PCR en tiempo real. Fundamentos.

Lic. Guido Fernández Marinone

2014

PCR cuantitativa

� ¿Cómo hacer para conocer la cantidad exacta de copias originales presentes en la muestra?

� ¿Qué problemas plantea este método?

Cinética de la reacción de PCR

Cinética de la reacción de PCR

Los comienzos

Los comienzos

Gráfico representativo de amplificación

� Threshold = umbral� Ct=Cq ciclo de cuantificación

“La cuantificación del ADN se debe hacer en la parte lineal de la escala logarítmica”

Aritmética Logarítmica

UMBRAL

� El punto dónde se acumula la fluorescencia en la muestra y cruza el UMBRAL se llama CICLO UMBRAL (Cq)

� El CICLO UMBRAL es inversamente proporcional al número de copias del target: a mayor concentración de target inicial, menor Cq.

UMBRAL

UMBRAL

Eficiencia de reacción� La eficiencia es máxima en la fase exponencial. Para cada par de

primer hay que probar la eficiencia que tiene que ser entre 95-105%.

¿Qué necesitamos para hacer una qPCR?

� Necesitamos un termociclador en tiempo real.

� Señal, que puede ser por intercalantes o sondas marcadas con fluorocromos.

Agentes intercalantes

� Bromuro de etidio, SYBR Green, Eva Green.

Sondas con fluorocromos� DONOR y ACEPTOR en estrecha proximidad.

� Espectro de excitación del ACEPTOR debe solapar con el espectro de emisión del DONOR

Sondas FRET

Sondas de hidrólisis (Taqman)

Molecular beacons

Comparación entre las químicas de la qPCR

Especificidad de la señal

� Esta una curva de disociación con productos específicos.

Diseño de un experimento de qPCR (S.

Deveaux; 2010)

Real-Time PCR Data Markup Language (RDML)

Cuantificación absoluta

� Curva estándar externa (ADN o ARN), se requieren idénticas eficiencias para el estándar y la muestra.

� Curva estándar externa y control interno (ADN o ARN) útil para detectar potenciales inhibidores de reacción en cada muestra. Ej: bacteriología.

� Muy difícil de reproducir, requiere un operador entrenado.

Cuantificación relativa

� Respecto a un control endógeno (ARN): el target se mide con transcriptos de al menos dos genes de referencia.

� Respecto a un gen de copia única (ADN), el target se mide en relación a un gen celular de copia única, preferiblemente ubicado en el mismo cromosoma que el target. Ej: medir número de copias de un gen.

¿Qué voy a tener en una placa de qPCR?

� Mis muestras por triplicado.

� Mis dos genes de referencia, también por triplicado.

� Un control sin templado, (un control negativos o NTC), que puede dar señal cerca del ciclo 40, no me preocupo por eso.

Elementos a tener en cuenta para una correcta cuantificación utilizando la curva cinética de

amplificación de la qPCR

� Estimación de la línea de base

� Establecimiento de la línea de cuantificación

� Determinación de la eficiencia de la amplificación

Cálculos

RQ= Ef^(Prom Cq – Prom Cq muestra)NF= media geométricaNRQ = RQ/NF

GOIeficiencia

promCq 1,93 23,92

nro muestraCq Cq DS RQ

Log trasnf

1 24,36 24,31 0,14 0,77 -0,1124,26

2 24,08 23,98 0,27 0,96 -0,0223,87

3 23,55 23,44 0,12 1,37 0,1423,33

4 23,52 23,45 0,80 1,37 0,1423,37

5 24,83 24,80 0,55 0,56 -0,2524,76

6 23,84 23,75 0,27 1,12 0,0523,66

7 23,31 23,35 0,48 1,45 0,1623,39

8 24,18 24,29 0,24 0,79 -0,1024,3923,92 23,92 0,36

GOI RG1 RG2 miR16 let7a miR16 let7a mir-122RQ RQ RQ NF NRQ NRQ M M NRQ Log transform

GOIRG1

RG2 GOI RG1RG2 GOI RG1 miR16 let7a RG2

RQ RQ RQ NF NRQ NRQ M M NRQLog

transform

0,77 1,31 0,95 0,77 1,31 0,95 1,12 1,17 0,85 0,46 -0,46 0,69 0,69 -0,16

0,96 1,25 0,76 0,96 1,25 0,76 0,97 1,28 0,78 0,72 -0,72 0,99 0,99 0,00

1,37 0,91 0,71 1,37 0,91 0,71 0,80 1,13 0,89 0,34 -0,34 1,70 1,70 0,23

1,37 2,29 2,06 1,37 2,29 2,06 2,17 1,05 0,95 0,15 -0,15 0,63 0,63 -0,20

0,56 2,35 2,02 0,56 2,35 2,02 2,18 1,08 0,93 0,22 -0,22 0,26 0,26 -0,59

1,12 0,74 0,78 1,12 0,74 0,78 0,76 0,97 1,03 -0,08 0,08 1,47 1,47 0,17

1,45 0,33 1,30 1,45 0,33 1,30 0,65 0,51 1,98 -1,97 1,97 2,22 2,21 0,35

0,79 0,51 0,46 0,79 0,51 0,46 0,49 1,06 0,95 0,16 -0,16 1,61 1,61 0,21

1,03 1,04 0,00 0,000,23 0,39 0,83 0,83

22,5036,9

2 prom cont 1,00 1,00

coeficiente de variacion

M promedio DS 0,49

29,71 % 0,83prom trat 1,39

menor 25%menor 0.5 DS 0,82

Libro recomendado de consulta

Diagnóstico

� Identificación de tumores resistente mediante su expresión génica.

� Identificación de enfermedades prenatales monogénicas causadas por cambios en un nucleótido.

Microbiología

� Brinda un rápido diagnóstico.

� Examinación de susceptibilidad a antibióticos.

� Detección de genes bacterianos específicos.

� Detección de mutaciones.

� Tipificación vírica mediante sondas secuencia-específicas.

� Medición de carga viral (ROCHE, sondas de hidólisis).

qPCR: troubleshooting

� Los problemas en la qPCR comienzan desde la extracción del material.

� Para extraer el ARN limpiar las mesadas con EtOH 70%, al igual que el material. Si se tiene RNAse away o RNAse Zap mejor.

� Chequear la pureza mediante la absorbancia(260, 280, 230) e integridad mediante gel de agarosa.

� La pureza se puede mejorar mediante kits a base de columnas (pero el rendimiento baja).

qPCR: troubleshooting: integridad

� Tratar cuba electroforética con NaOH 0,5 M por ½ - 1 hora

� Usar agua miliQ para preparación de buffer y muestras. Siempre esterilizo el agua miliQ, de histérico nomás.

� NO reutilizar el buffer.

� Separar reactivos exclusivamente para ARN (agarosa, gelred, Loading Buffer).

� Tener un juego de pipetas exclusivo para molecular en lo posible.

� Es el paso que más variabilidad trae. Gran cantidad de pasos con pipetas que aumentan el error, el iScript (BioRad) es un buen kit para disminuir todo eso.

qPCR: troubleshooting: la RT

� Se recomiendan hacer triplicados (tanto de las muestras como de los genes de referencia), pero aún así cada placa es un mundo.

� Cq elevadísimos!!!! La desviación estándar por las nubes…

qPCR: troubleshooting: la qPCR

� ARN realmente íntegro?

� Problema en la qPCR?? Usar un control

� Problema en la RT? Pueden ser las enzimas.

� Lámpara de excitación o el intercalante??

qPCR: troubleshooting: la qPCR

� Mucho SYBR

qPCR: troubleshooting: la qPCR

� Dímero de primer: cambiar la temperatura de annealing, rever la concentración y si nada de esto funciona…hacer nuevos.

qPCR: troubleshooting: la qPCR

qPCR: troubleshooting: la qPCR

� No tengo reacción, puede ser por los GUANTES o…

� El NTC da señales en Cq bajos, dímeros de primers o contaminación.

• Lidiar con las contaminaciones:

• Usar DNAsa previo a la RT.

• Juego de pipetas exclusivo (cuando se pueda).

• Gel agarosa en sala aparte (cuando se pueda).

• Alicuotar reactivos.

• Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para

cada gen.

qPCR: troubleshooting: la qPCR

Nomenclatura según MIQE (2009)� qPCR: no RT-PCR, queda confinada a

retrotranscripción.� Reference genes: genes de referencia, no

housekeeping gene.� Taqman probes: hydrolisys probes� FRET probe (flouresence resonance energy transfer

probes): es muy genérico, especificar cuales se están usando.

� Cq: quantification (y no quantitation) cycle y no se recomienda el uso de Ct.

� Hay una lista disponible on-line de datos esenciales para poner en la publicación y de otros que son deseables según MIQE (MinimumInformation for publication of Quantitative real-time Experiments).

Item to check

Importance

Experimental design

Definition of experimental and control groups E Muestras de hígado en 2 grupos, control y tratamiento

Number within each group E 4

Assay carried out by the core or investigator’s laboratory? D Llevado a cabo en nuestro laboratorio

Acknowledgment of authors’ contributions D

Sample

Description E Murciélagos con diferentes dietas (D. rotundus, T. brasiliensis, S. lilium, A. literatus)

Volume/mass of sample processed D 50mg

Microdissection or macrodissection E Extracción de los órganos

Processing procedure E Los murciélagos fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal ketamina (100 mg/kg ) / xilazina (3 mg/kg) y sacrificados por exceso de anestesia. Los órganos son aislados y lavados con solución salina.

If frozen, how and how quickly? E Las muestras son almacenadas en RNAlater, por una noche a 4ºC y luego colocados a -20ºC

If fixed, with what and how quickly? E No

Sample storage conditions and duration E Almacenadas a -20ºC hasta la extracción de ácidos nuecleicos

Nucleic acid extraction

Procedure and/or instrumentation E

El ARN total fue extraído usando el kit Pure link (Ambion) siguiendo los protocolos del

fabricante. La homogeneización fue llevada a cabo en eppendorfs, extrayendo

previamente el ARNlater. El ARN purificado fue disuelto en 35ul de agua libe de

nucleasa y almacenado a -20ºC.

Name of kit and details of any modifications E Pure link (Ambion). Sin modificaciones.

Source of additional reagents used D Agua tratada con DEPC (Sigma)

Details of DNase or RNase treatment E1 ug de ARN es tratada con con 1 U of Turbo DNA free (Ambion) en un volumen final de reacción de 50ul. La digestión del ADN es lograda con una incubación de 1h a 37ºC. La reacción es parada con una solución inhibidora, DNase Inactivation Agent (Ambion) siguiendo una

incubación de 3min, posterior centrifugación.

Contamination assessment (DNA or RNA) E

Controles negativos para la RT fueron llevados a cabo. Para ese propósito el ARN fue

procesado como una muestra normal, excepto que no se agrego transcriptasa

reversa.

Nucleic acid quantification E La concetración de ARN, fue medida a 260nm

Instrument and method E Espectofotómetro AQ7 (Ampliquant)

Purity (A260/A280) D La pureza de ARN fue obtenida mediante la relación 260/280.

Yeld D El rendimiento del ARN fue calculado como ug/ul.

RNA integrity: method/instrument E La integridad del ARN fue medida a través de un gel de agarosa (Genbiotech) al 1%, en buffer TBE 1X, visualizado con gelred en transiluminador

RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts E

Electrophoresis traces D

Inhibition testing (Cq dilutions, spike, or other) E Las curvas estándar utilizando muestras de cDNA a estudiar se considerò prueba para evaluar la presencia de inhibidores

Reverse transcription

Complete reaction conditions ETranscripción reversa: se colocó 1ug de ARN en un volumen final de 16ul, se le agregan 4ul de iScript (Biorad)quedando un volumen final de 20ul. Esta muestra es calentada 5min a 25ºC, luego 30min a 42ºC y por último 5min a 85ºC para inactivar. En este paso también se utiliza el

control negativo.

Amount of RNA and reaction volume E Cantidad de ARN 1ug, volumen de reacción: 20ul

Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration E Oligo dt y random primers

Reverse transcriptase and concentration E iScript (Ambion)

Temperature and time E En complete reaction conditions

Manufacturer of reagents and catalogue numbers D Turbo Dnase free (Ambion Cat.AM1907); iScript (Biorad Cat. 170-8890)

Cqs with and without reverse transcription DSe controló la eficiencia con una PCR de punto final, en un totoal de 30 ciclos.Luego se realizó un gel de agarosa

al 2,5%

Storage conditions of cDNA D -20°C

qPCR TARGET INFORMATION

Gene symbol E Gen de interes:MDR1; Gen de referencia: Eef1a1, y b actina

Sequence accession number E M33581, NM010106

Location of amplicon D

Amplicon length E Gen de interés: 120 pb ; Gen de referencia: 77, y 60 pb

In silico specificity screen (BLAST, etc) E

Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs? D

Sequence alignment D

Secondary structure analysis of amplicon D

Location of each primer by exon or intron (if applicable) E

What splice variants are targeted? E

qPCR OLIGONUCLEOTIDES

Primer sequences EActina: Forward: TGCGTGACATCAAGGAGAAG; Reverse: CGGATGTCCACATCACACTT; MDR1 FW:: CTGAGACAGGATGTGAGCTG, Reverse primer 5´a 3´: AATCACAGCAAGCCTAGACC; Eef1a1; Forward primer 5´a 3´: CTGAACCATCCAGGCCAAAT, Reverse primer 5´a 3´:

GGCTGTGTGACAATCCAG

RTPrimerDB Identification Number D

Probe sequences D

Location and identity of any modifications E

Manufacturer of oligonucleotides D

Purification method D

qPCR protocol

Complete reaction conditions E

Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador Applied Biosystem 7500, usando SYBR Green Super Mix

(AB) en un volumen final de 25ul. La mix de reacción consisitió en 12,5ul de SYBR mix, 2,5ul agua libre de nucleasa, 2,5ul

de cada par de cebadores (forward and reverse) con una concetración 2.5 uM, y 5 ul de 1/50 cDNA. La PCR fue iniciado

con 2min incubación a 50°C, seguido por una etapa de 95°C por 10 seg, continuaron 40 ciclos de 15seg a 95ºC, 60°C por

1min y 72°C por 40 seg. Todas las reacciones fueron llevadas a cabo por triplicado.

Reaction volume and amount of cDNA/DNA E Complete reaction conditions

Primer, (probe), Mg2, and dNTP concentrations E Complete reaction conditions

Polymerase identity and concentration E Complete reaction conditions

Buffer/kit identity and manufacturer E Complete reaction conditions

Exact chemical composition of the buffer D

Additives (SYBR Green I, DMSO, and so forth) E Complete reaction conditions

Manufacturer of plates/tubes and catalog number D Placas de PCR de 96 wells y flims opti well ambos provistos por Applied Biosystem

Complete thermocycling parameters E Complete reaction conditions

Reaction setup (manual/robotic) D Manual

Manufacturer of qPCR instrument D Applied Biosystem 7500

qPCR validation

Evidence of optimization (from gradients) D

Specificity (gel, sequence, melt, or digest) E

Curva de melting, las medidas de fluorescencia son medidas continuamente. La especificidad del gen fue confirmada con

la presencia de una sola banda en un gel de agarosa al 2,5% teñido con gelred. Controles sin templado (NTC) son

llevados a cabo.

For SYBR Green I, Cq of the NTC E L a señal fue en un Cq mayor a 36,9.

Calibration curves with slope and y intercept E MDR1: y= -3.42X + 32,65

PCR efficiency calculated from slope E MDR1: 95,56

CIs for PCR efficiency or SE D

r2 of calibration curve E MDR1: 0.996

Linear dynamic range E

Se realizaron 5 diluciones seríadas por triplicado del gen de inte´res y de los de referencia. Eea1f1 cq:20 ; b- actina Cq:

21; MDR1 Cq: 19

Cq variation at LOD E

CIs throughout range D

Evidence for LOD E

If multiplex, efficiency and LOD of each assay E

Data analysis

qPCR analysis program (source, version) E Excel 2007. Office 2007

Method of Cq determination E7500 System SDS software

Outlier identification and disposition E SD: 0,13

Results for NTCs E

Justification of number and choice of reference genes E 2 genes de referencia, b-actina y Eef1a

Description of normalization method E Utilización de 2 genes de referencia

Number and concordance of biological replicates D

Number and stage (reverse transcription or qPCR) of technical replicates E Las muestras fueron realizadas por triplicado

Repeatability (intraassay variation) E

Reproducibility (interassay variation, CV) D SD: 0,05

Power analysis D

Statistical methods for results significance E Student t

Software (source, version) E Systat 12

Cq or raw data submission with RDML D No lo he hecho

¡Gracias por su atención!