134

Pemanfaatan Pseudomonas putida dan Pseudomonas fluorescensSebagai Biosensor untuk Mengukur Kadar BOD5 Dalam Air

Sri Sugiarti 1)*, Setyawan P. Sakti 2), Unggul P. Juswono 2)

1)Progam Studi Magister Fisika, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang2)Jurusan Fisika, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang

Diterima 15 Agustus 2013, direvisi 08 Oktober 2013

ABSTRAK

Seiring dengan pertambahan penduduk, kebutuhan akan air bersih pun semakin meningkat.Ketersediaan air bersih saat ini sudah mulai berkurang karena penurunan kualitas maupun kuantitas airdi lingkungan. Penurunan kualitas air dapat disebabkan pencemaran air akibat pembuangan limbahindustri. Untuk mengetahui tingkat pencemaran air dapat dilakukan dengan berbagai cara, salah satunyaadalah penentuan kadar BOD (Biological Oxygen Demand) dan metode pengukuran BOD yang palingumum adalah metode titrasi. Selain titrasi, metode biosensor merupakan metode yang dikembangkandalam mengukur BOD. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk merancang sebuah biosensor berbasismikroorganisme yang dapat digunakan untuk mengukur kadar Biochemical Oxygen Demand (BOD5)dengan memanfaatkan mikroelektroda sebagai tranduser dengan Pseudomonas putida dan Pseudomonasfluorescens sebagai bioreseptor. Pengaturan tingkat BOD dilakukan dengan penambahan fenol denganberbagai konsentrasi. Dalam penelitian ini konsentrasi yang dipergunakan adalah 0 mg/L, 50 mg/L, 100mg/L, 150 mg/L, 200 mg/L dan 250 mg/L. Kadar BOD dari air dalam penelitian diukur dengan metodetitrasi dan menggunakan biosensor yang dikembangkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwapeningkatan tegangan keluaran biosensor berkorelasi linier dengan peningkatan kadar BOD dalam air.Sedangkan perubahan luas permukaan membran tidak memiliki pengaruh terhadap nilai tegangankeluaran biosensor. Dari hasil ini dapat disimpulkan bahwa Pseudomonas putida dan Pseudomonasfluorescens dapat dipergunakan sebagai bahan aktif biologis untuk pengukuran kadar BOD dalam air.

Kata kunci : Fenol, BOD, mikroelektroda, tegangan biosensor.

ABSTRACT

Along with population growth, the need for clean water is increasing. The availability of cleanwater is starting to decrease due to the decline in quality and quantity of water in the environment. Waterquality degradation can be caused by water pollution from industrial waste disposal. One of theparameters to measure the level of pollution is the biochemical oxygen demand (BOD). Beside titration,biosensor method is a method developed to measure the BOD. The purpose of this study is to design amicroorganism-based biosensors that can be used to measure levels of Biochemical Oxygen Demand(BOD5) using a microelectrode transducer with Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens asbioreceptor on phenol wastes. BOD concentration was controlled by adding phenol in water withconcentration of 0 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L, 200 mg/L and 250 mg/L. BOD concentration asmeasured by using titration method and developed biosensor. Experimental result shows that thepotential of the biosensor linearly correlated to the concentration of BOD in water. Membrane surfacearea does not contribute any effect to the output potential of the biosensor. We can conclude that bothPseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens can be use as material for measuring BODconcentration in water.

Keywords : Phenol, BOD, microelectrode, biosensor voltage.

NATURAL B, Vol. 2, No. 2, Oktober 2013

---------------------*Coresponding author :E-mail: srisugiarti2717@yahoo.co.id

135Sri Sugiarti, dkk : Pemanfaatan Pseudomonas putida dan Pseudomonas fluorescens Sebagai Biosensoruntuk Mengukur Kadar BOD5 dalam Air

PENDAHULUAN

Ketersediaan air bersih saat ini sudahmulai berkurang karena penurunan kualitasmaupun kuantitas air di lingkungan. Penurunankualitas air dapat disebabkan pencemaranakibat pembuangan limbah industri. Salah satulimbah organik yang sangat berbahaya danmenyebabkan pencemaran air adalah limbahfenol. Senyawa ini banyak digunakan sebagaicampuran pada perekat (50%), plastik (20%),antiseptik, desinfektan, sintesis zat warna, danobat-obatan serta ditemukan pada limbahindustri pengilangan minyak, tekstil dan kayulapis [1].

Dampak langsung dari pencemaran airadalah terjadi degradasi air di mana-mana, baikitu di air tanah, air sungai, maupun air laut [2].Dalam upaya untuk pengendalian kualitas air,langkah awal yang perlu dilakukan diantaranyaadalah penentuan tingkat pencemaran. Untukmengetahui tingkat pencemaran air dapatdilakukan dengan berbagai cara, salah satunyaadalah penentuan kadar BOD (BiologicalOxygen Demand). Penentuan BOD digunakanuntuk menaksir oksigen yang dipakai dalamproses dekomposisi oksidatif oleh bakteriaerob di dalam perairan alami dan merupakanukuran banyaknya kandungan bahan organikyang terlarut dalam perairan tersebut [3].Kadar BOD yang berlebih di perairanmenunjukkan bahwa dalam perairan tersebutbanyak mengandung bahan organik sebagaisumber polutan.

Metode pengukuran BOD secaratradisional dilakukan dengan mengukurkonsumsi oksigen oleh mikroorganisme yaitudengan titrasi kimia. Pengukuran denganmetode ini memerlukan waktu yang cukuplama karena harus menunggu selama 5 hari.Metode biosensor merupakan metode lain yangdikembangkan dalam mengukur kadar BOD.Biosensor ini memanfaatkan bakteriPseudomonas putida dan Pseudomonasfluorescens sebagai bioreseptor danmikroelektroda sebagai alat pengukuran kadarBOD yang praktis. Sudah banyak penelitianyang menunjukkan bahwa genus Pseudomonassp. merupakan genus bakteri yang palingbanyak dilaporkan kemampuannya dalammendegradasi fenol [4,5]. Proses degaradasi

fenol oleh bakteri melibatkan reaksi oksidasifenol menjadi senyawa lain yang lebihsederhana yang dikenal sebagai respirasi.Kenaikan respirasi dapat diukur berdasarkantingkat konsumsi oksigen dalam menguraikansenyawa organik (fenol) yang dikenal sebagaiBOD [6]. Kemampuan mikroelektroda yangakurat dalam pengukuran potensial membranmerupakan dasar biosensor dalam mengukurreaksi oksidasi reduksi dari proses respirasiberdasarkan prinsip elektrokimia. Elektrokimiamerupakan energi yang terkandung dalamcairan intraseluler dan ekstraseluler. Energi inimerupakan kombinasi antara energi listrikyang merupakan hasil dari pengaruh membrankarena adanya pergerakan ion dan juga energikimia yang berasal dari akibat gradienkonsentrasi ion. Biosensor juga menggunakanmembran selulosa ester karena mempunyai cirikhusus yang tidak dimiliki membran yang lainyaitu sensitif untuk kondisi panas, kimia, dandegradasi biologis sehingga sangat cocokuntuk mengimobilisasi bakteri pada tranduser[7].

METODE PENELITIAN

Pembuatan media pertumbuhan.Pembuatan media pertumbuhan dibagi menjadidua yaitu (a) Pseudomonas putida dan (b)Pseudomonas fluorescens dengan komposisisebagai berikut:a) 1 gram NH4NO3; 0,5 gram (NH4)2SO4; 0,5

gram NaCl; 0,5gram MgSO4·7H2O; 1,5gram K2HPO4; 0,5 gram KH2PO4; 0,014gram CaCl2·2H2O; 0,01 gram FeSO4·7H2Odan larutan trace element (1 ml/L)

b) 2,44 gram Na2HPO4; 1,52 gram KH2PO4;0,50 gram (NH4)2SO4; 0,2 gram MgSO4·7H2O; 0,05 gram CaCl2·2H2O dan (10ml/L) larutan trace element [8].

Media mineral sederhana dilarutkan dalam 1liter aquades, disterilkan pada suhu 121°C,tekanan 1 atm selama 15 menit danditambahkan fenol 100 mg/l [4].

Pembuatan kurva pertumbuhan.Sebanyak 3 ose subkultur Pseudomonas putidadan Pseudomonas fluorescens hasilperemajaan ditanam dalam 60 ml MMS dandiinkubasi dalam shaker pada suhu 30°Cselama 24 jam. Tiap jamnya diambil 6 ml dan

136 Sri Sugiarti, dkk : Pemanfaatan Pseudomonas putida dan Pseudomonas fluorescens Sebagai Biosensoruntuk Mengukur Kadar BOD5 dalam Air

diukur optical density-nya menggunakanspektrofotometer pada panjang gelombang 600nm hingga diperoleh trend pertumbuhanbakteri.

Pengukuran BOD dengan metodetitrasi. Limbah fenol dengan konsentrasi 0mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L, 200mg/L dan 250 mg/L disimpan dalam botolBOD terang dan gelap. Botol BOD teranglangsung dititrasi sebagai DO0 sedangkan botolBOD gelap disimpan dalam inkubator suhu20oC dan dititrasi pada hari ke-5 sebagai DO5.Nilai BOD5 didapatkan dari hasil penguranganantara DO0 dengan DO5.

Imobilisasi Pseudomonas putida danPseudomonas fluorescens. Metodeimmobilisasi dilakukan dengan cara menjebakdiantara membran semipermiabel (selulosaester), dimana satu bagian berisi biakan bakteripada fase logaritmik dan bagian yang lainberisi limbah fenol.

Pengujian biosensor. Elektroda referensidipotong sepanjang ± 4 cm yang telah disisipikawat perak sepuhan dimasukkan ke dalambagian chamber limbah fenol dan dihubungkandengan kutup negatif plotter. Mikroelektrodadihubungkan dengan kutup positif plotter dandimasukkan pada larutan inokulum bakteri.Hasil pengukuran tegangan dapat dilihat padaplotter.

Gambar 1. Sketsa alat penelitian (Keterangan: 1 =membran selulosa ester, 2 = larutaninokulum, 3 = limbah fenol, 4 =mikroelektroda, 5 = elektroda referensi dan6 = Plotter).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Bakteri di dalam pembiakan danpertumbuhan terjadi karena adanya energiyang diperoleh dari reaksi kimia dalam air,antara lain pemecahan bahan-bahan organikdan proses oksidasi reduksi yang dikatalisisoleh bakteri. Kecepatan pembiakan danpertumbuhan akan bergantung pada kulturmedia tempat tumbuh, pH dan suhu. Bakteriyang hidup di lingkungan perairan umumnyamemiliki suhu optimum 20-45 oC dan pH 6-9,3[9].

Pada penelitian ini menggunakan duamacam bakteri yang berfungsi sebagaibioreseptor yaitu Pseudomonas putida danPseudomonas fluorescens. Perancanganbioreseptor harus memperhatikan bagaimanamembuat biakan dari Pseudomonas putida danPseudomonas fluorescens yang telah aktif danmampu melakukan pendektesian terhadapanalit. Studi pertama yang harus dilakukanadalah mengetahui kurva pertumbuhan bakteridalam media mineral sederhana denganpenambahan fenol 100 mg/L. Kurvapertumbuhan Pseudomonas putida danPseudomonas fluorescens dalam 60 ml MMSyang diinkubasi pada suhu 30oC dengankecepatan 120 rpm dapat dilihat pada Gambar2.

Gambar 2. Kurva pertumbuhan bakteri pada mediamineral sederhana. (Keterangan: Pp =Pseudomonas putida dan Pf = Pseudomonasfluorescens).

Proses pertumbuhan bakteri terjadi dalamempat fase yakni fase penyesuaian diri (lagphase), fase pertumbuhan cepat (log phase),

137Sri Sugiarti, dkk : Pemanfaatan Pseudomonas putida dan Pseudomonas fluorescens Sebagai Biosensoruntuk Mengukur Kadar BOD5 dalam Air

fase tetap (stationary phase) dan fase kematian(death phase) [10]. Berdasarkan kurvapertumbuhan bakteri Pseudomonas putida danPseudomonas fluorescens dapat diketahuibahwa pada jam ke-0 sampai jam ke-4 sebagaifase lag, jam ke-4 sampai jam ke-14 sebagaifase logaritmik, jam ke-14 sampai jam ke-24sebagai fase stasioner dan setelah jam ke-24sebagai fase kematian.

Pengaruh Konsentrasi fenol terhadapnilai BOD. Hasil penelitian pengaruhkonsentrasi fenol dengan penambahanPseudomonas putida dan Pseudomonasfluorescens terhadap nilai BOD5 dapat dilihatpada Gambar 3.

Gambar 3. Grafik hubungan konsentrasi fenol terhadapnilai BOD5 pada limbah fenol (Keterangan: Pp = Pseudomonas putida dan Pf =Pseudomonas fluorescens).

Gambar 3 menunjukkan bahwa nilai BOD5

akan semakin meningkat dengan peningkatankonsentrasi fenol. Hal ini disebabkanpeningkatan konsentrasi fenol akanmeningkatkan konsumsi oksigen Pseudomonasputida maupun Pseudomonas fluorescensdalam mendegradasi fenol. Degradasi bahanorganik adalah proses alami yang dilakukanoleh bakteri aerob. Proses ini dapat terjadi jikalimbah mengandung oksigen yang cukup, olehkarena itu dilakukan aerasi terlebih dahulusebelum dilakukan uji pada limbah. Nilai BODmerupakan jumlah oksigen yang digunakanoleh bakteri untuk menguraikan hampir semuazat organik yang terlarut dan sebagian zatorganik yang tersuspensi dalam air limbah [6].Peningkatan nilai BOD terjadi karena adanyameningkatnya jumlah bahan organik sebagaisumber subtrat dan meningkatnya jumlah

bakteri yang menguraikan bahan organikdalam limbah menjadi CO2 dan H2O. Menurut[9] hancurnya bahan organik menjadi CO2 danH2O oleh aktivitas bakteri yang terjadi padatahap awal akan mengakibatkan penurunannilai oksigen terlarut, sehingga meningkatkannilai BOD.

Hasil penelitian juga menunjukkan bahwalimbah fenol dengan penambahanPseudomonas putida mempunyai nilai BOD5

yang lebih tinggi dibandingkan denganpenambahan Pseudomonas fluorescens.Pseudomonas putida mempunyai kemampuanyang lebih baik dalam mendegradasi fenoldibandingkan Pseudomonas fluorescens [12]sehingga mempunyai nilai BOD5 lebih tinggi.Pseudomonas putida merupakan bakteri yangagresif dan efektif serta mempunyai waktugenerasi yang cepat. Hal ini diduga karenakeperluan nutrisinya yang mudah karenamampu menggunakan berbagai sumber karbonserta kemampuannya membentuk berbagaisenyawa penghambat, sehingga Pseudomonasputida mampu berkembang biak dengan cepat.Pseudomonas putida yang diaplikasikan padadegradasi akan memperbanyak diri danbertahan selama beberapa waktu untukberkompetisi dengan mikroorganisme lain [4].

Hubungan antara konsentrasi BOD5 hasiltitrasi dan tegangan keluaran biosensor dapatdilihat pada Gambar 4 dan Gambar 5.

Berdasarkan Gambar 4 dan Gambar 5dapat diketahui bahwa peningkatan nilai BOD5

juga diikuti oleh peningkatan tegangan yangdihasilkan. Meningkatnya kadar BOD5

Gambar 4. Grafik hubungan antara BOD5 dengantegangan biosensor pada limbah fenolPseudomonas putida (Keterangan: d5 =diameter membran 5 mm, d9 = diametermembran 9 mm dan d15 = diametermembran 15 mm).

138 Sri Sugiarti, dkk : Pemanfaatan Pseudomonas putida dan Pseudomonas fluorescens Sebagai Biosensoruntuk Mengukur Kadar BOD5 dalam Air

Gambar 5. Grafik hubungan antara BOD5 dengantegangan biosensor pada limbah fenolPseudomonas fluorescens (Keterangan: d5= diameter membran 5 mm, d9 = diametermembran 9 mm dan d15 = diametermembran 15 mm).

menunjukkan kenaikan respirasi rata-ratamikroorganisme sebagai bioreseptor dalammenguraikan/mendegradasi senyawa organikdalam limbah. Terdapat tiga cara transport(fenol) ke dalam sel bakteri, yang pertamamelalui interaksi sel dengan fenol yang terlarutdalam fase air, umumnya rata-rata kelarutanfenol oleh proses fisika sangat rendah sehinggatidak dapat mendukung. Yang kedua melaluikontak langsung (perlekatan) sel denganpermukaan tetesan fenol yang lebih besardaripada sel mikroba. Pada kasus yang keduaini, perlekatan dapat terjadi karena sel bakteribersifat hidrofobik. Sel mikroba melekat padapermukaan tetesan fenol yang lebih besardaripada sel dan pengambilan substratdilakukan dengan difusi atau transport aktif.Perlekatan ini terjadi karena adanyabiosurfaktan pada membran sel bakteri danyang terakhir melalui interaksi sel dengantetesan fenol yang telah teremulsi atautersolubilisasi oleh bakteri. Pada kasus ini selmikroba berinteraksi dengan partikel fenolyang lebih kecil daripada sel. Fenol dapatteremulsi dan tersolubilisasi dengan adanyabiosurfaktan yang dilepaskan oleh bakteri kedalam medium [13].

Sel-sel yang melakukan respirasi padaumumnya mempunyai kecenderunganmenggunakan oksigen sebagai aseptor donorterakhir. Elektron-elektron di dalam sistemrespirasi berasal dari DPNH+H+, yaitu hasiloksidasi dari subtrat. Pasangan elektron inimelalui flavoprotein atau pembentukan FADdan sitokrom menjadi energi dalam bentuk

ATP (Adenosin-ribosatripospat). Prosesoksidasi tersebut dapat dijelaskan sebagaiberikut, pertama oksidasi sebagian limbahmenjadi produk akhir untuk mendapatkanenergi guna memelihara sel, sertapembentukan serat-serat baru. Kedua beberapabagian limbah diubah menjadi serat sel barudengan menggunakan sebagian energi yangdilepaskan. Akhirnya pada saat bahan organikdipakai, sel-sel yang baru mulai memakanserat selnya sendiri dan tahap ini yang disebutsebagai pernafasan atau respirasi endogen [13].

Hasil penelitian menunjukkan tingkatketelitian biosensor bernilai antara 1,79%sampai 4,81%. Waktu respon antara 20 sekonsampai 80 sekon dan recovery time antara 2,3menit sampai 9 menit. Waktu respon ini relatiflebih lama karena chamber yang digunakantidak mempunyai saluran pembuangansehingga pergantian sampel harusmenggunakan pipet. Kelinieran antara BOD5

dengan tegangan biosensor mencapai 96,7%pada bioreseptor Pseudomonas putida dan98,3% pada Pseudomonas fluorescens sertadapat bekerja pada luasan membran terkecilyaitu diameter 5 mm. Biosensor ini mampubekerja pada range nilai BOD5 antara 0,897mg/L sampai 3,169 mg/L.

KESIMPULAN

Biosensor pada penelitian inimemanfaatkan Pseudomonas putida danPseudomonas fluorescens sebagai bioreseptor.Membran selulosa ester digunakan untukmengimobilisasi bioreseptor pada permukaanmikroelektroda yang berfungsi sebagaitranduser. Teknik imobilisasi dilakukandengan cara menjebak bakteri diantaramembran sehingga bakteri tetap terkukungpada tempatnya sedangkan fenol mengalirmenuju bakteri tersebut. Pseudomonas putidadan Pseudomonas fluorescens dapatmendegradasi limbah fenol yang berfungsisebagai subtrat untuk melakukan respirasi.Pada proses respirasi juga diikuti oleh reaksireduksi oksidasi yang terukur oleh traduserberdasarkan prinsip elektrokimia danmenghasilkan sinyal listrik berupa bedapotensial.

Berdasarkan hasil penelitian dapatdiketahui pengaruh konsentrasi fenol, semakin

139Sri Sugiarti, dkk : Pemanfaatan Pseudomonas putida dan Pseudomonas fluorescens Sebagai Biosensoruntuk Mengukur Kadar BOD5 dalam Air

tinggi konsentrasi fenol akan menghasilkannilai BOD5 dan tegangan yang semakin besar.Biosensor ini dapat melakukan pendektesiandengan baik pada nilai BOD5 0,897-3,169mg/L. Biosensor yang dikembangkan inimempunyai tingkat ketelitian atau deviasiantara 1,79% sampai 4,81% dan waktu responantara 20 sekon sampai 80 sekon sertarecovery time antara 2,3 menit sampai 9 menit.

DAFTAR PUSTAKA

[1] Rocha, L.L. (2007), Isolation andcharacterization of phenol-degradingyeasts from an oil refinery wastewater inBrazil, Mycophatologia, 64, 183– 188.

[2] Wardoyo, S.T.H. (1978), Kriteria kualitasair untuk keperluan pertanian danperikanan. Dalam: Prosiding SeminarPengendalian Pencemaran Air. (edsDirjen Pengairan Dep. PU.), 293– 300.

[3] Tan T.C. and Lim E.W.C. (2005),Thermally killed cells of complexmicrobial culture for biosensormeasurement of bod of wastewater, SensActuators B Che.,107, 546–551.

[4] Agarry S.E, Solomon B.O., Layokun S.K.(2008), Kinetics of batch microbialdegradation of phenols by indigenousbinary mixed culture of pseudomonasaeruginosa and pseudomonasfluorescence, Afr J Biotechnol., 7, 2417–2423.

[5] Annadurai G and Lee J.F. (2007),Application of artificial neural network

model for the development of optimizedcomplex medium for phenol degradationusing Pseudomonas pictorum (NICM2074), Biodegradation.,18, 383–392.

[6] Salmin (2005), Oksigen terlarut (DO) dankebutuhan oksigen biologi (BOD) sebagaisalah satu indikator untuk menentukankualitas perairan, Oseana.,3, 21 – 26.

[7] Mulder, M. (1991),Basic Principles OfMembrane Technology, Kluwer,Netherland, 78 – 86.

[8] Timur S, Pazarlioglu, R. Pilloton, A.Telefoncu, (2003), Detection of phenoliccompounds by thick film sensors basedon Pseudomonas putida, Talanta. 61, 87–93.

[9] Van Ginkel, C.G. (1996), Completedegradation of xenobiotic surfactants byconsortia of aerobic microorganism,Biodegradation.,7,151–164.

[10] Cai W, Li J, Zhang Z. (2007), Thecharacteristics and mechanisms of phenolbiodegradation by Fusarium sp, J HazardMat., 148, 38–42

[11] El-Naas M, Al-Muhtaseb S.A., MakhloufS. (2009), Biodegradation of phenol byPseudomonas putida immobilized inpolyvinyl alcohol (PVA) gel, J HazardMat., 164, 720–725.

[12] Tang, J. Xiaowei, N. Qing, S. RugangWang (2010), Bioremediation ofpetroleum polluted soil by combination ofryegrass with effective microorganisms,Journal of Environmental Technologyand Engineering, 3, 80–86.