los reforzadores naturales.

Durante la desintoxicación del alcohol típicamente se administran

benzodiacepinas, como clordiacepoxide, ya que son menos reforzantes que el propio

etanol en los alcohólicos y muestran dependencia cruzada con el etanol en los

receptores GABAA.

Algunos fármacos se han utilizado, junto con terapias psicosociales, para

prevenir la recaída. Dos fármacos en particular - naltrexona y acamprosato - han

mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos y en la práctica.

Desafortunadamente, a excepción de la naltrexona que es parcialmente eficaz en el

tratamiento del alcoholismo, no se han desarrollado aún tratamientos que reduzcan el

refuerzo producido por la droga.

En estudios animales donde se han asociado el refuerzo del etanol y el sistema

opiode endógeno, se ha utilizado naltrexona (y al menos un antagonista opioide:

nalmefene) para prevenir la adicción a etanol. En muchos ensayos clínicos, la

naltrexona disminuye tanto el riesgo de volver a consumir alcohol como la frecuencia

del consumo aunque no existe un aumento del grado de abstinencia total. Reduce

sentimientos positivos como la euforia, inducida por el alcohol, mediante el bloqueo de

la liberación de endorfinas.

Diversos estudios europeos sugieren que el acamprosato reduce la frecuencia del

consumo y la recaída siendo su mecanismo de acción desconocido. En roedores se sabe

Introducción

- 23 -

que modula la función del receptor NMDA de forma que se da facilitación del receptor

en ciertas regiones y efectos antagonistas en otras (Dachour y Dewitte, 2000).

Otras farmacoterapias han mostrado menor eficacia clínica. El disulfiram es un

inhibidor de la enzima aldehído deshidrogenasa, con lo que su administración conlleva

toxicidad debido al acetaldehído generado tras el consumo de etanol. La razón por la

que se usa disulfiram es que devalúa el consumo de alcohol al estar asociado a una

experiencia fuertemente repulsiva (náuseas, vómitos, dolores en el pecho, disminución

de la presión sanguínea, etc.; Garbutt et al., 1999) aunque, a pesar de ello, no previene

el retorno al consumo de alcohol.

La administración de citalopram (Naranjo et al., 1992), un antidepresivo,

disminuye los efectos reforzadores del alcohol reduciendo así el deseo por dicha droga.

Este fármaco actúa facilitando la disponibilidad de serotonina. Sin embargo, uno de

cada seis pacientes que lo toman padecen náuseas, insomnio, sudoración excesiva, dolor

de cabeza o convulsiones lo que reduce su atractivo como tratamiento para el

alcoholismo por lo que finalmente se emplean otras drogas para tratar la depresión y la

ansiedad que ayudan a reducir el consumo de alcohol (Johnson et al., 1993; Pettinati,

1996).

Se ha descrito, en varios estudios en los que se ha utilizado el antagonista

cannabinoide SR141716A, que el sistema endocannabinoide podría jugar un papel

fundamental en las propiedades reforzadoras no sólo del cannabis sino también de otras

sustancias de abuso como la cocaína, los opiáceos y el alcohol.

En otros estudios, en los que se han utilizado diferentes protocolos

experimentales, se ha demostrado la habilidad del SR141716A para reducir el consumo

y el deseo por el alcohol (Arnone et al., 1997; Colombo et al., 1998; Rodríguez de

Fonseca et al., 1999; Gallate y McGregor, 1999; Gallate et al., 1999). Es interesante

destacar que existen datos que sugieren que la activación del sistema cannabinoide

endógeno, por un agonista, promueve el deseo por etanol (Gallate et al., 1999).

Recientemente se ha descrito que el antagonista SR147778 disminuye tanto la

ingesta como la preferencia a etanol en ratas tras ser sometidas a tratamientos crónicos

de etanol. Estos resultados refuerzan la hipótesis que implicaría al receptor CB1 como

mediador de la ingesta de etanol y en las propiedades motivacionales del alcohol.

Introducción

- 24 -

Además este antagonista suprime aún más que SR141716A (Rimonabant) la ingesta de

etanol en ratas sometidas a tratamiento crónico de etanol (Lallemand y De Witte, 2006).

Hay que destacar que los receptores μ opioides y los receptores CB1 se co-

expresan en varias zonas cerebrales, incluyendo el núcleo accumbens (Navarro et al.,

1998). Estos datos en conjunto nos indican que el receptor CB1 podría ser importante

no sólo para los efectos reforzadores de la marihuana, sino también en la modulación de

los efectos reforzadores del alcohol y la morfina. Estas características neurobiológicas

sugieren un papel del sistema cannabinoide endógeno en el procesamiento del refuerzo

y abren un nuevo campo para el desarrollo de estrategias terapéuticas para el

tratamiento del alcoholismo y la adicción en general.

Introducción

- 25 -

2. EL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE

2.1 - HISTORIA

La planta Cannabis sativa es originaria, probablemente, de las estepas de las

regiones que se extienden desde Asia Central al Norte del Himalaya, África y Europa

Meridional desde donde fue difundida por los griegos y especialmente los romanos. Se

ha cultivado durante siglos tanto por la fibra del cáñamo como por sus propiedades

psicoactivas y su supuesta utilidad clínica.

El término marihuana, de origen mejicano, se refiere a una forma particular del

cannabis que deriva principalmente de las hojas de la planta. Los datos más antiguos

sobre el uso del cannabis datan de hace 10.000 años. Entre los años 2700 y 2000 a.C. el

cannabis se usaba en China para tratar los dolores reumáticos y otras patologías (Adams

y Martins, 1996) y en la India el cannabis jugaba un papel

muy importante en la religión. En Europa, esta planta llamó la

atención de los científicos cuando las tropas de Napoleón

volvieron de la campaña de Egipto introduciendo su uso como

psicotrópico.

Actualmente se sabe que los efectos del cannabis en humanos incluyen la

alteración de la memoria a corto plazo, daños cognitivos, descoordinación, insomnio,

taquicardia refleja, hipotermia y alteraciones del carácter con euforia o disforia según la

experiencia previa del consumidor, etc. (Pertwee, 1988).

En 1964, Gaoni y Mechoulam aislaron el principal componente psicoactivo del

cannabis y determinaron su estructura química. El compuesto era un derivado de un

dibenzopirano, el Δ9- tetrahydrocannabinol (Δ9 - THC), presente en la resina amarilla

que cubre las hojas y flores de la planta femenina madura. A partir

de ese momento, se realizaron grandes esfuerzos por averiguar el

modo de acción molecular de las preparaciones de Cannabis sativa.

En los últimos 50 años, se han dado grandes avances en el

conocimiento de la fisiología y farmacología del sistema

cannabinoide así como la posible utilidad de sus efectos terapéuticos en ciertas

patologías.

Introducción

- 26 -

2.2 - LIGANDOS EXÓGENOS

La planta Cannabis sativa posee más de 60 cannabinoides, siendo el Δ9-THC el

principal responsable de las propiedades psicoactivas aunque existen también otros

cannabinoides como el Δ8-THC, el cannabinol y el cannabidiol. Estos dos últimos

cannabinoides son además responsables de algunas propiedades antiinflamatorias del

cannabis.

A partir de la estructura química de estos cannabinoides naturales se han

desarrollado una serie de cannabinoides sintéticos que han resultado muy importantes

para avanzar en el conocimiento de la farmacología de estos compuestos y en la

fisiología del Sistema Endocannabinoide.

Existe una amplia variedad de moléculas que se comportan como agonistas de

los receptores cannabinoides, es decir, activadores de las respuestas mediadas por éstos.

Entre los agonistas de receptores de cannabinoides destacan análogos bicíclicos (CP-

55,940), derivados de aminoalquilindoles (WIN 55,212-2) y análogos sintéticos del

THC (HU-210: 11-hidroxi-Δ8-THC-dimetilheptil).

En cuanto a la capacidad de interacción de los compuestos cannabimiméticos, el

THC se une con una afinidad similar a los receptores CB1 y CB2, funcionando como

agonista parcial en ambos casos. Sin embargo, su eficacia es mayor en la interacción

con CB1 llegando incluso a comportarse como un antagonista en determinados sistemas

CB2.

Los compuestos CP-55,940 y WIN 55,212-2 muestran afinidades por los dos

receptores y su eficacia es relativamente alta. Por último, el compuesto HU-210 es un

potente agonista cannabinoide clásico, cuya eficacia es similar a la de CP-55,940 y WIN

55,212-2 y su afinidad, por ambos receptores, superior.

HU-210 WIN 55,212-2 CP – 55,940

Introducción

- 27 -

2.3 - LIGANDOS ENDÓGENOS

El sistema cannabinoide endógeno o endocannabinoide está constituido por un

conjunto de moléculas, con función moduladora sobre otros sistemas de señalización,

entre las que se incluyen: receptores endógenos, transportadores, endocannabinoides y

enzimas implicadas en la síntesis y degradación de éstos.

Los endocannabinoides cumplen las condiciones necesarias de todo

neurotransmisor ya que son sintetizados y liberados a partir de las neuronas, son

capaces de unirse y activar receptores de membrana siendo, finalmente, inactivados por

recaptación y degradación enzimática en el interior de la célula. A diferencia de los

demás neurotransmisores, tienen naturaleza lipofílica por lo que no se almacenan en el

interior de vesículas sinápticas sino que se sintetizan y liberan a demanda desde la

membrana celular.

El hecho de que CB1 se identificase como receptor del THC condujo a la

búsqueda de cannabinoides endógenos. En 1992, se identificó al primer ligando

endógeno de CB1 y se definió su estructura como una araquidonil-etanolamida,

denominándose anandamida (AEA) (Devane et al., 1992). Se encontró que la AEA se

unía a los receptores cannabinoides y mimetizaba muchos de los efectos

farmacológicos y de comportamiento del Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), el principal

componente psicoactivo de la mariguana.

La AEA es una amida, entre el ácido araquidónico y la etanolamina, que se

comporta como un agonista parcial de CB1 y un agonista muy débil de CB2. Pertenece

a la familia de las N-acil-etanolaminas (NAEs) y, al igual que otros componentes de esta

familia como la homo-γ-linoleniletanolamida (HEA) y la docosatetraeniletanolamina

(DEA), son producidas por neuronas y se unen a CB1.

Las concentraciones de anandamida en cerebro son muy bajas ya que no se

almacena en las células, en su forma biológicamente activa, sino que es sintetizado en

respuesta a un determinado estímulo o a demanda a partir de un precursor presente en

la membrana celular. En general, los niveles más altos de AEA en cerebro se

corresponden con áreas que también presentan una elevada densidad de receptores para

cannabinoides tales como el hipocampo, la corteza o el estriado (Felder et al., 1996).

Esta correlación no es completa ya que en otras áreas como el tálamo o el tallo cerebral

Introducción

- 28 -

existen pocos receptores y un alto nivel de AEA (Felder et al., 1996; Bisogno et al.,

1999).

Posteriormente, se identificó a un segundo cannabinoide endógeno, el 2-

araquidonil-glicerol (2-AG), tanto en cerebro como intestino, siendo su concentración

en cerebro de 2 a 3 órdenes de magnitud mayor que el de AEA (Mechoulam et al.,

1994; Sugiura et al., 1995). En células y tejidos no estimulados, los niveles de 2-AG son

mucho mayores que los de AEA aunque probablemente estén sobreestimados debido,

por ejemplo, al rápido incremento de la formación de 2-AG que se da tras la

decapitación de la rata (Sugiura et al., 2001).

Se han descrito a otros tres candidatos como agonistas de receptores

cannabinoides, denominándose: 2-araquidonil-gliceril-eter (Noladina, 2-AGE), que se

comporta como agonista selectivo de CB1, O-araquidonil-etanolamina (Virodamina)

antagonista de CB1 y agonista parcial de CB2 y N -araquidonil-Dopamina (NADA)

agonista selectivo de CB1 y potente agonista de los receptores vaniloides (Hanus et al.,

2001; Bisogno et al., 2000; Porter et al., 2002).

Δ9- tetrahydrocannabinol (THC) Anandamida (AEA)

2- Araquidonil-glicerol (2-AG)

Virodamina Noladin-eter

N - araquidonil-Dopamina (NADA)

Estructura química del principal componente psicoactivo del cannabis Δ9-tetrahydrocannabinol

(THC) y de los principales endocannabinoides descritos.

Introducción

- 29 -

Otro miembro de esta familia de lípidos, la palmitoiletanolamida (PEA),

comparte con los cannabinoides endógenos diversos efectos fisiológicos aunque no es

capaz de unirse a ninguno de los dos subtipos de receptores de cannabinoides (CB1 y

CB2), conocidos hasta el momento.

2.3.1 - Biosíntesis de Anandamida

La AEA se produce a demanda mediante la hidrósilis de una N-araquidonil

fosfatidiletanolamina (NAPE), presente en la membrana plasmática celular, proceso que

es catalizado por una fosfolipasa D (PLD). Dicho precursor se genera a partir de

fosfolípidos de membrana como la fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina gracias a la

actividad de una transferasa de grupo N-acilo (NAT), dependiente de Ca2+, que

transfiere el grupo acilo desde la posición sn-1 de los fosfolípidos al grupo amino de la

fosfatidiletanolamina (PE).

Esta vía no parece ser capaz de generar grandes cantidades de AEA ya que los

niveles de ácido araquidónico, esterificado en la posición sn-1, de los fosfolípidos son

normalmente muy bajos. Esto concuerda con el hecho de que los niveles de AEA son

menores que los de aquellas otras N-aciletanolaminas en la mayoría de los tejidos

analizados. De hecho, tanto NAPE-PLD como NAT no parecen ser selectivas para un

determinado motivo de ácido graso.

Se ha demostrado que la actividad enzimática de NAPE-PLD es dependiente de

la concentración de Ca2+ y puede ser estimulada por poliaminas. Es diferente al resto de

las fosfolipasas D ya que no cataliza la típica reacción de transfofatidilación de las

PLDs, reacción por la que la cadena alifática de un alcohol primario se transfiere al

motivo fosfatidil de un ácido fosfatídico (Ueda et al., 2001; Liu et al., 2002; Petersen y

Hansen., 1999).

Introducción

- 30 -

Formación e inactivación de anandamida. La anandamida se genera por hidrólisis de la N-araquidonil fosfatidiletanolamina (N-araquidonil PE), la cual es catalizada por una fosfolipasa D (PLD) (1). La síntesis de N-araquidonil PE está mediada por una actividad N-acil transferasa (NAT) (2), la cual separa el motivo araquidonato (rojo) de la posición sn-1 de los fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina (PC), y lo transfiere al grupo amino de la PE. La anandamida recién formada se libera al espacio extracelular, donde se une y activa a receptores cannabinoides, acoplados a proteínas G, localizados en las células vecinas (3) o en las mismas células que producen anandamida. La anandamida puede ser interiorizada gracias a un transportador de anandamida (4). Dentro de las células es hidrolizada por una amidohidrolasa de ácidos grasos (FAAH) unida a membrana (5), liberándose ácido araquidónico y etanolamina. El ácido araquidónico producido puede ser reincorporado a los fosfolípidos y es improbable que sufran otro metabolismo. In vitro, FAAH puede catalizar la reacción contraria, la formación de anandamida a partir de ácido araquidónico y etanolamina, aunque el sentido fisiológico de esta reacción no está aún claro. Abreviatura: R, grupo ácido graso. Modificado de Piomelli et al., 2000.

Introducción

- 31 -

Otros estudios, en los que se ha inactivado la enzima NAPE-PLD, revelan la

existencia de vías de síntesis independientes por las que otras enzimas participarían en

la generación de N-aciletanolamidas poliinsaturadas como la AEA (Leung et al., 2006).

De hecho, está descrito que existe una vía alternativa, independiente de NAPE-PLD,

donde la N-acil-PE es primero hidrolizada liberándose N-acil-lyso-PE, junto con un

ácido graso libre, gracias a una enzima miembro del grupo IB de las fosfolipasas A2.

Posteriormente se libera la N-aciletanolamida (NAE) desde la N-acil-lyso-PE gracias a

la actividad enzimática de una lyso-PLD (Sun et al., 2004).

2.3.2 – Biosíntesis de 2-araquidonilglicerol (2-AG)

Este endocannabinoide es un importante precursor y/o producto de degradación

de las vías de fosfo-, di- y triglicéridos. Se ha demostrado que varios estímulos pueden

provocar la formación de 2-AG en células en reposo tales como lipopolisacáridos,

Rutas alternativas de síntesis de AEA. La AEA se puede formar a partir de la hidrólisis directa, catalizada por la enzima PLD, de la N-araquidonil-PE mayoritariamente o bien mediante la formación de un N-araquidonil-lysoPE gracias a la actividad enzimática de la PLA1/A2 para posteriormente generar AEA gracias a la lysoPLD, liberándose ácido lisofosfatídico (LPA).

Introducción

- 32 -

endotelina, factor activador plaquetario, ionomicina, carbacol, trombina, etc. (Bisogno

et al., 1997; Basavarajappa et al., 2000; Stella et al., 1997; Sugiura et al., 1998; 2002;

Di Marzo et al., 1999; Berdyshev et al., 2001; Mechoulam et al., 1998; Stella y

Piomelli, 2001; Walter y Stella, 2003).

Sin embargo, poco se sabe acerca de la ruta de biosíntesis del 2-AG, la cual

implicaría probablemente a la misma cascada enzimática que cataliza la formación de

segundos mensajeros tales como el inositol (1,4,5)-trifosfato y 1,2-diacilglicerol (DAG).

El DAG es el sustrato de la lipasa de diacilglicerol (DAGL), enzima que cataliza la

producción de 2-AG.

Tras su liberación, el 2-AG interaccionaría con los receptores cannabinoides y

podría entrar en la célula, gracias al mismo sistema de transporte que la AEA, y ser

hidrolizada por una lipasa de monoacilgliceroles (MAGL).

Debido a su producción no sináptica y a su rápida inactivación, se piensa que los

endocannabinoides podrían actuar como moduladores a corto plazo de la actividad

sináptica y celular (Piomelli et al. 2000; Di Marzo et al. 1998; Fride, 2002).

Formación e inactivación del 2-araquidonilglicerol (2-AG). La hidrólisis del fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato [PtdIns (4,5) P2] por una fosfolipasa C (PLC) genera la liberación de los segundos mensajeros 1,2-diacilglicerol (DAG) e inositol (1,4,5)-trifosfato [Ins(1,4,5)P3] (1). El DAG sirve como sustrato para la DAG lipasa (DAGL), la cual cataliza la producción del 2-AG (2). El 2-AG puede liberarse al medio externo, tras lo cual interaccionaría con los receptores cannabinoides y sería transportado al interior celular. Sin embargo, la liberación extracelular del 2-AG no se ha descrito aún in vivo. Una vez dentro de la célula, el 2-AG puede ser hidrolizado a ácido araquidónico y glicerol por una esterasa como la lipasa de monoacilglicerol (MAGL). Tomado de Piomelli et al., 2000.

Introducción

- 33 -

2.4 - RECEPTORES CANNABINOIDES

Los receptores endocannabinoides, CB1 y CB2, pertenecen a una superfamilia

de receptores, acoplados a proteínas G, con siete dominios transmembrana y con una

secuencia altamente conservada entre especies.

El receptor CB1 tiene un 44% de homología en su secuencia aminoacídica con el

receptor CB2, aunque dicha cifra incrementa hasta un 68% si se comparan sólo las

regiones transmembranales.

El receptor CB1 se localiza predominantemente en el sistema nervioso central

(SNC), donde se le atribuye un importante papel en la modulación de la liberación de

neurotransmisores (Herkenham et al., 1991; Glass et al., 1997), pero también en la

mayoría de los tejidos periféricos como células inmunes, el sistema reproductor, el

tracto gastrointestinal, el hígado, páncreas endocrino y pulmón.

La mayor densidad de CB1 en el SNC se da en áreas relacionadas con el control

de la actividad motora tales como la corteza, ganglios basales y cerebelo. Son también

abundantes en áreas importantes para la memoria y el aprendizaje (hipocampo) y la

regulación neuroendocrina (núcleos hipotalámicos). Su localización es

predominantemente presináptica, lo que concuerda en buena medida con el efecto

inhibitorio que los cannabinoides ejercen sobre la liberación de varios

neurotransmisores (Pertwee, 1997), aunque, en algunos casos, también se localiza en

menor proporción en somas y dendritas neuronales así como en oligodendrocitos,

Introducción

- 34 -

astrocitos y células madre neurales (Rodríguez et al., 2001; Molina-Holgado et al.,

2002; Aguado et al., 2005).

El receptor CB2 se localiza principalmente en determinados componentes del

sistema inmune (amígdala, bazo, macrófagos, linfocitos B y células NK) (Devane et al.,

1988; Matsuda et al., 1990; Munro et al., 1993) aunque también en células de la

microglía, astrocitos e incluso en ciertas subpoblaciones neuronales, aunque siempre en

menor proporción que CB1 (Gong et al., 2006).

Experimentos llevados a cabo en ratones carentes del receptor CB2 (CB2-/-)

muestran cambios en la respuestas inmune, especialmente a nivel de la activación,

inducida por macrófagos, de la célula T- helper (Munro et al., 1993; Galiègue et al.,

1995; Herring y Kaminski, 1999).

En algunas de las poblaciones celulares del sistema inmune, los niveles de

expresión de los receptores CB2 son equiparables, cuantitativamente, a los de receptores

CB1 en el SNC, por lo que se considera que CB2 podría desempeñar importantes

funciones en los procesos de inflamación. La proporción de CB2, en dichas células

inmunes, también podría explicar buena parte de los efectos moduladores que ejercen

los cannabinoides naturales y sintéticos sobre la respuesta inmune. A este respecto,

entre los cannabinoides naturales, parece ser más eficaz el cannabinol que el THC

(Felder et al., 1995) con lo que sería el principal responsable de las propiedades

antiinflamatorias de C. sativa.

Se ha descrito que en la microglía presente en tejido del SNC sano, se expresa

muy poco o nada CB2 mientras que las células de microglía activadas, tales como las

encontradas en modelos de ratón de esclerosis múltiple y Alzheimer, se expresan

niveles significativos de CB2 (Maresz et al., 2005; Benito et al., 2003). Esto concuerda

con el hecho de que, en condiciones patológicas, se induce la expresión de CB2 en

leucocitos (Carlisle et al., 2002).

Estudios llevados a cabo en ratones CB1-/- y/o CB2-/-, sugieren la existencia de

receptores cannabinoides cerebrales distintos a CB1 y CB2. Estudios farmacológicos

han revelado la presencia de otras dianas de los endocannabinoides que incluyen al

receptor vaniloide (Zygmunt et al., 1999) y a dos receptores “CB-like” distintos del

CB1 y CB2, uno en el lecho vascular y otro en los terminales axónicos de glutamato

(Hajos et al., 2001; Howlett et al., 2002; Kunos et al., 2002). En varios tejidos se ha

Introducción

- 35 -

descrito a un receptor acoplado a proteína G, denominado GPR55, como un posible

nuevo receptor cannabinoide (Baker et al., 2006). La existencia de estos y otros posibles

receptores para cannabinoides, y su función en la fisiología endocannabinoide sólo se

verá clara tras su caracterización molecular. En relación con estos datos, se ha sugerido

la presencia de sitios de fijación con perfil cannabimimético, distintos a CB1 y CB2, en

cerebro de ratones en los que se ha generado genéticamente la ausencia de receptores

CB1 (‘Knock-out’) (Berrendero et al., 1998). Sin embargo, la existencia de receptores

cannabinoides diferentes a CB1 /CB2 en cerebro humano no ha sido confirmada.

2.4.1 - Mecanismos de Transducción de Señales

Una vez liberada, la AEA puede actuar sobre los receptores cannabinoides y/o

ser transportada al interior celular gracias a un sistema de transporte independiente de

Na+ y energía. Dentro de las células, puede ser hidrolizada por una amidohidrolasa de

ácidos grasos (FAAH) liberándose ácido araquidónico y etanolamina.

Los principales mecanismos intracelulares, en los que están implicados los

receptores CB1, incluyen la inhibición de la adenilato ciclasa, la regulación de

diferentes canales iónicos y la activación de la vía de las MAP quinasas (Berrendero et

al., 1998). Ambos receptores, CB1 y CB2, son sensibles a la inhibición de la formación

de AMPc por la toxina pertusis, lo cual implica a proteínas Gi/o como transductores, y a

la estimulación de la actividad kinasa de proteínas p42/p44 activadas por mitógenos

(Vogel et al., 1993; Bouaboula et al., 1995). De hecho, el acoplamiento de estos

receptores a proteínas Gi/o constituye la base de todos los efectos.

La inhibición de la vía de la adenilato ciclasa da lugar a un descenso en los

niveles de AMPc intracelular, así como a una inhibición de los canales de Ca2+ tipo N y

P/Q y un aumento de la conductancia del K+ (Mackie y Hille, 1992; Mackie et al., 1995;

McAllister et al., 1999). El efecto combinado sobre ambos tipos de canales parece ser la

base de la inhibición que los cannabinoides ejercen en la liberación de

neurotransmisores. Finalmente, también se activa la ruta de las MAP quinasas, vía

involucrada en la regulación de fenómenos de proliferación y diferenciación (Breivogel

et al., 2001).

Introducción

- 36 -

Esquema de las vías bioquímicas de síntesis/degradación y acciones celulares de la anandamida. La anandamida es liberada desde un precursor de membrana lipídico (N-araquidonil-fosfatidil etanolamida, NAPE) por la acción de una fosfolipasa D específica (PLD) activada por despolarización o estimulación de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). La biosíntesis de NAPE es catalizada por una enzima, N-aciltransferasa (NAT) activada por calcio (Ca2+) y AMP cíclico. La anandamida actúa como un mensajero retrógrado en los receptores presinápticos cannabinoides (CB1) donde regula la liberación de neurotransmisores (NT) a través de sistemas de transducción secundarios (principalmente el Ca2+ incorporado a través de canales de calcio unidos a voltaje (VGCC) o receptores de glutamato NMDA). La anandamida también actúa como un neuromodulador de los principales sistemas de neurotransmisores, incluyendo dopamina, en las células postsinápticas, donde regula la excitabilidad y la plasticidad sináptica a través de la modulación de canales de potasio (K+) y la regulación de un amplio espectro de proteínas kinasas (PK), incluyendo la proteína kinasa A y las proteínas kinasas activadas por mitógeno (MAPK). La acción de la anandamida termina a través de un proceso de dos etapas que incluye, primero, su recaptación celular a través de un transportador específico de anandamida (AT) y segundo, la degradación enzimática a ácido araquidónico (AA) y etanolamida por la enzima de membrana amidohidrolasa de ácidos grasos (FAAH). Tomado de Rodríguez de Fonseca et al., 2005.

Introducción

- 37 -

En cuanto al receptor CB2, su activación también conduce a una inhibición de la

adenilato ciclasa y una activación de la vía de las MAP quinasas. Sin embargo, a

diferencia del CB1, el receptor CB2 no es capaz de modificar las corrientes de los

canales de Ca2+ y K+ (Herkenham, 1995).

Se ha propuesto que los endocannabinoides podrían funcionar como

neuromoduladores reduciendo la liberación de ciertos neurotransmisores durante

periodos de intensa estimulación. La actuación de los endocannabinoides sobre

receptores presinápticos CB1 reduciría la actividad neuronal a través de la inhibición de

canales de Ca2+ sensibles a voltaje, cuya apertura es necesaria para producir la

liberación del neurotransmisor. A su vez, la activación de los receptores CB1 podría

incrementar la entrada de K+, lo que reduciría la intensidad de eventuales

despolarizaciones, la generación de los potenciales de acción, y, en definitiva, la

propagación del impulso nervioso.

2.5 - NEUROFARMACOLOGÍA DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE

El Sistema Endocannabinoide (SEC) está ampliamente distribuido en todo el

cuerpo, lo cual se correlaciona con su papel modulador de múltiples procesos

fisiológicos. En los tejidos periféricos, la localización de los componentes del sistema

endocannabinoide refleja la distribución de los tipos celulares donde se ubican (por

ejemplo, linfocitos B en nódulos linfáticos y bazo). Sin embargo, en el sistema nervioso

su distribución es mucho más compleja y estructurada, y claramente refleja la

importancia de dicho sistema en la transmisión sináptica. En algunas regiones, tales

como el hipocampo, hay una distribución complementaria de receptores cannabinoides,

transportadores y enzimas de degradación. Sin embargo, en otras áreas del cerebro,

como el tálamo, hay discrepancias (por ejemplo, donde existen transportadores y

expresión de MAGL están ausentes los receptores CB1) en su distribución, lo cual

refleja el desconocimiento existente acerca de este sistema.

En cuanto a la bioquímica del SEC, los endocannabiniodes se liberan a demanda

tras la despolarización celular o estimulación del receptor siendo, en ambos casos, de

forma dependiente de calcio. Una vez producidos, actúan sobre los receptores

Introducción

- 38 -

cannabinoides como mediadores locales en las células cercanas al lugar de producción,

lo que indica que actúan de manera similar a los autacoides. En el SNC, la distribución

altamente organizada de los elementos de señalización endocannabinoide en las sinapsis

glutamatérgicas y GABAérgicas y su conservación a lo largo de la evolución, demuestra

su papel fundamental en la transmisión sináptica.

Debido a la inhibición de la adenil ciclasa, la activación de las corrientes de K+ y

la inhibición de la entrada de Ca2+ en la célula, el efecto neto de la estimulación del

receptor CB1 es una hiperpolarización local que conduce a los efectos inhibitorios

generales descritos.

Si los endocannabinoides actúan postsinápticamente, contrarrestarán la

activación existente en las células postsinápticas. Este mecanismo de interacciones

postsinápticas se ha propuesto para el caso de la transmisión dopaminérgica (Felder et

al., 1998; Rodríguez de Fonseca et al., 1998; Giuffrida et al., 1999). A pesar de su

importancia, la modulación postsináptica en cuantitativamente menor a las importantes

acciones presinápticas, lo cual se basa en dos hechos: la concentración de receptores

CB1 en los terminales presinápticos y los efectos inhibidores descritos, con agonistas de

CB1, sobre la liberación de GABA, glutamato, acetilcolina y noradrenalina (Schlicker y

Kathmann, 2001; Piomelli, 2003). Este efecto inhibidor se ha demostrado también con

neuropéptidos como el factor liberador de corticotropina y la colecistoquinina

(Rodríguez de Fonseca et al., 1997; Beinfeld y Connolly, 2001).

El efecto de inhibición de la liberación de neurotransmisores presinápticos se

asocia con la acción inhibidora de los endocannabinoides sobre los canales de Ca2+

presinápticos, a través de la activación de CB1. Dicha inhibición podría dar lugar a dos

formas diferentes de plasticidad a corto plazo, dependiendo de la implicación, ya sea de

la transmisión de GABA o glutamato: supresión de la inhibición inducida por

despolarización (DSI) y supresión de la excitación inducida por despolarización (DSE),

respectivamente (Wilson y Nicoll, 2002; Diana y Marty, 2004). Ambas formas de

plasticidad implican la activación inicial de una neurona de proyección postsináptica

(célula piramidal o de Purkinje) que envía un mensajero retrógrado al terminal

presináptico GABAérgico (DSI) o glutamatérgico (DSE), induciendo una supresión

transitoria ya sea de la inhibición o excitación presináptica. La contribución de los

endocannabinoides a estas formas de plasticidad a corto plazo se ha descrito en

Introducción

- 39 -

hipocampo (Wilson y Nicoll, 2001; Wilson et al., 2001) y en cerebelo (Diana et al.,

2002).

El papel del DSI o DSE, inducido por endocannabinoides, parece ser resultado

de la coordinación de elementos neurales, dentro del hipocampo y el cerebelo, que están

implicados en procesos fisiológicos relevantes, tales como la memoria o la coordinación

motora.

Otras formas adicionales de modulación endocannabinoide de la transmisión

sináptica implican la inducción de plasticidad sináptica a largo plazo, denominada como

potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD). Ambas formas de

plasticidad implican cambios a largo plazo en la eficacia de la transmisión sináptica en

las neuronas glutamatérgicas, las cuales tienen un mayor impacto sobre la consolidación

y remodelación de la sinapsis.

La activación de los receptores cannabinoides previene la inducción de LTP en

las sinapsis hipocampales (Stella et al., 1997) y la facilitación de LTD en el estriado

(Gerdeman et al., 2002) y núcleo accumbens (Robbe et al., 2002). En el hipocampo, los

mensajeros endocannabinodes regulan una forma de LTD que afecta a las neuronas

GABAérgicas (Chevaleyre y Castillo, 2003). En general, los endocannabinoides actúan

como mensajeros locales que ajustan el valor sináptico y contribuyen significativamente

a la eliminación del flujo de información a través de sinapsis específicas en un amplio

rango temporal.

El hecho de que la estimulación del receptor cannabinoide tenga impacto sobre

los segundos mensajeros implicados no sólo en la remodelación sináptica (Derkinderen

et al., 1996; Piomelli, 2003) sino también en la diferenciación neuronal (Rueda et al.,

2002) y la supervivencia neuronal (Panikashvili et al., 2001; Marsicano et al., 2003),

indica que el sistema de señalización es un importante mecanismo homeostático que

garantiza un fino ajuste del procesamiento de la información en el cerebro y provee

mecanismos contrarreguladores dirigidos a preservar la estructura y función de los

principales circuitos cerebrales. Ambos procesos son relevantes para el comportamiento

homeostático como es el comportamiento motivado (alimentación, reproducción,

relajación, sueño) y emociones, así como para la cognición, ya que el aprendizaje y

memoria requieren cambios morfológicos y en las dinámicas funcionales de los

circuitos cerebrales. Una confirmación experimental de este hipotético papel del sistema

Introducción

- 40 -

endocannabinoide fue la demostración de su implicación en el control de la extinción de

la memorias aversivas (Marsicano et al., 2002; Terranova et al., 1996).

A pesar de la modulación periférica del sistema inmune, lechos vasculares,

órganos reproductores, el metabolismo y motilidad gastrointestinal, el SEC también

regula los procesos de percepción incluyendo la nocicepción (los cannabinoides son

potentes analgésicos, Martin y Litchman, 1998) y el proceso visual en la retina (Straiker

et al., 1999). Otras funciones ejercidas por el SEC implican la regulación de los

circuitos cerebelares y de los ganglios basales, donde actúa en la modulación del

aprendizaje implícito de las rutinas motoras (Rodríguez de Fonseca et al., 1998).

Entre las variadas funciones en las que el SEC está implicado, el control

homeostático de las emociones y la regulación del comportamiento motivado merece

una atención especial debido a su impacto sobre enfermedades humanas, incluyendo la

adicción. Los efectos positivos de los endocannabinoides sobre la motivación parecen

estar mediados no sólo por los sistemas sensoriales periféricos en los que los receptores

cannabinoides están presentes (por ejemplo, el fomento del consumo de alimentos

mediante agonistas de receptores CB1, Gómez et al., 2002), sino también por la acción

de los endocannabinoides sobre el sistema de recompensa.

El SEC está ampliamente distribuido en la amígdala extendida (conjunto de

núcleos telencefálicos localizados en las neuronas del septo medio, el shell del núcleo

accumbens y el complejo amigdalar) y está implicado en el control del comportamiento

motivado, en las respuestas condicionadas y en las respuestas emocionales asociadas.

Esta hipótesis se apoya en dos hechos: la inhibición del comportamiento motivado tras

la administración de antagonistas cannabinoides (Colombo et al., 1998a; Navarro et al.,

2001) y los déficits de recompensa observados en el ratón ‘knockout’ del receptor CB1

(Ledent et al., 1999; Maldonado y Rodríguez de Fonseca, 2002; Sanchis-Segura et al.,

2004).

La investigación de las bases neurobiológicas de los efectos de los

endocannabinoides sobre el comportamiento motivado se ha focalizado sobre la

interacción endocannabionide-dopamina así como en el papel del SEC en el aprendizaje

y condicionamiento. La amígdala extendida es una diana de las proyecciones

mesocorticolímbicas ascendentes de las neuronas dopaminérgicas del área tegmental

ventral (ATV), un subconjunto de neuronas mesencefálicas que dan lugar a una

Introducción

- 41 -

respuesta contundente a las drogas que causan dependencia (Maldonado y Rodríguez de

Fonseca, 2002).

La mayoría de las drogas activan a las neuronas dopaminérgicas del ATV, en

términos de liberación de dopamina en las áreas terminales, especialmente en el núcleo

accumbens y la corteza prefrontal, o mediante las tasas de disparo de dichas neuronas

del ATV.

El THC y otros agonistas de CB1, incrementan el eflujo de dopamina en el

núcleo accumbens y en la corteza prefrontal e incrementan la tasa de disparo de

dopamina en el ATV (Gardner y Vorel, 1998). Este efecto no está causado por la

activación directa de las neuronas dopaminérgicas ya que no expresan CB1 (Julián et

al., 2003). Aunque los efectos de los agonistas sobre la liberación de dopamina, en las

áreas de proyección, pueden bloquearse con antagonistas opioides, como la naloxona,

no se puede bloquear el incremento de la tasa de disparo en la célula. Esta discrepancia

podría sugerir la existencia de un papel diferente para los sistemas opioides endógenos,

como moduladores de las acciones cannabinoides, en los cuerpos celulares

dopaminérgicos con respecto a sus terminaciones axonales.

Los efectos cannabinoides podrían también implicar a las aferencias

glutamatérgicas y GABAérgicas del núcleo accumbens y del ATV, ya que los

receptores CB1 presinápticos regulan la liberación de GABA y glutamato en estas áreas,

incluyendo el LTD (Schlicker y Kathman, 2001; Robbe et al., 2002). De acuerdo con

estas acciones en los circuitos de recompensa, la exposición continuada a cannabinoides

puede inducir sensibilización similar a la producida por otras drogas que causan

dependencia. La administración crónica de cannabinoides también produce una

sensibilización cruzada con los efectos locomotores de los psicoestimulantes

(Maldonado y Rodríguez de Fonseca, 2002).

Debido a que los endocannabinoides inducen LTD en el núcleo accumbens (que

afecta a las aferencias procedentes de la corteza prefrontal), probablemente regulen la

adquisición del hábito aprendido y las respuestas condicionadas relevantes para la

pérdida progresiva del control, que caracterizan a la adicción a alcohol (Maldonado y

Rodríguez de Fonseca, 2002).

La administración de un antagonista de CB1 bloquea la recaída en el consumo

de heroína y cocaína (De Vries et al., 2001, 2003). La importancia del SEC en el control

Introducción

- 42 -

del comportamiento motivado va más allá del control del procesamiento de las señales

de recompensa constantes (Sanchis-Segura et al., 2004). Además, cuando los

mecanismos homeostáticos cannabinoides no son adecuados para restaurar la pérdida de

equilibrio en el control de la recompensa derivada de la exposición contínua y no

controlada al reforzador (por ejemplo, opiáceos o alcohol), los cambios alostáticos que

implican a CB1 contrarrestan la espiral de daños sobre el circuito de recompensa. Esto

se ha demostrado en roedores expuestos a ciclos de dependencia-abstinencia a alcohol y

morfina (Navarro et al., 2001; Rimondini et al., 2002). En este modelo, se asocia un

historial de dependencia con una permanente sobrexpresión de CB1, en áreas

relacionadas con la recompensa, y con una incrementada sensibilidad a la interrupción

de la recompensa, inducida por antagonistas de los receptores cannabinoides (Rodríguez

de Fonseca et al., 1999; Rimondini et al., 2002).

Los receptores cannabinoides no sólo se asocian con alteraciones

motivacionales, sino también se relacionan con el procesamiento de las emociones. Un

punto clave para la regulación endocannabinoide de las emociones es el complejo

amigdalar. Los endocannabinoides son capaces de disminuir la liberación de glutamato

y del factor liberador de corticotropina, reduciendo la señalización vía eferencias

amigdalares y la actividad de las proyecciones inhibidoras basolaterales de GABA hacia

el núcleo central de la amígdala, con lo cual se activa la vía amigdalofugal (Rodríguez

de Fonseca et al., 1996, 1997; Navarro et al., 1997; Marsicano et al., 2002; Piomelli,

2003).

El balance final conducirá a la ansiedad o ansiolisis, dependiendo de la tasa de

activación de las proyecciones descendentes del núcleo central de la amígdala hacia el

hipotálamo (respuestas endocrinas) y el tronco cerebral (respuestas autónomas y de

comportamiento). Sin embargo, estudios recientes indican que la ansiolisis es una

respuesta normal a un incremento de la transmisión cannabinoide en el sistema límbico,

como se refleja en el fenotipo de ratones ‘knockout’ de FAAH y con los efectos de los

inhibidores de FAAH (Cravatt y Lichtman, 2003; Kathuria et al., 2003). La inducción

de ansiedad por antagonistas cannabionides (Navarro et al., 1997) apoya también esta

hipótesis.

Introducción

- 43 -

3. ALCOHOL Y SISTEMA ENDOCANNABINOIDE

3.1 - Efectos Agudos del Alcohol sobre el Sistema Endocannabionoide

Actualmente no existen estudios que describan los efectos centrales de la

administración aguda de etanol. En la presente tesis, se expondrán los efectos

observados tras dicho tratamiento sobre la síntesis, degradación y señalización mediada

por anandamida y sus congéneres sobre sistemas de transmisión lipídicos como los

endocannabinoides.

3.2 - Efectos Crónicos del Alcohol sobre el Sistema Endocannabionoide

Gran número de artículos científicos relacionan la señalización a través del

receptor CB1 con el comportamiento de búsqueda de alcohol.

La administración de agonistas de CB1 promueve el consumo de etanol

(Colombo et al., 2002) mientras que los antagonistas reducen la autoadministración de

etanol (Arnone et al., 1997; Freedland et al., 2001), especialmente en animales con un

historial de dependencia a etanol (Rodríguez de Fonseca et al., 1999) o en líneas de

ratas con preferencia al alcohol (Colombo et al., 1998; Gessa et al., 2005).

Mediante hibridación in situ se ha demostrado que, durante el consumo crónico

de etanol, la expresión génica del receptor CB1 disminuye en áreas cerebrales de rata

como el núcleo caudado-putamen, el núcleo ventromedial del hipotálamo y ciertas

regiones del hipocampo (CA1, CA2) (Ortiz et al., 2004).

El desarrollo de ratones deficientes en el gen del receptor CB1 ha permitido

demostrar que la señalización endocannabinoide, actuando sobre CB1, está implicada

en la preferencia a etanol. Se ha demostrado que los ratones CB1-/- muestran un

consumo de etanol voluntario drásticamente disminuido (Hungund et al., 2003;

Poncelet et al., 2003; Wang et al., 2003; Naassila et al., 2004). Por otro lado, un rastreo

génico ha identificado al gen del receptor CB1 como uno de los que presentan

alteraciones en su expresión durante los ciclos de exposición a etanol (Rimondini et al.,

2002) y estudios genéticos en humanos han encontrado relación entre el alcoholismo y

Introducción

- 44 -

polimorfismos y/o mutaciones de dicho gen (Comings et al., 1997; Schmidt et al.,

2002).

Otros estudios han puesto de manifiesto que la administración crónica de etanol

está asociada con un incremento en la formación de AEA y de su precursor la N-

araquidonilfofatidiletanolamina (NAPE) en el linaje de células SK-N-SH de

neuroblastoma humano (Basavarajappa y Hungund, 1999; Ortiz et al., 2004). A su vez,

la exposición crónica a etanol también estimula la formación del endocannabinoide 2-

araquidonilglicerol (Basavarajappa et al., 2000). Se ha demostrado que el incremento

encontrado en las concentraciones de anandamida extracelular en cultivos de neuronas

granulares de cerebelo, tras someterse a tratamiento crónico de etanol, podrían deberse

a una inhibición indirecta de FAAH y a una disminución en la recaptación de AEA

(Basavarajappa et al., 2003). El transportador de anandamida es, además, independiente

de CB1 ya que su actividad no se altera ante la presencia de antagonistas de CB1

(SR141716A) así como tampoco existen tales diferencias en ratones ‘knockout’ de CB1

disminuyendo, tanto en éstos como en ratones silvestres, el transporte de anandamida

tras ser sometidos a tratamientos crónicos de etanol (Basavarajappa et al., 2003). Estos

resultados apoyarían la hipótesis de que la ingesta prolongada de etanol incrementa los

niveles de ligandos endocannabinoides cerebrales (Basavarajappa y Hungund, 1999), lo

cual llevaría a un decremento de la expresión génica y función de CB1 (Basavarajappa

et al., 1998; Basavarajappa y Hungund, 1999; Ortiz et al., 2004).

Se sabe también que animales genéticamente predispuestos a un mayor consumo

de etanol, poseen niveles elevados de endocannabinoides en la corteza prefrontal (área

relacionada con la recompensa) y un menor número y activación de receptores CB1

(Hansson et al., 2007)

Varias evidencias sugieren que la enzima FAAH actúa como un regulador

catabólico primario de anandamida y que está relacionado con la degradación de otras

amidas de ácidos grasos bioactivas. Concretamente, ratones FAAH -/- están seriamente

afectados en su capacidad de degradar anandamida y muestran un comportamiento

exagerado a esta amida de ácido graso, tales como hipomovilidad, hipotermia, analgesia

y catalepsia. Además, los niveles endógenos de anandamida en cerebro y de amidas de

ácidos grasos relacionadas, están incrementados unas 10 veces en ratones FAAH-/-

correlacionándose con el aumento de la analgesia, dependiente de CB1, en estos

animales (Cravatt et al., 1996).

Introducción

- 45 -

Todos estos hechos, sugieren que FAAH podría controlar la magnitud y

duración de la señalización in vivo de las amidas de ácidos grasos mediante el

establecimiento de un tono endocannabinoide en el cerebro así como, posiblemente, en

otras partes del sistema nervioso. De hecho, el patrón de distribución de FAAH es muy

parecido al que presenta el receptor CB1, con altas concentraciones en hipocampo,

cerebelo y corteza cerebral.

En humanos se ha descrito que un polimorfismo en un solo nucleótido del gen

de la enzima FAAH, 385A, está fuertemente asociado con el consumo de drogas, entre

ellas el alcohol (Sipe et al., 2002). El polimorfismo encontrado en FAAH produce una

mutación sin sentido (385C→A) que resulta en la conversión de un residuo de Pro por

Thr (P179T). Curiosamente, este residuo está altamente conservado en todos los

mamíferos caracterizados hasta la fecha. Aunque la mutación P179T no se ha

encontrado que altere las propiedades catalíticas o la estabilidad estructural de FAAH,

sí produciría una variante de FAAH con una incrementada sensibilidad a la degradación

proteolítica (Sipe et al., 2002). Por tanto, los polimorfismos en el gen FAAH humano

que generasen enzimas alteradas funcionalmente también se esperaría pudiesen cambiar

los niveles tónicos de señalizadores lipídicos del SEC, lo cual podría repercutir sobre

las vías cerebrales de adicción/recompensa a drogas.

En ratones FAAH -/- está descrito un incremento en la preferencia y el consumo

de alcohol (Walker et al., 2005; Basavarajappa et al., 2006; Blednov et al., 2007) y

recientemente se han encontrado diferencias tanto en la expresión como en la actividad

de FAAH en la corteza prefrontal de ratas genéticamente alcohólicas. Todo ello parece

sugerir un importante papel para esta enzima en los procesos adictivos.

3.3 - Interacción de Cannabinoides y Alcohol: una Nueva Diana para el Tratamiento

De todos los cannabinoides, sólo el THC posee una interacción farmacodinámica

con el etanol significativa (Hollister y Gillespie, 1970), siendo sus efectos

comportamentales y farmacológicos como hipotermia, euforia, analgesia, y ataxia

además del desarrollo de tolerancia y dependencia similares entre sí (Kalant y LeBlanc,

1974).

Introducción

- 46 -

Un gran número de evidencias sugieren la existencia de interacciones

funcionales entre los efectos del cannabis y el etanol. Primero, la capacidad de esta

pequeña molécula para interaccionar con numerosos sistemas fisiológicos. Los efectos

iniciales del etanol darían lugar a la facilitación de receptores GABAA y a la inhibición

de la transmisión de receptores de glutamato NMDA. Segundo, el cannabis y el etanol

muestran algunos perfiles de comportamiento similares: a bajas dosis ambos producen

estimulación de la actividad locomotora y a altas dosis producen sedación aunque,

obviamente, los niveles de dosis a los que estos efectos se dan son muy diferentes. Por

último, ambos activan las mismas vías de recompensa y el receptor CB1 juega un

importante papel en la regulación de sus propiedades de refuerzo positivo. Está bien

establecido que el sistema mesolímbico dopaminérgico juega un papel central en los

circuitos de recompensa, ruta que es común en el refuerzo producido por la mayoría de

las drogas de abuso.

Se ha demostrado que el tratamiento crónico con anandamida produce tolerancia

a una determinada dosis y tolerancia cruzada al THC en ratones, de manera similar a la

observada tras el tratamiento crónico de THC (Fride y Mechoulam, 1993). Ya que

muchos de estos efectos comportamentales son similares a los observados en el etanol,

se sugiere que estos compuestos (THC, etanol y anandamida) podrían compartir una

diana común para inducir tolerancia y podrían tener un mecanismo común para sus

acciones.

Está descrito que la administración del antagonista SR141716A inhibe la ingesta

de etanol en animales consumidores de etanol como los ratones C57Black/6 (Arnone et

al., 1997) y las ratas sP (Serra et al., 2001), incrementando la ingesta voluntaria de

dicha solución en estas últimas cuando se administran agonistas del receptor

cannabinoide (Colombo et al., 2002). Por otro lado, usando cerveza (la cual las ratas

beben fácilmente) como solución alcohólica, Gallate et al. (1999) han descrito que el

agonista CP-55,940 incrementa, de manera dependiente de la dosis, la respuesta por la

cerveza, efecto que revertía cuando se administraba SR141716A.

Un estudio de autoadministración ha demostrado que el antagonista SR141716A

reduce las respuestas operantes en ratas Wistar, que se hicieron dependientes de etanol

mediante una exposición a vapores de etanol durante 14 días, aunque no ocurría lo

mismo en ratas que no eran dependientes de etanol (Rodríguez de Fonseca et al., 1999).

Introducción

- 47 -

El hecho de que los receptores CB1 estén implicados en mediar los aspectos

consumidores y de apetencia por el etanol (Freedland et al., 2001), sugiere que el

antagonista SR141716A podría tener una gran utilidad para el tratamiento del abuso de

alcohol y podría ser también efectivo en la prevención de la recaída ya que se ha

descrito que dicho compuesto es eficaz en inhibir la restauración del comportamiento de

búsqueda de droga provocado por la cocaína (De Vries et al., 2001).

OBJETIVOS

Objetivos

- 51 -

1.- Caracterizar las acciones agudas del etanol, en ratas Wistar, sobre la dinámica de

señalización cannabinoide mediante estudios de:

a) Expresión de ARNm y de proteínas del Sistema Endocannabinoide.

b) Actividades enzimáticas de síntesis y degradación de

endocannabinoides.

c) Producción de endocannabinoides.

d) Relación con la actividad de neurotransmisores implicados en las

acciones del alcohol.

2.- Caracterizar las acciones crónicas del etanol, en ratas Wistar, sobre la dinámica de

señalización cannabinoide mediante estudios de:

a) Expresión de ARNm y de proteínas del Sistema Endocannabinoide.

b) Actividad enzimática de síntesis y degradación de endocannabinoides.

3.- Caracterizar el Sistema Endocannabinoide en líneas animales con preferencia

alcohólica, mediante estudios de:

a) La expresión de ARNm y de proteínas.

b) La actividad enzimática de síntesis y degradación.

c) La producción de endocannabinoides.

d) Relación de la señalización endocannabinoide con la actividad de los

neurotransmisores implicados en las acciones del alcohol.

e) Respuesta de estas líneas a la administración de fármacos que

interfieren con la señalización endocannabinoide.

4.- Formular propuestas de terapia del alcoholismo en base a los hallazgos en las

acciones del alcohol sobre el Sistema Endocannabinoide.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

- 55 -

1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 1.1 – RATAS WISTAR

En la realización de esta tesis doctoral se han utilizado ratas adultas macho

Wistar (Charles River, Wilmington, MA y Barcelona, España) con un peso entre 250-

400 gr, las cuales fueron sometidas a diferentes tratamientos de etanol tal y como se

detalla en el apartado 1.3.1. Los animales se mantuvieron a una temperatura de 20 U+ U 2º

C, una humedad relativa de 40 U+ U 5 % y a ciclos de luz-oscuridad de 12 horas de

duración (encendido de luz a las 8:00 a.m.), teniendo libre acceso a comida (dieta

comercial para roedores SAFE A04; Panlab, Barcelona, España) y agua en el animalario

de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga.

Para el manejo y sacrificio de los animales se siguió la normativa europea

vigente 86/609/ES que regula la investigación animal.

1.2 - MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO

1.2.1. Ratas AA

En esta tesis se han estudiado modelos animales con preferencia al consumo de

etanol como son las ratas AA (Alko Alcohol) las cuales fueron comparadas con ratas sin

preferencia, denominadas ANA (Alko Non-Alcohol).

Las ratas AA y ANA tenían un peso comprendido entre 180- 200 y 220-250 gr,

respectivamente, y procedían del Instituto Nacional de Salud Público de Helsinki

(Finlandia). En los experimentos de autoadministración de etanol se agruparon dos o

cuatro animales en cada caja bajo condiciones controladas de temperatura (20 U+U 2º C) y

humedad (55 U+ U 5 %) y con ciclos de luz-oscuridad invertidos (fase de luz iniciada al

mediodía). El agua y la comida estaban disponibles ad libitum en la caja, a excepción

del inicio del entrenamiento (apartado 1.3.2). Todas las sesiones de entrenamiento se

realizaron durante la fase oscura.


- 56 -

Para los estudios in vitro e in situ los animales fueron sacrificados por

decapitación, sus cerebros fueron rápidamente extraídos y congelados a – 40º C en

isopentano y almacenados a – 70º C.

Todos los procedimientos experimentales llevados a cabo con estos animales se

hicieron bajo la aprobación de los comités éticos locales (Nacional Public Health

Institute’s Animal Care and Use Committee; Stockholm South Animal Ethics

Committee) y cumpliendo la normativa europea vigente 86/609/ES que regula la

investigación animal.

1.2.2. Ratas msP

Las ratas msP (Marchigian Sardinian alcohol-preferring) son otro modelo animal

de alcoholismo, por su preferencia al consumo de etanol, las cuales han sido

comparadas con ratas Wistar no tratadas.

Tenían un peso entre 175-225 gr y procedían del Departamento de Ciencias

Farmacológicas y Medicina Experimental de la Universidad de Camerino (Italia).

Fueron criadas durante más de 42 generaciones a partir de la 13ª generación de ratas sP

(Sardinian alcohol-Preferring) procedentes del Departamento de Neurociencias de la

Universidad de Cagliari (Agabio et al., 1996; Colombo, 1998; Lobina et al., 1997).

Se agruparon dos animales en cada caja, en condiciones de temperatura y

humedad controladas y bajo ciclos de luz-oscuridad invertidos (luz a partir de 6:00 pm;

oscuridad a partir de 6:00 am), disponiendo de agua y comida ad libitum. Las sesiones

de entrenamiento se realizaron durante la fase oscura del ciclo.

Para el manejo y sacrificio de los animales se siguió la normativa europea

vigente 86/609/ES que regula la investigación animal.


- 57 -

1.3 – ADMINISTRACIÓN DE ALCOHOL

1.3.1. Tratamientos intraperitoneales de Etanol

Se realizaron dos tipos de tratamientos a las ratas Wistar:

- un tratamiento agudo y

- un tratamiento crónico de etanol.

Se establecieron, en ambos casos, dos grupos experimentales:

1. Grupo Etanol, a los que se les inyectó intraperitonealmente (i.p.)

etanol al 20%, disuelto en solución fisiológica salina, a razón de 4 y

2 gr/kg.

2. Grupo Control, a los que se les inyectó i.p., proporcionalmente a su

peso, el mismo volumen de solución fisiológica salina que el grupo

etanol.

En el tratamiento agudo, los animales fueron sacrificados a diferentes tiempos

(0, 45, 90, 120, 240 y 720 minutos) tras haber recibido una inyección i.p. con la

solución correspondiente.

En el tratamiento crónico, los animales fueron inyectados i.p. cada 12 horas,

durante 15 días, tras lo cual fueron sacrificados.

En ambos tratamientos las inyecciones se realizaron entre las 9:00 y 13:00 a.m.

de la fase de luz con el fin de evitar variaciones debidas al ritmo circadiano.

En el tratamiento agudo de etanol se formaron varios grupos de animales los

cuales fueron anestesiados con metoxiflurano y sacrificados mediante decapitación. Con

el fin de evaluar el efecto agudo del etanol sobre el contenido endocannabinoide se

recogieron muestras de sangre y vísceras (hígado, intestino delgado y grasa perirrenal)

de un primer grupo de animales y, de un segundo grupo de animales, se extrajeron los

cerebros como a continuación se detalla.

La sangre fue extraída con una jeringa que contenía 1 ml de tampón Krebs-Tris

(NaCl 136 mM; KCl 5 mM; MgClB2 B 1.2 mM; CaCl B2 B 2.5 mM; glucosa 10 m; Trizma base

20 mM; pH 7.4) y posteriormente se centrifugó en tubos ‘accuspin’ (Sigma), con el fin


- 58 -

de obtener el plasma donde se analizó su contenido de AEA. Las muestras de hígado,

grasa perirrenal e íleon se congelaron inmediatamente en hielo seco.

Siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente, se extrajeron y congelaron

rápidamente, en hielo seco, los cerebros de un segundo grupo de animales con el fin de

evaluar la expresión de los ARNm del sistema endocannabinoide (tiempos: 0, 2 y 12

horas) y el contenido endocannabinoide de los mismos. Todas las muestras se

mantuvieron a – 80º C hasta su posterior procesamiento.

Tras el tratamiento crónico de etanol los animales fueron sacrificados y se

tomaron muestras de sangre así como los cerebros, que fueron rápidamente congelados

en hielo seco y almacenados a -80º C hasta su posterior procesamiento.

Por otro lado, se estudió el posible efecto de la inyección i.p. sobre los niveles de

endocannabinoides ya que el estrés podría afectar a los niveles de anandamida en

determinadas áreas cerebrales (Patel et al., 2005). Se analizó el efecto de una única

inyección de solución salina sobre los niveles de anandamida en el estriado ventral,

cerebelo e hipocampo dorsal.

Se anestesiaron un grupo de animales, habituados a las inyecciones, con

metoxiflurano (Scherin-Plough, Union, NJ) a los 0, 30 y 60 minutos tras la inyección de

solución salina al 0.9% (1 ml/kg). Se sacrificaron por decapitación y se extrajeron los

cerebros de los animales y rápidamente se congelaron en hielo seco y se almacenaron a

-80º C.

1.3.2. Entrenamiento Operante y Autoadministración de Etanol

El entrenamiento y las pruebas realizadas se llevaron a cabo en cámaras

operantes estandarizadas, localizadas en cubículos ventilados y con atenuación del

sonido. Los estímulos visuales y auditivos se presentaban a través de un altavoz y un

foco de luz colocados en el panel frontal de la cámara. Ésta estaba equipada con un

reservorio de bebida (capacidad de volumen de 0.1 ml), posicionado a 4 cm del suelo en

el centro del panel frontal, y con dos palancas colocadas a 3 cm, a la derecha e

izquierda, del receptáculo de bebida. La palanca activaba una bomba que liberaba una

gota con 0.1 ml de líquido en el recipiente donde bebían. Para controlar las cámaras y la


- 59 -

obtención de los datos se utilizó el programa de comportamiento MED-PC (MED

Associates Inc., Georgia, VT).

Las ratas AA se entrenaron para la autoadministración oral de etanol usando un

protocolo de entrenamiento con sacarina consistente en la privación de agua durante 12

horas, 3 días consecutivos, y en el entrenamiento para responder a una gota de 0.1 ml de

sacarina al 0.2% (p/v) en ambas palancas, con un programa de refuerzo de ratio fijo 1.

Tras la solución de sacarina al 0.2% (p/v), la concentración se disminuyó al 0.1% y

posteriormente al 0.05%. Se les permitió responder a esta solución durante 2 semanas

antes de hacerlo a otros procedimientos. Las sesiones de entrenamiento tenían una

duración de 30 minutos diarios.

De manera similar, las ratas msP fueron entrenadas para autoadministrarse

soluciones de etanol al 10% (v/v), sacarina al 0.2% (p/v), sacarosa al 10% (p/v) o agua

en sesiones de 30 minutos diarios con un esquema de refuerzo de ratio fijo 1 (Weiss et

al., 1993). En este caso, el entrenamiento consistía en la restricción de agua durante 2

horas diarias de los 3 primeros días. Durante este tiempo, se estableció el refuerzo

mediante la presión de la palanca con solución de sacarosa al 10% (p/v) o sacarina al

0.2% (p/v). El entrenamiento con sacarosa/sacarina continuó hasta que los animales

alcanzaron la estabilidad en sus respuestas.

Tras el entrenamiento inicial los animales tuvieron libre acceso a comida y agua

en sus cajas.

Las ratas AA y un subconjunto de ratas msP, separadas de las entrenadas con

sacarina, fueron posteriormente entrenadas para autoadministrarse etanol usando una

modificación del procedimiento de sacarosa (Samson, 1986) ya que usaba sacarina en

vez de sacarosa (Weiss et al., 1993). Durante los 6 primeros días de esta fase de

iniciación al etanol, las respuestas sobre la palanca derecha daban lugar a la liberación

de una solución de etanol al 5% (p/v) y sacarina al 0.2% (p/v) mientras que las

respuestas sobre la otra palanca servían de recordatorio ya que no tenían consecuencias

programas. A partir del día 7, la concentración de etanol se incrementó gradualmente

desde el 5% al 8% y finalmente hasta el 10% (p/v), así como la concentración de

sacarina fue disminuyendo hasta ser completamente eliminada de la solución.

Las posiciones de las palancas activas e inactivas se mantuvieron constantes

durante el entrenamiento y las pruebas. Las respuestas a la palanca inactiva fueron


- 60 -

grabadas como medida de la activación no específica del comportamiento. Todas las

sesiones de entrenamiento y pruebas se realizaron en sesiones de 30 minutos diarios

durante 5 días a la semana. A los animales se les permitió responder a soluciones de

etanol al 10% durante 4-5 semanas antes de la cirugía.

1.4 – CIRUGÍA

Las ratas AA fueron anestesiadas con una mezcla de halotano-aire y se

posicionaron en un aparato estereotáxico con la barra incisiva ajustada a 3.3 mm debajo

de la línea interaural. Se implantaron 23 cánulas guía bilaterales a 2 mm sobre las áreas

diana en la corteza prefrontal (CPF) (AP 2.7 desde Bregma; ML U+ U 0.6; DV 3.2 desde la

superficie del cráneo) y estriado (AP 1.0 desde Bregma; ML U+ U 3.0; DV 5.0) de acuerdo

con Paxinos y Watson (1986).

Las cánulas se fijaron al cráneo con tres tornillos de anclaje y cemento dental y

se sellaron con hilos metálicos para evitar su oclusión. Con el fin de aliviar el dolor

postoperatorio, se les administró una dosis de buprenorfina (0.03 mg/kg

subcutáneamente) inmediatamente después de la cirugía. Los animales se recuperaron

durante una semana, antes de las sesiones de autoadministración de etanol y sacarina

previamente descritas.

1.5 – ADMINISTRACIÓN DE DROGAS

El antagonista SR141716A del receptor cannabinoide CB1, administrado

mediante inyecciones intraperitoneales a las ratas AA, estaba disuelto en una mezcla de

propilen glicol, Tween-80 y solución salina en una proporción 1:1:18. Se administró 30

minutos antes de testarlo mediante un diseño experimental de cuadrados latinos.

Para las microinyecciones intracerebrales (0.5 μl), se disolvió el antagonista en

DMSO y se diluyó al 75% con solución salina. Las soluciones de la droga se inyectaron

a través de 30 cánulas conectadas a microjeringas de 10 μl que se extendían hasta 2 mm

bajo las guías. Las microinyecciones se realizaron con una bomba de inyección, durante


- 61 -

un periodo de 45 segundos, 20 minutos antes de las sesiones experimentales. Antes de

retirar los inyectores, se dejó que difundiera durante 60 segundos.

En la primera inyección se les suministró vehículo (DMSO al 75%) con el fin de

habituarlos a las inyecciones intracraneales, seguido de dosis de 0, 3 y 6 μg de

SR141716A usando un diseño experimental de cuadrados latinos. Se realizaron al

menos dos sesiones con vehículo (sesiones control) entre las inyecciones.

Por otro lado, se inyectó el vehículo (DMSO al 75%) a un grupo de ratas con

cánulas en la CPF (n = 7) y estriado (n = 7) con el fin de poder excluir los posibles

efectos del vehículo sobre la autoadministración de etanol.

Para las microinyecciones intra-CPF (0.5 μl) del inhibidor de FAAH: URB597

(Kathuria et al., 2003; Cayman Chemicals, MI, USA), se disolvió la droga en DMSO al

75%. Se inyectó a través de 30 cánulas conectadas a microjeringas de 10 μl que se

extendían hasta 2 mm bajo las guías. Las microinyecciones se realizaron, mediante una

bomba, 30 minutos antes de las sesiones experimentales y durante un periodo de unos

60 segundos, dejándose difundir durante 60 segundos antes de retirar los inyectores. Se

utilizó un diseño entre sujetos y cada animal recibió sólo una inyección de la droga.

1.6 - MICRODIÁLISIS IN VIVO

A las ratas Wistar (n = 11; 300- 350 g), tras ser anestesiadas con vapor de

isofluorano al 1-2%, se les implantó una cánula guía de microdiálisis en el shell del

núcleo accumbens (+1.6 mm AP, +/- 0.8 mm ML y – 5.7 mm DV, según coordenadas

Bregma; Paxinos y Watson, 1997; Giuffrida et al., 1999), dejándose siete días de

recuperación antes de iniciar la microdiálisis. Un día antes de la misma, se anestesiaron

a los animales (con vapor de isofluorano al 1-2%) y se insertó una sonda de

microdiálisis (membrana PES de 2 mm, peso molecular de 15 kDa) que se fijó a la

cánula guía previamente implantada.

Las sondas fueron perfundidas, durante toda la noche, con líquido cerebroespinal

artificial (145 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1.2 mM MgCl B2 B, 1.2 mM CaCl B2B, 5.4 mM D-

glucosa, 0.25 mM ácido ascórbico, pH = 7.2 – 7.4) a una tasa de 0.2 μl/ min. A la

mañana siguiente, se perfundió con líquido cerebroespinal artificial que contenía


- 62 -

hidroxipropil-β-ciclodextrina (HB-β-CD) al 30% (p/v) y se incrementó la tasa a 0.6

μl/min. La inclusión de HB-β-CD en el medio de perfusión permitió un sustancial

incremento en la recuperación, mediante diálisis, de endocannabinoides (similar a los

descritos por Walker et al., 1999).

Tras un periodo de 90 min de equilibrado, se recolectaron las muestras

dializadas en intervalos de 10 min, durante un periodo inicial de 40 minutos, una vez

transcurridos 30 minutos después de la inyección del vehículo (etanol:emulfor:salino,

1:1:18; 1 ml/kg) y finalmente durante los 120 minutos posteriores a la administración

i.p. de etanol al 20% (p/v) en dosis de 0.75 ó 2 g/kg. Las muestras se congelaron

inmediatamente después de su recolección y se almacenaron a -80º C hasta el análisis

del contenido de endocannabinoides mediante cromatografía líquida acoplada a

espectrometría de masas (LC-MS) tal y como se describe en el apartado 5.2.1.

A un segundo grupo de ratas macho Wistar (n = 5) se les implantó

quirúrgicamente unas cánulas guía de microdiálisis en el núcleo accumbens para el

análisis de las posibles alteraciones, inducidas por el etanol, sobre los niveles de

glutamato (Glu). Se siguió el mismo protocolo descrito anteriormente a excepción de

que el medio de perfusión no contenía HB-β-CD, ya que este aditivo no es necesario

para la recuperación de monoaminas y aminoácidos. En esta ocasión, se usó una tasa de

flujo mayor (1 μl/min) necesaria para la separación muestral y el análisis de

monoaminas y aminoácidos (apartado 5.3).

1.7 - MEDIDA DE LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA Y LA TEMPERATURA

CORPORAL

En este experimento se realizaron varios grupos de ratas Wistar (n = 8-10) a

cada uno de los cuales se les inyectó una de las siguientes soluciones:

- Vehículo: Tween-80, dimetilsulfóxido y agua 10:10:80 (v/v).

- AM404 disuelto en la solución vehículo a una dosis de 2 mg/kg

- Etanol (20% v/v en solución salina) a una dosis de 2 g/kg


- 63 -

- Combinación de AM404 (2 mg/kg) y Etanol (2 g/kg). En este caso, el

AM404 se inyectó 30 minutos antes de administrar i.p. la solución de

etanol.

La temperatura corporal se midió utilizando una sonda rectal acoplada a un

sistema telemático de registro, realizándose medidas a los 5, 30, 60 y 120 segundos de

la inyección i.p. con la solución correspondiente.

La actividad locomotora se midió en campo abierto (100 x 100 cm, divido en 25

cuadrados de 20 x 20 cm) grabándose automáticamente en un ordenador (SMART,

Panlab) al que la cámara estaba conectada. Los animales se situaron en arena durante 10

minutos antes de dicha medida para que se habituasen y a continuación se ubicaron en

el centro del campo abierto midiéndose la actividad horizontal (número de veces que los

animales cruzaban los cuadrados en un tiempo dado). Esta medida se llevó a cabo en

una habitación aislada de ruidos e iluminada con una luz halógena indirecta.

1.8 – DISECCIONES DE CEREBROS DE RATA

Los cerebros fueron cortados coronalmente en secciones de 1 mm de grosor

(6.70 mm a -9.30 mm coordenadas Bregma), a excepción del cerebelo.

Las secciones se manipularon sobre un soporte de nieve carbónica que los

mantenía congelados y permitía el aislamiento de las regiones cerebrales de interés. Las

regiones aisladas fueron:

- Corteza Prefrontal (5.20 a 4.20 mm, coordenadas Bregma).

- Cuerpo Estriado y Núcleo accumbens (1.70 a -2.12 mm, coordenadas

Bregma)

- Formación hipocampal (entre -2.12 y -5.80 mm, coordenadas Bregma),

- Cerebelo (desde -9.30 a -14.60 mm, coordenadas Bregma),


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CORTEZA PREFRONTAL (Bregma 4.20 mm)

ESTRIADO (Bregma 0.70 mm)

FORMACIÓN HIPOCAMPAL (Bregma -3.80 mm)

CPu, núcleos caudado y putamen; AcbC, core del núcleo accumbens; AcbSh, shell del núcleo accumbens.

DG, Giro Dentado; áreas CA1, CA2, CA3 y CA4 del hipocampo.


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CEREBELO (Bregma -10.04 mm)

Una vez aisladas las regiones cerebrales de interés, se procedió a su

procesamiento ya fuese para la obtención de extractos proteicos o de ARN total.

2. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DEL SISTEMA

ENDOCANNABIONIDE

2.1 – PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL

La cuantificación de los niveles de expresión de los genes del sistema

endocannabinoide mediante PCR cuantitativa a tiempo real. Para ello, realizaron una

secuencia ordenada de técnicas experimentales que a continuación se detallan:

1. Extracción de ARN total

2. Cuantificación del ARN total

3. Purificación del ARN total

4. Cuantificación y electroforesis del ARN purificado

5. Transcripción reversa (RT)

6. PCR cuantitativa a tiempo real


- 66 -

2.1.1 – Puesta a punto de la PCR cuantitativa

2.1.1.1 - Diseño de los Cebadores

El programa informático empleado para el diseño de los cebadores fue Primer3

versión 0.3.0 ( Thttp://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi T). Las variables

establecidas fueron, entre otras, que el rango de tamaño de nuestro producto de PCR

estuviese entre 150 y 200 pares de bases (pb), el rango de temperatura de fusión de los

cebadores estuviese comprendida entre 57 y 63º C, el porcentaje de nucleótidos G-C

oscilara entre el 40 y 60% y el tamaño de los cebadores entre 18 y 23 nucleótidos.

En el diseño de los cebadores se tuvo además en cuenta que la secuencia de los

cebadores no tuviesen un nucleótido T ni más de tres nucleótidos G ó C en el extremo

3’. También se evitaron la posible complementariedad de dos o más bases en los

extremos 3’ de la pareja de cebadores para así reducir la formación de dímeros así como

la complementariedad dentro de la secuencia.

Una vez diseñada y elegida la pareja de cebadores se realizó un análisis de

comparación de secuencias con la base de datos del genoma de rata, mediante el

programa informático Nucleotide BLAST ( Thttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/T). Ello

permitió discriminar aquellas parejas de cebadores que se pudieran unir a los ADNc de

otros genes evitándose, de esta forma, su amplificación durante la PCR.

2.1.1.2 – Determinación de la Temperatura de Alineamiento de los Cebadores

Tras el diseño de la secuencia de los cebadores específicos de cada gen se hace

necesario determinar la temperatura de alineamiento más adecuada. Para ello se realizó

una PCR con diferentes temperaturas de alineamiento y, a continuación, se corrieron las

muestras en un gel de agarosa al 1%, seleccionándose aquella temperatura a la que la

muestra no presentaba productos de PCR de tamaño diferente al esperado. El protocolo

seguido para realizar esta PCR se muestra en el apartado 7.5. Las secuencias de los

genes analizados así como las temperaturas de alineamiento empleadas en la PCR a

tiempo real se encuentran en el siguiente apartado (2.1.1.2).


- 67 -

2.1.1.3 - Secuencias de los Cebadores y Temperatura de Alineamiento

Gen Secuencia Cebador Sentido

Secuencia Cebador Antisentido

Temperatura Alineamiento

β-Actina 5’-TACAGCTTCACCACCACAGC-3’ 5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC-3’ 43.5º C

CB1 5’-AGACCTCCTCTACGTGGGCTCG-3’ 5’-GTACAGCGATGGCCAGCTGCTG-3’ 58º C

Ciclofilina-A 5’-AGAAGGCATGAGCATTGTGG-3’ 5’-TTACAGGGTATTGCGAGCAG-3’ 55º C

DAGL-α 5’- GGGTACCTAATGGCTGCTCA- 3’ 5’- AGGACTGACCATCCAACCTG- 3’ 60.5º C

FAAH 5’-GTTACAGAGTGGAGAGCTGTC-3’ 5’-GAGGGTTACTGCAGTCAAAGC-3’ 41º C

GAPDH 5’-GGTGATGCTGGTGCTGAGTA-3’ 5’-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3’ 66º C

GUS 5’- TCCTGTACACCACCCCTACC- 3’ 5’- GCCATCCTCATCCAGAAGAC- 3’ 61º C

MAGL 5’-CATGGAGCTGGGGAACACTG-3’ 5’-GGAGATGGCACCGCCCATGGAG-3’ 58º C

NAPE-PLD 5’-GGAGCTTATGAGCCAAGGTG-3’ 5’- ACTCTCCGTGCTTCAGGATG-3’ 57º C

Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR de una muestra sometida a diferentes temperaturas de alineamiento (calle 1 = 48º C; calle 2 = 50º C; calle 3 = 52.8º C; calle 4 = 55º C; calle 5 = 57.2º C). De esta forma se determina que la más adecuada para generar el estándar de ciclofilina-A de rata es de 55º C. PM = pesos moleculares de ADN desde 100 a 1000 pb, en intervalos de 100 pb respecto al fragmento anterior.


- 68 -

2.1.1.4 - Producción y Purificación del Estándar

El estándar de un determinado gen permite la cuantificación de los niveles de

expresión de dicho gen en una muestra, gracias a que previamente se conoce la

concentración del primero.

Para generar un estándar se debe hacer un adecuado diseño de los cebadores

(sentido y antisentido) así como establecer su temperatura de alineamiento (apartado

2.1.1.3). Una vez determinada, se procede a la producción del estándar mediante la

amplificación de ADNc procedente de un tejido de rata rico en el ARNm que se desea

cuantificar (protocolo en apartado 7.6).

Una vez generado el estándar, se purifica con el fin de eliminar los productos

de menos de 100 pb (protocolo en apartado 7.7). Para la purificación de los estándares

se utilizó un kit de purificación de alta pureza de productos de PCR (Roche), el cual se

basa en la selectividad de unión de éstos, en presencia de sales de tiocianato de

guanidina, a las fibras de vidrios especiales pre-empaquetadas que contiene el tubo con

membrana suministrado con el kit. El ADN es purificado en una serie de pasos rápidos

de lavados y centrifugaciones que permiten eliminar los cebadores, nucleótidos y sales

contaminantes. Posteriormente se eluye el ADN en una solución baja en sales.

Tras la purificación del estándar, se cuantifica su concentración mediante

espectrometría (a una longitud de onda de 260 nm) y se visualiza mediante

electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) junto con el estándar no purificado para

comprobar la eficiencia de la purificación.

Electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) del estándar sin purificar (1) y purificado (2) de ciclofilina-A de rata. Se puede apreciar cómo tras la purificación se han eliminado los productos con un tamaño inferior a 100 pb. PM = pesos moleculares de ADN de 100 a 1000 pb.


- 69 -

2.1.2 - Extracción de ARN total

La extracción de ARN total se realizó homogeneizando las muestras en reactivo

Trizol (Invitrogen). Dicho reactivo, constituido por fenol e isotiocianato de guanidina,

permite mantener la integridad del ARN cuando se rompen las células y se disuelven

sus componentes celulares.

La adición de cloroformo, seguida de la centrifugación, permite la separación de

una fase acuosa, donde se encuentra el ARN exclusivamente, de otra fase orgánica. Tras

separar la fase acuosa, se precipitó el ARN con isopropanol y posteriormente se

realizaron lavados con etanol al 75% (v/v). Por último se dejaron secar los precipitados

y posteriormente se disolvieron en agua, tratada con DEPC, libre de RNasas y DNasas

(apartados 7.1 y 7.17).

2.1.3 - Limpieza del ARN total

La purificación permite la eliminación de posibles contaminantes (ADN, ARN

de pequeño tamaño, etc.) procedentes de la extracción de ARN total y, una vez

realizada, que el ARN se encuentre en un ambiente libre de sales.

La limpieza del ARN se realizó siguiendo las instrucciones del manual del

RNeasy Mini Kit de Qiagen (apartado 7.2).

La adición de etanol a la muestra genera las condiciones necesarias para la unión

selectiva del ARN a la membrana de sílica-gel, suministrada con el kit, eliminándose los

contaminantes y diluyéndose posteriormente el ARN en agua libre de RNasas. El

tratamiento con la enzima DNasa permite la digestión de posibles restos de ADN

contaminante en la muestra, eliminándose dicha enzima en lavados posteriores. El ARN

total purificado se conservó a -80º C hasta su posterior uso.


- 70 -

2.1.4 - Cuantificación del ARN

La concentración del ARN se obtuvo tras medir la absorbancia, a una longitud

de onda de 260 nm, del ARN diluido en agua DEPC. Los ratios ARN/proteína se

obtuvieron midiendo las absorbancias a 260 nm y 280 nm de la muestra (diluida en

solución de Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM) y dividiendo los valores obtenidos para

ambas absorbancias. Se consideraron valores óptimos a aquellos comprendidos entre

1.8 - 2.1.

RATIO = Abs (260 nm)/ Abs (280 nm)

La cuantificación del ARN se realizó antes y después de su limpieza, lo cual

permitía conocer cuál había sido la eficiencia de la purificación.

2.1.5 - Electroforesis de ARN

Con el fin de conocer la integridad de los ARNs purificados se realizó la

visualización de los ARNs ribosómicos 18S y 28S.

Se cargaron, en cada pocillo, 1 μg por muestra junto con 2 μl de tampón de

carga de ARN (apartado 7.17) en un gel de agarosa al 1% (p/v), preparado con tampón

Tris-EDTA 1x diluido en agua DEPC. Se corrieron a un voltaje constante de 68 V

durante los primeros 10 minutos y a 80 V posteriormente. Todo el material empleado

fue previamente limpiado con una solución de SDS al 10% en agua DEPC y con RNAse

AWAY (Invitrogen).

Una vez finalizada la electroforesis, las bandas de ARN ribosomal 18S y 28S

fueron visualizadas y capturadas con el programa informático GelSuperII (TDI, Madrid,

España).


- 71 -

2.1.6 – Transcripción Reversa (RT)

Los ARNs purificados fueron sometidos a una transcripción reversa, usando

cebadores de secuencia azarosa, lo que permitió obtener ADNc de todos los ARN

mensajeros de la muestra.

Se partió de un volumen correspondiente a 4 μg de ARN de cada muestra,

completándose hasta un volumen final de 54 μl con agua libre de RNasas.

Posteriormente se añadieron 4 μl de los cebadores de secuencia azarosa (2 mM) y se

sometieron a una temperatura de 65º C con la finalidad de facilitar la alineación de los

cebadores al ARN. Una vez finalizada, a cada tubo se le añadió 22 μl de una solución

que contenía la enzima que cataliza la transcripción reversa, los desoxinucleótidos

trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y dCTP), el tampón de la enzima y el protector de ARN

(RNAsín, Roche) y se corrió la RT (protocolo en apartado 7.3) en el termociclador

Opticon 2 (MJ Research). Paralelamente, se incluyeron controles negativos de la PCR

de cada una de las muestras, procesadas en iguales condiciones, a excepción de la no

inclusión de la enzima que cataliza la transcripción reversa.

Una vez concluida la RT, las muestras de ADNc se conservaron a -20º C hasta

su posterior cuantificación mediante PCR a tiempo real.

Gel de agarosa al 1% (p/v) con muestras de ARN total purificado (1 μg/ pocillo). Se pueden observar dos bandas correspondientes a los ARNr de 28S y 18S.


- 72 -

2.1.7 - PCR Cuantitativa a Tiempo Real

Los ADNc, obtenidos a partir de la transcripción reversa, fueron de nuevo

amplificados mediante PCR con cebadores de secuencia específica al del ARNm del

gen a cuantificar (protocolo en apartado 7.4). En este caso, al final de cada ciclo de

amplificación se cuantificaban los niveles de ADN, de doble cadena, gracias al reactivo

SYBR-Green.

El reactivo SYBR-Green tiene la capacidad de unirse a las dobles cadenas de

ADN, emitiendo, al unirse, una señal de fluorescencia. La máxima excitación y emisión

de SYBR-Green se da a longitudes de onda de 494 y 521 nm respectivamente, las

cuales son compatibles con el uso de cualquier termociclador a tiempo real. En nuestro

caso el termociclador a tiempo real empleado fue el Opticon 2 (MJ Research) junto con

el programa informático Opticon Monitor 2, versión 2.0.0.1 (MJ Research).

Los datos de fluorescencia obtenidos generan, cuando la escala es lineal, una

curva de puntos con forma sigmoidal en la que la fluorescencia está representada frente

al número de ciclos. El ciclo umbral (C BTB) sirve como herramienta para el cálculo de las

cantidades iniciales de ADNc en cada muestra. Este es el ciclo en el que hay un primer

incremento detectable en la fluorescencia y en el que, por tanto, el valor alcanza el

umbral.

Esta curva presenta diferentes fases:

- Fase Lineal: en ella se visualiza la fluorescencia debida al ruido de fondo. Se da

en los primeros ciclos de amplificación (ciclos 3 a 15), donde no es aún

Fase de Saturación

Fase Log-Lineal

Fase Lineal

Número de Ciclos

Fluo

resc

enci

a

CBTBA CBTBB

10 20 30 40

Umbral

Muestra A Muestra B


- 73 -

detectable el incremento en fluorescencia debida a los productos de PCR. Los

valores de esta fase son sustraídos de los debidos a la fluorescencia de los

productos de PCR.

- Fase Log-Lineal. Se da un incremento exponencial en el número de copias de

ADN.

- Fase de Saturación, en ella se alcanzan los máximos valores de fluorescencia y

se estabilizan a lo largo de los ciclos ya sea debido a un cese en la síntesis de

ADN, ya que alguno de los reactivos (nucleótidos, polimerasa de ADN, etc.) se

haga limitante, o a causa del agotamiento de moléculas disponibles del reactivo

SYBR-Green.

El umbral se ajusta a un valor sobre la fase lineal, debiéndose localizar en la fase

log-lineal de la PCR y nunca en la fase de saturación.

Existen dos formas distintas de calcular el CBTB ya sea mediante el método de

ajuste de dicho punto o por el método del máximo de la segunda derivada.

En el método de ajuste el umbral se establece manualmente en la fase log-lineal

de la PCR y de esta manera se define el ciclo umbral (CBTB). En el segundo método, el

punto en el que se da el máximo incremento de la fluorescencia, dentro de la fase log-

lineal, se calcula determinando el máximo de la segunda derivada de la curva de

amplificación. El programa informático calcula cuál es el ciclo en el que se alcanza

dicho valor, de manera que no es necesario establecer dónde se encuentra el umbral. En

esta tesis se ha empleado el primer método para establecer el CBTB.

Para poder determinar cuál es la concentración de ADN correspondiente a un

determinado valor de fluorescencia es necesario el uso de muestras estándares de ADN

del gen de interés de concentración conocida. Los resultados obtenidos, tras la PCR de

dichos estándares, permiten generar una curva estándar donde se representan los C BT B

frente al logaritmo de la concentración de ADN, lo cual genera una recta. Los valores

CBTB de las muestras y de los estándares son posteriormente usados para calcular la

cantidad inicial del ADNc, específico del gen a determinar, en las muestras

experimentales.


- 74 -

Es posible, además, saber cuál ha sido la eficiencia (E) de la PCR mediante la

aplicación de la siguiente fórmula:

E = 10 P

(-1/m)P - 1

donde m es la pendiente de la recta que se obtiene cuando se comparan las C BTB frente al

logaritmo de la concentración.

Con el fin de corroborar la especificidad de los productos generados por PCR, se

hace necesario realizar una curva de fusión (“Melting Curve”) consistente en

incrementar gradualmente la temperatura (0.5ºC/ciclo) desde una temperatura de 56º C

hasta 95º C, realizándose una lectura de fluorescencia cada 0.5º C.

A bajas temperaturas, todos los productos de PCR se encuentran como doble

cadena, con lo que el SYBR Green se une a ellos y la fluorescencia es elevada. Sin

embargo, a medida que incrementa la temperatura, se van alcanzando valores de

temperatura correspondientes a las temperaturas de fusión de los productos de PCR, lo

que provoca descensos en la fluorescencia. Este fenómeno se puede visualizar en una

gráfica donde se represente la fluorescencia frente a la temperatura.

Los sistemas de detección calculan la primera derivada de la curva generándose

un máximo correspondiente a la temperatura de fusión (TBmB) del producto de PCR. Las

y = mx + a


- 75 -

curvas que presenten máximos relativos a una TBmB más baja que la del producto

específico de PCR podrían indicar bien la formación de dímeros de cebadores o de

productos inespecíficos de pequeño tamaño y/o bajo contenido G-C. Aquellos máximos

relativos con TBmB diferentes indicarían la generación de productos inespecíficos de mayor

tamaño y/o contenido G-C.

2.2 – HIBRIDACIÓN in situ DEL ARNm DEL RECEPTOR CANNABINOIDE

CB1 EN MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO (Líneas AA y msP)

2.2.1 - Procesamiento de los Cerebros

En este experimento se utilizaron ratas msP y Wistar no tratadas así como ratas

msP que, durante 18 días, tuvieron libre acceso a agua y a una solución de etanol al 10%

(n = 8 por grupo). Posteriormente fueron sacrificadas, mediante decapitación, se

extrajeron rápidamente los cerebros, se congelaron a – 40º C en isopentano y se

almacenaron a – 70º C hasta su procesamiento.

Temperatura (º C)

Fluo

resc

enci

a –

dF/

dT

Muestra B

Muestra A

Productos Específicos

Dímeros de cebadores

Curva de fusión. La muestra A tiene un único máximo resultante de la amplificación de un producto específico por PCR. Sin embargo, la muestra B muestra un máximo relativo a una temperatura que podría corresponderse con la temperatura de fusión de los dímeros de cebadores.


- 76 -

Se realizaron secciones cerebrales de 10 μm de grosor a los siguientes niveles

Bregma: (1) + 2.5 a + 1.7 mm; (2) – 0.3 a – 0.4 mm y (3) – 2.3 a – 3.3 mm, de acuerdo

con el atlas de Paxinos y Watson (1986).

Las ratas AA y ANA, no sometidas a ningún tratamiento, fueron sacrificadas por

decapitación y sus cerebros fueron tratados en las mismas condiciones descritas

anteriormente para la línea msP. Las secciones cerebrales (10 μm de grosor) se tomaron

(1) desde + 2.2 a + 1.7 mm; (2) + 1.0 a + 0.2 mm; (3) - 0.4 a – 1.8 mm y (4) – 2.3 a –

3.3 mm, coordenadas Bregma (Paxinos y Watson, 1986).

2.2.2 – Producción de la Ribosonda de CB1

La ribosonda del receptor CB1 fue generada mediante PCR y se corresponde con

los nucleótidos 1232-1272 de la secuencia de ADNc patentada NM_012784 (Matsuda et

al., 1990). La síntesis de la sonda de ARN y la hibridación in situ se realizó tal y como

está descrito por Caberlotto et al., 2004.

Antes de iniciar la transcripción, los plásmidos fueron cortados con enzimas de

restricción con el fin de obtener una secuencia lineal y, así, poder sintetizar las

ribosondas sentido y antisentido. Las sondas, complementarias a las secuencias

codificantes, se transcribieron con 150 μCi α-[P

35PS]UTP (Dupont NEN, Boston, USA)

gracias a las polimerasas de ARN T3, T7 y SP6.

La transcripción se realizó en presencia de 10 mM de ditiotreitol (DTT), 0.5 mM

de cada nucleótido (ATP, GPT, CTP) y 1 μg del plásmido lineal en tampón de

transcripción 1x, durante 60 minutos a 37º C. Las sondas marcadas se separaron de los

nucléotidos no incorporados usando columnas spin (Pharmacia Biotech).

2.2.3 – Hibridación in situ

La hibridación in situ comenzó con la fijación de las secciones de cerebro en

paraformaldehído al 4% / tampón fosfato salino 1x durante 10 minutos, seguido de dos


- 77 -

lavados en PBS 1x y el tratamiento, durante 5 minutos, con anhídrido acético al 0.25% /

trietanolamina 0.1 M/ cloruro sódico al 0.9%.

Posteriormente, se lavaron los cortes dos veces en tampón SSC 2x, se

deshidrataron en una serie graduada de etanol (70, 80, 95, 100%) y finalmente pasaron

por cloroformo. Se dejaron secar antes de ser usados o congelados a -70º C hasta su uso.

Todas las soluciones acuosas fueron pretratadas con 0.1% de DEPC antes de ser

utilizadas. El tampón de hibridación contenía 0.5 mg/ml de ADN monocadena cortado,

250 μg/ml de ARNt de levadura, solución de Denhardt 1x, sulfato de dextrano al 10%,

SSC 4x y formamida al 50%.

Antes de la hibridación, se añadió la sonda marcada al cóctel de hibridación a

una concentración de 20x10P

3P cpm/μl. Se pusieron 150 μl de esta mezcla a cada una de

las secciones de cerebro y se cubrieron con el fin de evitar su evaporación. La

hibridación se realizó en una cámara húmeda durante toda la noche a 55º C.

Una vez finalizada la incubación, se lavaron las secciones en una serie graduada

de SSC (2x, 1x, 0.5x, 0.5x/formamida al 50%, 0.1x), que contenían DTT 1mM, a

temperatura ambiente a excepción del lavado con la solución de SSC 0.1x que se realizó

a 53º C. La deshidratación se llevó a cabo con soluciones de etanol graduadas que

contenían acetato amónico 300 mM. Se dejaron secar las secciones y se expusieron ante

películas Biomax Kodak (Amersham) junto con estándares de P

14PC durante un periodo de

3-7 días.

2.2.4 – Obtención de datos

Se escanearon las autorradiografías, usando el aparato ScanMaker III (Microtek)

a una resolución de 400 dpi, y se midieron los valores de transmitancia de la luz, a partir

de las imágenes digitalizadas, con el programa informático IMAGE. Posteriormente,

dichas imágenes se analizaron usando el programa AIS (Imaging Research Inc.).

Las regiones de interés se marcaron mediante trazado individual de las

estructuras con un cursor y de acuerdo con el atlas de Paxinos (Paxinos y Watson,

1986). En base a la radiactividad conocida de los estándares de P

14PC, se convirtieron los


- 78 -

valores de transmitancia de las imágenes en nCi/g para lo cual se usó una curva de

calibración Rodbard.

Las secciones hibridadas se expusieron ante una película BiomaxP

TMPMR (Kodak,

NY, USA), definiéndose para ello las regiones de interés con determinadas marcas

anatómicas. Se midieron los valores medios de grises del autorradiograma usando el

sistema analizador de imágenes Biovision SAS (Avanti, Milan, Italia). Los valores de

densidad óptica (medias U+U SEM) se obtuvieron como describen Hansson et al (2003).

Los artefactos de radiactividad cercanos al tejido fueron eliminados de dichas medidas.

Se realizaron tres medidas por cada región cerebral: (1) el valor total, es decir,

las medidas en las secciones hibridadas de la región con ARN antisentido marcada con

α-[P

35PS]UTP; (2) el valor inespecífico, es decir, las medidas en las secciones control

hibridadas con el ARN sentido marcado con α-[P

35PS]UTP de la región correspondiente y

(3) el valor del fondo, es decir, las medidas del fondo de la película fuera de las

secciones.

Los valores de porcentaje de transmitancia (%T) del marcaje específico e

inespecífico se obtuvieron tal y como describen Benfati et al. (1986) y Zoli et al.

(1991). A partir de los valores de %T se obtuvieron los valores de densidad óptica

(D.O.) mediante la fórmula D.O. = - log (%T).

3. CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN PROTEICA

MEDIANTE INMUNOHISTOQUÍMICA

3.1 – Procesamiento del tejido

Los animales fueron anestesiados con una inyección i.p. de pentobarbitol a una

dosis de 60 mg/kg, tras lo cual fueron perfundidos intracardialmente con 100 ml de

tampón fosfato salino (PBS) 0.1M pH = 7.3, seguido de 400 ml de paraformaldehído al

4% en tampón fosfato (PB) 0.1M pH = 7.3.


- 79 -

Los cerebros y cerebelos fueron extraídos y permanecieron en la misma solución

fijadora durante 12 h a temperatura ambiente y en agitación. Fueron lavados en PBS tres

veces, durante 10 minutos, en agitación a temperatura ambiente, tras lo cual se

incubaron en solución crioprotectora de sacarosa al 30% (p/v), azida sódica 0.02% (p/v)

en PBS, a 4º C hasta que decantaron.

Los cerebros fueron cortados, rostro-caudalmente, en secciones de 30 μm de

grosor en un microtomo de congelación y depositados seriadamente sobre placas

multipocillos con azida sódica 0.02% en PBS. Se conservaron a 4º C hasta ser

inmunoteñidos.

3.2 - Inmunohistoquímica

Se seleccionaron aquellos cortes que contenían al núcleo accumbens (1.70 a 0.7

mm, coordenadas Bregma), pálido ventral (-0.26 a -0.4 mm, coordenadas Bregma)

hipocampo dorsal (-2.30 a -3.80 mm, coordenadas Bregma) y distintas regiones del

cerebelo (-9.68 a -12.80 mm, coordenadas Bregma) según Paxinos y Watson (1997).

Todos los cortes fueron lavados tres veces en PBS, durante 10 minutos, en

agitación y posteriormente se siguió el protocolo específico para cada marcador

(apartados 7.8, 7.9, 7.10, 7.11).

La inmunotinción se realizó mediante el método ABC (complejo avidina-

biotina) aunque, en nuestro caso, se utilizó estreptavidina en vez de avidina con el que

se consiguió un marcaje inmunohistoquímico indirecto para CB1, FAAH, MAGL y

NAPE-PLD. Este método se fundamenta en la aplicación, sobre el tejido, de un

anticuerpo primario que es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, que se

une a la región Fc del primario. El anticuerpo secundario está unido a una molécula de

biotina, por la que tiene gran afinidad la estreptavidina que, a su vez, va unida al

marcador peroxidasa (HRP).


- 80 -

El cromógeno empleado fue el tetracloruro de la diaminobenzidina (DAB), el

cual forma un precipitado de color marrón e insoluble cuando se oxida, en presencia de

agua oxigenada, por acción de la enzima peroxidasa (HRP). Para incrementar la señal,

se añadió sal de níquel a la solución de DAB, formándose un precipitado de color más

intenso.

Este método es mucho más sensible que los directos ya que al anticuerpo

primario se pueden unir más de un anticuerpo secundario y a éste más de un complejo

estreptavidina-HRP, incrementándose así la señal.

Las inmunohistoquímicas de todos los animales de cada tratamiento, para un

determinado anticuerpo, se realizaron simultáneamente con el fin de evitar diferencias

no debidas al tratamiento recibido.

3.3 - Cuantificaciones

La inmunorreactividad de cada marcador fue medida mediante análisis de

imágenes bidimensionales por densitometría digital. Para ello se tomaron fotografías de

las regiones cerebrales de interés con una cámara fotográfica digital (Olympus BX41) y

empleando el programa informático Olympus Micro DP70 DP Manager. Todas las

imágenes fueron obtenidas en idénticas condiciones de luz, tiempo de exposición,

apertura del diafragma (ajuste manual) y aumentos.


- 81 -

Posteriormente las fotografías se pasaron a escala de grises con el programa

Adobe Photoshop 7.0 y fueron cuantificadas con el programa informático Visilog 6

(Noesis Vision Inc. Quebec PQ, Canada). Con este programa se puede delimitar, de

cada fotografía, el área de interés a analizar y obtener los valores de intensidad de grises

en cada punto, oscilando éstos entre 0 (negro) y 255 (blanco). De esta manera se

obtuvieron los valores medios, desviación estándar, máximo y mínimos de intensidad de

las áreas seleccionadas.

Las distintas áreas cerebrales fueron seleccionadas según su participación,

primero, en los procesos de recompensa y dependencia a drogas de abuso y, segundo,

según su grado de expresión.

Las áreas a cuantificar, en ratas Wistar, para el marcador CB1 fueron:

- la capa molecular y de Purkinje del cerebelo,

- la capa granular del giro dentado hipocampal,

- el accumbens shell del estriado ventral y

- el pálido ventral

Para el marcador FAAH:

- la capa molecular y de Purkinje del cerebelo,

- la capa granular del giro dentado hipocampal,

- la capa piramidal de CA4 (hipocampo),

- el accumbens shell del estriado ventral y

- el pálido ventral

En la corteza prefrontal de las ratas msP se realizaron inmunohistoquímicas para

los marcadores CB1, FAAH, MAGL y NAPE-PLD.


- 82 -

Capas Molecular, Purkinje y Granular de la Corteza Cerebelar

Capas Molecular, Granular y Polimórfica del Giro Dentado (DG);

Capas Molecular, Granular y Polimórfica de CA1 y CA4 en Hipocampo.


- 83 -

4. ANÁLISIS DE LA FUNCIONALIDAD PROTEICA

Previo al análisis de la funcionalidad proteica, se realizó una extracción de

membranas cuantificándose su contenido proteico. Posteriormente, se realizaron los

análisis de actividad enzimática así como los ensayos de unión y funcionalidad del

receptor CB1.

4.1 - Extracción de Membranas

Las muestras se homogeneizaron en solución HEPES 50 mM pH = 8 sacarosa

0.32 M en un volumen, en ml, 10 veces el peso (gr) de la muestra, manteniéndose

durante todo el proceso a 4º C.

Se centrifugaron a 800 xg durante 10 minutos a 4º C y se descartó el precipitado.

Se centrifugó el sobrenadante a 40.000 xg durante 30 minutos a 4º C y, tras ello, se

desechó el sobrenadante.

El precipitado se resuspendió y homogeneizó en solución HEPES 50 mM pH = 8

en un volumen que era un cuarto del añadido inicialmente de HEPES 50 mM pH = 8

sacarosa 0.32 M. Posteriormente se realizó la cuantificación de la cantidad total de

proteínas mediante el método de Bradford tal y como se detalla en el siguiente apartado.

4.2 - Cuantificación de Proteínas

La cuantificación de proteínas se realizó mediante el método de Bradford

empleándose para ello el reactivo Coomasie Blue G-250. Este reactivo interacciona

principalmente con residuos de arginina y levemente con otros residuos de aminoácidos

básicos (histidina y lisina) y residuos aromáticos (tirosina, triptófano y fenilalanina). En

ausencia de proteínas, tiene color rojo palo y cuando interacciona con ellas toma color

azul, teniendo su máximo de absorbancia a una longitud de onda (λ) de 595 nm.


- 84 -

De cada muestra (por duplicado) se mezclaron 5 μl de la solución proteica con

250 μl de reactivo de Coomasie, dejándose incubar 2-3 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente se midió la absorbancia a λ = 595 nm.

Se construyó una curva patrón con diferentes concentraciones de albúmina (0,

75, 100, 250, 400, 500, 1000 y 1500 μg/ml). Para las muestras de concentración

desconocida se realizaron diferentes diluciones (1, 1/10 y 1/100) de forma que sólo se

tomaron aquellos valores que estuviesen comprendidos entre los valores extremos

generados con los estándares de albúmina en la curva patrón.

0 200 400 600 800 1000 1200 14000

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Den

sida

d óp

tica

(595

nm

)

Concentración (μg/ ml)

Curva patrón de albúmina (0, 75, 100, 250, 400, 500, 1000 y 1500 μg/ml). y = - 6x10P

-3P + 10 P

-3 Px – 6.42 x10P

-7P x P

2P; rP

2 P= 0.999.

Reactivo de Coomasie Blue G-250


- 85 -

4.3 -Ensayo de Actividad Enzimática de la Amidohidrolasa de Ácidos Grasos

(FAAH)

La actividad de la enzima FAAH se midió empleando como sustrato

araquidonil-[1- P

3PH]-etanolamina la cual, tras ser metabolizada, libera [P

3PH]-AEA (en

forma de [P

3PH]- etanolamina) en la fase acuosa, tras la extracción con cloroformo, tal y

como está descrito (Desarnaud et al, 1995; Rodríguez et al, 2001).

La mezcla se dejó incubar a 37º C en tampón TRIS 50 mM, pH = 7.5 que

contenía además de la fracción de membranas, una concentración saturante de [P

3PH]-

AEA (10.000 dpm/ml) (protocolo en apartado 7.12). Cada muestra se realizó por

triplicado. Los blancos fueron incubados en idénticas condiciones, a excepción de que

no contenían membranas, siendo su valor sustraído al de las muestras con membranas.

Bajo estas condiciones está descrito que existe una linealidad en la hidrólisis de

AEA con respecto al tiempo y la concentración de proteínas (Desarnaud et al, 1995).

Medida de la cantidad de [P

3PH]-etanolamina liberada, a lo largo del tiempo, y de la actividad

amidohidrolasa (medido como cantidad de [P

3PH]-etanolamina formada) respecto a la cantidad de

proteína existente en la mezcla de incubación en condiciones estándares. Tomado de Desarnaud et al(1995).


- 86 -

4.4 - Ensayo de Actividad Enzimática de la Transferasa de grupo N-Acilo (NAT)

La actividad de la tranferasa de grupo N-acilo (NAT) se midió empleando como

sustrato L-3 Fosfatidilcolina 1,2-di(1 CP

14P) palmitoil (Cadas H. et al., 1997) la cual, junto

con fosfatidiletanolamina, puede dar lugar al precursor lipídico N-acil-

fosfatidiletanolamina (NAPE) marcado con CP

14P gracias a la actividad NAT, reacción en

la que necesita como cosustrato al ión Ca P

2+P.

A cada tubo se añadieron, por duplicado, la mezcla de incubación que contenía:

la muestra de fracción de membrana, tampón HEPES, el sustrato marcado (L-3

fosfatidilcolina 1,2-di(1 CP

14P) palmitoil), cloruro cálcico o un quelante de calcio (EGTA)

(protocolo en apartado 7.13).

Los datos de actividad obtenidos en presencia del quelante de calcio fueron

sustraídos a los obtenidos, en las correspondientes muestras, cuando se añadía cloruro

cálcico. La mezcla se dejó incubar a 37º C y, tras parar la reacción, se realizó una

extracción de ácidos grasos con cloroformo. Posteriormente se separaron los ácidos

grasos de las NAPEs, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y se

cuantificaron por centelleo.

4.5 - Ensayo de Unión del receptor CB1

El ensayo de unión de CB1 (Hirst et al, 1996) se llevó a cabo en membranas de

tejido cerebral usando como ligando [P

3PH]SR141716A (Amersham, 59 Ci/mmol).

Está demostrado que la unión de [P

3PH]SR141716A, en membranas cerebelares, es

dependiente de la dosis y saturable (Hirst et al., 1996). A una concentración de 0.4 nM

se une a un 71.1 U+ U 1.5 % (n = 11) respecto de la unión total a receptores y dicha unión

puede desplazarse con SR141716A de forma dependiente de la dosis, con una pKBi B =

8.37 U+ U 0.07.

Cada muestra se realizó por triplicado y la mezcla contenía la fracción de

membrana junto con una concentración saturante de SR141716A, la cual se incubó a

30º C (protocolo en apartado 7.14). Se lograron uniones inespecíficas con la inclusión

de WIN-55,212-2 a 10 nM. Los resultados se expresan como fmol/mg de proteína.


- 87 -

4.6 - Ensayo de Acoplamiento del receptor CB1

Esta técnica se basa en la unión de [P

35PS]GTPγS, estimulada por un agonista de

CB1, a las membranas (Hilf et al., 1989; Traynor y Nahorski, 1995).

Cada muestra se realizó por triplicado (con y sin el agonista WIN 55,212-2) y se

añadieron a la mezcla de incubación: proteínas de las fracciones membranales, el

agonista WIN 55,212-2 (a los tubos estimulados), GDP y [P

35PS]GTPγS en tampón

(protocolo en apartado 7.15).

Se midió la unión basal en ausencia del agonista, y la unión inespecífica en

presencia de guanidil imidodifosfato, el cual desplaza al GTP marcado.

La radiactividad de unión se determinó mediante espectrofotometría de

centelleo, con un 95% de eficiencia para [P

35PS]. Los datos se presentan como media U+ U

SEM del porcentaje de estimulación respecto a los niveles basales.

5. MEDIDAS BIOQUÍMICAS

5.1 - MEDIDA DE LOS NIVELES DE ETANOL EN PLASMA

En ratas Wistar sometidas a tratamientos agudo y crónico de etanol, se realizó la

medida de los niveles de etanol en el plasma mediante un método basado en la

oxidación del alcohol a acetaldehído. En esta reacción, que cataliza la enzima alcohol

deshidrogenasa (ADH), se genera NADH cuyos niveles son medidos posteriormente por

espectrofotometría (protocolo en apartado 7.16).

BADH CB2 BHB5 BOH + NADP

+P CHB3 BCHO + NADH + HP

+

En ratas AA, con el fin de verificar la correlación entre las concentraciones de

etanol en sangre y la autoadministración de dicha solución, se tomaron muestras de

sangre (10 μl) de la vena lateral de la cola del animal justo tras la sesión de


- 88 -

autoadministración (30 minutos, n = 20). Las concentraciones de etanol se determinaron

mediante cromatografía gaseosa en espacio abierto.

5.2 - ANÁLISIS DEL CONTENIDO ENDOCANNABINOIDE

5.2.1 – Ratas Wistar

La determinación de los niveles de AEA en la solución resultante de la

microdiálisis (apartado 1.6) se realizó mediante cromatografía líquida acoplada a

espectrometría de masas (LC-MS).

Se tomaron alícuotas de 5 μl de la solución microdializada junto con 5 μl de (S)-

(+)-araquidonil-2’-hidroxi-1’-propilamida (S-2 metanandamida) 100 nM y se cargó

sobre una precolumna (0.5 x 2.5 mm, Haisil HL C18 5 μm; Higgins Analytical Inc.,

Mountain View, CA) usando una fase móvil de metanol (MeOH) al 30% (v/v) a una

tasa de 70 μl/min. Tras un lavado de 2 minutos, se invirtió el flujo de la fase móvil a

través de la precolumna gracias a una válvula y de esta manera se liberaron los

endocannabinoides en una columna analítica microperforada (0.3 x 50 mm; Haisil HL

C18 3μm; Higgins Analytical Inc., Mountain View, CA) usando una fase móvil

isocrática formada por MeOH al 70% (v/v) que descargaba 5 μl/min.

La columna eluyente se descargaba en el interior del espectrómetro de masas

(Agilent 1100MSD), que se corría en modo iónico positivo con el fin de maximizar la

sensibilidad. Al igual que se ha descrito anteriormente (Giuffrida et al., 2000) se

encontró que los aductos de sodio de estas moléculas permitían tener una mayor

sensibilidad respecto a la de sus formas protonadas.

Los ratios masa/carga (m/z) usados fueron: AEA, 370.3 (M + 1Na); S-2

metanandamida, 384.3 (M + 1Na). Las curvas de calibración se construyeron a partir de

un mínimo de 3 concentraciones estándar (por duplicado) y se realizaron diariamente.

Bajo estas condiciones, los límites de cuantificación eran aproximadamente 0.1 nM.

Por otro lado, se determinaron los niveles de endocannabinoides (AEA y PEA)

en muestras de plasma, en ciertas áreas cerebrales (cerebelo, hipocampo dorsal y

estriado) y tejidos periféricos (grasa perirrenal, hígado e íleon). Los endocannabinoides,


- 89 -

se fraccionaron mediante cromatografía en columna y se cuantificaron por HPLC/MS

mediante el método de dilución del isótopo (Giuffrida et al., 2000).

Se realizaron separaciones en fase reversa usando soluciones con

concentraciones crecientes de metanol en agua (25% agua, 75% metanol durante 2

minutos; 15% agua, 85% metanol durante 3 minutos; 5% agua, 95% metanol durante 20

minutos; 100% metanol durante 5 minutos) con un flujo de 0.5 ml/min manteniéndose

la temperatura de la columna a 20º C. Bajo estas condiciones, se eluyeron los estándares

de la columna con los siguientes tiempos de retención: 15.4 minutos para AEA y 17.3

minutos en el caso de PEA.

El análisis mediante espectrometría de masas (MS) se llevó a cabo con una

fuente iónica de electrospray situado en modo iónico negativo o positivo. El voltaje

capilar se ajustó a 3.5 kV y el voltaje de fragmentación varió desde 80 a 100 V. Para

secar se usó nitrógeno a una tasa de 12 litros/minuto ajustándose su temperatura a 350º

C y la presión del nebulizador a 50 psi. Para los análisis cuantitativos, los iones de

diagnóstico (ión molecular protonado [M+H]P

+P y aductos de sodio de los iones

moleculares [M+Na]P

+P) se detectaron en modo de monitorización iónica seleccionada

(SIM). El control del sistema completo y la evaluación de los datos se realizaron con el

programa informático HP Chemstation.

5.2.2 - Ratas AA y ANA

La medida del contenido de AEA y 1-AG en el cerebro de las ratas AA y ANA

se realizó según el método descrito por Wang et al., 2003.

Las áreas cerebrales aisladas (corteza prefrontal, núcleos caudado-putamen e

hipocampo), de peso entre 30-60 mg, fueron homogeneizadas en 0.5 ml de solución fría

de metanol:tampón Tris (50 mM, pH = 8), 1:1, con 7 ng de d4-anandamida. A cada

muestra se le añadió 2 ml de una mezcla enfriada de cloroformo:metanol (1:1) y 0.5 ml

de tampón Tris 50 mM, pH = 8. Dicho homogeneizado se centrifugó a 4º C (500 xg

durante 2 minutos), se recuperó la fase de cloroformo y se transfirió a un tubo de

borosilicato. La fase acuosa se extrajo, dos veces más, con cloroformo refrigerado.


- 90 -

Se evaporó la muestra a 32º C con nitrógeno y el residuo seco resultante se

reconstituyó con 110 μl cloroformo añadiéndose posteriormente 2 ml de acetona fría. Se

desecharon las proteínas precipitadas mediante centrifugación (1800 xg, 10 minutos), y

el sobrenadante fue de nuevo evaporado hasta su desecación. Los residuos secos

resultantes se reconstituyeron en 50 μl de cloroformo frío, de los cuales se usaron 35 μl

para realizar análisis mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas con el

aparato LC-MSD Agilent serie 1100.

La separación mediante cromatografía líquida de los endocannabinoides se llevó

a cabo mediante una columna guardia (Discovery HS C18, 2 cm x 4 mm, 3 μm, 120A)

y una columna analítica (Discovery HS C18, 7.5 cm x 4.6 mm, 3 μm) a 32º C con una

fase móvil de metanol: agua: ácido acético (85: 15: 0.1; vol: vol: vol) a un flujo de 1

ml/min durante 12 minutos seguido de 8 minutos de metanol: ácido acético (100: 0.1;

vol: vol).

El MSD (modelo LS) fue ajustado para ionización química bajo presión

atmosférica, polaridad positiva, y monitorización iónica seleccionada para los iones de

ratio m/z de 348 para AEA, 352 para d4-AEA y 379 para 2-araquidonilglicerol (2-AG).

Los ajustes de la cámara de spray fueron los siguientes: vaporizador, 400º C;

temperatura del gas, 350º C; secado del gas, 5 litros/min; el nitrógeno fue empleado

como gas nebulizante a una presión de 60 psig.

Las curvas de calibración se hicieron usando anandamida sintética y 2-AG

(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Las cantidades de AEA y de 2-AG en las muestras

se hallaron mediante regresión lineal invertida de las curvas estándar. Los valores se

expresan como fmol o pmol por mg de tejido húmedo.

5.3 - ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE GLUTAMATO

Las muestras microdializadas fueron subdivididas en dos alícuotas de 5 μl para

la cuantificación del contenido de glutamato mediante electroforesis capilar acoplada a

un sistema de detección de fluorescencia inducida por láser (CE-LIF).


- 91 -

La electroforesis capilar (CE) permite la separación en un capilar de las

moléculas de una muestra, sometidas a un campo eléctrico, en función de su movilidad

electroforética.

La muestra se introduce en el capilar (ya sea por capilaridad, aplicando presión,

etc.), situando uno de sus extremos en el interior de una cubeta que contiene la muestra.

El capilar se rellena con tampón y cada extremo se sitúa en una cubeta (de origen y

destino) que contiene el mismo tampón electrolito. Se aplica un campo eléctrico entre la

cubeta origen y de destino, que provoca la migración de las moléculas de la muestra

según la relación carga/coeficiente de fricción (movilidad electroforética) de cada una

de ellas. Las diferencias en la movilidad electroforética permiten la separación de las

moléculas de la muestra.

En el otro extremo del capilar cada uno de los analitos separados se detecta y

cuantifica mediante fluorescencia inducida por láser. Este modo de detección ofrece una

elevada sensibilidad y requiere que el láser enfoque hacia el capilar directamente. Los

límites de detección de esta técnica son del orden de 10P

-18 Pa 10P

-21P mol.

Los detalles específicos de esta técnica han sido previamente publicados

(Hansen et al., 1997).

Fuente de Voltaje

- +

Detector

Capilar

Cubeta Origen Muestra Cubeta Destino

Tampón Tampón Ánodo Cátodo

Electroforesis capilar acoplada a sistema de detección de fluorescencia inducida por láser (CE-LIF). Los diferentes componentes de una muestra, sometidos a un campo eléctrico, pueden ser separados, en función de su movidad electroforética, y detectados mediante fluorescencia inducida por láser. Los datos de las cuantificaciones son recogidos y almacenados en un sistema informático.


- 92 -

6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico de las PCR cuantitativas se realizó mediante ANOVA de

una vía seguido del cálculo del valor F, que en caso de ser significativo, llevaba al

análisis post hoc (Student-Newman- Keuls).

El análisis de los datos obtenidos de las hibridaciones in situ en las ratas AA y

ANA se realizó mediante ANOVA de una cola separando los datos de cada región ya

que las varianzas eran homogéneas dentro de las regiones pero no entre ellas. Debido a

la gran cantidad de regiones examinadas, las probabilidades computadas por ANOVA,

para un efecto del tratamiento en cada región, fueron corregidas mediante el método de

Bonferroni (Holm, 1979). En las ratas msP el análisis estadístico se realizó mediante el

test t seguido de la corrección de Bonferroni.

Los datos de la cuantificación de las inmunohistoquímicas se analizaron

estadísticamente mediante la prueba t de Student para dos muestras. Se compararon los

valores medios de las ratas control frente al de las ratas tratadas con etanol, tanto para el

tratamiento agudo como para el crónico. Previo a ello, se realizó la prueba F de

Snedecor.

El análisis de los datos obtenidos de la medición de los niveles de

endocannabinoides en las ratas AA y ANA se realizó mediante el test de Mann-

Whitney.

Los efectos del antagonista SR141716A sobre la autoadministración de sacarina

y etanol se expresan como la media del número total de respuestas sobre la palanca

activa e inactiva durante la sesión de 30 minutos. Dichos datos se analizaron mediante

ANOVA de una vía con varias repeticiones de las medidas por dosis. Tras la

significación del efecto de la dosis, cada dosis de la droga fue comparada con la

condición vehículo usando una comparación post hoc de medias con corrección de

Bonferroni.

Los efectos de URB597 se analizaron usando ANOVA de una vía seguido del

test post hoc de múltiples comparaciones de Tukey.


- 93 -

7. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES

7.1 - Extracción de ARN total

Las áreas cerebrales, que pesaban entre 50 - 100 mg, fueron homogeneizadas en

1 ml de Trizol (Invitrogen) en tubos DNA LoBind 2,0 ml (Eppendorf).

En cada extracción se manipularon un máximo de 24 muestras, de forma que

hubiese el mismo número de muestras de cada grupo experimental.

La superficie de trabajo era limpiada, previa a la extracción de ARN, con RNase-

AWAY (Invitrogen) y, entre muestra y muestra, el homogeneizador se limpió en agua

DEPC y solución de NaOH 0.5 N alternativamente finalizando siempre en agua DEPC.

Los pasos que siguieron fueron:

Centrifugar a 12000 xg durante 10 minutos a 4º C.

Transferir el sobrenadante a otro tubo y añadir 200 μl de cloroformo. Agitar

manualmente, por inversión, durante 15 segundos e incubar a temperatura

ambiente durante 2 minutos.


Transferir la fase orgánica (incolora) a otro tubo (DNA LoBind 1,5 ml) y añadir

500 μl de isopropanol mezclando de nuevo por inversión. Incubar a temperatura

ambiente durante 10 minutos.


Descartar el sobrenadante y añadir al precipitado 500 μl de etanol al 75% (v/v).

Centrifugar a 7500 xg durante 5 minutos a 4º C. Repetir el lavado con etanol y la

centrifugación.

Tras descartar el sobrenadante, dejar secar los precipitados durante 10 minutos a

temperatura ambiente.

Añadir 50 μl de agua libre de RNasas a cada tubo e incubar 10 minutos a 55º C

para disolver el precipitado. Resuspender con la micropipeta para obtener una

solución homogénea de ARN.


- 94 -

7.2 - Purificación del ARN total

La purificación del ARN total se realizó según las instrucciones contenidas en el

kit de purificación ‘RNeasy Mini Kit’ (Qiagen). El protocolo se detalla a continuación:

Tomar el volumen correspondiente a 100 μg de ARN total, o todo si hay menos

de 100 μg, y llevar a un volumen final de 100 μl con agua libre de RNasas

(DEPC).

Añadir 350 μl de tampón RLT (al que previamente se le ha incorporado β-

Mercaptoetanol en proporción 1:100) a los 100 μl de muestra de ARN,

mezclando bien.

Añadir 250 μl de etanol 100%. Mezclar bien con la pipeta y transferir la muestra

(700 μl) a una columna de sílica-gel del kit.

Centrifugar durante 15 segundos a 8000 xg, descartando el filtrado y el tubo de

recolección.

Para el tratamiento con DNasa I, lavar con 350 μl del tampón RW1 en la

columna y centrifugar 15 segundos a 8000 xg. Descartar el filtrado y reutilizar el

tubo de recolección.

Añadir por cada 10 μl de la solución ‘stock’ de DNasa I, 70 μl de tampón RDD

(por muestra). Mezclar suavemente por inversión ya que la DNasa es sensible a

la degradación física.

Pipetear la mezcla de incubación de DNasa I (80 μl) directamente en la

membrana de sílica-gel de la columna e incubar durante 15 minutos a 20-30º C.

Añadir 350 μl de tampón RW1 a las columnas y centrifugar durante 15 segundos

a 8000 xg.

Descartar el filtrado y el tubo de recolección. Añadir 500 μl de tampón RPE.

Centrifugar durante 15 segundos a 8000 xg. Descartar el filtrado.

Añadir 500 μl de tampón RPE.

Centrifugar durante 2 minutos a máxima velocidad.

Descartar el filtrado y el tubo. Tomar otro tubo de recolección nuevo y

centrifugar de nuevo a máxima velocidad, durante 1 minuto.


- 95 -

7.3 – Transcripción Reversa (RT)

Añadir el volumen correspondiente a 4 μg de ARN de cada una de las muestras

y 1 μg para los blancos (controles negativos) en tubos de PCR.

Completar con agua DEPC hasta un volumen final de 54 μl para las muestras y

13.5 μl para los blancos.

Añadir a los tubos con las muestras 4 μl de cebadores de secuencia azarosa

(Roche) y 1 μl a los blancos.

Correr el programa 1 de la RT.

Añadir, en función del número de muestras, el volumen necesario de los

siguientes reactivos de forma que por cada muestra haya:

- 16 μl de Tampón de reacción 5x (Roche)

- 4 μl de dNTPs

- 1 μl de RNasín

- 20 unidades de la enzima Transcriptasa Reversa (Roche)

Repartir 22 μl de esta solución a cada muestra.

Preparar la solución para los blancos que contiene por cada muestra:

- 4 μl de Tampón de reacción 5x

- 1 μl dNTPs

- 0.25 μl RNasín

- 0.25 μl agua DEPC

Repartir 5.5 μl de esta solución a cada tubo de blanco y correr junto con las

muestras el programa 2 de la RT.

Programa 1:

- 65º C durante 5 minutos


- Mantener a 4º C

Programa 2:


- 42º C durante 1 hora


- Mantener a 4º C


- 96 -

7.4 - PCR Cuantitativa a Tiempo Real

Añadir en un tubo DNA-Lobind (Eppendorf), el volumen de cada reactivo

proporcional al número de muestras. Para una muestra sin réplica se añade:

3.38 μl de agua libre de DNasas y RNasas

0.26 μl de cebador sentido 20 μM

0.26 μl de cebador antisentido 20 μM

5.6 μl de Master Mix (Qiagen)

Repartir en tubos de PCR la mezcla anterior a razón de 19 μl por tubo. Añadir a

cada uno de ellos 3.36 μl del ADNc de cada muestra. Se incluye un control

negativo (que llevará agua libre de DNasas y RNasas en vez de ADNc) y las

diluciones del estándar del gen cuya expresión se quiere cuantificar.

Pasar el contenido de cada tubo de PCR a dos pocillos (10 μl por pocillo) de la

placa (de 96 pocillos) donde se realizará la PCR a tiempo real. Tapar los pocillos

y centrifugar la placa hasta llegar a 3500 rpm.

Meter la placa en el Opticon 2 y correr el programa de PCR específico de cada

gen, con la temperatura de alineamiento adecuada.

Los programas de PCR difieren en el valor de la temperatura de alineamiento y

el número de ciclos, pero comparten pasos en común como son:

1. Incubar a 95º C durante 15 minutos.

2. Incubar a 94º C durante 15 segundos.

3. Incubar a la temperatura de alineamiento de cada gen durante

30 segundos.

4. Incubar a 72º C durante 30 segundos.

5. Lectura de la fluorescencia.

6. Volver al paso 2 el número de veces más adecuado según las

diluciones del estándar utilizadas.

7. Hacer curva de fusión (‘Melting Curve’) incubando desde 56º C

a 96º C, con incrementos de 0.5º C, manteniendo la temperatura

durante 10 segundos, y realizando una lectura de la

fluorescencia cada 0.5º C.

8. Disminución progresiva de la temperatura hasta 4º C.


- 97 -

7.5 - PCR para la determinación de la Temperatura de Alineamiento de los

Cebadores

Los pasos a seguir para realizar la PCR son:

Poner en un tubo de PCR la siguiente mezcla:

- 27.5 μl de Master mix (Qiagen)

- 1.1 μl de cebador sentido 20 μM

- 1.1 μl de cebador antisentido 20 μM

- 16.8 μl de agua grado de PCR

- 8.5 μl de ADNc de rata

Repartir la mezcla anterior a razón de 10 μl por tubo en un total de 5 tubos.

Hacer una centrifugación rápida a todos los tubos para que la mezcla esté en el

fondo del tubo.

Poner a cada tubo en el hueco del Opticon 2 (MJ Research) que le corresponda en

función de la temperatura del gradiente deseada.

Correr el programa con los siguientes pasos:

1. Incubación a 95º C durante 15 minutos

2. Incubación a 94º C durante 15 segundos

3. Incubación a la temperatura del gradiente elegida durante 30 seg

4. Incuabación a 72º C durante 30 seg

5. Lectura de la fluorescencia

6. Volver al paso 2 durante 44 ciclos

7. Curva de Fusión (Melting Curve) con lectura de fluorescencia cada

0.5ºC, manteniéndose la temperatura durante 10 seg , incubando desde

56º C a 95º C.

8. Incubar a 4º C

7.6 - Producción del Estándar mediante PCR

- Añadir a cada tubo de PCR, que posteriormente se dividirá en 2:

25 μl de Master Mix (Qiagen)

1.5 μl de cebador sentido 20 μM


- 98 -

1.5 μl de cebador antisentido 20 μM

14.5 μl de agua grado de PCR

7.5 μl de ADNc procedente de un tejido de rata que exprese el

ARNm que se desea cuantificar o de agua grado de PCR en el

control negativo de la PCR.

- Dar una centrifugación rápida al tubo de PCR para que todo el volumen

se vaya al fondo del mismo.

- Poner la PCR en el Opticon 2 (MJ Research) siguiendo el siguiente

protocolo:

1. Incubación a 95º C durante 15 minutos

2. Incubación a 94º C durante 30 segundos

3. Incubación a la temperatura de alineamiento de los cebadores

durante 1 minuto

4. Incubación a 72º C durante 1 minuto

5. Lectura de la fluorescencia

6. Volver al paso 2 durante 44 ciclos

7. Curva de Fusión (Melting Curve) con lectura de fluorescencia cada

0.5ºC, manteniéndose la temperatura durante 10 seg , incubando

desde 56º C a 95º C.

8. Incubar a 4º C

De los 50 μl de la mezcla de PCR, 10 μl se reservaban para realizar la

visualización de las bandas de ADN, del estándar sin purificar, en gel de agarosa al

1% (p/v). Los 40 μl restantes se purificaron tal y como se detalla en el apartado 7.7.

7.7 - Purificación del Estándar

La purificación de los estándares se realiza con los reactivos del kit ‘High Pure

PCR Product Purification Kit’ (Roche) según el protocolo que se detalla a

continuación:

Llevar el estándar hasta un volumen final de 100 μl, completado con agua

DEPC, y añadir 500 μl de tampón de unión. Pasar los 600 μl a un tubo con

membrana (suministrado con el kit) e introducir éste en un tubo de recolección.


- 99 -

Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad a 25º C.

Descartar el filtrado y añadir 500 μl de tampón de lavado.


Descartar el filtrado y el tubo de recolección. Meter el tubo con membrana en un

tubo eppendorf libre de DNasas y RNasas y añadir 50 μl de tampón de elución.


Descartar el tubo con membrana y centrifugar el tubo eppendorf durante 2

minutos a máxima velocidad a 25º C.

7.8 - Inmunohistoquímica de CB1

Realizar tres lavados a los cortes en PBS 0.1 M pH = 7.3, cada uno durante ٭

10 minutos.

.Incubar en citrato sódico 50 mM pH = 9, durante 30 minutos a 80º C ٭

.Realizar tres lavados en PBS 0.1 M pH = 7.3, cada uno durante 10 minutos ٭

Incubar en HB2 ٭ BOB2 B al 3% en PBS, 10 minutos a temperatura ambiente en

agitación.


-Incubar en anti-CB1 (cabra) a 1/100 en PBS 0.1 M pH=7.3, 0.2% Tritón TX ٭

100, 0.1% NaNB3 B (azida sódica), toda la noche a temperatura ambiente y en

agitación.


Incubar en anticuerpo secundario (anti-IgG biotinilado de cabra) a 1/500 en ٭

PBS 0.1M, 0.2% Tritón TX-100, 0.1% Azida Sódica, durante 1 hora a



,Incubar en estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano) diluida en PBS 0.1M ٭

0.2% Tritón TX-100 (sin azida ya que ésta inhibe a la peroxidasa) a 1/2000

durante 1h a temperatura ambiente y en agitación.



- 100 -

Pasar los cortes a pocillos con solución de DAB (0.2 mg/ml), Níquel ٭

(0.08%) en PBS. Añadir 5-10 μl de HB2 BOB2 Bal 30% y agitar manualmente,

parando la reacción pasando de nuevo los cortes a PBS.

.Montar los cortes sobre portaobjetos gelatinados ٭

.Deshidratar y montar en DPX ٭

7.9 - Inmunohistoquímica de FAAH

Realizar a los cortes tres lavados en PBS 0.1 M pH = 7.3, cada uno durante ٭

10 minutos.




agitación.


,Incubar en anti- FAAH a 1/75 en PBS 0.1 M pH=7.3, 0.2% Tritón TX-100 ٭

0.1% NaNB3 B (azida sódica), toda la noche a temperatura ambiente y en

agitación.


Incubar en anticuerpo secundario (anti-IgG biotinilado de conejo) a 1/500 en ٭




Incubar en estreptavidina-HRP diluida en PBS 0.1M, 0.2% Tritón TX-100 ٭

(sin azida ya que ésta inhibe a la peroxidasa) a 1/2000 durante 1h a

temperatura ambiente y en agitación.








- 101 -

7.10 - Inmunohistoquímica de MAGL


10 minutos.




agitación.


,Incubar en anti- MAGL a 1/200 en PBS 0.1 M pH=7.3, 0.2% Tritón TX-100 ٭

0.1% NaNB3 B (azida sódica), toda la noche a temperatura ambiente y en

agitación.















7.11 - Inmunohistoquímica de NAPE-PLD


10 minutos.



- 102 -



agitación.


-Incubar en anti-NAPE-PLD a 1/400 en PBS 0.1 M pH=7.3, 0.2% Tritón TX ٭

100, 0.1% NaNB3 B (azida sódica), toda la noche a temperatura ambiente y en

agitación.















7.12 - Ensayo de la Actividad Enzimática FAAH

Las muestras se realizaron por triplicado incluyéndose un control negativo (que

no llevaría membranas). La mezcla de incubación, con un volumen final de 0.5 ml por

tubo, contenía:

50 μg de la fracción de membranas

10 μM de [P

3PH]-AEA (10000 dpm/ml)

Tris-HCl 50 mM, pH = 7.5 hasta completar un volumen de 0.5

ml.


- 103 -

Incubar durante 10 minutos a 37º C con agitación.

Parar la reacción añadiendo 1 ml de cloroformo:metanol (1:1) a temperatura

ambiente, mezclándolo vigorosamente y dejando reposar durante 2-3

minutos.

Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Tomar 600 μl de la fase acuosa y llevar a viales de centelleo.

Añadir líquido de centelleo (3 ml), tapar y agitar. Dejar incubar toda la noche

en oscuridad a temperatura ambiente.

Agitar vigorosamente.

Añadir otros 3 viales de plástico con 50 μl de [P

3PH]-AEA y 3 ml del líquido

de centello con el fin de ver las cuentas totales.

Realizar el contaje de la radiactividad en un contador de emisiones beta.

7.13 - Ensayo de la Actividad Enzimática NAT

Las muestras se realizaron por duplicado, conteniendo uno de los tubos CaCl B2 B y

otro EGTA, en un volumen final de 500 μl. Cada tubo contenía:

300 μg de fracción de membranas.

50 μl de solución de CaCl B2 B 100 mM disuelta en HEPES 50 mM

pH = 8 ó 50 μl de EGTA 100 mM disuelto en HEPES 50 mM

pH = 8.

10 μl de L-3 fosfatidilcolina, 1,2-di(1 P

14PC) palmitoil.

Tampón HEPES 50 mM pH = 8 hasta completar el volumen

final de 0.5 ml.

Incubar a 37º C durante 1 hora con agitación.

Parar la reacción con 1 ml de etanol.

Añadir 2 ml de cloroformo para realizar la extracción.

Centrifugar a máxima velocidad para separar las fases.

Tomar la fase de cloroformo (en el fondo del tubo) y pasarlo a tubos limpios.

Evaporar el cloroformo, en una centrífuga de vacío, a 55º C

aproximadamente en 1 hora.


- 104 -

Añadir 400 μl de cloroformo a las muestras secas y resuspender el

precipitado.

Realizar la cromatografía añadiendo entre 180-200 μl de la muestra a cada

columna. Cada muestra se divide en dos columnas.

Correr 2 ml de metanol:cloroformo 9:1 y recoger, en viales de centelleo, las

amidas de ácidos grasos.

Correr 2 ml de metanol:cloroformo 5:5 y recoger, en viales de centelleo, las

N-acil-fosfatidiletanolaminas (NAPEs).

Añadir 4 ml de líquido de centelleo a cada vial, agitarlos y dejar incubar toda

la noche en oscuridad.

Realizar el contaje en un contador de emisiones beta.

7.14 - Ensayo de Unión del receptor CB1

Previo a la preparación de la mezcla de incubación, se realizan las diluciones de

los compuestos desplazantes, los cuales se encuentran almacenados a 4º C, a una

concentración de 10 mM en DMSO.

Cada muestra se realiza por triplicado en un volumen final de 500 μl que

contiene:

- 350 μl de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH = 7.4 – 7.7; BSA al 0.1%

(p/v))

- 50 μl de la dilución del compuesto en sus correspondientes tubos

- 50 μl de solución de membranas

- 50 μl de [P

3PH]SR141716A, 3.4 μM, diluido en tampón Tris-HCl 50

mM pH = 7.4 - 7.7; BSA al 0.1% (p/v).

Incubar durante 1 hora a 30º C.

Parar la reacción con la adición de tampón frío.

Centrifugar durante 8 minutos a 1500 xg.

Descartar el sobrenadante y añadir 2 ml de líquido de centelleo.

Realizar el contaje de radiactividad en un contador de emisiones beta.


- 105 -

7.15 - Ensayo de Acoplamiento del receptor CB1

El ensayo se realizó en un volumen total de 1 ml, haciéndose cada muestra por

triplicado y en dos series: una serie con el agonista WIN 55,212-2 y otra con el agente

desplazante guanidil imidodifosfato. La mezcla de incubación contenía:

20 μg de proteínas de la fracción de membranas

20 μM de GDP

0.05 nM de [P

35PS]GTPγS

10 μM de WIN 55,212-2 (sólo a los tubos estimulados) ó 10

μM de guanidil imidodifosfato (sólo a los tubos basales).

Tampón Tris-HCl 50 mM, MgCl2 3 mM, EGTA 0.2 mM, NaCl

100 mM, BSA 0.1 mg/ml; pH = 7.4, completando hasta un

volumen final de 1 ml.

Incubar a 30º C durante 1 hora.

Parar la reacción centrifugando a 20000 xg a 4º C.

Lavar dos veces el precipitado con tampón Tris frío.

Añadir 5 ml de líquido de centelleo Ecolite y dejar toda la noche incubando

en oscuridad.

Realizar el contaje de radiactividad en un contador de emisiones beta.

7.16 - Medida de Etanol en plasma

La medida de etanol en plasma se realizó en placas de 96 pocillos según el

protocolo detallado en el kit de detección de etanol (Randox). Los pasos a seguir fueron:

Añadir 150 μl del tampón (Pirofosfato 75 mM pH = 8.7, semicarbazida 75 mM,

glicina 21 mM) y 50 μl de la solución de NADP

+ Pa cada pocillo.

Añadir 5 μl de la muestra correspondiente.

Mezclar bien y añadir 10 μl de la solución de ADH.

Mezclar bien e incubar la placa a 37º C durante 25 minutos.

Leer la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm.


- 106 -

7.17 - Soluciones de uso común

- Tampón de Carga de ARN

Esta solución contiene: glicerol al 50%, EDTA 1mM, azul de bromofenol al

0.4% y bromuro de etidio al 4%.

- Tampón de Carga de ADN

Para un volumen final de 10 ml añadir:

5 ml de glicerol

4 mg de EDTA

40 mg de azul de bromofenol

- Agua DEPC

Añadir a un litro de agua mili-Q, 1 ml de Dietil-pirocarbonato (Sigma,

D5758)

Agitar vigorosamente e incubar a 37º C toda la noche.

Autoclavar.

- Solución Tris-EDTA (TE)

La solución de TE 1x (pH= 7.5) está compuesta por:

- Tris-HCl 10 mM pH=7.5

- EDTA 1 mM pH=8

La solución stock de Tris-HCl 100 mM pH=7.5 se preparó de la siguiente

manera:

- Disolver 1.211 gr de Tris Base en 80 ml de agua DEPC.

- Ajustar pH hasta 7.5.

- Enrasar hasta 100 ml con agua DEPC.

- Guardar a 4ºC


- 107 -

La solución stock de EDTA 100 mM (pH=8) se preparó de la siguiente

forma:

- Disolver 1.861 g de EDTA en unos 40 ml de agua DEPC.

- Ajustar el pH a 8.

- Enrasar hasta 50 ml con agua DEPC.

- Guardar a 4º C.

Preparar solución de TE 1x pH = 7.5

Si se desea preparar, por ejemplo, un volumen final de 10 ml de TE

1x, se deben mezclar:

- 8.9 ml de agua DEPC

- 1 ml de Tris- HCl 100 mM pH = 7.5 y

- 0.1 ml de EDTA 100 mM pH = 8

El pH de la solución debería ser de 7.5; en caso contrario se debe ajustar

a dicho valor.

- Tampón fosfato (PB) 0.4 M, pH = 7.3

Para 1000 ml:

- NaHB2 BPOB4 B- HB2 BO, 13.8 gr

- Na B2 BHPOB4 B- 2HB2 BO, 53.4 gr

Disolver en agua destilada y ajustar el pH a 7.3 con HCl 1N ó NaOH 1N.

- PBS (tampón fosfato salino), pH = 7.3

Para 1000 ml:

- 250 ml de PB 0.4 M pH = 7.3

- 750 ml de agua destilada

- 9 gr de NaCl

Ajustar, si es necesario, el pH a 7.3 con HCl 1N ó NaOH 1N.

RESULTADOS

Resultados

- 111 -

TRATAMIENTO AGUDO DE ETANOL

1.1 - Medida de los Niveles de Etanol y Anandamida en Plasma y Tejidos Periféricos

La administración aguda de etanol (4 gr/kg), mediante inyección intraperitoneal

(i.p.), provoca un fuerte incremento de los niveles de etanol en plasma, permaneciendo

estables durante las primeras cuatro horas y disminuyendo posteriormente, a partir de

las 8 horas, hasta no ser detectables a las 24 horas.

Los niveles de anandamida (AEA) se alteran, tras la administración de etanol, de

la siguiente manera: no son detectables a los 45 minutos de la inyección de etanol,

aumentan a partir de los 90 minutos alcanzando valores normales, siendo máximos a las

4 horas y volviendo a niveles control a las 8 horas (1.3 + 0.6 pmol/ml, n = 8) y 24 horas

(0.7 + 0.5 pmol/ml, n = 8).

A B

En tejidos periféricos, la administración de etanol provoca una disminución de

los niveles de AEA en grasa perirrenal, aunque aumentan en intestino delgado e hígado

tras 90 minutos de la inyección (ver tabla 1).

TIEMPO (min)

0

10

20

30

40

50

ET

AN

OL

(mM

)

N.D. N.D.

0 45 90 240 480 1440 0 45 90 2400

2

4

6

8

TIEMPO (min)

AE

A (

pmol

/ml)

N.D.

*

Figura 1. Efectos a lo largo del tiempo de la administración aguda de etanol (4 gr/kg) sobre los niveles de etanol (A) y anandamida (B) en plasma. Los datos son las medias + SEM de al menos 5 muestras por grupo. (*) P < 0.01 versus grupo del tiempo 0. ANOVA de una vía con análisis post-hoc de Student-Newman-Keuls.

Resultados

- 112 -

Tiempo tras la inyección (min): 0’ 45’ 90’ 240’

Grasa 16.2 ± 1.7 11.9 ± 0.9 19.1 ± 1.2 6.4 ± 0.6 *

Hígado 3.7 ± 1.8 3.7 ± 1.8 21.9 ± 3.7 * 4.8 ± 2.9

Intestino Delgado 33.9 ± 13.2 63.4 ± 23.5 285.1 ± 13.2 * 62.8 ± 12.8

En base a la estabilidad de los niveles de etanol y los cambios de los niveles de

AEA en plasma, se han seleccionado los tiempos de 0, 45, 90 y 240 minutos para el

análisis bioquímico de AEA y PEA (palmitoiletanolamida) y la medida de las

actividades enzimáticas de NAT y FAAH en el cerebro.

1.2 - Medida de los Niveles de Endocannabinoides en Cerebro

Previamente a la medida de los efectos del etanol, se comprobó si la

administración aguda de solución salina, mediante inyección i.p., afectaba a los niveles

de anandamida en estriado ventral, cerebelo o hipocampo, resultando negativo (tabla 2).

Debido a que la inyección de solución salina en animales habituados provoca un estrés

moderado, la ausencia de efectos por este procedimiento sobre el sistema

endocannabinoide en cerebro concuerda con lo descrito previamente en la bibliografía

(Patel et al., 2005): existe un decremento de AEA sólo tras estrés severo, inducido por

inmovilización activa, localizándose exclusivamente en la amígdala (no existiendo ni en

cerebelo ni prosencéfalo).

Tabla 1. Efectos de la administración aguda de etanol (4 gr/kg i.p.) sobre los niveles de anandamida (pmol/gr tejido) en la grasa perirrenal, hígado e intestino delgado a los 0, 45, 90 y 240 minutos tras la inyección. Los datos son las medias + SEM de 5-8 muestras por grupo. (*) P < 0.01 versus grupo del tiempo 0. Newman-Keuls.

Resultados

- 113 -

Tiempo tras la inyección (min): 0’ 30’ 60’

Estriado Ventral 119 ± 20 98 ± 40 82 ± 29

Cerebelo 16.5 ± 1.4 14.7 ± 1.8 26.7 ± 1.9

Hipocampo Dorsal 137 ± 51 134 ± 63 119 ± 41

Una vez comprobado que la manipulación experimental no afecta a los niveles

de endocannabinoides, se procedió a su determinación tras la administración de alcohol.

La inyección aguda de etanol produce una disminución en los niveles de AEA en

estriado ventral, cerebelo e hipocampo, tal y como se muestra en la figura 2. Este efecto

se observa en todas las áreas cerebrales estudiadas tras 90 minutos de la administración

de etanol. En el hipocampo, la reducción de los niveles de AEA se observa en todos los

tiempos seleccionados (figura 2C).

A. Estriado Ventral B. Cerebelo

0 45 90 240 0 20 40 60 80 100 120 140

TIEMPO (min)

AE

A (p

mol

/g)

* 0

5

1

1

2

0 45 90 240TIEMPO (min)

AE

A (p

mol

/g)

*

Tabla 2. Efecto de la administración aguda del vehículo (solución salina al 0,9%, en dosis de 1 ml/kg i.p.) sobre los niveles de anandamida (pmol/g tejido) en el estriado ventral (núcleo accumbens), cerebelo e hipocampo dorsal. Medidas realizadas a los 0, 30 y 60 minutos en animales habituados a inyección. Los datos son las medias + SEM de 5-8 muestras por grupo. (*) P < 0.01 versus grupo del tiempo 0. Newman-Keuls.

Resultados

- 114 -

C. Hipocampo Dorsal

De manera similar, se observa una disminución de los niveles de PEA en

estriado ventral tras 45 min de la inyección, en cerebelo a los 45 y 90 min y en

hipocampo en todos los tiempos estudiados.


0 45 90 240 0

50

100

150

200

TIEMPO (min)

AE

A (p

mol

/g)

* **

0 45 90 2400

100

200

300

400

500

TIEMPO (min)

PEA

(pm

ol/g

)

*

0 45 90 2400

200

400

600

800

TIEMPO (min)

PEA

(pm

ol/g

)

* *

Figura 2. Efecto a lo largo del tiempo de la administración aguda i.p. de etanol (4 gr/kg) sobre los niveles titulares de AEA en: A. Estriado Ventral-núcleo accumbens; B. Cerebelo y C. Hipocampo Dorsal. Los datos son las medias + SEM de al menos 5 muestras por grupo. (*) P< 0.01, versus grupo del tiempo 0.

Resultados

- 115 -

C. Hipocampo Dorsal

Dado que los niveles de endocannabinoides están regulados a nivel de síntesis

(actividades NAT y NAPE-PLD) y de degradación, estudiamos tanto las actividades de

estas enzimas como su expresión. Comenzamos por FAAH dado que esta enzima ha

sido vinculada al alcoholismo (Sipe et al., 2002).

1.3 - Medida de la Actividad Enzimática FAAH

Se ha estudiado si la actividad enzimática FAAH podría estar alterada y con ello

justificarse la disminución, en cerebro, de los niveles de AEA y PEA observados debido

a la actividad de degradación de dicha enzima sobre estas aciletanolamidas.

Se ha encontrado que no existen variaciones en la actividad FAAH ni en estriado

ventral ni en cerebelo. Sin embargo, en hipocampo dicha actividad sí varía,

disminuyendo a los 45 minutos de la administración de alcohol y normalizándose

posteriormente. Otros estudios in vitro, usando membranas cerebelares, indican que la

actividad FAAH no se ve afectada por la presencia de etanol en el tampón de ensayo a

0 45 90 2400

500

1000

1500

2000

2500

TIEMPO (min)

PEA

(pm

ol/m

g)

* **

Figura 3. Efectos a lo largo del tiempo de la administración aguda de etanol (4 gr/kg) sobre los niveles titulares de palmitiletanolamida (PEA) en A. Estriado Ventral- Núcleo Accumbens, B. Cerebelo y C. Hipocampo dorsal. Los datos son las medias + SEM de al menos 5 muestras por grupo. (*) P< 0.01, versus grupo del tiempo 0. Newman-Keuls.

Resultados

- 116 -

concentraciones en el rango de aquellas encontradas en el plasma tras la administración

aguda de etanol (10-9 a 10-2 M).


C. Hipocampo Dorsal

0

100

200

300

TIEMPO (min)

FAA

H (p

mol

/min

/mg)

0 45 90 240

0 45 90 240 0

10

20

30

40

50

TIEMPO (min) FA

AH

(pm

ol/m

in/m

g)

TIEMPO (min)0 45 90 240

0

10

20

30

40

50

FAA

H (

pmol

/min

/mg)

*

Figura 4. Efecto a lo largo del tiempo de la administración aguda i.p. de etanol (4 gr/kg) sobre la actividad de la amidohidrolasa de ácidos grasos (FAAH) en membranas de: A. Estriado Ventral-Núcleo Accumbens; B. Cerebelo y C. Hipocampo Dorsal. Los datos son las medias + SEM de al menos 7 muestras por grupo. (*) P< 0.01, versus grupo del tiempo 0. Newman-Keuls.

Resultados

- 117 -

1.4 - Medida de la Actividad Enzimática NAT

La actividad de la enzima implicada en la síntesis del precursor de la

anandamida, N-araquidonil fosfatidiletanolamina, no se encuentra afectada en las

membranas cerebelares tras la administración aguda de etanol. No se pudo medir la

actividad NAT sobre hipocampo ya que la técnica requiere la recolección de varias

muestras para obtener suficiente cantidad de proteína, por lo que no se dispuso de

material suficiente.

0’ 45’ 90’ 120’

NAT (pmol/mg/min) 452 ± 108 449 ± 104 687 ± 234 385 ± 122

1.5 - Medida de los niveles de ARNm del Sistema Endocannabinoide

Con el fin de averiguar si la disminución observada en los niveles de

endocannabinoides podría ser debida a la alteración de la expresión de los genes que

codifican para las enzimas de síntesis y degradación y/o el receptor CB1, se analizaron

los niveles de ARNm de cada uno de dichos componentes.

La expresión de ninguno de los genes relacionados con los endocannabinoides

está alterada tras la administración aguda de etanol ni a las 2 ni a las 12 horas de su

inyección vía intraperitoneal (figura 5A-C). Sin embargo, la expresión de GAPDH se

encuentra claramente incrementada (figura 5D) tanto en hipocampo como en cerebelo.

Estos resultados apuntan en contra de una activación de la degradación como la

principal causa del descenso de los niveles de endocannabinoides en cerebro, inducido

por etanol.

Tabla 3. La administración aguda de etanol (4 gr/kg i.p.) no produce ningún efecto sobre la actividad de la transferasa de grupo N-acilo (NAT) en las fracciones de membrana de cerebelo a los 0, 45, 90 y 240 minutos tras la inyección. Los datos son las medias + SEM de 5-8 muestras por grupo.

Resultados

- 118 -

A B

C D

0 2 12 0 2 12 0

100

200

Tiempo tras inyección i.p. (h)

RA

TIO

CB

1/G

US

HIPPOCAMPUS CEREBELLUM

0 2 12 0 2 12 0

1000

2000

3000

Tiempo tras inyección i.p. (h)R

AT

IO F

AA

H/G

US


0 2 12 0 2 120

2

4

6

8


RA

TIO

NA

PE-P

LD

/GU

S

HIPPOCAMPUS CEREBELLUM 0 2 12 0 2 12 0

500

1000

1500

2000

2500


RA

TIO

GA

PDH

/GU

S


*

*

* *

Figura 5. Niveles de expresión de ARNm, medidos por PCR a tiempo real, de: A. receptor cannabinoide CB1, B. amidohidrolasa de ácidos grasos (FAAH), C. fosfolipasa D específica de N-acilfosfatidil-etanolamina (NAPE-PLD) y D. deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) en hipocampo y cerebelo de animales control (tiempo = 0) y animales tratados con alcohol (tiempos = 2 y 12 horas tras inyección i.p.). Los datos son las medias + SEM de al menos 7 muestras por grupo. (*) P < 0.01, versus grupo del tiempo 0. Newman-Keuls.

Resultados

- 119 -

1.6 - Inmunohistoquímica de CB1 y FAAH

Para comprobar si la ausencia de cambios a nivel de expresión génica tenía su

correlato en cuanto a la presencia de la proteína, se procedió a la medición de la

expresión de CB1 y FAAH en cortes histológicos.

Las cuantificaciones realizadas para el receptor endocannabinoide CB1 revelan

la no existencia de diferencias estadísticamente significativas, entre los grupos etanol y

control, en ninguna de las áreas estudiadas, esto es, ni en la capas molecular y de

Purkinje del cerebelo (Figura 6), ni en la capa granular del giro dentado hipocampal

(Figura 7), ni en el accumbens shell del estriado ventral (Figura 8), ni en el pálido

ventral (Figura 9).

La inmunohistoquímica de FAAH tampoco reveló diferencias estadísticamente

significativas entre los grupos etanol y control en ninguna de las áreas estudiadas, esto

es, ni en las capa molecular y de Purkinje del cerebelo (Figura 10), ni en la capa

granular del giro dentado hipocampal (Figura 11), ni en la capa piramidal de CA4 en

hipocampo (Figura 12), ni en el accumbens shell del estriado ventral (Figura 13), ni en

el pálido ventral (Figura 14).

CB1 en Cerebelo

Etanol

Control

Figura 6. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en el cerebelo (capas molecular, CM, y de Purkinje,CP) de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

CMCP

0

25

50

75

100

125

150

175

Capa Molecular Capa Purkinje

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

ControlEtanol

- 120 -

Control

Etanol

CB1 en Giro Dentado

Figura 7. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en la capa granular (CG) del giro dentado hipocampal de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

CG

Capa Granular

0

10

20

30

40

50

60

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 121 -

CB1 en Estriado Ventral

Figura 8. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en el accumbens shell (AcbSh) del estriado ventral de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

Etanol

Control

AcbSh

Accumbens Shell

0

25

50

75

100

125

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 122 -

Figura 9. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en el pálido ventral (PV) de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

CB1 en Pálido Ventral

Control

Etanol

PV

0

15

30

45

60

75

CONTROL ETANOL

Den

sida

d öp

tica

(ua)

- 123 -

Figura 10. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en el cerebelo (capas molecular, CM, y de Purkinje, CP) de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

FAAH en Cerebelo

Control

Etanol

CMCP

0

25

50

75

100

125

150

175

200


Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

ControlEtanol

- 124 -

Figura 11. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en capa granular (CG) del giro dentado de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. Diferencia estadísticamente significativa para p< 0.05 (*). U.a.= unidades arbitrarias.

FAAH en Giro Dentado

Etanol

Control

CG

Capa Granular

0

15

30

45

60

75

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 125 -

FAAH en CA4

Figura 12. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en la capa piramidal (CP) de CA4 de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

Etanol

Control

CP

Capa Piramidal

0

15

30

45

60

75

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 126 -

FAAH en Estriado Ventral

Figura 13. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en el accumbens shell (AcbSh) del estriado ventral de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

Etanol

Control

AcbSh

Accumbens Shell

0

20

40

60

80

100

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 127 -

Figura 14. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en pálido ventral (PV) de ratas con tratamiento agudo de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

FAAH en Pálido Ventral

Control

Etanol

PV

0

20

40

60

80

100

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 128 -

Resultados

- 129 -

1.7 - Medida de los niveles de Anandamida y Glutamato en Estriado Ventral

Si la disminución de endocannabinoides no se debe ni a la enzima FAAH ni a

NAT, cabe pensar que el candidato que explicaría tales cambios sería la enzima NAPE-

PLD. Esta enzima es activada por neurotransmisores excitadores como el glutamato, de

forma que una disminución en la liberación de dicho neurotransmisor podría generar

una bajada en la actividad de NAPE-PLD.

Con el fin de dilucidar si la alteración en los niveles de AEA podría deberse a

cambios en la actividad NAPE-PLD se han analizado, mediante diálisis, los niveles de

AEA y glutamato en estriado ventral tras la administración aguda de etanol.

Las concentraciones basales de AEA en estriado ventral son de 2.03 + 0.5 y 2.12

+ 1.1 nM para los grupos etanol inyectados a una dosis de 0.75 g/kg (n = 6) y 2 g/kg (n

= 5), respectivamente (figura 15A).

La inyección del vehículo no altera los niveles de AEA pero cuando se

administra etanol disminuye de forma dosis-dependiente (F(1.141) = 25.094; p < 0.001).

La administración de una dosis de 0.75 g/kg de etanol genera un leve descenso, aunque

no significativo, en los niveles de AEA. Sin embargo, la inyección de dosis de 2 g/kg de

etanol produce una disminución significativa en los niveles de AEA (F12, 52 = 2.621; p <

0.001) transcurridos 40 minutos de la administración de etanol y persiste

aproximadamente un 60% por debajo del nivel basal de AEA, medido antes de la

administración, hasta el final del experimento (tiempo = 120 min).

La concentración basal de glutamato, en las mismas muestras, es 602 + 21 nM

(figura 15B). A los 30 min, de la administración de dosis de 2 g/kg de etanol, disminuye

significativamente hasta aproximadamente un 70% respecto al nivel basal,

manteniéndose hasta el final del experimento (t = 120 min).

Resultados

- 130 -

A

B

-60 - 40 -20 0 20 40 60 80 100 120 40 60 80

100 120 140 160

EtOHVEH

Tiempo (min)

GLU

(% re

spec

to n

ivel

bas

al)

****** ****

-60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120

0.75 g/kg 2 g/kg

EtOH

********

VEH

Tiempo (min)

40

60

80

100

120

AEA

(% re

spec

to a

niv

el b

asal

)

Figura 15. La administración aguda de etanol disminuye la liberación de anandamida y glutamato en el estriado ventral. A. Efectos producidos a lo largo del tiempo sobre los niveles de AEA. La administración de dosis de 0.75 g/kg de etanol (n = 6) producen un leve pero no significativo descenso en el contenido de AEA, mientras que dosis de 2 g/kg (n = 5) sí generan una disminución significativa que persiste al menos 120 minutos tras la administración de etanol. Los datos son las medias + SEM del porcentaje de la concentración de AEA respecto a los niveles basales. B. Efectos sobre los niveles de glutamato tras la administración de etanol. Dosis de 2 g/kg (n = 5) generan un descenso significativo en los niveles de glutamato. Los datos son las medias + SEM del porcentaje de las concentraciones de glutamato respecto a niveles basales. (*) p < 0.05 determinado mediante análisis post hoc tras ANOVA.

Resultados

- 131 -

1.8 - Medida de la Temperatura Corporal y la Actividad Locomotora

Tanto los cannabiniodes como el alcohol producen una disminución de la

temperatura corporal y la actividad locomotora. Con el fin de comprobar la existencia

de posibles efectos aditivos tras la administración de etanol y del inhibidor del

transportador de anandamida, AM404, sobre la hipotermia e hipolocomoción, se ha

inyectado i.p. el inhibidor AM404 (2 mg/kg) a ratas 30 minutos antes de inyectarles i.p.

la solución de etanol (2 g/kg).

Los resultados obtenidos muestran que, al administrarse ambas soluciones, se

obtienen resultados similares a cuando se inyecta individualmente el compuesto

AM404, generándose hipolocomoción (figura 16A) e hipotermia (figura 16B). El

pretratamiento con AM404 no potencia la hipolocomoción inducida por etanol aunque

sí incrementa levemente la hipotermia.

A B

Vehículo AM404 (2 mg/kg) Etanol (2 g/kg) Etanol (2 g/kg) + AM404 (2 mg/kg)

5 30 60 1200

2000

4000

6000

8000

10000

Tiempo tras inyección (seg)

Dis

tanc

ia R

ecor

rida

(cm

)

5 30 60 12033

34

35

36

37

38

Tiempo tras inyección (seg)

Tem

pera

tura

Rec

tal (

ºC)

Figura 16. Efectos a lo largo del tiempo de la administración aguda de AM404 (2 mg/kg), 30 minutos antes de la de etanol (2 gr/kg), sobre la actividad locomotora (A) y la temperatura corporal (B) de ratas Wistar. El inhibidor AM404 no potencia ninguno de los efectos del etanol (hipotermia e hipomovilidad). Los datos son las medias + SEM de 8-10 muestras por grupo.

Resultados

- 132 -

TRATAMIENTO CRÓNICO DE ETANOL

2.1 - Medida de los niveles de ARNm del Sistema Endocannabinoide

Varios trabajos describen que, tras el tratamiento crónico de etanol, se produce

una elevación de los niveles de endocannabinoides (Basavarajappa y Hungund, 1999) lo

cual podría deberse bien a alteraciones en su síntesis o degradación. Es por ello que se

han analizado los niveles de expresión de ARNm de enzimas implicadas en ambos

procesos: NAPE-PLD, en el caso de la síntesis, y FAAH y MAGL, en el caso de la

degradación. Por otro lado, también se han estudiado los niveles de expresión del

receptor cannabinoide CB1 ya que existen trabajos que describen una regulación a la

baja de sus niveles así como una activación en cerebro de ratón (Basavarajappa et al.,

1998; Basavarajappaa y Hungund, 1999) tras tratamiento crónico de etanol.

La cuantificación de los niveles de ARNm, tras la administración crónica de

etanol, reveló la existencia de una disminución significativa de la expresión de CB1 en

cerebelo. Sin embargo, en hipocampo no varía y en estriado se observa un aumento de

su expresión (figura 17A).

En cuanto a la expresión de las enzimas de degradación de endocannabinoides,

no se observan cambios en la expresión de FAAH (figura 17B) ni de MAGL a

excepción del estriado ventral donde están incrementados los niveles de ARNm de

MAGL (figura 17C). Por último, el análisis de los niveles de NAPE-PLD (figura 17D)

revela un incremento en su expresión tanto en hipocampo como en estriado siendo más

pronunciada en esta última área cerebral.

A

0

60

120

180

240

300

CEREBELO ESTRIADO HIPOCAMPO

Ratio

CB1

/ GUS

Salino

Etanol

**

*

Resultados

- 133 -

B

0

300

600

900

1200

1500


Ratio

FA

AH/ G

US

Salino

Etanol

C

0

250

500


Rat

io M

AGL/

GU

S

Salino

Etanol

**

D

0

1.75

3.5

5.25

7


Ratio

NAP

E- P

LD/ G

US

Salino

Etanol**

*

Figura 17. Medida de los niveles de expresión del ARNm de CB1 (A), FAAH (B), MAGL (C) y NAPE-PLD (D) en cerebelo, hipocampo y estriado de ratas sometidas a tratamiento crónico de etanol (2 g/kg) mediante inyección intraperitoneal cada 12h durante 15 días. Los datos están expresados como medias + SEM y relativizados según los niveles de expresión de la β-glucoronidasa (GUS). (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; análisis realizado mediante test t-Student; n = 6 / grupo.

Resultados

- 134 -

2.2 - Inmunohistoquímica de CB1 y FAAH

Con la finalidad de dilucidar si existe correlación entre los datos obtenidos de

expresión génica y la expresión proteica, tras la administración crónica de etanol, se

realizaron inmunohistoquímicas sobre secciones histológicas.

Las cuantificaciones realizadas para el receptor CB1 revelan la existencia de un

aumento, del grupo etanol respecto al control, en cerebelo (capas molecular y de

Purkinje; figura 18) y en el giro dentado hipocampal (capa granular; figura 19). No se

encontraron diferencias estadísticamente significativas ni en el accumbens shell del

estriado ventral (figura 20) ni en el pálido ventral (figura 21).

Las cuantificaciones realizadas para la enzima FAAH revelaron la existencia de

una disminución, del grupo etanol respecto al control, en la capa molecular de la corteza

cerebelar (figura 22) aunque no se aprecian diferencias en la capa de Purkinje. Se

observa también una disminución en el accumbens shell del estriado ventral (figura 25)

y en el pálido ventral (Figura 26) y no se observan diferencias en la formación

hipocampal (Figuras 23 y 24) aunque sí haya una fuerte tendencia a disminuir tras el

tratamiento crónico en la capa granular del giro dentado (p = 0.0506) y una ligera

tendencia a disminuir en la capa piramidal de CA4 (p = 0.1396).

Etanol

Control

CM

CP

0

25

50

75

100

125

150


Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

Control

Etanol* ***

Figura 18. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en el cerebelo (capas molecular, CM, y de Purkinje, CP) de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. Diferencias estadísticamente significativas para p< 0.05(*) y p< 0.001 (***). U.a.= unidades arbitrarias.

CB1 en Cerebelo

- 135 -

CB1 en Giro Dentado

Figura 19. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en la capa granular (CG) del giro dentado hipocampal de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. Diferencia estadísticamente significativa para p<0.05 (*). U.a.= unidades arbitrarias.

Etanol

Control

CG

Capa Granular

0

20

40

60

80

100

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a) *

- 136 -

CB1 en Estriado Ventral

Figura 20. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en el accumbens shell (AcbSh) del estriado ventral de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

Control

Etanol

AcbSh

Accumbens Shell

0255075

100125150

CONTROL ETANOLDen

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 137 -

Figura 21. Cuantificación mediante densitometría digital del receptor CB1 en el pálido ventral (PV) de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

CB1 en Pálido Ventral

Control

Etanol

PV

0

20

40

60

80

100

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 138 -

FAAH en Cerebelo

Figura 22. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en el cerebelo (capas molecular, CM, y de Purkinje, CP) de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. Diferencia estadísticamente significativa para p< 0.05 (*). U.a.= unidades arbitrarias.

Etanol

Control

CM

CP

0

20

40

60

80

100

120


Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

ControlEtanol

*

- 139 -

Figura 23. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en la capagranular (CG) del giro dentado de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

FAAH en Giro Dentado

Etanol

Control

CG

Capa Granular

0

20

40

60

80

100

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 140 -

Figura 24. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en la capapiramidal (CP) de CA4 de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. U.a.= unidades arbitrarias.

FAAH en CA4

Etanol

Control

CP

Capa Piramidal

0

25

50

75

100

125

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

- 141 -

FAAH en Estriado Ventral

Figura 25. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en el accumbens shell (AcbSh) del estriado ventral de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. Diferencia signficativa para p< 0.05 (*). U.a.= unidades arbitrarias.

Etanol

Control

AcbSh

Accumbens Shell

0

20

40

60

80

100

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a) *

- 142 -

FAAH en Pálido Ventral

Figura 26. Cuantificación mediante densitometría digital de FAAH en pálido ventral (PV) de ratas con tratamiento crónico de etanol versus ratas control. Diferencia significativa para p< 0.05 (*). U.a.= unidades arbitrarias.

Control

Etanol

PV

0

20

40

60

80

CONTROL ETANOL

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a) *

- 143 -

Resultados

- 144 -

3. DISCUSIÓN PARCIAL

El tratamiento agudo de etanol, según los resultados obtenidos, va acompañado

de una bajada de los niveles de endocannabinoides, lo cual no podría deberse ni a la

activación de FAAH ni a cambios en la actividad de NAT, por lo que cabe pensar que se

deba a una disminución en la actividad de la enzima NAPE-PLD como principal fuente

de liberación de aciletanolamidas (Giuffrida et al., 1999; Hansen et al., 1997; Stella y

Piomelli, 2001).

La acción del tratamiento agudo de etanol podría afectar a la liberación de

neurotransmisores capaces de interaccionar con receptores acoplados a NAPE-PLD y,

de esta manera, modificar su actividad sin que ello deba llevar asociado un cambio en la

producción de dicha enzima. El etanol podría afectar a la actividad de NAPE-PLD por

inhibición de la liberación presináptica de glutamato y acetilcolina los cuales son

responsables de la activación de PLD (Maejima et al., 2001; Wilson y Nicoll, 2001). En

este sentido los resultados obtenidos en los experimentos de microdiálisis confirman

esta hipótesis ya que disminuyen paralelamente los niveles extracelulares de Glu y AEA

en el estriado ventral.

Por el contrario, está descrito que el tratamiento crónico de etanol está asociado

con un aumento en los niveles de AEA y de su precursor NAPE en el linaje celular de

neuroblastoma humano SK-N-SH (Basavarajappa y Hungund, 1999) y con un

incremento en los niveles de otro endocannabinoide, el 2-araquidonilglicerol (2-AG), en

neuronas granulares cerebelares (Basavarajappa et al., 2000). Esto concuerda con la

disminución encontrada en los niveles proteicos de FAAH y el incremento en la

expresión del ARNm en la enzima NAPE-PLD, tanto en estriado como hipocampo tras

el tratamiento crónico de etanol realizado en la presente tesis y se podría explicar

adicionalmente, según los resultados obtenidos, por una inhibición de la enzima MAGL.

Otra posibilidad podría ser que el alcohol modificase la actividad de síntesis del 2-AG

de las dos isoformas, α y β, de la lipasa de diacilglicerol (DAGL) aunque dicho estudio

no se ha abordado en la presente tesis.

Resultados

- 145 -

MODELOS ANIMALES DE ALCOHOLISMO

Una vez identificadas las acciones del alcohol sobre los elementos del sistema

endocannabinoide, se procedió al análisis funcional de dicho sistema en dos modelos de

ratas con preferencia alcohólica, las líneas AA/ANA y la línea msP.

4.1. Ratas AA y ANA

Las ratas que tienen preferencia por el alcohol (AA) y las que lo rechazan

(ANA) fueron proporcionadas por el Dr. Petri Hyytia (Instituto Nacional de la Salud,

Helsinki).

4.1.1 - Medida de los niveles de ARNm del Sistema Endocannabinoide

En la corteza prefrontal (CPF) de las ratas AA se encuentran disminuidos los

niveles de las enzimas FAAH (62% respecto a la línea ANA; F[1,12] = 18.1; p < 0.001),

y MAGL (19% respecto a la línea ANA; F[1,139] = 4.81; p < 0.05). A su vez, se

observa la existencia de especificidad regional ya que ni en cerebelo ni en estriado

existen diferencias en su expresión (figura 27).

La expresión del ARNm de NAPE-PLD o del receptor CB1 no varía en ninguna

de las áreas cerebrales estudiadas (esto es, ni en cerebelo, ni estriado, ni hipocampo ni

corteza prefrontal) entre las líneas comparadas.

A B

0

200

400

600

800

CPF Cerebelo

Ratio

CB

1/ G

US

0

1000

2000

3000

4000

5000

CPF Cerebelo

Rat

io F

AAH

/ GUS

**

ANAAA

Resultados

- 146 -

C D

0

30

60

90

120

CPF Cerebelo

Rat

io M

AGL/

GU

S *

0

2.5

5

7.5

10

CPF Cerebelo

Ratio

NA

PE-P

LD/ G

US

4.1.2 - Medida de la Actividad Enzimática FAAH

La actividad de la enzima FAAH, en condiciones saturantes, es

aproximadamente un 30% (F[1,10] = 9.63; p < 0.01) menor en la corteza prefrontal

(CPF) de las ratas AA respecto de las ANA, lo cual concuerda con los datos de

expresión de ARNm obtenidos. Sin embargo, no varía su actividad ni en el estriado ni

en el cerebelo de estos animales (figura 28).

Figura 28. Análisis bioquímico de la actividad FAAH en membranas cerebrales de ratas AA (barras negras) y ANA (barras blancas). Se aprecia un descenso en la corteza prefrontal (CPF) de las ratas AA, usando como sustrato araquidonil-[1-3H]-etanolamida (media + SEM en pmol/mg proteína/min), (*) p < 0.05 versus ratas ANA; n = 6-8 por grupo.

Figura 27. Medida de los niveles de expresión de ARNm mediante PCR a tiempo real de CB1 (A), FAAH (B), MAGL (C) y NAPE-PLD (D) en la corteza prefrontal (CPF) y cerebelo de las ratas AA y de las ratas ANA. Los datos están relativizados respecto a la expresión del ARNm de la β-glucoronidasa (GUS) y son la media + SEM; (*) p < 0.05; (**) p < 0.01 versus ratas ANA; n = 7-8 por grupo.

ANAAA

Resultados

- 147 -

4.1.3 - Medida de los Niveles de Endocannabinoides

Los niveles de 1-AG y 2-AG están significativamente elevados en la corteza

prefrontal de las ratas AA respecto a las ANA aunque no varían los de AEA (tabla 4).

Tampoco se encuentran diferencias en los niveles de ninguno de los endocannabinoides

ni en estriado ni en cerebelo (datos no mostrados).

Niveles endocannabinoides (pmol/mg tejido) 1 - AG 2 - AG AEA

AA 5.3 + 0.6 ** 0.47 + 0.04* 0.367 + 0.05

ANA 3.5 + 0.31 0.31 + 0.03 0.44 + 0.02

4.1.4 – Estado Funcional del Receptor Cannabinoide CB1

Con el fin de valorar el estado funcional del receptor CB1 se midieron el número

de sitios de unión y su capacidad de acoplamiento a proteínas G.

Las preparaciones de membranas de las ratas AA, a concentraciones saturantes

de SR141716A (10 mM), muestran un 20% menos de sitios de unión en la corteza

prefrontal respecto a las ratas ANA (F[1,13] = 5.6, p < 0.05), y no varían ni en cerebelo

ni en estriado dorsal. A su vez, la incorporación de [35S]GTPγS (mediante estimulación

con WIN 55,212-2) se encuentra disminuida en la corteza prefrontal de las ratas AA no

variando ni en el estriado ni en el cerebelo de las mismas.

Tabla 4. Medida de los niveles de endocannabinoides en la corteza prefrontal de las ratas AA y ANA. Los niveles de 1-AG (araquidonilglicerol) y 2-AG están significativamente elevados en las ratas AA respecto a las ANA no existiendo diferencias en los de AEA (1-AG: F[1,14] = 14.3, (**) p < 0.002; 2-AG: F[1,15] = 11.8, (*) p < 0.005; AEA: F[1,17] = 1.8). En el resto de áreas cerebrales (cerebelo y estriado) no se aprecian diferencias en ninguno de los endocannabinoides analizados; n = 8-10.

Resultados

- 148 -

Regiones

Cerebrales ANA AA ANA AA

Corteza Prefrontal 680.0 + 52.0 546.0 + 27.0* 203.1 + 12.9 170.5 + 9.6*

Estriado Dorsal 2040.0 + 156.0 1742.0 + 132.0 195.8 + 18.4 161.2 + 8.9

Cerebelo 1462.0 + 190.0 1825.0 + 240.0 193.4 + 21.1 187.4 + 17.3

4.1.5 - Medida de la Expresión Génica del Receptor CB1 mediante Hibridación in situ

El patrón de expresión del ARNm de CB1 observado en las ratas AA y ANA

concuerda con estudios previos realizados en otras cepas de ratas (Mailleux y

Vanderhaeghen, 1992; Hohmann y Herkenham, 2000; Matsuda et al., 1990), no

existiendo diferencias entre ambas líneas en la corteza prefrontal. En hipocampo,

existen diferencias significativas aumentando sus niveles de expresión en la subregión

CA4 de las ratas AA (tabla 6). Sin embargo, en los núcleos caudado-putamen se

observa un gradiente de intensidad de ARNm de CB1 dorso-mediolateral o dorso-

ventrolateral, dependiendo del nivel Bregma de referencia.

La región con mayor intensidad de señal en el caudado-putamen se encuentra

rostralmente en la porción mediolateral (+ 1.0 a + 0.2 mm, coordenadas Bregma; figura

29) y caudalmente en la porción ventrolateral (- 0.4 a - 1.8 mm, coordenadas Bregma).

Existe una expresión diferencial entre ambas líneas de ratas en el caudado-putamen a

nivel + 1.0 a + 0.2 mm, coordenadas Bregma (media de densidad óptica x103 + SEM, n

= 8; AA: 78 + 3 vs ANA: 106 + 6; F[1,14] = 17.39, ajuste de Bonferroni p < 0.002). No

se encontraron diferencias en la expresión de CB1 ni en la corteza cingulada, ni frontal

ni frontoparietal.

Tabla 5. Medida de los sitios de unión a CB1 con [3H]-SR141716A (10 nM). Los datos son las medias + SEM en fmol/mg proteína (columnas de la izquierda). Medida de la incorporación de [35S]GTPγS inducida por WIN 55,212-2 (10 mM) como porcentaje de unión estimulada (medias de % + SEM). (*) p < 0.05 versus ratas ANA; n = 6 - 8 por grupo.

Densidad Acoplamiento

Resultados

- 149 -

Región Cerebral ANA AA

Corteza Cingulada 120 ± 5 128 ± 6

Corteza Frontal 86 ± 2 91 ± 4

Corteza Frontoparietal 63 ± 1 64 ± 5

Caudado-putamen 106 ± 6 78 ± 3**

Caudado-putamen Ventrolateral 182 ± 10 157 ± 6

Septum medial-Banda diagonal 76 ± 3 68 ± 2

Núcleo Amigdaloide Central 105 ± 3 113 ± 4

Núcleo Amigdaloide Basolateral 212 ± 5 193 ± 8

Subregiones de Hipocampo Dorsal: CA1 153 ± 6 138 ± 6 CA3 113 ± 5 124 ± 5 CA4 121 ± 3 145 ± 5**

Giro Dentado 126 ± 5 129 ± 6

Tabla 6. Cuantificación de los niveles de expresión del ARNm de CB1 mediante hibridación in situ. Se observa una disminución en la expresión del ARNm de CB1 en los núcleos caudado-putamen (CPu) y un aumento en la subregión CA4 del hipocampo dorsal de ratas AA comparadas con ratas ANA. Los datos están expresados como valores de densidad óptica (x103, media + SEM). Análisis estadístico realizado mediante test t seguido de corrección de Bonferroni/Holm. (**) p < 0.01; n = 8 por grupo.

Figura 29. Fotomicrografías en campo oscuro de películas autorradiográficas de hibridaciones in situ que muestran una disminución de los niveles de expresión del receptor CB1 en el caudado-putamen (CPu) de ratas AA (derecha) comparadas con las ratas ANA (izquierda). Corte a + 1.0 mm, coordenadas Bregma.

Resultados

- 150 -

4.1.6 - Efecto del antagonista SR141716A sobre la Autoadministración de Alcohol

Las ratas AA respondieron al condicionamiento operante tanto con etanol al

10% (v/v) como con sacarina al 0.05% (p/v). Durante una sesión inicial de 30 minutos,

la autoadministración de alcohol se produjo en cantidades de 0.86 + 0.07 g/kg (media +

SEM, n = 20), lo cual llevó a una concentración media de etanol en sangre de 5.85 +

0.85 mM tras finalizar la sesión. La concentración de etanol en sangre se correlacionaba

con la ingesta de etanol durante la sesión (Pearson r = 0.84; p < 0.01), mostrando que el

etanol liberado del recipiente era de hecho consumido.

Las inyecciones intraperitoneales (i.p.) de SR141716A suprimen la respuesta a

etanol de forma proporcional a la dosis administrada del antagonista (F[3,33] = 21.44, p

< 0.0001; Figura 30). Las inyecciones en la corteza prefrontal (Figura 31a) reproducen

el efecto sistémico y la respuesta se encuentra significativamente suprimida (F[2,16] =

16.13, p < 0.0001), mientras que las disminuciones por vía intraestriatal (Figura 31b) no

llegan a ser significativas (F[2,18] = 3.28).

Las zonas microinyectadas de la corteza prefrontal y estriado se muestran en las

figuras 31c y d, respectivamente. Para las inyecciones de SR141716A en la corteza

prefrontal medial, se verificaba que la cánula estuviese ubicada dentro de la región

desde 2.7 a 3.7 mm anterior a bregma (según el atlas de Paxinos y Watson, 1997) y las

posiciones para las inyecciones intraestriatales se verificaron durante el consumo de

etanol.

La inyección del inhibidor URB597 de FAAH en la corteza prefrontal, de ratas

Wistar no seleccionadas, incrementa la respuesta a etanol (F[3,39] = 5.2, p < 0.01;

Figura 32). Análisis posteriores muestran diferencias significativas entre la dosis más

elevada (4 μg) y el grupo control (p < 0.05) o la dosis más baja (0.4 μg; p < 0.05).

Figura 30. Efecto del tratamiento previo con SR141716A sobre la autoadministración de etanol. Los datos están expresados como media (+ SEM) de respuestas a la solución de etanol al 10% durante sesiones de 30 min. (***) p < 0.001 vs vehículo.

Resultados

- 151 -

Figura 31. Efectos de las microinyecciones de SR141716A en la corteza prefrontal (a) y estriado (b) sobre la respuesta a etanol. Los datos están expresados como medias (+ SEM) de las respuestas a solución de etanol al 10% durante sesiones de 30 minutos. (*) p < 0.05, (**) p < 0.001 vs vehículo. La zonas inyectadas con cánula de la corteza prefrontal y estriado se muestran en (c) y (d), respectivamente. Los números indican la posición (en mm) de las secciones coronales según las coordenadas Bregma.

Resultados

- 152 -

4.2. Ratas msP y Wistar

Las ratas msP son una cepa de ratas con preferencia al alcohol derivadas de la

línea de ratas sP (Sardinian-Preferring, Universidad de Cagliari) que han sido criadas

durante más de 30 generaciones en la Universidad de Camerino (Italia) y puestas a

disposición de nuestro grupo de colaboración.

4.2.1 - Medida de los niveles del ARNm de CB1 mediante Hibridación in situ

Los niveles de expresión del ARNm de CB1, medidos mediante hibridación in

situ, muestran fuertes diferencias entre las ratas msP y Wistar en áreas cerebrales como

la porción rostral de los núcleos caudado-putamen (Cpu), la corteza frontoparietal

(fpCx) y las subregiones CA1 y CA4 del hipocampo (13-26% menores en Wistar) tal y

como se deduce del análisis estadístico mediante el test t con correción de

Bonferroni/Holm (CPu rostral: F[1,14] = 24.0, p < 0.01 corregida; fpCx: F[1,13] = 19.6,

p < 0.01 corregida; CA1: F[1,14] = 18.9, p < 0.01 corregida; CA4: F[1,14] = 7.8, p <

0.05 corregida; Figura 33A).

En ratas msP, que consumieron voluntariamente etanol durante periodos de 18

días (ingesta de etanol que aumentaba de forma progresiva durante este periodo y entre

Figura 32. Efectos de la inyección local del inhibidor de FAAH URB597 (0, 0.4 y 4 μg) en la corteza prefrontal sobre la autoadministración de etanol. Los datos están expresados como media (+ SEM) de las respuestas a la solución de etanol al 10% durante sesiones de 30 minutos. (*) p < 0.05; test de Tukey; n = 7- 9 por grupo.

Resultados

- 153 -

msP Wistar

ccg cf cfp CP (+ 2.2)

CA1 CP (- 0.4)

CP ml (- 0.4)

CA3 CA4 GD

AR

Nm

de

CB

1 (%

msP

)

0

25

50

75

100

125

ccg cf cfp CP (+ 2.2)

CA1 CP (- 0.4)

CP ml (- 0.4)

CA3 CA4 GD

AR

Nm

de

CB

1 (%

msP

)

0

100

125

25

50

75

msP msP + EtOH

rangos de 4.93 + 0.39 g/kg en el día 1 y de 8.36 + 0.36 g/kg en el día 18), se observa

una regulación a la baja de la expresión del receptor CB1 en las regiones del

prosencéfalo analizadas. Sin embargo, este efecto sólo era significativo en la porción

rostral de los núcleos caudado-putamen (un 27% de regulación a la baja; test t con

corrección de Bonferroni/Holm: Cpu rostral: F[1,14] = 18.0, p < 0.01 corregida; Figura

33B, Tabla 7).

A

B

Figura 33. Niveles de expresión relativos del ARNm de CB1 en diferentes áreas cerebrales de las ratas mSP y Wistar (A), y de las ratas mSP control y tras 18 días de ingesta de etanol (B). Los datos están expresados como medias de porcentaje + SEM, n = 7-8. Los análisis estadísticos se han realizado mediante el test t con correción de Bonferroni/Holm (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs ratas mSP). Corteza frontal (cf); corteza cingulada (ccg); corteza frontoparietal (cfp); núcleos caudado-putamen (CP) a nivel de +2.2 coordenadas Bregma (CP, +2.2), a nivel -0.4 mm (CP, -0.4) y la porción mediolateral de CP a nivel -0.4 mm (CP ml, -0.4); subregiones del hipocampo dorsal (CA: áreas Cornus Ammon, de CA1 a CA4; giro dentado, GD).

Resultados

- 154 -

Ratas Tratamiento ccg cf cfp CP (+2.2)

CP (– 0.4)

CP ml (– 0.4)

Wistar Ninguno 11.8 ± 0.6 6.8 ± 0.4 2.7 ± 0.1 9.6 ± 0.3 20.1 ± 0.8 50.1 ± 2.6

msP Ninguno 11.9 ± 0.5 7.9 ± 0.5 3.7 ± 0.2 12.8 ± 0.6 20.4 ± 0.7 54.7 ± 1.9

msP Etanol (10 días) 10.5 ± 0.4 6.9 ± 0.6 3.1 ± 0.2 9.3 ± 0.6 17.4 ± 1.1 44.4 ± 2.7

Ratas Tratamiento CA1 CA3 CA4 GD

Wistar Ninguno 11.2 ± 0.4 16.4 ± 1.6 7.4 ± 0.4 20.9 ± 1.1

msP Ninguno 15.0 ± 0.8 19.1 ± 1.8 8.9 ± 0.4 23.8 ± 0.9

msP Etanol (10 días) 11.8 ± 0.8 18.4 ± 1.1 7.6 ± 0.6 21.5 ± 0.5

Tabla 7. Niveles de ARNm de CB1 en diferentes áreas cerebrales de las ratas mSP y Wistar. Los datos se expresan como valores de densidad (nCi/g, medias + SEM; n = 7-8). Corteza frontal (cf); corteza cingulada (ccg); corteza frontoparietal (cfp); núcleos caudado-putamen (CP) a nivel de +2.2 coordenadas Bregma (CP, +2.2), a nivel -0.4 mm (CP, -0.4) y la porción mediolateral de CP a nivel -0.4 mm (CP ml, -0.4); subregiones del hipocampo dorsal (CA: áreas Cornus Ammon, de CA1 a CA4; giro dentado, GD).

Resultados

- 155 -

4.2.2 - Medida de los niveles de ARNm del Sistema Endocannabinoide

Existe una disminución en la expresión del ARNm de FAAH (figura 34C) en el

estriado y de MAGL (figura 34D) en corteza prefrontal (CPF) de las ratas msP respecto

a las Wistar. No se aprecian diferencias en los niveles de ARNm ni de CB1 (figura

34A), ni de NAPE-PLD (figura 34E) ni de DAGL-α (lipasa α de diacilglicerol, enzima

que produce 2-AG; figura 34B) entre las ratas Wistar y msP en ninguna de las áreas

cerebrales analizadas.

A

0

2

4

6

8

10

12

14

Cerebelo Estriado Hipocampo CPF

Rat

io C

B1 /

Cicl

ofili

na-A

Wistar

msP

B

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3


Rat

io D

AGL-

α /

Cicl

ofili

na-A Wistar

msP

Resultados

- 156 -

C

0

5

10

15

20

25

30


Rat

io F

AAH

/ Ci

clof

ilina

-AWistar

msP

**

D

0

5

10

15

20

25

30


Ratio

MAG

L / C

iclo

filin

a-A

Wistar

msP **

Resultados

- 157 -

E

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12


Rat

io N

APE-

PLD

/ C

iclo

filin

a-A Wistar

msP

4.2.3 - Medida de la Expresión Proteica del Sistema Endocannabinoide Con el fin de dilucidar si existe una correlación entre los datos de expresión

génica y proteica se realizaron inmunohistoquímicas para los marcadores CB1, FAAH,

MAGL y NAPE-PLD a las secciones de cerebro de ratas msP y Wistar.

A raíz de los resultados obtenidos en las ratas AA y ANA, se ha estudiado la

corteza prefrontal de las ratas msP y Wistar, no encontrándose diferencias

estadísticamente significativas para ninguno de los marcadores analizados (figura 35).

Figura 34. Medida de los niveles de ARNm de CB1 (A), DAGL-α (B), FAAH (C), MAGL (D) y NAPE-PLD (E) en cerebelo, estriado, hipocampo y corteza prefrontal (CPF) de ratas mSP y Wistar. Los resultados se expresan como medias + SEM relativizadas a la expresión del ARNm de Ciclofilina-A. (*) p < 0.05; (**) p < 0.01 vs ratas Wistar; n = 8.

Corteza Prefrontal

Wistar msP

CB1

FAAH

MAGL

NAPE-PLD

Figura 35. Cuantificación, mediante densitometría digital, de la expresión proteica de CB1, FAAH, MAGL y NAPE-PLD en la corteza prefrontal de ratas msP y Wistar.

0

50

100

150

200

250

CB1 FAAH MAGL NAPE-PLD

Den

sida

d Ó

ptic

a (u

a)

WistarmsP

- 158 -

DISCUSIÓN

Discusión

- 161 -

1.- Papel General del Sistema Endocannabinoide en el Alcoholismo

En la presente tesis se ha tratado establecer cuáles son las alteraciones que se

dan en los componentes del Sistema Endocannabinoide (SEC) en varios modelos

animales de alcoholismo, con el fin de intentar dilucidar el papel de dicho sistema en

esta adicción.

Varios trabajos científicos han demostrado que la administración crónica de

alcohol promueve cambios en los niveles de endocannabinoides (Basavarajappa y

Hungund, 1999; González et al., 2002) y en esta tesis se demuestra cuáles son los

componentes del SEC que podrían ser responsables de tales variaciones. A su vez, se

ha podido analizar cuáles son los efectos de la administración aguda de etanol, no

descritos previamente, y completar las acciones crónicas de etanol sobre el sistema

endocannabinoide (SEC). Por último, se ha caracterizado y analizado las alteraciones en

el SEC de modelos animales seleccionados y criados por su preferencia al consumo de

etanol (líneas AA y msP) en áreas cerebrales relacionadas con el proceso de adicción a

drogas.

No existe ningún trabajo científico que describa las alteraciones sufridas tras la

exposición aguda de etanol sobre el SEC. En la presente tesis se ha abordado dicho

análisis y se ha encontrado, a diferencia de los efectos crónicos del etanol, una

disminución en los niveles de endocannabinoides (AEA y PEA) no asociada a

alteraciones en la expresión de ninguna de las enzimas implicadas en la síntesis y

degradación de endocannabinoides, así como la inexistencia de alteraciones en la

expresión génica o proteica de CB1, aunque se desconoce la posible existencia de

alteraciones a nivel funcional lo cual sería objeto de futuros estudios.

Los receptores CB1 son abundantes en regiones cerebrales que juegan un papel

importante en la regulación de los circuitos de recompensa, comúnmente activados por

drogas de abuso como el etanol (Rodríguez de Fonseca y Navarro, 1998). El papel de

dicho receptor durante la intoxicación crónica de etanol ha sido muy investigado,

describiéndose una desensibilización de CB1 (Basavarajappa et al., 1998) asociada a un

incremento en los niveles de endocannabinoides. Ello concuerda con el hecho de que la

administración de agonistas de CB1 estimule el consumo, la autoadministración y las

propiedades motivacionales del etanol, mientras que la administración de antagonistas

las suprima (Colombo et al., 2005; Maldonado et al., 2006; Cippitelli et al., 2005).

Discusión

- 162 -

Los estudios en los que se ha bloqueado (Arnone et al., 1997; Rodríguez et al.,

1999; Colombo et al., 1998) o inactivado genéticamente el receptor CB1 (Hungund et

al., 2003; Wang et al., 2003; Naasila et al., 2004) implican a la señalización

endocannabinoide en la regulación de la autoadministración de etanol. El perfil de

expresión en cerebro, mas allá de indicar la posibilidad de una desregulación en la

expresión de los genes endocannabinoides y las señales de transducción bajo su control,

podría contribuir a una elevada preferencia al alcohol (Rimondini et al., 2002; Arlinde

et al., 2004).

En la presente tesis, se ha abordado un estudio más completo de las acciones de

crónicas del etanol sobre el SEC en el que se ha podido comprobar que existen otras

enzimas relacionadas con la degradación de endocannabinoides (MAGL, FAAH), que

podrían ser, al menos en parte, responsables de dichos cambios.

Los estudios con animales modelos han demostrado que las drogas, que activan

a los receptores cannabinoides en cerebro, son capaces de regular la autoadministración

de etanol, cannabinoides y opiáceos. El análisis del SEC de dos líneas de animales,

seleccionados y criados por su preferencia al consumo de etanol, permitiría reafirmar la

existencia de variaciones a nivel del SEC de la misma índole a las observadas tras la

administración crónica de etanol, estableciéndose un vínculo entre dichas alteraciones y

la preferencia y consumo de etanol así como facilitando la identificación de las áreas

cerebrales relevantes en estos procesos.

Los resultados obtenidos en estos animales tienen una gran relevancia en

aquellos estudios en humanos sobre la retirada de alcohol ya que los receptores CB1 de

rata y humano muestran una gran homología (93% y 97% de identidad nucleotídica y

aminoacídica, respectivamente; Ameri, 1999).

La identificación de las alteraciones sobre el SEC ayudará al diseño de

estrategias farmacológicas específicas dirigidas al tratamiento del alcoholismo y al

establecimiento, de nuevo, de la homeostasis del sistema endocannabinoide.

Discusión

- 163 -

2.- Acciones Agudas del Etanol y Adaptación Crónica

2.1. Acciones Agudas del Etanol

Los resultados obtenidos, tras el tratamiento agudo de etanol, sugieren que el

etanol afecta a la formación de AEA en cerebro y tejidos periféricos sin que ello se deba

a una inducción de la degradación por parte de la enzima FAAH. Los efectos sobre los

niveles de AEA tienen su réplica en una segunda aciletanolamida, PEA, cuyas vías de

síntesis y degradación se asemejan a las de AEA, lo que sugiere la existencia de un

mecanismo común para la disminución de los niveles de ambas aciletanolamidas.

El etanol induce una disminución en la formación de AEA en cerebro, plasma y

tejido adiposo, limitado a los primeros 90 minutos del experimento. Sin embargo, en

hígado y, especialmente, en intestino delgado se observa un remarcable incremento en

su liberación tras 90 minutos de la administración de etanol. Estos efectos sugieren la

existencia de una selección de dianas a nivel de tejido en el sistema endocannabinoide.

La especificidad local de los mecanismos reguladores de la formación de AEA,

podría basarse en el papel activador del etanol en el intestino delgado. Recientemente se

ha descrito que el intestino delgado produce grandes cantidades de AEA en animales en

ayunas (Gómez et al., 2002). Los efectos agudos del etanol sobre la producción de AEA

se asemejan a los encontrados tras 18 horas de la privación de comida, probablemente

debido a que el etanol podría actuar como una droga hipoglucemiante por su

interferencia con el metabolismo de la glucosa (Williams, 1984). Esta hipótesis se vería

apoyada por la existencia de un rápido incremento en la expresión génica de la enzima

GAPDH, que es crucial para la regulación de los procesos de glucólisis y

neoglucogénesis hepática.

Los resultados obtenidos tras la administración aguda de etanol y/o el inhibidor

del transportador de AEA, AM404, sugieren que el etanol no es responsable directo de

la elevación de los niveles de endocannabinoides al no existir efecto aditivo cuando se

inyectan ambos compuestos ni sobre la hipolocomoción ni hipotermia, efectos típicos

generados por endocannabinoides (Dewey, 1986). Por tanto, cabría esperar que dichas

alteraciones se deban a un efecto directo del etanol sobre los sistemas de

neurotransmisión, los cuales podrían afectar al metabolismo endocannabinoide. Los

experimentos realizados, mediante microdiálisis in vivo, apoyarían dicha hipótesis al

Discusión

- 164 -

disminuir paralelamente tanto la liberación de glutamato como los de AEA tras la

administración aguda de etanol.

El etanol provocaría una disminución en los niveles de neurotransmisores como

glutamato y acetilcolina (Maejima et al., 2001; Wilson y Nicoll, 2001), lo que llevaría a

un descenso en la rotura del precursor de anandamida (AEA) y palmitoiletanolamida

(PEA), NAPE, mediada por la enzima NAPE-PLD. La exposición crónica a etanol

resultaría en el desarrollo de tolerancia y, en consecuencia, en un aumento de la

liberación de ambos neurotransmisores (AEA y glutamato) (Dahchour y De Witte,

2000; Imperato et al., 1998), lo cual contribuiría a un incremento en la formación de

AEA (Hungund et al., 2002), tal y como está descrito en la bibliografía.

El etanol podría inhibir directamente a los receptores metabotrópicos y NMDA

de glutamato implicados en la liberación de AEA, dependiente de la enzima PLD, lo

que conduciría a una disminución en la rotura del precursor NAPE (Lovinger et al.,

1989; Maejima et al., 2001; Hansen et al., 1997). Sin embargo, ciertas evidencias

directas apuntan a que el etanol podría alterar la señalización dependiente de PLD,

actuando como sustrato metabólico lo que conduciría a la actividad de PLD hacia la

producción de fosfatidiletanol (Kötter y Klein, 1999). Dicha hipótesis no podría

explicarse según los efectos observados ya que está descrito que NAPE-PLD no usa al

etanol como sustrato (Okamoto et al., 2004).

Los efectos observados son específicos de tejido lo que indica la existencia de

una compleja trama de señales regulando la producción endocannabionide. El hecho de

que el hipocampo dorsal sea más sensible a los efectos inhibidores del etanol sobre la

formación de AEA y PEA podría ser dependiente de la coexistencia de una importante

inervación glutamatérgica y colinérgica, neurotransmisores que estimulan

cooperativamente la liberación de AEA (Stella y Piomelli, 2001). Además, todos estos

mecanismos podrían interaccionar juntos de manera selectiva según el tejido, de

acuerdo con el papel propuesto para las aciletanolamidas como mediadores locales.

Un factor adicional que podría contribuir a la disminución de la formación de

anandamida sería la respuesta al estrés tras la exposición aguda a etanol (Rivier, 1993).

Debido a que el etanol puede activar la actividad del eje hipotalámico-pituitario-adrenal,

la elevación en los niveles de corticosterona afectaría a la producción

endocannabinoide. Sin embargo, el hecho de que la inmovilización activa, una forma

severa de estrés inducida en ratas, sólo disminuya la formación de AEA en la amígdala

Discusión

- 165 -

y no se altere en otras áreas, como el núcleo accumbens y cerebelo, sugiere que la

contribución del estrés a la inhibición de la liberación de aciletanolamidas podría ser de

menor importancia que la generada por la inhibición, inducida por etanol, sobre la

liberación de glutamato y acetilcolina. Dicha hipótesis experimental necesitaría

confirmarse en futuras experimentaciones y no se ha abordado como objetivo de la

presente tesis.

Todos los efectos sobre la formación de AEA y PEA descritas en cerebro se

observaron cuando aún existían cantidades sustanciales de etanol sin metabolizar, tal y

como se muestra en los niveles plasmáticos (Figura 1A, sección de Resultados). Su

rápida desaparición sugiere la existencia de una fuerte regulación en la producción de

aciletanolamidas, lo cual concuerda con el papel como mediador de la señalización

intercelular.

2.2. Acciones Crónicas del Etanol

La inhibición de la formación de anandamida estaría regulada por respuestas

homeostáticas contrarreguladoras, que tras repetidas exposiciones a etanol, conduciría a

un aumento en producción de precursores (NAPE) y a la liberación de AEA, tal y como

está descrito que ocurre en cultivos de neuroblastoma humano (SK-N-SH) y en cerebro

(Basavarajappa y Hungund, 1999; Basavarajappa et al., 2000; Hungund et al. 2002,

González et al., 2002).

La medida de los niveles de expresión génica de las diferentes enzimas de

síntesis y degradación de endocannabinoides, tras tratamiento crónico de etanol, revela

la existencia de un aumento en los niveles de NAPE-PLD, lo cual podría contribuir a

dicho efecto en áreas como estriado e hipocampo.

La disminución en los niveles proteicos de FAAH podría contribuir también a la

elevación de los niveles de endocannabinoides en el shell del núcleo accumbens, corteza

cerebelar (capa molecular) y pálido ventral. Sin embargo, en cultivos de neuronas

granulares cerebelares, sometidas a tratamiento crónico de etanol, el incremento en los

niveles de AEA y su precursor NAPE no está asociado a una inhibición directa de la

actividad de FAAH aunque sí a una inhibición en el transporte de AEA (Basavarajappa

Discusión

- 166 -

et al., 2003) y a una inducción de las enzimas implicadas en su síntesis. Por otro lado,

otros trabajos describen la no existencia de alteraciones en los niveles de

endocannabinoides (AEA y 2-AG) ni en cerebelo ni estriado (González et al., 2002). En

ambos casos ello no eximiría que dicha alteración se produjera en la capa molecular de

la corteza cerebelar o en el shell del núcleo accumbens.

De manera similar, si se comparan en cerebellum los niveles de proteínas con los

de ARNm se observa que, en el caso de CB1, existe un aumento en sus niveles

proteicos en dos capas de la corteza cerebelar (capa Molecular y de Purkinje) lo cual,

aparentemente, no concordaría con la disminución en los niveles de ARNm de CB1.

Esta aparente incongruencia podría tener su explicación en el hecho de que, para la

medida de los niveles de ARNm, se toma el cerebelo completo y no se discrimina

cuáles son los efectos del etanol en cada capa. Ello podría sugerir la existencia de un

posible efecto de ‘dilución’ de los cambios en los niveles de ARNm, en la

neuroanatomía cerebelar, ya que podrían darse efectos opuestos en cada estructura

cerebelar. Estudios adicionales, mediante hibridaciones in situ, podrían ayudar a

desvelar esta incógnita.

Otros investigadores sí han acometido dicho estudio en áreas diferentes al

cerebelo. Por ejemplo, las hibridaciones in situ de CB1 realizadas en secciones de

cerebro de ratas sometidas a tratamiento crónico de etanol (Ortiz et al. 2004), revelan la

existencia de diferencias en los niveles de ARNm en la formación hipocampal: existe un

aumento en regiones como CA1 y CA2 y una disminución en giro dentado lo que,

primero, concuerda con el incremento observado, en la presente tesis, en los niveles

proteicos de CB1 en giro dentado (capa granular) y, segundo, vuelve a sugerir la

existencia de dianas específicas del etanol, a nivel del SEC, en la neuroanatomía de la

formación hipocampal.

Está descrito que la exposición crónica a etanol induce un incremento en la

liberación neurotransmisores como glutamato y acetilcolina (Dahchour y De Witte,

2000b; Imperato et al., 1998), responsables de la activación de los receptores NMDA y

colinérgicos, así como un incremento en los niveles de 2-AG (Basavarajappa et al.,

2000) probablemente asociado a la activación de dichos receptores (Dinh et al., 2002,

Stella y Piomelli, 2001). La elevación en los niveles de 2-AG estimularía la expresión

de MAGL, enzima responsable de la degradación de 2-AG y no de anandamida. Está

descrito que la sobreexpresión de dicha enzima afectaría a la inactivación del

Discusión

- 167 -

endocannabinoide 2-AG aunque no a su síntesis mediada por receptor (Dinh et al.,

2002). Por tanto, en striatum, sería necesario analizar los niveles de expresión de las

enzimas implicadas en la síntesis de 2-AG, como la fosfolipasa-C (PLC) y la lipasa de

diacilgliceroles (DAGL), así como realizar una medida de los niveles de 2-AG en dicha

área. En la presente tesis se ha abordado principalmente el análisis de una de las dos

vías de síntesis de endocannabinoides, la de aciletanolamidas, no realizándose el estudio

de la vía de síntesis de 2-AG, la cual podría ser objeto de estudio en futuras

investigaciones.

El tratamiento crónico de etanol revela también la existencia, en striatum, de un

aumento en la expresión génica de CB1, lo cual no concuerda con lo descrito hasta el

momento. Teniendo en cuenta que los núcleos caudado y putamen son los que mayor

área representan, serían, por tanto, en mayor parte los responsables de dicha alteración.

Otros autores describen bien una disminución en la expresión génica de CB1 en

caudado-putamen (Ortiz et al., 2004) o bien ningún cambio ni en la expresión génica ni

en el número de sitios de unión de CB1 en ninguna de las áreas cerebrales analizadas,

entre las que se incluían NAcb y Caudado-Putamen (González et al.; 2002a). No está

claro cuáles son los motivos para estas incongruencias en estriado, a nivel del receptor

CB1. Quizás se deba a la existencia de diferencias en el protocolo en cuanto a la

duración del tratamiento (52 días según Ortiz et al. y 15 días según González et al.), a la

concentración de la solución de etanol o al modo de administración de la misma. Ello

podría sugerir la necesidad de ampliar la duración del tratamiento para poder observar

estos cambios adaptativos en el SEC a nivel de estriado.

En resumen, este primer conjunto de experimentos demuestra que la

administración aguda de etanol suprime los niveles de endocannabinoides en cerebro y

que las neuroadaptaciones, debidas a la exposición crónica, conducen a un incremento

permanente de los mismos. Este hecho está de acuerdo con la teoría general

homeostática y la teoría de los procesos opuestos (Solomon, 1980). Esta última se basa

en que los organismos reaccionan, ante los cambios producidos a causa del medio,

intentando mantener cierto equilibrio (principio de homeostasis). Solomon mantiene

que cuando un evento externo produce una reacción en los sujetos (Proceso A), los

organismos reaccionan produciendo una respuesta contraria (Proceso B) para

amortiguar los efectos de la primera. Estos procesos B aparecen un poco más tarde, ya

que son una reacción a los primeros, por lo que tardan un poco más en desaparecer

Discusión

- 168 -

dejando una sensación opuesta a la que generó inicialmente el evento externo. Todo ello

ratificaría la veracidad de los efectos del etanol, descritos en la presente tesis, sobre el

Sistema Endocannabinoide.

3.- Selección de Preferencia Alcohólica y Sistema Endocannabinoide

En la presente tesis se ha caracterizado el Sistema Endocannabionide de dos

modelos animales seleccionados y criados por su preferencia al alcohol en diferentes

laboratorios. Ambas líneas, AA y msP, muestran una disminución en la expresión de las

enzimas de degradación de endocannabinoides lo cual podría ser una de las causas que

llevarían a la elevación de los niveles de endocannabinoides. Todo ello sugiere la

existencia de una fuerte asociación de la preferencia al alcohol con una elevación en los

niveles de endocannabinoides en áreas cerebrales implicadas en la recompensa y

formación del hábito de consumo, concordando con los efectos descritos tras

tratamiento crónico de etanol (Basavarajappa y Hungund, 1999).

En la corteza prefrontal (CPF) de las ratas AA se observa una pronunciada

disminución en la expresión génica de FAAH y en menor grado de MAGL, no variando

la expresión de la enzima NAPE-PLD. Todo ello, junto con el incremento en los niveles

de los endocannabinoides (1-AG y 2-AG), sugiere que la degradación de dichos

compuestos está alterada en esta área cerebral. Ello conduciría a una elevación local del

tono endocannabinoide lo cual sería un efecto esperable para compensar la

desensibilización del receptor CB1. De hecho, existe una disminución en la densidad y

acoplamiento de dicho receptor en la CPF de las ratas AA, aunque su expresión génica

no muestra diferencias con las ratas ANA. Esta disociación entre la unión de CB1 y su

expresión, en ratas AA, podría tener su explicación en que los receptores CB1 se

localizan normalmente en los terminales axónicos de las neuronas de proyección (Tsou

et al., 1998), por lo que la medida de la unión de CB1 sería debida, en gran parte, a los

receptores de fibras aferentes procedentes de otras áreas cerebrales.

En el estriado dorsal de las ratas AA se ha encontrado una disminución en los

niveles de ARNm de CB1, no variando la expresión de enzimas de degradación como

FAAH o MAGL entre ambas líneas. La menor expresión de CB1 no se acompaña con

una disminución en su unión. Gran parte de la expresión del ARNm del receptor CB1

Discusión

- 169 -

en el estriado dorsal depende de su expresión en las neuronas de proyección estriatales

(Hohmann y Herkenham, 2000). Por tanto, las diferencias observadas en los niveles de

ARNm de CB1 podrían afectar principalmente a la síntesis de receptores CB1 ubicados

en los terminales eferentes que proyectan desde las regiones estriatales.

Varios trabajos relacionan las diferencias en el Sistema Endocannabinoide con

las encontradas en los fenotipos relacionados con el consumo de alcohol. Los ratones

C57BL/6 tienen menor número de sitios de unión de CB1 aunque una mayor afinidad y

acoplamiento que los ratones con baja preferencia al alcohol DBA/2 (Basavarajappa y

Hungund, 2002; Hungund y Basavarajappa, 2000). En ratas Wistar, se han descrito gran

variedad de cambios adaptativos en el Sistema Endocannabinoide tras ser sometidos a

tratamiento crónico de etanol (González et al., 2004; Basavarajappa y Hungund, 2005).

Existen trabajos que describen, en ratones nulos para el gen de FAAH (Walker

et al., 2005; Basavarajappa et al., 2006; Blednov et al., 2007), un incremento en el

consumo de etanol. Los resultados presentados en esta tesis, muestran una disminución

en la expresión y actividad de FAAH en la CPF de ratas AA y un incremento de

respuestas al etanol, en ratas Wistar, tras la administración intraprefrontal del inhibidor

de FAAH, URB597. Todas estas evidencias apoyarían la hipótesis de que una

disminución en la degradación endocannabinoide, en ciertas regiones cerebrales, serían

claves para incrementar el consumo de etanol.

Las diferencias encontradas en el Sistema Endocannabinoide, a nivel de la CPF,

se añaden a la lista de aspectos neuroquímicos y genéticos que se han segregado

mediante la cría selectiva de las líneas AA y ANA (Sinclair et al., 1989; Gianoulakis et

al., 1992; Arlinde et al., 2004), siendo probablemente, la mayoría de ellos, resultado de

una cosegregación al azar.

El análisis de la expresión del receptor CB1 reveló la existencia de una

disminución en los niveles de ARNm en los núcleos caudado-putamen, de las ratas AA

respecto a las ratas ANA, no existiendo diferencias en su porción ventrolateral. De la

misma manera, en hipocampo sólo se observa un aumento en su expresión en el área

CA4 de ratas AA, no existiendo diferencias en las demás regiones del hipocampo

analizadas. Todo ello sugeriría la existencia de una posible compartimentalización en

ambas áreas cerebrales y una posible selectividad de dianas del etanol a nivel de

Sistema Endocannabionide, lo cual debería ser estudiado en más profundidad en futuras

investigaciones.

Discusión

- 170 -

Con el fin de demostrar que una sola diferencia entre las líneas podría contribuir

casualmente a la preferencia por el alcohol, se ha realizado un tratamiento

farmacológico que revierte dicho fenotipo. La administración sistémica del antagonista

de CB1, SR141716A, produce una notable reducción en la autoadministración de etanol

en las ratas AA.

Las dosis necesarias para provocar dicho efecto son menores a las empleadas en

ratas no seleccionadas (Rodríguez et al., 1999), lo que sugiere la existencia de un

incremento de la sensibilidad a los efectos de este inhibidor en ratas AA. Este resultado

concuerda con estudios previos en los que se describen una disminución en la ingesta

voluntaria de alcohol o de autoadministración tras la administración de SR141716A

(Arnone et al., 1997; Colombo et al., 1998b; Rodríguez et al., 1999). En esta línea, se

ha demostrado que los ratones ‘knockout’ de CB1 tienen reducido tanto el consumo

como la preferencia por el etanol (Hungund et al., 2003; Wang et al., 2003; Naasila et

al., 2004). Estos estudios apoyan la noción de que el Sistema Endocannabinoide está

implicado en la regulación del consumo de etanol. En la presente tesis, se demuestra por

primera vez que las diferencias existentes en el metabolismo endocannabinoide

contribuyen a la preferencia al alcohol y que dicho fenotipo puede revertir si se trata la

diana que causa esta anormalidad preexistente.

El inhibidor SR141716A, en las dosis utilizadas, antagoniza gran variedad de

comportamientos relacionados con la ingesta. Por ejemplo, suprime la

autoadministración de heroína (Navarro et al., 2001; Rodríguez et al., 1999), las

respuestas ante la comida (Freedland et al., 2000) y disminuye también tanto la ingesta

de etanol como de sacarina (Colombo et al., 1998 a,b). Sin embargo, los efectos de

SR141716A sobre la autoadministración de etanol podrían separarse de los debidos a la

ingesta de comida, ya que la administración central de dicho inhibidor suprime la

autoadministración de etanol pero no la ingesta de comida. Ello sugeriría la posibilidad

de que los antagonistas de receptores cannabinoides podrían mediar las acciones

supresoras de la ingesta de comida periféricamente (Gómez et al., 2002).

El análisis bioquímico de las líneas AA y ANA sugiere que la CPF y el estriado

dorsal podrían ser las dianas implicadas en el efecto de SR141716A sobre la ingesta de

etanol. Las inyecciones intracerebrales de SR141716A, en la CPF, revelaron la

posibilidad de que dicha área, y no el estriado dorsal, podría estar implicada en mediar

el efecto de supresión de la ingesta de etanol, por parte de SR141716A, en las ratas AA.

Discusión

- 171 -

Sin embargo, las microinyecciones suprimen la autoadministración de alcohol en menor

grado que las inyecciones sistémicas, lo que sugeriría la implicación de otras regiones

cerebrales en las que el receptor CB1 también se encuentra (Tsou et al., 1998), varias de

las que se saben participan en la regulación de la ingesta de etanol, como por ejemplo el

hipocampo (Tierney et al., 2004) y otras estructuras corticales y subcorticales (Carr y

Sesack, 1998). La administración sistémica de SR141716A podría contribuir a que

dichas áreas participasen en el efecto funcional observado.

La CPF y el estriado dorsal se han asociado con la formación y expresión del

hábito de consumo (Killcross y Coutureau, 2003). Al contrario que los reforzadores

naturales, la autoadministración de etanol rápidamente se convierte en un hábito de

estímulo-respuesta (Dickinson et al., 2002). Por tanto, la observación, en la presente

tesis, de que el antagonismo del receptor CB1 suprime el comportamiento reforzador

del etanol de manera más eficiente que la mantenida por sacarina, podría ser atribuible a

los efectos sobre la motivación y/o al hábito de respuesta.

Los análisis bioquímicos y farmacológicos demuestran la existencia de una

elevación en el tono endocannabinoide en la CPF, debido a la inhibición de la

degradación, lo cual conduciría a una regulación a la baja de la densidad y transducción

del receptor para compensar dichos cambios. La compensación parece ser incompleta y

el continuo y elevado tono endocannabinoide, en la CPF, contribuiría a un aumento en

la preferencia y autoadministración de alcohol, reversible con la administración local de

antagonistas.

En ratas msP, comparadas con ratas Wistar, se observa una disminución en la

expresión génica de enzimas implicadas en la degradación de endocannabinoides, esto

es, FAAH en estriado y MAGL en CPF, no variando la expresión de las enzimas de

síntesis NAPE-PLD o DAGL-α. Ello sugeriría la existencia de una alteración en la

degradación de endocannabinoides lo cual podría llevar a la elevación del tono

endocannabinoide en dichas áreas cerebrales.

El análisis, por inmunohistoquímica, de la expresión proteica de CB1, FAAH,

MAGL y NAPE-PLD no revela la existencia de cambios dramáticos en las áreas

cerebrales analizadas. Sin embargo, la compartimentalización de estas proteínas hacia

los terminales axónicos o dendríticos exigiría realizar un análisis en las áreas de

Discusión

- 172 -

proyección de las neuronas de la CPF y cuerpo estriado, en los que se han encontrado

cambios en la expresión del ARNm.

Los mecanismos neurales subyacentes implicados en la regulación

endocannabinoide del consumo de etanol, en la CPF, son desconocidos pero

probablemente esté relacionada con, o bien, las posibles dianas primarias del etanol,

esto es, los sistemas glutamatérgicos y GABAérgicos, o con las vías dopaminérgicas u

opioidérgicas de los circuitos de recompensa (Pistis et al., 2002).

El consumo de etanol en ratas msP disminuye la expresión génica de CB1,

siendo dicha alteración más patente en el núcleo caudado-putamen al ser la región con

mayor diferencia respecto a las ratas Wistar cuando no se administra etanol. La

restricción de este efecto a la región más rostral del caudado-putamen, apunta a una

posible compartimentalización dentro de dicho núcleo. Sin embargo, la medida de

expresión de ARNm, mediante PCR cuantitativa, en estriado no revela la existencia de

ninguna diferencia. Ello puede ser debido a un efecto de dilución, al no discriminarse

ninguno de los núcleos que la constituyen cuando se realiza dicho análisis. Por otro

lado, en la línea msP se ha caracterizado una desregulación del sistema de señalización

del péptido regulador de la respuesta a estrés del factor liberador de corticotropina

(Hansson et al., 2006), por lo que el fenotipo de preferencia alcohólica no sólo parece

centrarse en el Sistema Endocannabinoide.

El análisis realizado, en ambos modelos de alcoholismo (ratas AA y msP),

revela la existencia de alteraciones tanto en el receptor CB1 como en la degradación de

endocannabinoides. La selección y cría de estos animales generaría una segregación de

genes al azar a pesar de lo cual ambos comparten las mismas alteraciones en el SEC en

las mismas áreas cerebrales, lo que reforzaría aún más la hipótesis que asociaría el

alcoholismo con la alteraciones del SEC en regiones cerebrales claves.

Discusión

- 173 -

4. Implicaciones Terapéuticas:

4.1 - Dependencia Severa a Alcohol y Sistema Endocannabinoide

La dependencia es resultado de una serie de cambios adaptativos tras el consumo

crónico de drogas, entre los que pueden incluirse la sensibilización y la tolerancia.

La sensibilización causa una progresiva adicción a la droga, relacionada con

alteraciones en el metabolismo de la misma, siendo el etanol una de las sustancias que

puede provocar este fenómeno. La administración crónica de sustancias adictivas

conduce a una progresiva y duradera tolerancia. El organismo intenta recuperar y

preservar su homeostasis mediante una serie de cambios adaptativos de diversa índole.

El desarrollo de tolerancia es un fenómeno complejo donde los factores

ambientales juegan un importante papel. La dependencia al alcohol suele ir acompañada

por una tolerancia a sus efectos intoxicantes y por los síntomas de retirada, como

temblores y confusión, cuando cesa el consumo. El desarrollo de tolerancia tras un

abuso continuado y el síndrome de abstinencia tras su cese, se consideran como el

núcleo principal de la dependencia a alcohol (Maldonado, 2006).

En el cerebro, la presencia del sistema de señalización endocannabinoide en

áreas como hipocampo, corteza, estriado, sustancia negra o cerebelo apoya el papel de

este sistema en las respuestas motoras y cognitivas. La distribución anatómica y las

acciones de los endocannabinoides concuerdan con los efectos del alcohol sobre el

comportamiento, incluyéndose alteraciones en la memoria, disminución en la actividad

motora, catalepsia, antinocicepción e hipotermia (Ryan y Butters, 1980; Brandt et al.,

1983; Gebhart et al., 1984; Herkehham et al., 1991; Compton et al., 1993; Fadda y

Rossetti, 1998). La adaptación, en varios pasos, del Sistema Endocannabinoide en el

cerebro podría jugar un importante papel en el desarrollo de tolerancia y dependencia al

alcohol (Basavarajappa et al., 1999; Basavarajappa y Hungund, 1998,1999; Hungund y

Basavarajappa 2000).

En la presente tesis se ha demostrado que los diferentes modelos animales con

preferencia al consumo a etanol, así como los tratados crónicamente con etanol, tienen

alteradas las vías de degradación de endocannabinoides lo cual está fuertemente

asociado con un incremento en el tono endocannabinoide.

Discusión

- 174 -

Varios estudios han relacionado el aumento en los niveles de endocannabinoides

con la degeneración tisular y daño celular así como con el periodo postmortem (Schmid

et al., 1995; Felder et al., 1996; Kempe et al., 1996). En ratas tolerantes a Δ9-THC (Di

Marzo et al., 2000) se ha observado un incremento en la síntesis de AEA en el

prosencéfalo límbico, efecto también descrito en cultivos de células de neuroblastoma

de ratón tratadas con Δ9-THC (Hunter y Burstein, 1997). Ello sugiere la implicación del

Sistema Endocannabinoide en los cambios neuroadaptativos en dichas células y en el

cerebro. El cambio en la neurotransmisión, mediada por endocannabinoides, podría ser

responsable, por tanto, de la activación del sistema de recompensa por parte del alcohol.

Se ha encontrado que los ratones DBA/2, que evitan la ingesta de alcohol, tienen

reducida la funcionalidad de los receptores CB1 en cerebro, lo que concuerda con otros

estudios en los que el antagonista SR141716A bloquea la ingesta de alcohol en

roedores. De manera similar, la activación de CB1 induce el fuerte deseo por el alcohol,

sugiriendo la implicación del receptor CB1 en el comportamiento asociado con el

consumo de alcohol y el desarrollo de alcoholismo (Basavarajappa et al., 2005).

Varios trabajos científicos describen que ratones nulos para el gen de FAAH

tienen incrementados tanto la preferencia como el consumo de alcohol (Blednov et al.,

2007; Basavarajappa et al., 2006). En humanos con dependencia severa a diversas

drogas de abuso, entre ellas el alcohol, existe una fuerte asociación de dicho estado

adictivo con una mutación sin sentido (C385A) en el gen de la enzima FAAH, cuya

consecuencia es una disminución tanto en la actividad como en los niveles proteicos de

dicha enzima (Chiang et al., 2004). En la presente tesis, se ha demostrado que la

reducción en la expresión y actividad de la enzima FAAH podría ser la principal

responsable de la elevación en los niveles de endocannabinoides en la CPF de ratas AA

y estriado de las ratas msP. En la CPF de ratas msP sería la disminución en la expresión

de MAGL, y no de FAAH, la responsable de ese esperable incremento en los niveles de

endocannabinoides. Ello sugiere la existencia de diferentes dianas del alcohol,

implicadas en los mecanismos de degradación de endocannabinoides, en las diferentes

áreas cerebrales analizadas y su relación con la dependencia severa a alcohol (ver tabla

1).

Discusión

- 175 -

Modelo Animal de Alcoholismo Área Cerebral Alteración en Sistema Endocannabinoide

CPF

Niveles Endocannabinoides (1-AG, 2-AG) CB1: Densidad y Acoplamiento FAAH: Expresión Génica y Actividad Enzimática MAGL: Expresión Génica

Línea AA

Estriado CB1: Expresión Génica (CPu +1.0 a +0.2 mm Bregma)

CPF MAGL: Expresión Génica

Estriado CB1: Expresión Génica (CPu +2.2 mm, Bregma) FAAH: Expresión Génica

Línea msP

Hipocampo CB1: Expresión Génica (CA1, CA4)

Cerebelo

Niveles Endocannabinoides (AEA) (Basavarajappa et al., 1999) CB1: Expresión Génica Afinidad, Sitios de Unión (Basavarajappa et al., 1998) FAAH: Niveles Proteicos (Capa Molecular)

Estriado CB1, MAGL, NAPE-PLD: Expresión Génica FAAH: Niveles Proteicos (Shell del núcleo accumbens)

Ratas Wistar tras Tratamiento Crónico

de Etanol

Hipocampo CB1: Niveles Proteicos (capa granular Giro Dentado) NAPE-PLD: Expresión Génica

Tabla 1. Alteraciones en el Sistema Endocannabinoide en diversas áreas cerebrales de ratas Wistar tras tratamiento crónico de etanol y en los modelos animales con preferencia al alcohol (líneas AA y msP). CPF = corteza prefrontal.

Discusión

- 176 -

4.2 - Recaídas y Sistema Endocannabinoide

Uno de los principales problemas en el tratamiento del abuso de drogas es la

reiniciación del fuerte deseo y búsqueda de la droga. Aún no se han identificado los

mecanismos exactos que subyacen a la reinstauración del consumo de drogas tras un

periodo de abstinencia, aunque cada vez existen más evidencias que apuntan a la

estimulación del receptor CB1 en el fenómeno de la recaída.

El Sistema Endocannabinoide se ha relacionado con los episodios de recaída,

especialmente con el receptor CB1 el cual está asociado con el estrés inducido por el

consumo y la retirada de alcohol en ratones ‘knockout’ de CB1 (Racz et al., 2003) así

como en los mecanismos que median la recaída al alcohol. La exposición a agonistas

cannabinoides WIN 55,212-2 ó a THC promueve la recaída en ratas abstinentes al

alcohol (López-Moreno et al., 2004; McGregor et al., 2005) mientras que la

administración del antagonista SR141716A reduce la reinstauración del

comportamiento de búsqueda de etanol en ratas (Cippitelli et al., 2005). Ello concuerda

con la elevación del tono endocannabinoide observado tras la administración crónica de

etanol, tanto en cultivos de células granulares de cerebelo (Basavarajappa y Hungund,

1999) como en el modelo animal con preferencia alcohólica (línea AA) analizada en la

presente tesis, lo que sugeriría la existencia de una fuerte probabilidad de recaída en

dichos animales y que las alteraciones experimentadas, en el SEC, se mantendrían

durante un largo periodo de tiempo tras el cese del consumo.

El Sistema Endocannabinoide parece participar en las propiedades de

recompensa del alcohol mediante la modulación de sus efectos sobre la activación de la

transmisión mesolímbica dopaminérgica. Estudios de microdiálisis in vivo, revelan que

el alcohol no incrementa los niveles extracelulares de dopamina en el núcleo accumbens

(NAc) de ratones ‘knockout’ para CB1 (Hungund et al., 2003). Resultados similares se

obtuvieron cuando se pretrataton a los ratones silvestres con el antagonista SR141716A

antes de la administración de etanol (Hungund et al., 2003). En la actualidad no existe

ningún dato clínico de la posible eficacia del bloqueo del receptor CB1 en humanos en

el tratamiento de la adición a alcohol.

El SEC puede modular la motivación que lleva a la búsqueda de la droga

mediante un mecanismo independiente de la liberación de dopamina en el NAc. Los

receptores CB1 están presentes en la CPF, lo cual constituye un nexo para la integración

Discusión

- 177 -

sensorial, el procesamiento de las emociones y la experiencia hedónica. Esta área

cerebral es un importante componente en el fenómeno adictivo ya que procesa la

recompensa hasta llegar a ser una ‘experiencia hedónica’ (Kringelbach, 2005). De ahí

que los endocannabinoides pudieran estar implicados en la motivación para obtener la

droga actuando como unión de la recompensa a la ‘experiencia hedónica’ en la CPF.

Los mecanismos que subyacen al papel del SEC en la recaída del

comportamiento de búsqueda de droga, producido por estímulos ambientales

relacionados con la droga y la reexposición a la misma, parecen estar relacionados con

la regulación del impacto sobre las memorias relacionadas con la recompensa. Además,

los endocannabinoides, actuando como mensajeros retrógrados, median LTP y/o LTD

de la transmisión sináptica en varias áreas cerebrales relacionadas con la memoria y la

adicción, como el NAc, CPF, amígdala e hipocampo (De Vries y Schoffelmeer, 2005).

Los efectos de los endocannabinoides sobre la plasticidad sináptica podrían

consolidar el comportamiento que lleva a la recompensa necesaria para establecer los

procesos adictivos. Existen otros circuitos neuroquímicos implicados en los efectos del

SEC sobre la recompensa. Por ejemplo, los endocannabinoides podrían facilitar los

efectos de las neuronas liberadoras de orexina en el hipotálamo, el cual proyecta hacia

el NAc y el área tegmental ventral. De esta forma, las orexinas hipotalámicas junto con

los endocannabinoides, estarían directamente implicadas en los efectos de recompensa

de las drogas y en la recaídas del comportamiento de búsqueda de droga (Harris et al.,

2005). Por tanto, el SEC representaría un elemento clave en el sustrato neurobiológico

de la adicción a drogas, y las variaciones genómicas podrían determinar la

vulnerabilidad en humanos a esta adicción (Zhang et al., 2004).

4.3 - Futuro: Tratamiento del Alcoholismo con Fármacos del Sistema

Endocannabinoide

De forma similar a otros desórdenes de recaída crónica, hay sólidas evidencias

que demuestran que los tratamientos farmacológicos pueden mejorar clínicamente el

alcoholismo. Los meta-análisis descritos demuestran la capacidad que tienen ciertos

tratamientos actuales de prolongar la duración de la abstinencia, tras el cese del

Discusión

- 178 -

consumo, o de disminuir el número de días de fuerte consumo aunque ninguno de ellos

evita la recaída (Bouza et al., 2004).

Hay evidencias que apuntan a una fuerte asociación entre la dependencia de

alcohol y los desórdenes psiquiátricos sobre todo los referentes a la ansiedad, cambios

de humor y sueño. Estos efectos se añaden a los del síndrome de abstinencia y su

tratamiento farmacológico es muy efectivo aunque no útiles para tratar el aspecto

principal de la dependencia al alcohol.

La detoxificación puede lograrse con agonistas opioides (metadona,

buprenorfina) o agonistas α2-adrenérgicos (clonidina, lofexidina) y la prevención de la

recaída puede apoyarse con el uso de naltrexona. Sin embargo, estas estrategias tienen

una baja efectividad y éxito así como una serie de efectos colaterales, como la depresión

y anhedonia (van der Brink y van Ree, 2003). Las nuevas estrategias de tratamiento

buscan prevenir la recaída a otras drogas de abuso en individuos abstinentes, en vista de

que lo anterior sólo es beneficioso en aquéllos fuertemente motivados. En consecuencia,

la recurrencia de episodios de recaída en individuos abstinentes durante largos periodos

es uno de los problemas más significativos durante la detoxificación.

Numerosos trabajos científicos apuntan la posibilidad de tratar el alcoholismo

con fármarcos dirigidos al Sistema Endocannabinoide. Se ha demostrado que el bloqueo

total del receptor CB1 en ratones ‘knockout’ disminuye la preferencia e ingesta de

alcohol cuando se comparan con ratones silvestres (Hungund et al., 2003; Poncelet et

al., 2003; Wang et al., 2003; Naasila et al., 2004; Lallemand y De Witte, 2004; Racz et

al., 2003). Por tanto, el bloqueo y la delección genética del receptor cannabinoide

generan una marcada reducción en la ingesta, preferencia y propiedades motivacionales

del alcohol.

El consumo crónico de etanol provoca una disminución en la funcionalidad y

acoplamiento del receptor CB1, los cuales no parecen ser cambios suficientemente

compensatorios ante el aumento de los niveles de endocannabinoides. Por tanto, el

tratamiento farmacológico más eficaz contra el alcoholismo podría ir dirigido hacia una

disminución en la funcionalidad del receptor CB1 que produzca su bloqueo total aunque

ello no excluiría otras posibilidades que generasen una modificación bien en la

producción o en la degradación de endocannabinoides.

Discusión

- 179 -

En la literatura científica hay descritos varios compuestos que actúan como

antagonistas del receptor cannabinoide CB1 como son: SR141716A (Rimonabant),

SR147778, AM251, AM281 y LY320135.

En esta línea, se ha demostrado que la administración de antagonistas como

SR141716A contribuye a la disminución de ingesta de etanol así como evita la recaída

(Cippitelli et al., 2005; Economidou et al., 2006). Este compuesto inhibe la liberación

de dopamina, inducida por etanol, en el NAc (Weiss et al., 1993; Campbell y McBride,

1995) lo cual contribuiría a la supresión de sus efectos reforzadores. En la presente tesis,

se ha demostrado que la administración de SR141716A en ratas AA suprime la ingesta

de etanol. Otros estudios describen que este antagonista de CB1 inhibe el consumo de

etanol así como la reinstauración del comportamiento de búsqueda de alcohol en la línea

de ratas msP (Cippitelli et al., 2005). En la línea de ratas sP, no expuestas anteriormente

al alcohol, se suprime la ingesta de dicha solución cuando se someten a un régimen de

libre elección entre dos botellas: una con alcohol y otra con agua (Serra et al., 2001). La

administración de SR141716A reduce la ingesta voluntaria de alcohol en ratones

C57BL/6J (Arnone et al., 1997), ratas sP (Colombo et al., 1998b) y ratas Wistar

(Lallemand et al., 2001) que normalmente bebían alcohol (modelo de fase de

AM281AM251

SR141716A LY320135

Estructura química de antagonistas y agonistas inversos del receptor CB1.

Discusión

- 180 -

mantenimiento o de bebedor activo del alcoholismo humano), suprime el incremento

temporal en la ingesta de etanol en las ratas sP tras un periodo de privación de alcohol

(fenómeno denominado ‘efecto de privación alcohólica’ el cual se propone como

modelo de los episodios de recaída que se dan en los humanos alcohólicos; Serra et al.,

2002), disminuye la autoadministración oral de alcohol en ratas no seleccionadas

(Freedland et al., 2001) y suprime las respuestas al alcohol en ratas sP (Colombo et al.,

2004).

Existen estudios que sugieren el uso de una dosis inicial de SR141716A de 10

mg/kg/día, en el periodo inicial de retirada de alcohol, seguido de una dosis de

mantenimiento de 3 mg/kg/día que evitaría el incremento en la preferencia de etanol

asociado con la dosis inicial (Lallemand et al., 2004). Actualmente se están realizando

estudios para testar la seguridad y fiabilidad del antagonista SR141716A en el Instituto

Nacional de Abuso de Alcohol y Alcoholismo.

Otros estudios apuntan al uso del antagonista SR147778 para el tratamiento del

alcoholismo. Se ha demostrado que este compuesto disminuye el desarrollo de la

preferencia por el alcohol en ratas sP que no han ingerido alcohol con anterioridad

(Doggrell, 2005). En ratas sP que han ingerido alcohol, la administración de SR147778

(2.5, 5 y 10 mg/kg) reduce la ingesta de etanol. Cuando se les priva de alcohol, durante

15 días, se produce una gran ingesta de alcohol, comportamiento que es prácticamente

suprimido cuando se administra SR147778. Por tanto, este compuesto, similar a su

análogo estructural rimonabant, suprime la adquisición y mantenimiento del

comportamiento de bebedor, la recaída y la motivación al consumo de alcohol en ratas

sP con preferencia al alcohol (Gessa et al., 2005). Desde el punto de vista preclínico,

actualmente no existen diferencias entre el uso de SR141716A (Rimonabant) y

SR147778 para el tratamiento del alcoholismo.

Otros posibles candidatos serían los agonistas inversos AM251, AM281 y

LY320135 que producen efectos opuestos a los agonistas al interaccionar con los

receptores CB1.

El compuesto LY320135 es capaz de revertir la inhibición, mediada por AEA,

de la adenilato ciclasa. Su estructura es más accesible para ser modificada que

SR141716A por lo que podría ser menos tóxico que este último.

Discusión

- 181 -

Los compuestos AM251 y AM281 son estructuralmente muy parecidos a

SR141716A. Tienen la capacidad de bloquear a los receptores CB1 y producir efectos

inversos a los cannabimiméticos, aunque se han observado varias diferencias en cultivos

in vitro con tejido cardiovascular (Pertwee, 2004) y en secciones de hipocampo de rata

(Hájos y Freund, 2002; Hajos et al., 2001) respecto a los efectos de SR141716A.

Algunos artículos describen que AM251 y AM281 tienen efectos opuestos en la

señalización retrógrada estimulada eléctricamente en el Sistema Nerviosos Central.

AM281 incrementa la liberación de [3H]D-aspartato en cultivos primarios de células

granulares cerebelares e inhibe la unión basal de [35S]GTPγS, antagonizando las

respuestas de los cannabinoides liberados endógenamente (Breivogel et al., 2004;

Kreitzer y Regehr, 2001; Ohno-Shosaku et al., 2001; Wilson y Nicoll, 2001).

Tanto SR141716A como AM251 tienen la capacidad de actuar como

antagonistas neutros de CB1 a bajas concentraciones y de comportarse como agonistas

inversos con concentraciones mayores. Estos ligandos podrían, por tanto, tener dos

sitios de acción en el receptor CB1: uno que desplace a los agonistas produciendo

antagonismo y otro donde se induce un agonismo inverso, quizás debido a un

mecanismo alostérico (Sim-Selley et al., 2001).

Sin embargo, no existen trabajos que describan los efectos de estos compuestos

(AM251, AM281 y LY320135) sobre la dependencia al alcohol. Existen trabajos que

apuntan que el compuesto AM251 inhibe el desarrollo de tolerancia a los efectos

analgésicos de la morfina, lo que sugiere la implicación de los receptores CB1 en el

desarrollo y mantenimiento de la tolerancia a esta droga (Trang et al., 2007), dejando

una vía abierta a futuras investigaciones en la dependencia a otras drogas.

Otra posible terapia farmacológica sería aquella que fuera dirigida a incrementar

la degradación de endocannabinoides con el fin de restablecer sus niveles normales.

Está descrito que la administración de progesterona provoca un incremento en la

expresión tanto proteica como génica de FAAH, en linfocitos T humanos, de hasta un

270% respecto a los controles, sin afectar ni a NAPE-PLD, ni a NAT, ni al tranportador

de anandamida ni a la unión a los receptores cannabinoides. Ello provoca un descenso

en los niveles de AEA de hasta un 60% (Maccarrone et al., 2003a).

La leptina también es capaz de disminuir los niveles de AEA y 2-AG, en

linfocitos T humanos, hasta un 300% respecto a los controles mediante la activación del

Discusión

- 182 -

factor de transcripción STAT3 el cual induciría la expresión génica de FAAH

(Maccarrone et al., 2003b).

Otra posible estrategia farmacológica podría consistir en disminuir la síntesis de

endocannabinoides. En la literatura científica no está descrita la existencia de fármacos

que actúen directamente sobre las enzimas de síntesis (NAT, NAPE-PLD y DAGL). Sin

embargo, existen nuevos fármacos, como la safinamida, dirigidos a la inhibición de la

liberación de glutamato, neurotransmisor responsable de la estimulación la actividad de

la enzima NAPE-PLD.

La safinamida es una sal de metanosulfonato muy estable y soluble en agua cuya

administración está dirigida a tratar tanto la epilepsia como la fase III de la enfermedad

del Parkinson ya que se cree que podría inhibir a la monoaminooxidasa-B (MAO-B),

responsable de metabolizar y recaptar aminas como la dopamina. Está descrito que, en

ratas sometidas a tratamiento crónico de etanol, disminuye la liberación de dopamina en

el NAc lo que contribuye a la aparición de síntomas del síndrome de abstinencia

(malestar, depresión, catatonia, temblores, etc.; Diana et al., 1993; Schulteis et al.,

1995; Lal et al., 1988; Fadda y Rossetti, 1998). Dichos efectos podrían revertir con la

administración de dicho fármaco al incrementar los niveles de dopamina en dicha área.

La safinamida se concentra en mayor proporción en cerebro, donde tiene efectos

neuroprotectores, que en plasma por lo que su efecto podría ser central. No posee

efectos ni sobre el comportamiento, la función cardíaca, actividad locomotora,

cognición, función renal ni tránsito intestinal ni siquiera a dosis muy superiores a las

que se considerarían terapéuticas. Sería, por tanto, un buen candidato para el tratamiento

del alcoholismo aunque dicha hipótesis necesitaría ser confirmada.

Como corolario, los trabajos presentados en la presente tesis doctoral permiten

confirmar el papel del Sistema Endocannabinoide en el alcoholismo, así como sugerir la

necesidad de terapias experimentales basadas en la interferencia farmacológica con este

sistema de señalización.

Discusión

- 183 -

Tratamiento Diana Efecto

SR141716A CB1 Antagonista. Disminuye el consumo y las recaídas.

SR147778 CB1 Antagonista. Disminuye la

ingesta de etanol, la motivación al consumo y las recaídas.

AM251, AM281, LY320135 CB1 Antagonistas o agonistas

inversos. Posible papel supresor de AM251 en el desarrollo de tolerancia (Trang et al., 2007)

Progesterona FAAH Incremento en la expresión génica y proteica de FAAH;

disminución en los niveles de endocannabinoides.

Leptina FAAH Incremento en la expresión

génica y actividad de FAAH; disminución de los niveles de

endocannabinoides.

Safinamida NAPE-PLD

Acción central. Inhibición de la liberación de glutamato, bloqueo de los canales de Ca2+; posible papel inhibidor de la actividad

NAPE-PLD.

Tabla 2. Posibles fármacos dirigidos al tratamiento del alcoholismo, dianas del Sistema Endocannabinoide sobre las que actuarían y efectos farmacológicos.

CONCLUSIONES

Conclusiones

- 187 -

1.- La administración aguda de etanol afecta a los niveles de endocannabinoides,

existiendo especificidad tisular en dicho efecto: incrementan en hígado e intestino

delgado y disminuyen en cerebro, plasma y tejido adiposo.

2.- En cerebro, la exposición aguda a etanol disminuye los niveles de

endocannabionides (AEA, PEA) sin actuar directamente sobre los mecanismos de

síntesis y degradación de endocannabinoides aunque sí sobre otros sistemas de

neurotransmisión, como el glutamatérgico, responsable directo de la estimulación de la

actividad de la enzima de síntesis de anandamida, NAPE-PLD. Se descarta que la

respuesta al estrés, tras la administración de etanol, sea responsable de la disminución

en los niveles de endocannabinoides en las áreas cerebrales analizadas.

3.- La administración crónica de etanol genera un aumento en la expresión de enzimas

de síntesis (NAPE-PLD) y una disminución en las enzimas de degradación (FAAH), lo

que contribuiría al aumento en los niveles de endocannabinoides, previamente descritos

por otros autores. La expresión génica y proteica del receptor cannabinoide CB1 está

afectada, existiendo una especificidad en la neuroanatomía del Sistema Nervioso para

dicha alteración.

4.- La administración aguda de etanol tiene efectos opuestos sobre el Sistema

Endocannabinoide a los encontrados, y descritos previamente por otros autores, tras la

administración crónica de etanol como consecuencia de la presión adaptativa a la que se

ve sometida el organismo al estar continuamente expuesto al etanol.

5.- Los análisis bioquímicos de las líneas de roedores con preferencia alcohólica, AA y

msP, ponen de manifiesto la presencia de alteraciones en la degradación de

endocannabinoides asociadas con la preferencia y consumo del etanol.

6.- El análisis de la corteza prefrontal de la línea AA revela la existencia de una

elevación en el tono endocannabinoide acompañado por una regulación a la baja en la

densidad y transducción del receptor, cambio que no es suficientemente compensatorio

para suprimir el consumo y la preferencia por el alcohol.

Conclusiones

- 188 -

7.- El tratamiento local con el antagonista SR141716A (Rimonabant) extingue el

consumo y la preferencia al alcohol, lo que abre nuevas expectativas futuras al

tratamiento del alcoholismo con fármacos bloqueantes del Sistema Endocannabinoide

en cerebro. Los tratamientos farmacológicos dirigidos a restablecer la homeostasis

cannabinoide bien modificando al receptor cannabinoide CB1 y/o la producción o

degradación de endocannabinoides, apuntan a la implicación de una prolongada

elevación del tono endocannabinoide en las recaídas al consumo de alcohol. Los

antagonistas de CB1 (SR141716A y SR147778) han demostrado ser eficaces en

disminuir el consumo y evitar las recaídas al alcohol por lo que podrían ser candidatos

ideales en el tratamiento del alcoholismo en humanos.

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