PCR 法による Entamoeba complex の高感度検出―高解像度融解曲線（PCR-HRM）解析と各種 PCR法の比較検討―

戸田　圭三 1) 中島　和希 1)

1) 兵庫県立尼崎総合医療センター検査部（〒 660-8550　兵庫県尼崎市東難波町 2-17-77） 

要 旨

5類感染症に分類される Entamoeba histolyticaは，非病原種である E. dispar，E. moshkovskiiと鑑別する必要があるが，顕微鏡検査では難しい。しかし，PCR法は E. histolyticaを特異的・高感度に検出することが可能で，その技術は従来の PCRからリアルタイム PCRに推移している。今回，我々はリアルタイム PCRを更に展開させた PCR-HRM解析を用いて Entamoeba complexの高感度検出を検討し，今まで数多く報告されているマルチプレックス PCR，アレル特異的 PCR，アレル特異的リアルタイム PCR，2段階リアルタイム PCRと比較した。その結果，増幅産物のサイズが大きくなると PCRの増幅効率が低下するため，マルチプレックス PCRの検出感度は他法より劣った。一方，増幅産物のサイズを小さくすると，何れの PCR法でも十分な検出感度が得られ，コンタミネーションの危険性を冒してまで 2段階 PCRを行う必要は無かった。PCR-HRM解析とリアルタイム PCRは，リアルタイム PCR装置を使用するため反応チューブの蓋を開ける必要が無い。そのため，コンタミネーションの危険性が非常に低く，結果報告時間も短縮できた。更に PCR-HRM解析は 1本のチューブで検査できるためランニングコストが安価で，Entamoeba complex 3種以外の種も検出できる優れた方法である。

キーワード 赤痢アメーバ，Entamoeba complex，HRM解析，リアルタイム PCR，small subunit rRNA

I　はじめに

5類感染症に分類されるアメーバ赤痢は，感染症法に基づく年間届出数が増加し，国立感染症研究所の報告によると 2007年からの約 10年間に 9,301例の発生報告があった。そして，全体の 49%が感染経路不明で，次いで性的接触 29%，生食などによる経口感染が 22%であった。診断は Entamoeba histolyticaの存在を証明することが望ましいが，顕微鏡によるアメーバ検出例が 9,301 例中 7,549 例，抗体検査2,500例，そして遺伝子検査によるものがわずか 108例であった。顕微鏡を用いた検査法は特別な装置が必要なく，

ランニングコストも安価であるため広く普及している。他の検査法と比較した検出感度の優劣は，報告 1 ), 2 )によって隔たりがあり，検査者の経験と知識が検査結果に大きく影響する。また，形態では病原性を有する E. histolyticaと，非病原種でヒトからの検出率が高い E. disparや，自由生活性で病原性が未確定の E. moshkovskii 3 )を鑑別できない問題がある。それに対して PCR（polymerase chain reaction）検査は，それらを同定することが可能で，最終診断として価値が高いとする報告もある 4 ), 5 )。そのため，設備の整った施設では遺伝子検査を併用し，WHO（WorldHealth Organization）はアメーバ赤痢の検査法としてPCR法を推奨している。

（2020年 11月 24日受付・2021年 2月 28日受理）© 2021 Japanese Association of Medical Technologists

技術論文 医学検査 Vol.70 No.3 (2021)  pp. 465–474 DOI: 10.14932/jamt.20-121

465

アメーバ赤痢の PCR検査は幾つかの種類があり，1本のチューブに複数本の種特異的なプライマーをミックスして PCRを行い，その PCR産物を電気泳動して特異バンドを確認するマルチプレックスPCR法 6 )～ 8 )（Multiplex PCR；M-PCR法），種特異的PCRを個別に行い，各 PCR産物を電気泳動で確認するアレル特異的 PCR法（conventional allele specificPCR；C-AS-PCR 法） 9 )，種特異的 PCR を個別に行

い，その増幅経過を SYBA Greenで測定するアレル特異的リアルタイム PCR法（allele specific real timePCR；RT-PCR法） 10 ), 11 )，1段階目の PCRを行い，その増幅産物の一部を用いて，再び RT-PCR法を行う2段階 RT-PCR法（nested-RT-PCR法）などがある。そして，今回は EVA Greenをインターカレーターとして PCRを行い，その PCR産物の融解曲線データを専用の解析ツールで分析する高解像度融解曲線解

E. histolytica gene for small subunit ribosomal RNATATCTGGTTGATCCTGCCAGTATTATATGCTGATGTTAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAAGACCAAGTAGGATGAAACTGCGGACGGCTCATTATAACAGTAATAGTTTCTTTGGTTAGTAAAATACAAGGATAGCTTTGTGAATGATAAAGATAATACTTGAGACGATCCAGTTTGTATTAGTACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGTATCGAGGACTACCAAGATTATAACGGATAACGAGGAATTGGGGTTCGACATCGGAGAGGGAGCTTTACAGATGGCTACCACTTCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCACTTTCGAATTGAAGAGGTAGTGACGACACATAACTCTAGAGTTGAGTAAAATCAATTCTTGAAGGAATGAGTAGGAGGTAAATTCTCCTACGAAATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGTGTATATTAAAGTTGCTGTGATTAAAACGCTCGTAGTTGAATTAAAATGTGGTTTTATACATTTTGAAGACTTTATGTAAGTAAAGTTTCTAGAAATGTTAAATTAAAATCAAAGAAGGAAACAATTCAAGTAATTGAGTTGTTATTACTTTGAATAAAATAAGGTGTTTAAAGCAAAACATTATGTTAATGAATATTCAAGCATGGGACAATGCTGAGGGGATGTCAATAAGACATTTCGAGAGAAGGATTAAAAGGAACAATTGGGGTGATTCAGAAAATAACGGGAGAGGTGAAAATCCATG

Mult-forwardATCGCTATAAGATGCACGAGAGCGAAAGCATTTCACTCAACTGTGTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACTATAAACGATGTCAACCAAGGATTGGATGAAATTCAGATGTACAAAGATAGAGAAGCATTGTTTCTAGATC

Mult-histoly�ca-reverseTGAGTATATCAATATTACCTTGTTCAGAACTTAAAGAGAAATCTTGAGTTTATGGACTTCAGGGGGAGTATGGTCACAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAAGACCGAACAGTAGAAGGAATGACAGATTAAGAGTTCTTTCATGATTTATTGGGTAGTGGTGCAGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCAGGTTAATTCCGGTAACGAACGAGACTGAAACCTATTAATTAGTTTTCTGCCTATAAGACAGAAATGTTCGCAAGAACAGGTGCGTAAGTACCACTTCTTAAAGGGACACATTTCAATTGTCCTATTTTAATTGTAGTTATCTAATTTCGGTTAGACCTCTTTTAACGTGGGAAAAAGAAAAAGGAAGCATTCAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACATCTTGGGCCGCACGCGCGCTACAATGGAGTTACTAGAGAGTATTTTATCATT

Ent-forward PCR-HRM-forwardTACACCTTATTTATTAGGCTTTGTCTAATAATTAAGGATAGTAAGTGGTGTACCGAGATTGAAATAGTTAAGGAAAACTCAAAAGAACG

E.histolytica-reverse PCR-HRM-reverse

TACATGACAGGGATAAATGATTGGAATTATTTGTTTTGAACGAGGAATTCCTTGTAATATCGAGTCATTAACTCGAGATGAATACGTCC1stPCR-reverse

CTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATAAAGAGGTGAAATTCTAGGATTCTGTCTTATAGATAGAAAAATGGATTTAAATCTCCTTATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA

E. dispar genes for small subunit ribosomal RNATATCTGGTTGATCCTGCCAGTATTATATGCTGATGTTAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAAGACCAAGTAGGATGAAACTGCGGACGGCTCATTATAACAGTAATAGTTTCTTTGGTTAGTAAAGTACAAGGATAGCTTTGTGAATGATAAAGATAATACTTGAGACGATCCAATTTGTATTAGTACAAAGTGGCCAATTTATGTAAGTAAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGTATCGAGGACTACCAAGATTATAACGGATAACGAGGAATTGGGGTTCGACATCGGAGAGGGAGCTTTACAGATGGCTACCACTTCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCACTTTCGAATTGAAGAGGTAGTGACGACACATAACTCTAGAGTTGAGTAAAATCAATTCTTGAAGGAATGAGTAGGAGGTAAATTCTCCTACGAAATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGTGTATATTAAAGTTGCTGTGATTAAAACGCTCGTAGTTGAATTAAAATGTGATTTTATACATTTTGAAGACTTTACATTAAGTGAAGTTTCTAGAAATGTTAAATTAAAATCAAAGAAGGAGACAATTCAAGTAATTGAGTTGTCATTACTTTGAATAAAATAAGGTGTTTAAAGCAAAACATTAAGAGGTGAAAATCCATGATCGCTATAAGATGCACGAGAGCGAAAGCATTTCACTCAACTGTGTTAATGAATATTCAAGCATGGGACAATGCTGAGGAGATGTCAATTAGACATTTCGAGAGAAGGATTAAAAGGAACAATTGGGGTGATTCAGAAAATAACGGGGGTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATC

Mult-forwardGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACTATAAACGATGTCAACCAAGGATTGGATGAAATTCAGATGTACAAAGATGAAGAAACATTGTTTCTAAATCCAAGTATATCAATACTACCTTGTTCAGAACTTAAAGAGAAATCTTGAGTTTATGGACTTCAGGGGGAGTATGGTCACAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAAGACCGAACAGTAGAAGGAATGACAGATTAAGAGTTCTTTCATGATTTATTGGGTAGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCAGGTTAATTCCGGTAACGAACGAGACTGAAACCTATTAATTAGTTTTCTGCCTATAAGACAGAAATGTTCGCAAGAACAGGTGCGTAAGTACCACTTCTTAAAGGGACACATTTCAATTGTCCTATTTTAATTGTTAGTTATCTAATTTCGATTAGAACTCTTTTAACGTGGAAAAAGAAAAAGGAAGCATTCAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACATCTTGGGCCGCACGCGCGCTACAATGGAGTTACTA

Ent-forward PCR-HRM-forwardGGAGAGCATTTTATACACCTTATTTATTAGGCTATGTCTAATAGGTAGGGATAGTAAGTGGTGTACCGAGATTGAAATAGTTAAGGAA

E.dispar-reverse and Mult-dispr-reverseAACTCAAAAGAACGTACATGACAGGGATAAATGATTGGAATTATTTGTTTTGAACGAGGAATTCCTTGTAATATCGAGTCATTAACTC

PCR-HRM-reverse 1stPCR-reverseGAGATGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATAAAGAGGTGAAATTCTAGGATTCTGTCTTATAGATAGAAAAATGGATTTAAATCTCCTTATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA

医学検査 Vol.70 No.3 (2021) 

466

析（high resolution melt analysis；PCR-HRM解析）を加えた計 5法で，Entamoeba complex（E. histolytica,E. dispar, E. moshkovskii）の高感度検出を試みた。

II　材料および方法

1．供試検体1）人工遺伝子合成プラスミド

GenBank に 登 録 さ れ て い る E. histolytica

（MH882419），E. dispar（Z49256），E. moshkovskii（AF149906）の Small subunit ribosomal RNA（SSUrRNA）塩基配列を基に，Figure 1の赤字斜体で示した DNA配列を人工合成し，各々 pEX-A2J2ベクターに組み込んだ 3種類のプラスミド作製を委託した（Eurofins Genomics社）。それらプラスミドは，陽性コントロールや PCR-HRM解析のリファレンス曲線作成に用いたり，滅菌精製水で希釈系列を作成して

E. moshkovskii gene for small subunit ribosomal RNA TATCTGGTTGATCCTGCCAGTATTATATGCTGATGTTAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAAGACCAAGTAGGATGAAACTGCGGACGGCTCATTATAACAGTAATAGTTTCTTTGGTTAGTAAAGTACAAGGATAGCTTTGTGAATGATAAAGATAATACTTGAGACGATCCGGTTTGTATTAGTACAAGTCGGCCACTCTCTTCACGGGGAGTGCGAATGCCATTCTGAATTGAATAAGGATGGTATGACAATTGTAGAGCACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATTTGTTGGTAGTATCGAGGACTACCAAGATTATAACGGATAACGAGGAATTGGGGTTCGACATCGGAGAGGGAGCTTTACAGATGGCTACCACTTCTACGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCACTTTCGACGTGAAGAGGTAGTGACGACAAATAACTCTCGAGGTGGTTAACTCCACTTCTTGAAGGAATGAGTAAGAAGTAAATACTCTTACGAAATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGTGTATATTAAAGTTGCTGTGATTAAAACGCTCGTAGTTGAATAATAAGGTGGTTTTAATCATTTTGAAGGCTTAGCGCAAGCTAAGTTTCTAGGAATGAGGTAATGAAACTAACGAAGGAGATGAAGTGAGTAATCACTTTATCATTACTTTGAATAAAATAGAGTGTTTAAAGCAAAACATTAAGTTAATGAATATTCAAGCATGGGACAATGCTGAGGGGATGTCTTCGGACATTTCGAGAGAAGGATTAAAAGGAACAATTGGGGTGATTCAGAAAATAACGGGAGA

Mult-forwardGGTGAAATTCCATGATCGCTATAAGATGCACGAGAGCGAAAGCATTTCACTCAACTGGGTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACTATAAACGATGTCAACCAAGGATTGGATGAAATAAAGAAATTCGCGGATGAAGAAACATTGTTTCGGAAACCAAGAGTTTCACAACTACCTTGTTCAGAACTTAAAGAGAAATCTCGAGTTTATGGACTTCAGGGGGAGTATGGTCACAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAAGACCGAACAGTAGAAGGAATGACAGATTAAGAGTTCTTTCATGATTTATTGGGTAGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCAGGTTAATTCCGGTAACGAACGAGACTGAAACCTATTAATTAGTTTCCTGCCTATACGACAGGAATCTCCGCAAGGTCAGGTGCCTCGGTACCACTTCTTAAAGGGACACATTTCAATTGTCTCATTTTAATCGATGTCTCTGGCTCCGGTCAGAACTCTTT

Mult-moshkovskii-reverseTAACGTGAGAAAAAGAAAAAGGAAGCATTCAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACATCTTGGGCCGCACGCGCGCTACAAT

Ent-forward PCR-HRM-forwardGGAGTTACTAGAGAGTATTTTATCATCCAAGCCTTATATTGTAGACTTTGTTTATAATGTAGGGATATTGGGTGATGTACCTAAATTG

E.moshkovskii-reverseAAATAGTTAAGGAAAACTCAAAAGAACGTACATGACAGGGATAAATGATTGGAATTATTTGTTTTGAACGAGGAATTCCTTGTAAT

PCR-HRM-reverse 1stPCR-reverseATCGAGTCATCAACTCGAGATGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATAAAGAGGTGAAATTCTAGGATCTTGCTCTTCGGAGTGGGAAAATGGATTTAAATCTCCTTATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA

※上記のSmall subunit ribosomal RNA塩基配列の内，黒字下線は各種プライマー領域，赤字斜体は人工遺伝子合成領域を示す。

【使用プライマーの塩基配列】●●

●

PCR-HRM-forward 5’-cgc gct aca atg gag tta cta-3’Ent-forward 5’-tga tgc cct tag aca tct tg-3’E. histolytica-reverse 5’-ggt aca cca ctt act atc ctt aat-3’E. moshkovskii-reverse 5’-ttt caa ttt agg tac atc acc c-3’Mult-forward 5’-ggt gat tca gaa aat aac ggg-3’Mult-dispar-reverse:5’-cac cac tta cta tcc cta cc-3’

PCR-HRM-reverse 5’-ccc tgt cat gta cgt tct ttt g-3’1stPCR-reverse: 5’-gga att cct cgt tca aaa ca-3’E. dispar-reverse 5’-cac cac tta cta tcc cta cc-3’

Mult-histolytica-reverse:5’-gat cta gaa aca atg ctt ctc t-3’Mult-moshkovskii-reverse 5’-tga ccg gag cca gag aca t-3’

Figure 1 各種 PCR に用いたプライマー設定領域および人工遺伝子合成領域（1）PCR-HRM解析用として，Entamoeba SSU rRNA保存領域内に PCR-HRM-forwardと PCR-HRM-reverseのプライマーセットを設定し PCRを行った。プライマーは Entamoeba属内の多くの種に共通で，PCRで 141 bpの増幅産物が合成される。（2）C-AS-PCR用として，Entamoeba complexに共通の Ent-forwardプライマーと，可変領域に種特異的な E. histolytica-reverse，E.dispar-reverse，E. moshkovskii-reverseプライマーを設定して PCRを行った。その結果 E. histolytica 122 bp，E. dispar 118 bp，E. moshkovskii 128 bpの PCR増幅産物を認める。（3）RT-PCRは，上記の C-AS-PCRと同じプライマーセットを用いた。そして，RT-PCRで PCR産物が対数増幅し，融解曲線において陽性コントロールと同じ Tm（melting temperature）値を認めた検体を陽性とした。（4）nested-RT-PCRを行うために，前記の C-AS-PCRで用いた Ent-forwardプライマーと，その約 850 bp下流の Entamoeba SSU rRNA保存領域内に 1stPCR-reverseプライマーを設定して 1段階目の PCRを行った。更にその増幅産物の一部を用いて，2段階目の RT-PCRを行った。（5）M-PCR用として，Entamoeba complex共通のMult-forwardプライマー1種類と，Zulhainanら 9 )が報告した種特異的な Mult-histolytica-reverse，Mult-dispar-reverse，Mult-moshkovskii-reverseプライマー 3種類の計 4種類をミックスして PCRを行った。その結果，E. histolyticaは 217 bp，E. disparが 738 bp，E. moshkovskiiでは 629 bpの陽性バンドが検出される。（6）赤色斜体で示した塩基配列どおりに DNAを人工合成し，それを pEX-A2J2ベクターに組み込んでプラスミドを作成した。この 3種類のプラスミドを陽性コントロールとして用い，各種 PCRの特異性と検出感度の検討を行った。

戸田 他「HRM解析による Entamoeba complexの高感度検出」

467

各種 PCR法の最低検出コピー数の検討に用いたりした。2）患者検体からの DNA 抽出

E. histolytica陽性患者便から，QIAamp DNA StoolMini Kit（キアゲン社）を用いて，試薬メーカーの指示通りに DNAを抽出した。同様に E. dispar陽性患者便からもDNAを抽出し，使用時まで−30℃で保存した。そして，この 2種類の抽出 DNAから滅菌精製水で希釈系列を作製し，最低検出感度の検討を行った。尚，患者検体を PCR検査するにあたり，検査対象

をアメーバのみとし，検体には個人情報を全く含まないため，本研究は当院倫理委員会の対象にならなかった。

2．高解像度融解曲線（PCR-HRM）解析1）使用プライマー使用プライマーの塩基配列を Figure 1に示した。

PCR-HRM-forward と PCR-HRM-reverse プライマーセットを Entamoeba SSU rRNA保存領域に設定し，Entamoeba complexに共通で 141 bpの PCR産物が合成される。2）PCR 反応および融解曲線反応液は KAPA HRM FAST Master Mix（日本ジェ

ネティクス社）10.0 μL，25 μM MgCl2 2.0 μL，各 10μMプライマー 0.6 μL，精製水 4.4 μL，テンプレートDNA 3.0 μLの計 20 μLとした。これを CFX96 Touchサーマルサイクラー（Bio-Rad社）を用いて 95℃ 2分のインキュベーション後，95℃ 5秒 60℃ 20秒のプログラムを 45サイクル行った。続いて融解曲線を得るために 95℃ 1分，70℃ 1分のインキュベーション後，0.2℃間隔 10秒間の plate readで，70℃から95℃まで連続上昇した融解曲線データを取得した。3）HRM 解析得られた融解曲線データを Precision Melt Analysis

ソフトウェア（Bio-Rad社）で精密解析した。そして，事前に作成した 3種類の Entamoeba complexリファレンス曲線と被検体の融解曲線を同時に解析し，クラスター分類することによって種を同定した。

3．アレル特異的 PCR 法（C-AS-PCR 法）1）使用プライマー使用プライマーを Figure 1に示した。Entamoeba

complex に共通の Ent-forward プライマーと，SSUrRNA可変領域に種特異的な E. histolytica-reverse，E.dispar-reverse，E. moshkovskii-reverseプライマー 3種類を設定し，種特異的プライマーセットを計 3組作成した。2）PCR 反応反応液は Ampli Taq Gold 360 master mix（Applied

Biosystems社）10 μL，各 10 μMプライマーセット0.6 μL，精製水 6.4 μL，テンプレート DNA 3.0 μLの計 20 μLとした。これを ProFlex PCR Systemサーマルサイクラー（Applied Biosystems社）を用いて 95℃10分間のホットスタート後，95℃ 20秒 58℃ 30秒 72℃ 60秒のプログラムを 45サイクル行い，最後に72℃ 7分間の伸長反応を行った。3）判定

PCR産物 8 μLに 5倍濃度 loading buffer 2 μLを加え，3%アガロースゲル電気泳動を行った。そしてE. histolytica 122 bp，E. dispar 118 bp，E. moshkovskii128 bpの特異バンドが確認されたものを陽性とした（Figure 2）。

4．アレル特異的リアルタイム PCR 法（RT-PCR 法）1）使用プライマー前述の C-AS-PCR法と同じ，種特異的な 3組のプライマーセットを使用した。2）RT-PCR 反応反応液は Sso Advanced Universal SYBR Green

Supermix（Bio-Rad社）10 μL，各 10 μMプライマーセット 0.6 μL，精製水 6.4 μL，テンプレート DNA 3.0μLの計 20 μLとした。これを CFX96 Touchを用いて98℃ 2分のインキュベーション後，95℃ 5秒 60℃15秒のプログラムを 45サイクル行った。3）判定

PCR増幅曲線で対数増幅を認め，融解曲線でリファレンス検体と Tm（melting temperature）値が同じ検体を陽性とした。

5．2 段階 PCR 法（nested-RT-PCR 法）1）使用プライマー使用プライマーを Figure 1に示した。C-AS-PCR

法で用いた Ent-forwardプライマーと，その約 850 bp下流の保存領域に設定した 1stPCR-reverse プライマーの汎用セットで 1段階目の PCRを行い，その

医学検査 Vol.70 No.3 (2021) 

468

PCR産物の一部をテンプレートとして 2段階目のRT-PCRを行った。2）Nested-RT-PCR 反応

1 段階目の PCR 反応液は AmpliTaq Gold 360master mix 10 μL，各 10 μM プライマーセット 0.6μL，精製水 6.4 μL，テンプレート DNA 3.0 μLの計20 μLとした。これを ProFlex PCR Systemサーマルサイクラーを用いて 95℃ 10分間のホットスタート後，95℃ 30秒 58℃ 30秒 72℃ 60秒のプログラムを 30サイクル行い，最後に 72℃ 7分間の伸長反応を行った。2段階目の PCR反応液は Sso AdvancedUniversal SYBR Green Supermix 10 μL，各 10 μMプライマーセット 0.6 μL，精製水 8.4 μLに 1段階目のPCR産物 1.0 μLを加えて計 20 μLとし，45サイクルの RT-PCR法を行った。3）判定

RT-PCR法と同様の判定を行った。

6．マルチプレックス PCR 法（M-PCR 法）1）使用プライマー使用プライマーは Figure 1 に示したとおりで，

Entamoeba complex共通のMult-forwardプライマー 1種類と，Zulhainanら 9 )が報告した種特異的な Mult-

histolytica-reverse ， Mult-dispar-reverse ， Mult-moshkovskii-reverseプライマー 3種類の計 4種類を，各 10 μMの濃度に調整・混和して M-PCR用プライマーミックスとした。2）反応液反応液組成は AmpliTaq Gold 360 master mix 10

μL，各 10 μMプライマーミックス 0.6 μL，精製水6.4 μL，テンプレート DNA 3.0 μLの計 20 μLとした。これを ProFlex PCR Systemサーマルサイクラーを用いて 95℃ 10分間のホットスタート後，95℃ 30秒 58℃ 30秒 72℃ 90秒のプログラムを 45サイクル行い，最後に 72℃ 7分間の伸長反応を行った。3）判定

PCR増幅産物 8 μLに 5倍濃度 loading buffer 2 μL加え，3%アガロースゲル電気泳動を行った。そして，E. histolytica 217 bp，E. dispar 738 bpの特異バンドが確認された検体を陽性とした。但し E.moshkovskii陽性検体が入手できなかったため，629bpと思われる E. moshkovskiiの陽性バンドは確認できなかった（Figure 3）。

E. histolytica特異的C-AS-PCR

E. dispar (+) E. moshkovskii (+)

200 bp→100 bp→

E. dispar (−)E. moshkovskii (−)

E. histolytica (+)

E. dispar特異的C-AS-PCR

E. moshkovskii特異的C-AS-PCR

A B C

Figure 2 人工遺伝子合成プラスミドを陽性コントロールとした 3 種類の C-AS-PCR 法A：3種類の人工遺伝子合成プラスミドを検体として E. histolyticaに特異的な C-AS-PCRを行い，その PCR産物を 3%アガロースゲル電気泳動した。レーン左側より 100 bpラダー，122 bpの E. histolytica陽性バンド，E. dispar陰性，E. moshkovskii陰性が確認された。B：同様に E. disparに特異的な C-AS-PCRで 118 bpの E. dispar 陽性バンドを認めた。C：E.moshkovskiiに特異的な C-AS-PCRでは，128 bpの E. moshkovskii 陽性バンドを認めた。

戸田 他「HRM解析による Entamoeba complexの高感度検出」

469

III　結 果

1．PCR-HRM 解析用リファレンス曲線の作製3種類（E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii）の

人工遺伝子合成プラスミドを，それぞれ 104，106，108 copy/μLの 3濃度に調整し，それらをテンプレート DNAとして，Eva Greenをインターカレーターとした PCRを行った。その時の Ct（threshold cycle）値は，12.3から 30.2サイクルで，良好な対数増幅を認める増幅産物が得られた（Figure 4A, B）。その後の融解曲線で得られた Tm（melting temperature）値は E. histolyticaプラスミド 74.6℃，E. disparプラスミド 75.9℃，E. moshkovskiiプラスミド 74.9℃と 3種類の Tm値に差を認めた（Figure 4B）。更にこの融解曲線を HRM解析した結果，3種のクラスター分類が更に明瞭になった（Figure 4C）。今後，この 3種類の HRM曲線をレファレンス曲線として用いた。

2．人工遺伝子合成プラスミドの希釈系列を用いた最低検出コピー数の検討

3種の人工遺伝子合成プラスミドから，それぞれ0，1，2，3，6，13，25，50，100 copy/μLの希釈系列を作製し，RT-PCR法，C-AS-PCR法，PCR-HRM解析の最低検出コピー数を求めた。測定は複数回行い，得られたコピー数の最頻値を最低検出コピー数

100 bp→

200 bp→

marker markerE. histolytica陽性検体

E. dispar陽性検体 陰性対象

Figure 3 患者便抽出 DNA を検体とした M-PCR 法患者の便から抽出 DNAを検体としてM-PCRを行い，その増幅産物を 3%アガロースゲル電気泳動した。その結果，E. histolytica陽性検体は 217 bpの陽性バンドを認め，E. dispar陽性検体から 738 bpの陽性バンドを認めた。但し，E. moshkovskii陽性検体を入手できなかったため，検討できなかった。

とした。結果は RT-PCR法，C-AS-PCR法，PCR-HRM解析の順に E. Histolytica プラスミドの最低検出コピー数が 1 copy/μL，3 copy/μL，2 copy/μLと何れの方法でも感度が高かった。E. disparプラスミドは 3copy/μL，3 copy/μL，25 copy/μL，そして E. moshkovskiiプラスミドが 25 copy/μL，25 copy/μL，50 copy/μLで

E. dispar

E. moshkovskii

E. histolytica

A 高濃度プラスミドを検体としたPCR増幅Amplification

Cycles

Difference Curve

Diff

eren

ce R

FU

Temperature

RFU

(103 )

← Threshold

B 高濃度プラスミドを検体としたPCRにおけるCt値とTm値

C 高濃度プラスミドを検体としたPCR-HRM解

Plasmid 108

copy/µL106

copy/µL104

copy/µL

Ct値 14.1 18.9 26.3

Tm値 74.6 74.6 74.6

Ct値 13.9 19.3 26.0

Tm値 75.8 76.0 76.0

Ct値 12.3 19.3 30.2

Tm値 75.0 74.8 74.8

E. histolytica

E. dispar

E. moshkovskii

40

30

20

10

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

00 10 20 30 40

73 74 75 76 77

Figure 4 Entamoeba complex の PCR-HRM 解析A：Entamoeba complex（E. histolytica, E. dispar, E.moshkovskii）の人工遺伝子合成プラスミドを 104，106，108 copy/μL 濃度に調整して PCR を行った結果，Ct（threshold cycle）値 12.3から 30.2サイクルで良好な

PCR増幅産物が得られた。B：これらの増幅産物を70℃から 95℃に 0.2℃間隔で温度変化させて融解曲線を描いた結果，E. histolytica の平均 Tm（meltingtemperature）値が 74.6 ℃， E. dispar 75.9 ℃， E.moshkovskii 74.9℃と差を認めた。C：更に，この融解曲線を HRM解析した結果，3種のクラスター分類が明瞭になった。今後，この 3種類 HRM曲線をリファレンス曲線として用いた。

医学検査 Vol.70 No.3 (2021) 

470

PCR-HRM 解 析 の 検 出 感 度 が や や 低 か っ た（Figure 5）。

3．患者検体の希釈系列を用いた最低検出感度の検討E. histolytica陽性患者の便から抽出した 460 ng/μL濃度の DNA液を基に，滅菌精製水で 10倍，20倍，40倍，80倍，100倍，200倍，400倍，800倍，1,000倍の希釈系列を作成し，検討 5法の最低検出感度を

E. moshkovskii

E. dispar

E. histolytica

RT-PCR法

C-AS-PCR法

PCR-HRM解析

copy/μL 100 50 25 13 6 3 2 1 0

Figure 5 人工遺伝子合成プラスミドの希釈系列を用いた検出感度の検討E. histolytica，E. dispar，E. moshkovskiiの人工遺伝子合成プラスミドを用いて 0 copy/μLから 100 copy/μL濃度の希釈系列を作成し，PCR-HRM解析，C-AS-PCR法，RT-PCR 法の最低検出コピー数を検討した。E.histolyticaプラスミドの検出感度は，RT-PCR法 1 copy/μL，PCR-HRM解析 2 copy/μL，C-AS-PCR法 3 copy/μLといずれも高感度であった。E. disparプラスミドでは RT-PCR法と C-AS-PCR法の検出感度が 3 copy/μLであったのに対し，PCR-HRM解析は 25 copy/μLであった。E. moshkovskiiプラスミドでは RT-PCR法とC-AS-PCR法の最低検出感度が 25 copy/μLであったのに対し，PCR-HRM解析は 50 copy/μLと低かった。

求めた。その結果 nested-RT-PCR法は 400倍希釈まで検出可能で，PCR-HRM解析が 200倍希釈，M-PCR法，RT-PCR法，C-AS-PCR法では 100倍希釈が最低検出感度であった。また，E. dispar陽性患者から抽出した 95 ng/μL濃度の DNA液についても同様の検討を行った結果，PCR増幅産物のサイズが 738 bpと大きい M-PCR法の検出感度が 40倍希釈と劣ったが，C-AS-PCR法と RT-PCR法が 400倍希釈，nested-RT-PCR法と PCR-HRM解析は 800倍希釈まで検出可能であった（Figure 6）。

IV　考 察

1992年，Tachibanaら 12 )は肝膿瘍から PCR法を用いて E. histolyticaを初めて検出し，その後，PCR法は便検査にも用いられるようになった。そして PCR技術の進歩に伴い，検査時間の短縮とコンタミネーションによる偽陽性の低減に効果を発揮するリアルタイム PCR法が現在の主流である。今回我々は，リアルタイム PCRを更に発展させた PCR-HRM解析による Entamoeba complexの高感度同定を試みたが，我々が知り得る限り同様の報告は無い。

PCR-HRM解析は PCR後の融解曲線を分析する手法で，本来，ターゲット遺伝子中の 1塩基の違いを検出できる高精密な分析方法である 13 )。そのため，検体間のテンプレート量を揃え，増幅は 30サイクル以内に抑えるなど良質な PCRが求められる。しかし，便中のアメーバ検出に応用するには，十分なテ

E. dispar

E. histolytica M-PCR法nested RT-PCR法RT-PCR法C-AS-PCR法PCR-HRM解析

×1 ×10 ×20 ×40 ×80 ×100 ×200 ×400 ×800 ×1,000 希釈倍率

Figure 6 患者検体抽出 DNA 液の希釈系列を用いた検出感度の検討E. histolytica患者検体の検討では，nested-RT-PCR法が 400倍希釈まで検出可能で最も感度が高く，次いで PCR-HRM解析が 200倍希釈，RT-PCR法，C-AS-PCR法，M-PCR法は 100倍希釈まで検出できた。また，E. dispar患者検体は nested-RT-PCR法と PCR-HRM解析が800倍希釈，RT-PCR法と C-AS-PCR法が 400倍希釈まで検出可能であったのに対し，PCR増幅産物が 738 bpと長いM-PCR法では 40倍希釈が最低検出感度であった。

戸田 他「HRM解析による Entamoeba complexの高感度検出」

471

ンプレート量が望めない。そこで，今回，ターゲットとした 141塩基の内 E. histolyticaと E. dispar間で5塩基，E. histolyticaと E. moshkovskii間で 20塩基，E. disparと E. moshkovskii間で 21塩基の違いがある領域を HRM解析した。その結果，テンプレート量が少なく 45サイクルの増幅を行っても，PCR-HRM解析で高感度に Entamoeba complexを分類できた。更に PCR-HRM解析特有の利点として，プライマーセットを遺伝子多型が少ない保存領域に設定したことにより，ヒトの腸管内からの検出が報告されている E. hartmanii，E. coli，E. polecki 14 )や人獣共通感染症を起こす E. nuttalli 15 )等のアメーバとプライマーが共通する。そのため，これらの種でも PCR反応が起こり，検出できると思われる。但し，当センターでは稀なアメーバの分離例が無かったため，今回の検討で確認できなかった。次に PCR-HRM解析と既存 PCR法の検出感度を比較した。PCR-HRM解析，RT-PCR法，C-AS-PCR法は，全て 45サイクルの増幅を行い，PCR産物の長さも 118 bpから 141 bpと短くした。一方，M-PCR法も 45サイクルの増幅を行ったが，この方法の特徴として 1本のチューブで増幅された PCR産物を電気泳動し，その泳動距離の差から種を同定するため，どうしても PCR産物が長くなる。その結果，M-PCR法の PCR産物が 217 bpと短い E. histolyticaの検出感度は，他法と差が無かったのに対し，PCR産物が738 bpと非常に長い E. disparでは，M-PCR法の検出感度が他法より 10倍低かった。通常，増幅産物中のターゲット遺伝子のコピー数が同じであれば，増幅産物が長い方が検出しやすい。しかし，E. disparの M-PCR法は，増幅産物の長さが原因して増幅効率が低下し，45サイクルの増幅でも十分な検出感度を得られなかったと考えられる。以上のことより，M-PCR法は 1本の反応チューブで事足りるため経済的であるが，増幅産物が長いと検出感度が劣るデメリットに注意が必要である。次に増幅サイクル数と PCR産物のサイズが同等である PCR-HRM解析，RT-PCR法，C-AS-PCR法の検出感度を比較した。プラスミドの希釈系列を用いた検討では，PCR-HRM解析は RT-PCR法，C-AS-PCR法よりやや感度が劣ったが，患者検体の検討では，PCR-HRM解析の検出感度が RT-PCR法，C-AS-PCR法より高かった。これらの希釈系列は，滅菌精製水

で希釈しただけであり，PCR阻害物質の影響など，実際の患者検体の検出感度を示したものでは無いが，低濃度域の同一検体を複数回測定するとゼロから 4倍のバラツキがあり，PCR-HRM解析と RT-PCR法，C-AS-PCR法の検出感度差は，このバラツキの範囲内であった。結局，良質なプライマーで PCR産物を小さくすれば，PCRの方法に関わらず，検体中に数コピーしか存在しない E. histolyticaを検出できた。過去に報告されたアメーバの PCR法は，シングル

PCR法，nested-PCR法，RT-PCR法など様々である。そして，PCRを 2段階で行う nested PCR法は，最も高感度な検出法として用いられているが，一方でYeeら 10 )は nested PCR法より RT-PCR法が高感度であったことを報告している。今回の検討では，nested-RT-PCRが最も高感度であったが，RT-PCR法とは 2倍から 4倍の感度差を認めたのみで，PCR-HRM解析とは同等の検出感度であった。そして，今回のように PCR産物のサイズを小さくすればシングル PCR法でも十分な感度が得られた。以上のことより，2段階 PCRは高感度検査法の一つであるが，RT-PCR法や PCR-HRM解析でも十分な感度が有り，コンタミネーションの危険性を冒してまで PCRを 2段階で行う価値は無いと思われる。

V　まとめ

今回，検討した 5種類の PCR法を Table 1にまとめた。PCR法によるアメーバの検出において，増幅産物のサイズを小さくすることにより良好な増幅効率が得られ，M-PCR法以外では十分な検出感度を得られた。そのため，操作が煩雑でコンタミネーションの危険性が高い 2段階 PCR法は，必要性に乏しかった。一方，PCR-HRM解析と RT-PCR法はリアルタイム PCR装置を必要とするが，チューブ開栓によるコンタミネーションの回避や，泳動用ゲル作成や検体のアプライなどの操作を短縮できるなどメリットが大きかった。更に PCR-HRM解析は 1本のチューブで PCRを完結できるのでチップやチューブ等の器材の使用が 1/3量になるため経済的であり，理論上，ヒトの腸管に生息する Entamoeba complex以外のアメーバも検出できる応用性に優れた検査法である。

医学検査 Vol.70 No.3 (2021) 

472

文献

 1) Mehmet T et al.: “Laboratory diagnosis of Amebiasis,” ClinMicrobiol Rev, 2003; 16: 713–729.

 2) Khairnar K et al.: “A novel nested multiplex polymerase chainreaction (PCR) assay for differential detection of Entamoebahistolytica, E. moshkovskii and E. dispar DNA in stool samples,”BMC Microbiol, 2007; 47: 1–9.

 3) Heredia RD et al.: “Entamoeba moshkovskii perspectives of a newagent to be considered in the diagnosis of amoebiasis,” ActaTropica, 2012; 123: 139–145.

 4) 赤尾 信明：「赤痢アメーバ検査」，検査と技術，2014; 42:1376–1381.

 5) Subhash CP et al.: “Polymerase chain reaction confirmation ofdiagnosis of intestinal amebiasis in Puducherry,” Indian JGastroenterol, 2010; 29: 140–142.

 6) 阿部 仁一郎，他：「赤痢アメーバ Entamoeba histolytica とEntamoeba dispar の鑑別における Multiplex-PCR 法の有用性」，感染症学雑誌，2002; 76: 921–927.

 7) Evangelopoulos A et al.: “A nested, multiplex, PCR assay for thesimultaneous detection and differentiation of Entamoebahistolytica and Entamoeba dispar in faeces,” Annals of TropicalMedicine and Parasitology, 2000; 94: 233–240.

 8) Zebardast N et al.: “Application of multiplex PCR for detectionand differentiation of Entamoeba histolytica, Entamoeba disparand Entamoeba moshkovskii,” Iranian J Parasitol, 2014; 9: 466–

473. 9) Zulhainan H et al.: “Differential detection of Entamoeba

histolytica, Entamoeba dispar, and Entamoeba moshkovskii by asingle-round PCRassay,” J Clin Microbiol, 2006; 44: 3196–3200.

10) Yee LL et al.: “Real-time PCR assay in differentiating Entamoebahistolytica, Entamoeba dispar, and Entamoeba moshkovskiiinfections in Orang Asli settlements in Malaysia,” Parasites andVectors, 2013; 6: 250.

11) Shantanu R et al.: “Real-time-PCR assay for diagnosis ofEntamoeba histolytica infection,” J Clin Microbiol, 2005; 43:2168–2172.

12) Tachibana H et al.: “Detection of pathogenic Entamoebahistolytica DNA in liver abscess fluid by polymerase chainreaction,” Int J Parasitol, 1992; 22: 1193–1196.

13) 宮原 悠太，他：「高解像度融解曲線分析（HRM）法を用いた遺伝子変異解析のポイントと注意点」，検査と技術，2017; 45:456–461.

14) Tengku SA et al.: “Public health and clinical importance ofamoebiasis in Malaysia: A review,” Tropical Biomedicine, 2011;28: 194–222.

15) Tachibana H et al.: “An Entamoeba sp. strain isolated from rhesusmonkey is virulent but genetically different from Entamoebahistolytica,” Mol Biochem Parasitol, 2007; 153: 107–114.

本論文に関連し，開示すべき COI状態にある企業等はありません。

アメーバの高感度検出における各種 PCR 法の有用性

検出感度 特殊装置の必要性 コンタミネーション回避 操作時間の短縮 消耗品費 応用性

PCR-HRM解析 〇 △ ◎ ◎ 〇 〇RT-PCR 〇 △ ◎ ◎ △ △M-PCR △ 〇 〇 〇 〇 △

C-AS-PCR 〇 〇 〇 〇 △ △nested-RT-PCR 〇 〇 △ △ △ △

◎：非常に優れている　〇：優れている　△：劣っている

Table 1 

戸田 他「HRM解析による Entamoeba complexの高感度検出」

473

Technical Article

High-sensitivity detection of Entamoeba complex by polymerase chainreaction (PCR) analysis: Comparison of PCR-HRM analysis andconventional PCR analysis

Keizo TODA 1) Kazuki NAKASHIMA 1) 

1) Department of Pathology, Hyogo Prefectural Amagasaki General Medical Center (2-17-77, Higashinaniwa-cho, Amagasaki-shi,Hyogo 660-8550, Japan)

Summary

Entamoeba histolytica, which is the cause of a category 5 infectious disease, needs to be differentiated from the non-pathogenic species Entamoeba dispar and Entamoeba moshkovskii. PCR analysis is a specific and highly sensitivemethod of detecting E. histolytica, and the technology is shifting from conventional PCR to real-time PCR analysis.Therefore, we investigated a highly sensitive method to detect the Entamoeba complex by PCR-HRM analysis, whichis a further evolution of real-time PCR analysis. Furthermore, we compared HRM analysis with multiplex PCR,allele-specific PCR, allele-specific real-time PCR, and nested PCR analyses. Results showed that the sensitivity ofmultiplex PCR analysis is inferior to that of other methods because the sensitivity decreased as the size of the PCRproduct increased. When the size of the PCR product is small, sufficient detection sensitivity can be obtained, so thatit is not necessary to carry out nested PCR, which increases the risk of contamination. Since PCR-HRM analysis andallele-specific real-time PCR analysis use a real-time PCR thermal cycler, there is no need to open the lid of the PCRtube. Therefore, the risk of contamination is extremely low, and the turnaround time can be shortened. Moreover,since only one tube is used in PCR-HRM analysis, running costs are low, and there is a possibility that moreEntamoeba species can be detected.

Key words: E. histolytica, Entamoeba complex, high resolution melt analysis, real time PCR, small subunitribosomal RNA

(Received: November 24, 2020; Accepted: February 28, 2021)

医学検査 Vol.70 No.3 (2021) 

474