Pembeahasan Isolasi DNA

7/25/2019 Pembeahasan Isolasi DNA

1/5

Pembahasan

Pada percobaan ini dilakukan isolasi DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) jamur tempe

yaitu jenisRhizopus sp. Jamur ini didapat dengan mengumpulkan bagian putih pada tempe,

bagian putih ini merupakan miselia jamur yang biasanya tumbuh pada permukaan biji

kedelai. Setelah bagian putih tempe terkumpul, kemudian dibuat larutan jamur. arutan jamur

ini dibuat dengan cara melarutkan miselia jamur (bagian putih tempe) dalam a!uades.

arutan jamur yang terbentuk ber"arna putih kecoklatan dan keruh. #eruhnya "arna larutan

jamur ini mengindikasikan bah"a terdapat jamur yang tersuspensi pada larutan tersebut.

$solasi DNA dari sel jamur tempe (Rhizopus oryzae) dilakukan dengan tiga tahapan

yaitu perusakan dinding sel jamur dan sistem membran sel untuk membantu ekstraksi

komponen yang dikehendaki, pemilihan kondisi yang baik dalam proses penghancuran

sehingga banyak dihasilkan turunan en%im selama perusakan sel jamur, serta pemilihan

metode pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang dikehendaki. Secara teoritis,

DNA hasil isolasi dikatakan baik bila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak

menglami &ragmentasi.

'eknik a"al yang digunakan pada praktikum ini adalah sentri&ugasi terhadap larutan

jamur, yang mana pemisahan subtansi ini berdasarkan pada berat jenis molekul dengan caramemberikan gaya senti&ugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di ba"ah dan

subtansi yang lebih ringan berada di atas. Jadi, dengan sentri&ugasi ini maka jamur yang

terkandung dalam suspensi akan mengendap pada dasar tabung reaksi. erdasarkan

percobaan yang telah dilakukan, setelah melakukan sentri&ugasi diperoleh &iltrat ber"arna

putih keruh dan endapan ber"arna putihkekuningan yang mengindikasikan endapan tersebut

adalah berupa jamur selanjutnya endapan tersebut ketika diamati dengan menggunakan

mikroskop terlihat adanya gumpalangumpalan ber"arna putih.

Selanjutnya sisa endapan yang diperoleh digabung dan ditambahkan larutan Na*l

+,- dengan perbandingan / 0,- 1 yaitu setiap gram endapan ditambahkan 0,- m

larutan Na*l +,- . Penambahan larutan tsb menyebabka terbentuknya larutan keruh dan

terdapat endapan yang ber"arna putih. 'ujuan penambahan larutan Na* +,- yaitu untuk

menciptakan kondisi lingkungan jamur yang hipotonik. Dalam kondisi hipotonik, akan terjadi

osmosis dari molekulmolekul air yang terdapat di dalam sel jamur ke lingkungan luar

dengan konsentrasi air lebih tinggi. Peristi"a osmosis ini terjadi karena membran sel

merupakan selaput semipermeabel. Dengan adanya peristi"a osmosis (keluarnya molekul


2/5

molekul air menuju ke lingkungan luar), menyebabkan sel jamur mengalami plasmolisis.

Plasmolisis ini merupakan peristi"a rusaknya2lisisnya membran plasma sel yaitu sel jamur.

Dengan keluarnya air dari dalam sel jamur secara terusmenerus maka lamakelamaan sel

jamur akan mengkerut dan membran plasma menjadi pecah sehingga dinding sel jamur rusak.

Penambahan Na*l dengan konsentrasi yang sangat tinggi (pada perbandingan yang cukup

banyak, /0,-) menyebabkan dinding sel jamur mengalami lisis dan protein keluar dengan

disertai adanyasalting out.

Setelah dilakukan penambahan larutan Na*l +,- , selanjutnya diinkubasi selama

menit dalam penangas air pada suhu 3+o*. 4al ini dilakukan untuk mempercepat reaksi

antara Na*l dengan dinding sel jamur sehingga proses lisisnya dinding sel lebih cepat terjadi.

4al ini mengingat bah"a di dalam sel jamur terdapat DNA yang tersusun oleh peptidoglikan

(kompleks polisakarida dan protein) akan terhidrolisis menghasilkan monosakarida, asam

amino, dan protein. 5usaknya dinding sel jamur ini disebabkan oleh kekuatan dinding sel

yang berupa ikatan silang antara disakarida dan protein terputus sehingga menyebabkan

lisisnya dinding sel jamur. Setelah pemanasan dilakukan suspensi tersebut didinginkan dan

didapatkan endapan ber"arna putih,yang mengindikasikan lisisnya dinding sel dari jamur

sehingga komponenkomponen yang berada di dalam sel jamur keluar dan tersuspensi ke

dalam sistem larutan. Selanjutnya ke dalam tabung reaksi ditambahkan dengan detergen 0-6,dengan perbandingan /- sehingga menyebabkan terbentuknya larutan yang ber"arna putih

dan terdapat buih.

Penambahan larutan detergen 0-6 ini bertujuan untuk membantu menyempurnakan

proses lisis yang dialami oleh dinding sel jamur akibat penambahan larutan Na*l pada tahap

pertama, sehingga DNA pada sel jamur akan lebih cepat keluar dari selnya. Detergen mampu

merusak dinding sel melalui ikatan antara sisi polar membran sel (gugus &os&at) dengan sisi

polar detergen (S78Na). Selain itu, juga dapat terjadi ikatan antara sisi hidro&obik pada

detergen dengan protein dan lemak pada jamur sehingga terbentuk senya"a komplek lipid

proteindetergen. Senya"a kompleks tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid


3/5

memiliki ujung hidro&obik dan hidro&ilik. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut.

*

7

7 *40

*4

*

7

*

7

7 P

7

7*40

*40

N49

7

S

7

7

77*49

*40

*40

*40

*40

*40

*40

*40

*40

Na

4

4

Gambar 1. 5eaksi Perusakan embran Sel

Detergen yang dilarutkan di dalam air akan membentuk misell yang merupakan

kumpulan molekul detergen yaitusodium dudoyl sulfate(SDS) dengan kepala hidro&iliknya

yang polar menghadap ke air dan ekor lipo&iliknya yang nonpolar di bagian tengah

membentuk agregat. #etika misell ini berdekatan dengan membran plasma yang tersusun atas

lapisan bilayer &os&olipid akan pecah, yang mana struktur detergen yang menyerupai

&os&olipid yaitu mengandung kepala polar dan ekor nonpolar, akan menggantikan beberapa

molekul &os&olipid dalam membran plasma. 4al inilah yang dapat menyebabkan membran

plasma pecah dan semakin lama menjadi lisis. Selain membantu proses lisisnya sel jamur,

detergen juga berperan dalam memperlambat akti:itas en%imatik yang berbahaya, misalnya

nukleasis yang disebabkan karena akti:itas inti sel dengan si&at detergen sebagai

pendenaturasi protein.

Setelah dilakukan penambahan larutan detergen 0-6, kemudian larutan ini diinkubasi

selama + menit pada suhu ;+o*. 4al ini bertujuan untuk mempercepat terbentuknya

senya"a kompleks antara detergenlipid dan protein sehingga DNA lebih cepat terlepas dari

sel jamur. 4asil dari inkubasi ini yaitu diperoleh endapan putih dengan larutan keruh.

#emudian campuran ini didiamkan pada suhu kamar hingga campuran menjadi dingin dan

setelah didiamkan, endapan putih yang terbentuk menjadi lebih banyak.


4/5

sebanyak + m. Penambahan larutan #*l79bertujuan untuk memisahkan larutan protein

dari DNA. $on #= yang terdapat pada #*l79 mampu membentuk ikatan dengan kutub

negati& pada ikatan &os&at pada DNA. Saat ion #=dari #*l79mengikat &os&at dari DNA, saat

itu pula DNA akan terkumpulkan. Penambahan larutan #*l79 ini menyebabkan larutan

menjadi keruh dan terdapat endapan putih, kemudian larutan didiamkan beberapa saat.

Agar DNA terkoagulasi dan terdenaturasi dengan cepat, selanjutnya ke dalam larutan

ditambahkan larutan isoamil kloro&orm sebanyak + m. 4asilnya yaitu larutan tetap keruh

dan terdapat endapan putih. Selain mempercepat terjadinya proses koagulasi dan denaturasi

DNA, isoamil kloro&orm berperan dalam pemecahan ikatan hidrogen yang terdapat pada

DNA yang menghubungkan rantai double helixdari DNA. Pemecahan ikatan hidrogen ini

dapat terjadi karena gugus >74 pada isoamil alkohol membentuk ikatan hidrogen dengan N

4 pada basa nitrogen dari DNA yang digambarkan sebagai berikut.

P

O

-O O-

O

O

O

P O--

O

N

N

N

N

H

H

O

H

ikatan hidrogen antaragugus 74 dari isoamyl dan N4dari basa nitrogen DNA

Gambar 2. $katan hidrogen antara gugus 74 dari isoamyl dan N4 dari basa nitrogen DNA

Dengan penambahan isoamil kloro&orm ini menyebabkan menggulungnya serat panjangDNA dari makromolekul yang lain misalnya 5NA dan protein yang terkoagulasi dalam

bentuk nonserat. erdasarkan hasil percobaan yang dilakukan ketika lembaran yang

terkandung dalam lapisan isoamil alkohol digulung dengan batang pengaduk diperoleh

larutan serat panjang yang mengindikasikan diperolehnya DNA sebagai hasil dari isolasi.

Pada tahap selanjutnya campuran kembali disentri&ugasi agar terjadi pengendapan

yang lebih sempurna dan &ragmen&ragmen DNA lebih sempurna pengendapannya, sehingga

DNA jamur dapat dikumpulkan dengan mudah. 4asilnya yaitu diperoleh endapan yang


5/5

ber"arna putih pada dasar tabung dengan larutan yang tidak ber"arna, serta terdapat selaput

tipis ber"arna putih pada bagian antara endapan dan larutannya. agian ini diyakini sebagai

DNA yang berhasil diisolasi. Selaput tipis atau lembaran tipis tersebut kemudian diambil atau

digulung menggunakan batang pengaduk. Selanjutnya dilakukan pengamatan pada

mikroskop dan diperoleh serat panjang berupa benangbenang halus DNA yang terlihat jelas

dan teratur.

Simpulan

erdasarkan pembahasan di atas dapat disimpulkan bah"a isolasi DNA jamur

Rhizopus Spdapat dilakukan dengan menggunakan beberapa tahap yakni pertama, merusak

dinding sel dari jamur dan sistem membran sel jamur untuk membantu ekstraksi dari

komponen yang dikehendaki. #edua, bekerja dalam kondisi baik itu dalam menghambat atau

menghancurkan turunan en%im yang dihasilkan dalam perusakan dinding sel bakteri. Serta,

terakhir adalah menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang

kita kehendaki.

Documents

Pembeahasan Isolasi DNA