VII. PembahasanPada praktikum kali ini telah dilakukan percobaan
tentang kuantitasi mikroba atau perhitungan mikroba dengan
melakukan pengenceran serial dan telah ditentukan konsentrasi
suspensi bakteri dengan metode hitungan cawan. Secara umum, dalam
perhitungan mikroba terdapat dua metode yang diapplikasikan, yaitu
metode secara langsung atau tidak langusng. Berikutan percobaan
ini, kita telah melakukan metode perhitungan cawan yaitu adalah
secara tidak langsung. Sedangkan secara langsung dikategorikan
dengan pembuatan preparat bahan atau menggunakan ruang hitung dan
secara tidak langsung meliputi 4 cara yaitu perhitungan cawan
(TPC), pengenceran, kalorimeter, dan metode most probable number
(MPN method). Sebenarnya, dasar metode hitungan cawan dengan
anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi
satu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan
suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung
daam sampel. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah
yang mengandung antara 30-300 koloni. Untuk memperoleh
sekurng-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah
yang memenuhi syarat maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan
pencawanan. Organisme yang terdapat daam sampel asal ditentukan
dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Percobaan kali ini telah
dilakukan dengan menyediakan alat dan bahan yang dibutuhkan seperti
kapas, rak tabung, tabung pereaksi, pipet 10ml dan 1ml
masing-masing, pembakar spiritus, petri dish, aquadest, Nutrient
agar, sampel yaitu air ledeng dari kawasan tinggal (Pinewood).
Kesemua alat masing-masing telah disterilisasikan dengan autoklaf
sebelum memulai praktikum maka tidak perlu dibersihkan dengan
alcohol. Masing-masing tabung uji dilabelkan No.1, 2, dan 3 agar
lebih mudah untuk mengidentifikasi ketika pengenceraan dilakukan.
Setelah itu, dimasukkan 9ml aquadest ke dalam kesemua tabung uji
tadi masing-masing dan difiksasi sebelum ditutup dengan kapas untuk
memastikan pengerjaan yang aseptis dipratekkan. Kemudian,
dipipetkan 1ml sample air ledeng Pinewood dan dimasukkan ke dalam
9ml aquadest dalam tabung uji No.1 sehingga diperoleh pengenceran
sebanyak 10-1 lalu difiksasi. Seterusnya, dibuat pengenceran
bertingkat iaitu 10-2 dan 10-3 dengan cara memipetkan 1 ml dari
pengenceran awal dari tabung uji No.1 yang dengan pengenceran 10-1.
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau
mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan
besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9
untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari
pengenceran sebelumnya. Selanjut itu, kita telah dipipet 1ml dari
pengenceran 10-3 yang diduga mengandung jumlah bakteri yang
terkecil ke dalam cawan petri lalu difiksasikan dan ditutup secara
rapat. Secara umum, setiap perlakuan yang melibatkan adanya
kontaminasi dari perlinkungan ketika pengenceran, penuangan mahupun
penyebaran harus ada proses fiksasi agar hasil tidak dipengaruhi
oleh kontaminan luar. Hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang
digunakan harus selalu diganti, berartinya setiap tingkat
pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda atau baru.
Prinsipnya adalah bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan
cairan dari sumber yang sama. Berikutan itu, telah dimulakan dengan
proses teknik penamanan dari sampel. Telah disediakan medium
pembiakan bakteri yaitu nutrient agar dan teknik ini memerlukan
agar yang belum padat (>45oC). Teknik penanaman ini merupakan
lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan sampel dapat
diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan
isolasi dimana untuk mendapatkan koloni tunggal harus diambil
beberapa tabung pengenceran terakhir. Berhubungan dengan itu, telah
dipipetkan 1ml dari setiap pengenceran masing-masing dan dituangkan
ke dalam 3 cawan petri masing-masing dan difiksasi. Setelah itu,
medium nutrient agar sebanyak 15-20ml dituangkan ke dalam
masing-masing cawan petri tadi. Metode yang diapplikasikan pada
percobaan ini adalah disebut sebagai cara agar tuang ( Pour plate
method). Kemudian, cawan petri diputarkan ke kiri dan kanan
beberapa kali secara merata dan dihomogenkan dan dibiarkan memadat
seperti yan digambarkan pada gambar1 dibawah. Hal ini akan
menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar yaitu di dalam agar sehingga terdapat
sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh
di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.
Untuk quantitas penuangan 1ml suspensi ke dalam media pembiakan
adalah bertujuan karena proses pour plate membutuhkan ruang yang
lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari
pada spread plate.Gambar 1: Menunjukan cara-cara dilakukan teknik
agar tuang dengan benar.Setelah itu, telah dibungkuskan cawan petri
tersebut dan didiamkan dalam posisi tebalik dalam keranjang yang
telah disediakan agar uap dalam cawan petri tidak menetes pada
medium. untuk diinkubasikan pada suhu 37C selama 24 jam. Metode ini
diulangi untuk cawan petri 2, 3 dan control negatif. Akhir sekali,
dihitung jumlah koloni sample tersebut yang mengandung 4 koloni
yang terbentuk pada cawan petri No.1 yang memgandungi sampel
sebagai air ledeng pinewood dan pencenraan sebanyak 10-1.
Seterusnya, telah diamati bahwa tidak ada sebarang koloni yang
terlihat pada cawan petri No.2 yang mempunyai pengenceran sebanyak
10-2, terakhir sekali ditemui hanya satu koloni pada pengenceran
10-3 yaitu meliputi pengenceran paling kurang dan sebanyak sepuluh
koloni yang terbentuk pada kontrol negatif. Sekian itu, mengikut
syarat-syarat koloni adalah sebagai berikut dimana cawan yang
dihitung atau dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni antara
30-300 koloni, satu koloni dihitung 1 koloni, dua koloni yang
bertumpuk dihitung 1 koloni, beberapa koloni yang berhubungan
dihitung 1 koloni, dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat
dibedakan dihitung 2 koloni, koloni yang terlalu besar (lebih besar
dari setengah luas cawan) tidah dihitung dan koloni yang besarnya
kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni. Dari hasil yang
diperoleh, dapat dibahaskan bahwa pembiakan paling murni ada pada
cawan petri No.3 karena mengandungi hanya satu koloni bakteri dalam
konsentrasi pengenceran paling rendah. Namun, pada cawan petri No.2
dengan konsentrasi pengenceran sebanyak 10-2 memberikan hasil tidak
relatif karena mungkin dipengaruhi beberapa faktor seperti proses
penyebaran atau homogenitas pada medium agar tidak sempurna, atau
munkin pengenceran yang dilakukan ditepat pada konsentrasinya dan
mungkin juga karena ada zat yang menghambat pertumbuhan bakteri
karena sampel itu telah dirawat sebelum diberi kepada pengguna
untuk dikonsumsi. Sekian itu, mengikut syarat-syarat koloni adalah
sebagai berikut dimana cawan yang dihitung atau dipilih adalah yang
mengandung jumlah koloni antara 30-300 koloni, satu koloni dihitung
1 koloni, dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni, beberapa
koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni, dua koloni yang
berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni, koloni
yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah
dihitung dan koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan
dihitung 1 koloni.
