PENENTUAN AKTIVITAS DAN STABILITAS SUPEROKSIDA

DISMUTASE DARI SEL Escherichia coli MENGGUNAKAN

ZEOLIT BAYAH SEBAGAI BIOSENSOR ANTIOKSIDAN

DINIE DIANITA BAKRI

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

ii

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER

INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penentuan Aktivitas

dan Stabilitas Superoksida Dismutase dari sel Escherichia coli menggunakan

Zeolit Bayah sebagai Biosensor Antioksidan adalah karya saya dengan arahan dari

komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan

tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang

diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juli 2013

Dinie Dianita Bakri

NIM G44080049

iv

v

ABSTRAK

DINIE DIANITA BAKRI. Penentuan Aktivitas dan Stabilitas Superoksida

Dismutase dari Sel Escherichia coli menggunakan Zeolit Bayah sebagai

Biosensor Antioksidan. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO,

NOVIK NURHIDAYAT, dan DEDEN SAPRUDIN.

Biosensor antioksidan merupakan inovasi dalam mengukur aktivitas dan

kapasitas antioksidan yang lebih mudah, ketepatan hasil yang tinggi, dan

memanfaatkan makhluk hidup. Bakteri Escherichia coli diketahui menghasilkan

suatu enzim bernama SOD (superoksida dismutase) yang dapat dijadikan sebagai

sensor senyawa antioksidan. Kondisi optimum aktivitas antioksidan yang

diperoleh berdasarkan response optimizer adalah suhu 30 oC, pH 9, dan zeolit 150

mg untuk sel bakteri utuh E. coli dan suhu 40 oC, pH 9, dan zeolit 150 mg untuk

ekstrak E. coli. Nilai KM app dan Vmaks app SOD dari sel bakteri utuh E. coli

ditentukan dengan metode Hones-Wolf. Nilai KM app sebesar 0.2691 mM dan Vmaks

app sebesar 1.1806 µA. Stabilitas biosensor antioksidan sel bakteri utuh yang

diperoleh hanya berkisar 2-4 jam dengan aktivitas antioksidan sebesar 56.35%.

Kata kunci: biosensor antioksidan, E. coli, superoksida dismutase.

ABSTRACT

DINIE DIANITA BAKRI. Superoxide Dismutase Activity and Stability from

Escherichia coli cell on Bayah Zeolites as Antioxidant Biosensor. Supervised by

DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, and DEDEN

SAPRUDIN.

Biosensor is an innovation in measuring antioxidant activity and antioxidant

capacity that is easier, higher accuracy, by utilizing living things. Escherichia coli

has been known to produce SOD (superoxide dismutase), which can be a good

antioxidant sensor. The optimum conditions for antioxidant activity obtained by

response optimizer were 30 oC, pH 9, and 150 mg zeolites for E. coli whole cells

and 40 oC, pH 9, and 150 mg zeolites for the E. coli extract. KM app and Vmaks app

values of the SOD from E. coli cells were determined by Hones-Wolf method.

The KMapp and Vmaks app values were 0.2691 mM and 1.1806 µA, respectively.

Stability of antioxidants biosensor using bacterial cells was relatively stable

between 2 and 4 hours, and the antioxidant activity was only 56.35%.

Keywords: antioxidant biosensor, E. coli, superoxide dismutase.

vi

vii

PENENTUAN AKTIVITAS DAN STABILITAS SUPEROKSIDA

DISMUTASE DARI SEL Escherichia coli MENGGUNAKAN

ZEOLIT BAYAH SEBAGAI BIOSENSOR ANTIOKSIDAN

DINIE DIANITA BAKRI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

viii

Judul Penentuan Aktivitas dan Stabilitas Superoksida Dismutase Ui:111

Sel Escherichia coli Menggunakan Zeolit Bayah sebagai Biosensor Antioksidan

Nama Dinie Dianita Bakri NIM G44080049

Disetujui oleh

MScA

Dr Deden Sa rudin MS Pembimbing III

MS

Tanggal Lulus: 10 SEP 2013

ix

Judul : Penentuan Aktivitas dan Stabilitas Superoksida Dismutase dari

Sel Escherichia coli Menggunakan Zeolit Bayah sebagai

Biosensor Antioksidan

Nama : Dinie Dianita Bakri

NIM : G44080049

Disetujui oleh

Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc Agr

Pembimbing I

Dr Novik Nurhidayat Dr Deden Saprudin, MS

Pembimbing II Pembimbing III

Diketahui oleh

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

x

xi

PRAKATA

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas hidayah dan anugerah-Nya

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “Penentuan Aktivitas dan

Stabilitas Superoksida Dismutase dari Sel Escherichia coli menggunakan Zeolit

Bayah sebagai Biosensor Antioksidan”. Penelitian dilaksanakan dari bulan Juli

2012 – Februari 2013 di Laboratorium Genetika Mikrobiologi LIPI Cibinong,

Laboratorium Bersama IPB, dan Laboratorium Kimia Fisik IPB.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dyah Iswantini Pradono

MSc Agr selaku pembimbing pertama, Dr Novik Nurhidayat selaku pembimbing

kedua, dan Dr Deden Saprudin MS selaku pembimbing ketiga yang telah

memberikan ilmu, bimbingan, dan saran selama penyusunan karya ilmiah ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Pak Acun, Pak Mail, Mas Eko,

Pak Wawan, Mbak Ratih, dan Bu Ai yang telah membimbing selama penelitian

berlangsung. Kepada Liyonawati, Okik Widyatmoko, Lukman La Gia, dan Kak

Yuanita Eka selaku teman seperjuangan dalam penelitian biosensor.

Tak lupa untuk Papa, Mama, Kak Raisa Baharuddin, Wenny Oktalisa,

Fauziah Husnu, Hafizhia Dhikrul, Abang Citra Yanto, Kak Felicia Nanda, teman-

teman Kimia Angkatan 45 dan teman-teman karate yang juga telah memberikan

doa dan semangat untuk menyelesaikan karya ilmiah ini.

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat dan ilmu yang tertulis bisa

menjadi berkah bagi semuanya. Terima kasih.

Bogor, Juli 2013

Dinie Dianita Bakri

xii

xiii

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR xii

DAFTAR LAMPIRAN xii

PENDAHULUAN 1

TINJAUAN PUSTAKA 3

Biosensor Antioksidan 3

Escherichia coli dan Superoksida Dismutase 4

Zeolit Bayah 5

BAHAN DAN METODE 6

Alat dan Bahan 6

Aktivasi Zeolit 6

Pembuatan Elektrode Pasta Karbon dengan Mediator Ferosena 6

Pengukuran Arus Elektrode Pasta Karbon 7

Penumbuhan Sel Bakteri E. coli dan Ekstraksi Sel E. coli 7

Optimasi Aktivitas Antioksidan Sel E. coli dan Ekstrak kasar E. coli 7

Pengukuran Aktivitas Antioksidan Sel E. coli 8

Penentuan Stabilitas Biosensor Antioksidan Sel Bakteri E. coli 8

HASIL DAN PEMBAHASAN 8

Penumbuhan Sel E. coli dan Ekstraksi Sel E. coli 8

Arus Elektroda Pasta Karbon

Optimasi Aktivitas Antioksidan Sel E. coli

Aktivitas Antioksidan Sel E. coli

Stabilitas Biosensor Antioksidan Sel Bakteri E. coli

9

10

13 15

SIMPULAN DAN SARAN 17

DAFTAR PUSTAKA 17

LAMPIRAN 21

RIWAYAT HIDUP 30

xiv

DAFTAR GAMBAR

1 Skema alat biosensor antioksidan 3

2 Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan 3

3 Morfologi Escherichia coli 4

4 Struktur zeolit jenis klipnotilolit 5

5 Voltamogram siklik arus elektroda pasta karbon 9

6 Voltamogram siklik sel bakteri dengan penambahan zeolit 11

7 Kontur sel bakteri dengan penambahan zeolit 12

8 Kontur ekstrak SOD dengan zeolit 13

9 Hubungan konsentrasi xantina dengan aktivitas antioksidan sel E. coli

dengan zeolit 14

10 Rentang linier antara xantina dengan aktivitas antioksidan sel E. coli dengan

zeolit 14

11 Alur Hanes – Woolf sel bakteri E. coli dengan zeolit 15

12 Kurva stabilitas biosensor antioksidan berbabasil sel bakteri E. coli dengan

penambahan zeolit 16

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan alir penelitian 21

2 Kombinasi faktor-faktor peubah bebas bakteri E. coli dengan penambahan

zeolit 22

3 Hasil optimasi bakteri E. coli dengan penambahan zeolit 23

4 Kombinasi faktor peubah bebas ekstrak kasar SOD E. coli dengan

penambahan zeolit 24

5 Hasil optimasi ekstrak kasar SOD E. coli dengan penambahan zeolit 25

6 Hasil pengukuran optimasi substrat xantina 26

7 Analisa kinetika dasar optimasi E. coli dengan metode Hones-Woolf 27

8 Stabilitas aktivitas bakteri E. coli 29

xv

1

1

PENDAHULUAN

Antioksidan adalah senyawa yang dapat memperlambat atau mencegah

proses oksidasi bila bereaksi dengan radikal bebas (Hudson 1990). Antioksidan

juga berfungsi sebagai pencegah munculnya radikal bebas yang dapat

mengganggu kesehatan tubuh. Tubuh mempunyai mekanisme antioksidan atau

antiradikal bebas secara endogenik (Dyatmiko et al. 2000). Namun, antioksidan

endogen tidak dapat mengatasi jumlah radikal bebas berlebih di dalam tubuh.

Oleh karena itu, penambahan antioksidan eksogen berupa asupan sayur dan buah-

buahan sangat diperlukan untuk menangkal radikal bebas. Saat ini, senyawa

antioksidan juga dapat diaplikasikan pada produk kecantikan dan pengawet

makanan antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid (Bjelakovic et al.

2007). Adanya perkembangan teknologi menyebabkan metode konvensional

untuk pengukuran antioksidan semakin ditinggalkan dan beralih ke metode yang

lebih praktis salah satunya, yaitu biosensor.

Biosensor antioksidan merupakan salah satu inovasi baru dalam mengukur

aktivitas dan kapasitas antioksidan yang lebih mudah, ketepatan hasil yang tinggi,

dengan memanfaatkan makhluk hidup sebagai komponen pengenal hayati.

Biosensor merupakan metode penentuan kapasitas antioksidan yang tidak

dipengaruhi oleh cahaya dan diukur berdasarkan arus yang dihasilkan, salah

satunya adalah biosensor elektrokimia. Keunggulan biosensor antara lain lebih

sensitif dan sampel yang dibutuhkan sedikit sehingga dapat mendeteksi aktivitas

biosensor dengan baik serta dapat menentukan jumlah enzim yang dihasilkan oleh

sel mikroba (Ikeda et al. 1998 dan 2000). Penelitian menggunakan biosensor telah

banyak dilakukan, antara lain pengembangan sensor kolin dengan imobilisasi

kolin oksidase ke lapisan nanoporus (Langer et al. 2004), pengukuran hibridasi

DNA berdasarkan interaksi nanokomposit PANI (Wu et al. 2005), pengukuran

aktivitas penangkapan radikal bebas berbasis sitokrom c (Cortina-Puig et al.

2007), dan biosensor glukosa menggunakan mikroba asal Indonesia sebagai

komponen pengenal hayati (Iswantini et al. 2011).

Biosensor antioksidan menggunakan enzim murni memiliki kekurangan,

yaitu biaya yang mahal dan kestabilan enzim yang rendah. Kekurangan tersebut

dapat diatasi dengan penggunaan mikroba yang menghasilkan enzim sebagai

sensor. Sensor menggunakan mikroba memiliki keunggulan, yaitu sensor mikroba

lebih tahan lama dan biaya lebih murah karena tidak memerlukan pengisolasian

dan pemurnian enzim aktif. Selain itu, penggunaan sel bakteri dapat lebih mudah

diperoleh melalui perkembangbiakan dan enzim yang terkandung dalam sel

bakteri lebih banyak dan lebih terbaru dibandingkan dengan enzim murni.

Salah satu modifikasi yang dilakukan dalam penelitian biosensor, yaitu

penambahan matrik imobilisasi yang bertujuan untuk meningkatkan stabilitas dan

efisiensi enzim. Matriks imobilisasi yang sering digunakan antara lain biopolimer

seperti selulosa, karagenan, kitin, dan kitosan (Nazaruddin 2007), polimer sintetik

seperti polianilin dan polistirena, dan bahan anorganik seperti alumina berpori,

silika (Bhatia et al. 2000) dan zeolit (Balal et al. (2009), Goriushkina et al.

(2010).

Zeolit merupakan mineral dari abu vulkanik yang secara kimia memiliki

struktur tetrahedral berikatan dengan oksigen membentuk pori berukuran nano.

2

Zeolit sering digunakan sebagai penjerap, penukar kation, dan katalis. Hal tersebut

diakibatkan karena zeolit memiliki kemampuan selektivitas, stabil pada suhu

tinggi, stuktur yang stabil, dan stabil pada tekanan mekanik yang tinggi (Valdes et

al. 2006).

Zeolit terdiri dari zeolit sintetik dan zeolit alam. Zeolit sintetik memiliki

kelemahan yaitu cukup mahal dengan pembuatan yang cukup rumit dan kelebihan

yaitu nilai KTK tinggi diatas 100 cmol/kg. Kelebihan zeolit alam yaitu sudah

tersedia di alam sedangkan kekurangannya yaitu nilai KTK lebih rendah

dibandingkan dengan zeolit sintetik. Berdasarkan Arif (2011) jumlah zeolit alam

di Indonesia sangatlah banyak dengan nilai Kapasitas Tukar Kation (KTK) yang

hampir diatas 50 cmol/kg (cukup baik untuk dijadikan matriks imobilisasi). Dari

hal inilah, zeolit dalam penelitian biosensor antioksidan menggunakan zeolit alam

berasal dari Bayah, Jawa Barat.

Penelitian menggunakan zeolit telah dilakukan oleh Goriushkina et al

(2010) dalam imobilisasi glukosa oksidase, dan Balal et al (2009) untuk

memodifikasi elektrode pasta karbon untuk mengukur kadar dopamin dan

triptofan. Hasil kedua penelitian tersebut, zeolit dapat meningkatkan nilai arus dan

stabilitas lebih tinggi untuk percobaan yang dilakukan secara berulang-ulang.

Selain itu, pengukuran yang diperoleh menjadi lebih selektif dan sensitif sesuai

dengan syarat efektivitas suatu biosensor.

Penelitian tentang biosensor antioksidan dengan menggunakan zeolit Bayah

telah dilakukan oleh Weniarti (2011). Penelitian tersebut menggunakan zeolit

pada ekstrak enzim SOD (superoksida dismutase) Deinococcus radiodurans

diperoleh nilai aktivitas SOD cenderung stabil selama 8 jam. Namun dalam

penelitian tersebut zeolit yang digunakan belum diaktivasi, penentuan konsentrasi

optimum ekstrak enzim SOD, dan stabilitas elektrode pasta karbon belum

dilakukan. Selain itu, zeolit Bayah juga digunakan dalam penelitian Liyonawati

(2013) dengan kestabilan biosensor selama 4 jam. Ini membuktikan bahwa zeolit

Bayah, cocok untuk dijadikan sebagai matriks imobilisasi.

Selain itu, penelitian Weniarti menggunakan bakteri D. radiodurans sebagai

sumber enzim SOD. Bakteri tersebut merupakan suatu bakteri non patogen

berbentuk bulat dengan diameter 3-5 µm serta memiliki dinding sel tebal

(Makarova et al 2001) sehingga sulit untuk mengekstraksi SOD. Selain itu,

bakteri ini memerlukan media yang cukup kompleks untuk menghasilkan koloni.

Oleh karena itu, dicoba menggunakan bakteri lain penghasil SOD, yaitu

Escherichia coli.

Proses penumbuhan bakteri E.coli tergolong lebih mudah karena cukup

ditumbuhkan pada media sederhana serta mudah dalam penanganannya. Bakteri

E. coli memiliki tingkat stabilitas yang tinggi dan lebih potensial sebagai

biosensor dibandingkan dengan bakteri lainnya seperti B. subtilis dan T. filiformis

(Ikeda et al. 2001). Salah satu biosensor antioksidan menggunakan E. coli telah

dilakukan oleh Liyonawati (2013) dimana E. coli diimobilisasi dalam elektroda

pasta karbon. Berdasarkan beberapa alasan sebelumnya, maka penelitian ini

bertujuan menentukan aktivitas dan stabilitas enzim SOD dari sel bakteri E. coli

menggunakan zeolit Bayah.

3

TINJAUAN PUSTAKA

Biosensor Antioksidan

Biosensor merupakan perangkat sensor yang menggabungkan senyawa

biologi dengan suatu transduser. Senyawa aktif biologi tersebut berinteraksi

dengan molekul yang akan dideteksi (molekul sasaran). Hasil interaksi berupa

arus listrik, panas, potensial listrik yang ditunjukan oleh transduser dan diproses

menjadi sinyal (Gambar 1). Biosensor terdiri dari tiga unsur, yaitu unsur biologi,

transduser, dan sistem elektronik pemroses sinyal. Unsur biologi digunakan untuk

mendesain biosensor seperti enzim, DNA, jaringan, organel, bakteri dan jasad

renik.

Gambar 1 Skema umum tahapan operasi suatu biosensor secara elektrokimia

(Rivas et al. 2005)

Suatu biosensor berbasis elektrokimia pada dasarnya terdiri dari suatu

elektrode yang dimodifikasi. Proses modifikasi menyebabkan interaksi dengan

sampel melalui pengenalan urutan komplementernya, antara lain pH, kekuatan

ion, dan temperatur tertentu (Marraza 1999). Prinsip penelitian biosensor

elektrokimia berdasarkan pada daya hantar listrik yang memanfaatkan potensial

reduksi dari reaksi reduksi-oksidasi dimana reaksi redoks akan menghasilkan arus

yang akan sebanding dengan konsentrasi analat yang dianalisis (Martin 2011).

Salah satu biosensor yang sudah sering diujikan adalah biosensor

antioksidan. Biosensor antioksidan ini menggunakan mekanisme pengukuran

kapasitas antioksidan melalui reaksi redoks. Suatu enzim pengikat radikal (SOD)

akan mengoksidasi radikal superoksida yang berasal dari substrat menjadi O2 dan

H2O2. Hasil dari reaksi tersebut dideteksi oleh elektrode tranduser sebagai sinyal

listrik dan menghasilkan grafik arus listrik yang menunjukan reaksi oksidasi dan

reduksi.

Gambar 2 Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan

Kelebihan dari biosensor antioksidan berdasarkan penelitian terdahulu

antara lain hasil aktivitas arus yang dihasilkan tinggi, selektif, dan spesifikasi

reaksi yang dikatalisnya (Mateo et al. 2007). Selain itu, menggunaan sampel dari

bahan alami seperti teh dan produk herbal (Campanella et al. 2003), anggur

4

merah dan anggur putih (Campanella et al. 2004). Hasil korelasi yang sangat baik

antara metode biosensor dengan voltrametri siklik.

Escherichia coli dan Superoksida Dismutase

Bakteri Escherichia coli berasal dari filum Proteobacteria, kelas Gamma

Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, family Enterobacteriaceae, genus

Escherichia, dan spesies Escherichia coli (Holt et al. 1994). Bakteri ini memiliki

diameter 0.5 µm dengan panjang tubuh 2 µm dan berbentuk batang (Gambar 3).

Bakteri E. coli termasuk dalam bakteri gram negatif dan biasa hidup di kisaran

suhu 20-40 oC dengan suhu optimum 37

oC . Habitat alami E. coli terletak di

dalam splotan usus manusia dan hewan tingkat tinggi lainnya (Herawati 2012).

Selain itu, kelebihan bakteri ini antara lain memiliki tingkat stabilitas yang tinggi

dengan ketahanan periode hidup dan suhu tinggi (Iswantini et al. 2011).

Gambar 3 Morfologi Echerichia coli

Bakteri E. coli mengandung berbagai macam enzim didalam sitoplasma dan

permukaan periplasmanya. Enzim yang terdapat di bagian periplasma E. coli

antara lain glukosadehidrogenase (GDH) dan superoksida dismutase (SOD). SOD

merupakan suatu metaloenzim dan enzim detoksifikasi yang dapat mengoksidasi

radikal bebas menjadi oksigen dan hidrogen peroksida (Mc Cord dan Fridovich

1969). Enzim SOD dihasilkan oleh bakteri yang mengkonsumsi oksigen dimana

enzim ini berperan sebagai pertahanan tubuh terhadap spesi oksigen reaktif hasil

efek samping metabolisme dan respirasi. Bakteri penghasil SOD lainnya adalah

Thermothrix sp., Deinococcus radiodurans, Rhodothermus sp., dan Bacillus sp

(Benov et al. 1996).

Berdasarkan kofaktor logam utamanya, SOD terbagi atas Cu/Zn-SOD, Mn-

SOD, Fe-SOD, dan Ni-SOD (Buyukuslu et al. 2006). Mekanisme pembentukan

SOD berasal dari hasil oksidasi xantina dengan katalis xantina oksidae

(Campanella et al 2004), dengan mengkatalis radikal O2- menjadi hidrogen

peroksida (H2O2 dan oksigen) (Emregul 2005).

Xantin + H2O2 + O2 + Xantin oksidase asam urat + 2H+ + O2

O2- + O2

- + 2H

+ O2 + H2O2

Kelebihan enzim SOD antara lain spesifik mengatalis radikal superoksida

menjadi oksigen dan peroksida, serta tahan terhadap panas saat diaplikasikan pada

makanan (Donnely et al. 1989). Faktor inilah yang menyebabkan SOD dapat

dimanfaatkan sebagai biosensor antioksidan.

Penelitian menggunakan E. coli sebagai biosensor telah sering dilakukan,

namun berbatas pada analisis enzim GDH sebagai biosensor glukosa. Iswantini et

al. (2011) menggunakan enzim didalam bakteri E. coli sebagai pengganti enzim

5

murni untuk biosensor glukosa dan metode elektrokimia dalam pengukuran

aktivitas enzim. Metode tersebut cukup efektif karena penggunaan enzim aktif

tidak memerlukan proses pemurnian. Selain itu, penggunaan E. coli sebagai

biosensor antioksidan juga telah dilakukan oleh Liyonawati (2013) dimana bakteri

dan ektrak kasar E. coli diimobilisasi dalam sebuah elektrode pasta karbon dan

diukur aktivitasnya. Dalam penelitian ini diperoleh hasil bahwa ekstrak E. coli

imobilisasi lebih stabil dibandingkan dengan bakteri E. coli imobilisasi.

Zeolit Bayah

Zeolit adalah batuan mineral berasal dari silika berbentuk halus dan

merupakan produk sekunder yang stabil pada kondisi permukaan yang berasal

dari proses pelapukan, sedimentasi, maupun aktivitas hidrotermal (Hamdan 2005).

Zeolit terdiri dari pori yang terbuka ke permukaan luar partikel sehingga terjadi

transfer massa. Pori memerangkap molekul atau ion dengan berbagai ukuran atau

melepaskan molekul lain yang tidak sesuai pori.

Sistem penjerapan zeolit dalam mengikat cairan yang direaksikan antara lain

karena faktor pori berukuran nano yang dimilikinya. Pori berukuran nano tersebut

bervariasi tergantung pada zeolit yang digunakan. Akibat adanya variasi bentuk

tersebut, pori memerangkap molekul atau ion dengan berbagai ukuran atau

sebaliknya melepaskan molekul lain yang tidak sesuai dengan ukuran pori.

Sintesis polimer anorganik in situ dalam zeolit alam menghasilkan material baru

yang memiliki kandungan sifat fisik dan kimia yang sangat berbeda

(Hadiyawarman et al. 2008).

Salah satu zeolit yang digunakan sebagai matriks imobilisasi biosensor

antioksidan adalah zeolit Bayah. Menurut PTBIN-BATAN, zeolit alam Bayah

mempunyai diameter tinggi, tahan terhadap suhu tinggi, berstruktur sangkar dan

termasuk dalam zeolit jenis klipnotilolit. Rumus molekul zeolit klipnotilolit yaitu

(Na4K4) (Al8Si40O96).24H2O dengan nilai kapasitas tukar kation pada zeolit Bayah

sebesar 48 cmol/kg (Arif 2011). Nilai kapasitas zeolit ini lebih rendah

dibandingkan dengan zeolit sintesis sekitar 250-450 cmol/kg (Supandi 1998).

Gambar 4 Struktur zeolit jenis klipnotilolit (Arif 2011)

6

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan adalah sel bakteri Escherichia coli, media

pertumbuhan bakteri, xantina oksidase (XO), xantina, etanol 8%, grafit, ferosena,

larutan bufer fosfat pH 7-11, parafin cair, zeolit bayah, dan dimetil sulfoksida

(DMSO).

Alat-alat yang digunakan adalah eDAQ, Potentiostat-Galvanostat yang

dilengkapi dengan perangkat lunak Echem v2.1.0, sel elektrokimia,

DNA/Protein/Enzyme Analyzer BioSpec-1601 Shimadzu, Ultrasonic

Homogenizer UH-150, laminar air flow, High Speed Refrigerated Centrifuge

KUBOTA 6500, eppendorf Centrifuge 5415 R, inkubator, autoklaf, pipet mikro,

dan alat kaca lazim.

Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu aktivasi zeolit, pembuatan

elektrode pasta karbon dengan mediator ferosena, pengukuran arus elektrode,

penumbuhan sel bakteri dan ekstraksi SOD, optimasi aktivitas sel E. coli dan

ekstrak SOD E. coli, pengukuran optimasi aktivitas antioksidan sel bakteri, dan

penentuan stabilitas biosensor antioksidan sel bakteri E. coli.

Aktivasi Zeolit

Zeolit sebanyak 50 gram dicuci dengan akuades hingga netral, disaring, dan

dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC. Zeolit yang telah dikeringkan

diaktivasi dengan menambahkan larutan HCl 3M sebanyak 250 mL dalam gelas

piala dan diaduk selama 1 jam. Zeolit yang telah diaktivasi disaring dan dicuci

dengan akuades sampai netral. Larutan hasil saringan diuji kandungan klorin

dengan AgNO3 dan dicuci kembali dengan akuades sampai tidak mengandung

klorin. Setelah larutan netral dan bebas klorin, zeolit dikeringkan pada suhu 300 oC selama 3 jam. Zeolit yang telah diaktivasi kemudian dihaluskan dan diayak

dengan ayakan 100 mesh.

Elektrode Pasta Karbon dengan Mediator Ferosena

Bubuk ferosena sebanyak 3 mg dilarutkan dengan 1 mL DMSO, kemudian

ditambahkan dengan grafit sebanyak 100 mg. Campuran grafit didiamkan hingga

cukup kering selama 2 jam dan diuapkan dengan pengering vakum. Grafit yang

telah kering ditambahkan dengan larutan parafin sebanyak 35 µL hingga terbentuk

pasta. Pasta karbon dimasukkan ke dalam batang elektrode hingga cukup padat

dan dihaluskan dengan amplas dan kertas minyak (Trivadilla 2011).

7

Pengukuran Arus Elektrode Pasta Karbon

Elektrode pasta karbon yang telah diperoleh selanjutnya diukur besar

arusnya dengan larutan elektrolit bufer fosfat pH 9. Elektrode dengan arus

tertinggi digunakan sebagai elektrode dalam penelitian. Elektrode pasta karbon

yang digunakan harus seragam panjang kawat Cu, besar diameter batang

elektrode, dan tinggi grafit pasta karbon pada elektrode.

Penumbuhan Sel E. coli dan Ekstraksi Sel E.coli

Bakteri ditumbuhkan pada media LB (Luria Bertani) miring selama 24 jam

dengan suhu inkubator sebesar 37 oC. Bakteri yang telah tumbuh dipindahkan ke

media LB cair 5 mL sebagai starter dan diinkubasi selama 24 jam sehingga

mencapai nilai OD610 = 0.5-1.0. Bakteri kemudian diinokulasi ke dalam media LB

cair 50 mL dan diinkubasi kembali selama 24 jam dengan suhu 37 oC. Sel bakteri

dipanen dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit

dan dicuci dengan akuades steril sebanyak 100 µL selama 10 menit. Setelah itu,

sel bakteri diresuspensikan dengan larutan buffer fosfat pH 7.5.

Pada pemecahan sel bakteri menjadi ekstrak kasar bakteri, suspensi

biomassa sel bakteri yang telah terpisah disonikasi dengan Ultrasonic

Homogenizer dengan pulse 50% dan output 5, dengan interval 10 x 2 menit

dengan interval berhenti setiap 1 menit. Sel bakteri yang telah disonikasi

kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.

Ekstrak kasar bakteri diukur konsentrasinya dengan menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

Optimasi Aktivitas Sel E.coli dan Ekstrak kasar E. coli

Sel bakteri dicampur dengan nanokomposit zeolit. Zeolit disuspensikan ke

dalam 5 mL larutan bufer fosfat yang telah dimasukkan sel bakteri sebanyak 20

µL. Campuran diaduk secara konstan selama beberapa saat. Hal ini bertujuan

untuk memberikan keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya bagi

bakteri. Elektrode pasta karbon dimasukkan dan dilakukan pengukuran aktivitas.

Ekstrak kasar bakteri dicampur dengan nanokomposit zeolit. Zeolit

disuspensikan ke dalam 5 mL larutan bufer fosfat yang telah dimasukkan ekstrak

kasar bakteri sebanyak 20 µL. Campuran diaduk secara konstan selama beberapa

saat. Elektrode pasta karbon dimasukkan dan dilakukan pengukuran aktivitas.

Optimasi Aktivitas Antioksidan Sel E. coli dan Ekstrak kasar E. coli

Pengukuran secara elektrokimia dengan metode voltametri siklik

menggunakan seperangkat alat potensiostat/galvanostat eDAQ dan komputer

dengan perangkat lunak pengolah data Echem V2.1.0. Elektrode yang digunakan

antara lain elektrode Ag/AgCl sebagai pembanding, elektrode Pt/Ti sebagai

elektrode bantu, dan elektrode pasta karbon sebagai elektrode kerja. Parameter

yang digunakan dalam pengukuran antara lain, Mode: Clyclic, Initial E: -400 mV,

8

Final E: -400 mV, Rate: 250 mV/s, Step W: 20 ms, Upper E: 600 mV, Lower E: -

400 mV, dan Range: 100 µV.

Senyawa radikal superoksida dihasilkan melalui reaksi enzimatis xantina-

XO (xantin oksidase). Radikal tersebut didismustasi menghasilkan senyawa O2

dan H2O2 dengan SOD. Larutan XO 0,1 U/mL sebanyak 100 μL ditambahkan

pada sel pengukuran dan puncak blangko adalah puncak arus anode yang

terbentuk. Selanjutnya seluruh enzim baik yang ekstrak bakteri maupun sel bakteri

utuh diukur masing-masing aktivitasnya. Substrat xantina 2,1 mM sebanyak 1 mL

ditambahkan dan diukur kembali perubahan puncak arus anode yang terjadi

(Trivadila 2011).

Variasi optimasi yang dilakukan pada sel dan ekstrak kasar bakteri meliputi

suhu 20-40 oC, pH 7-11, dan jumlah zeolit 50-250 mg. Variasi optimasi ini

diperoleh menggunakan perangkat lunak statistika Minitab dengan metode

Response Surface Method (RSM). Kombinasi yang diperoleh selanjutnya

dilakukan untuk mendapatkan nilai aktivitas optimumnya.

Pengukuran Aktivitas Antioksidan Sel E. coli

Proses uji aktivitas dilakukan pada rentang konsentrasi xantina 0,20 – 1,00

mM dengan interval 0,1 mM pada prosedur pengukuran elektrokimia. Selanjutnya

dibuat kurva hubungan antara konsentrasi xantina dan aktivitas bakteri E. coli.

Penentuan Stabilitas Biosensor Antioksidan Sel Bakteri E. coli

Elektrode pasta karbon yang telah buat kemudian digunakan untuk

mengukur aktivitas E. coli secara langsung. Seluruh nilai aktivitas yang diperoleh

pada pengukuran awal dianggap sebesar 100%. Aktivitas diukur kembali selama 8

jam dengan interval 2 jam. Persen aktivitas SOD diukur dengan menggunakan

rumus : I saat ke-jam (A)

I saat awal (A) × 100%

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penumbuhan Sel E. coli dan Ekstraksi Sel E. coli

Pertumbuhan bakteri merupakan penambahan jumlah atau volume atau

ukuran sel bakteri mengikuti pola pertumbuhan tertentu berupa kurva

pertumbuhan sigmoid. Kurva pertumbuhan sigmoid terdiri dari empat fase, yaitu

fase log (fase lambat), fase eksponensial (fase cepat), fase stasioner (fase statis),

dan fase kematian populasi. Fase eksponensial merupakan fase metabolisme sel

paling aktif, dan sintesis badan sel sangat cepat dengan jumlah konstan hingga

fase habis. Media pertumbuhan bakteri salah satunya adalah LB. Media ini

mengandung tripton sebagai vitamin, NaCl sebagai sumber mineral, dan ekstrak

khamir sebagai nutrisi makanan bagi bakteri.

9

Proses pertumbuhan bakteri pada penelitian ini diawali dengan peremajaan

bakteri ke dalam media LB miring dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah tumbuh,

bakteri dipindahkan ke dalam media LB cair dan diinkubasi hingga mencapai nilai

OD610= 0.5. Nilai OD merupakan nilai kekeruhan kultur bakteri, dimana nilai

kekeruhan kultur berbanding lurus dengan jumlah sel bakteri (Purwoko 2007).

Selanjutnya bakteri dipisahkan dari media tumbuhnya dengan cara di sentrifugasi

dan direndam dengan larutan NaCl 0.85%. Larutan NaCl 0.85% berfungsi sebagai

pelarut yang disamakan dengan habitat hidup bakteri.

Bakteri E. coli merupakan bakteri Gram negatif dimana kandungan enzim

lebih banyak terdapat di dalam sitoplasma tubuhnya sehingga harus dilakukan

pemecahan sel bakteri. Enzim merupakan suatu molekul biologis bersifat selektif

untuk substrat yang ditargetkan dan memiliki aktivitas katalitik yang tinggi

(Putzbach 2013). Dinding sel bakteri yang berukuran sekitar 10-15 nm dipecah

menggunakan Ultrasonic Homogenizer dengan konsentrasi yang diperoleh

10680.60 µg/mL. Sel bakteri utuh dan ekstrak kasar bakteri yang diperoleh

kemudian diukur aktivitasnya.

Arus Elektroda Pasta Karbon

Penyeragaman elektroda pasta karbon dilakukan secara fisik dan kimia.

Perlakuan fisik dilakukan dengan menyamakan panjang kawat Cu sebesar 10 cm,

diameter batang elektrode sebesar 0.1 mm, dan tinggi grafit pasta karbon sebesar

0.1 mm. Perlakuan kimia dilakukan dengan pengukuran arus elektroda pasta

karbon menggunakan larutan elektrolit bufer fosfat pH 9. Larutan bufer fosfat

akan bereaksi dengan permukaan pasta karbon untuk menghasilkan arus berupa

voltamogram. Berikut contoh voltamogram yang dihasilkan oleh pasta karbon.

Gambar 5 Voltamogram siklik pengukuran arus elektroda pasta karbon

Gambar 5 merupakan bentuk voltamogram siklik elektroda pasta karbon

yang telah dilakukan secara berulang-ulang. Garis pertama yang muncul pada

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

-0.00004

-0.00003

-0.00002

-0.00001

0.00000

0.00001

0.00002

Aru

s (µ

A)

Potensial (V)

10

voltamogram menunjukan garis proses oksidasi dengan adanya puncak arus

oksidasi. Garis kedua menunjukan proses reduksi yang terjadi pada elektrode

pasta karbon. Elektrode yang memiliki puncak arus oksidasi-reduksi dan rentang

voltamogram yang cukup seragam digunakan untuk pengukuran optimasi, uji

aktivitas, dan stabilitas biosensor selanjutnya.

Optimasi Aktivitas Antioksidan Sel

Optimasi sel bakteri dengan penambahan zeolit

Metode pengukuran optimasi aktivitas sel bakteri menggunakan metode

voltametri siklik. Voltametri siklik adalah metode analisis elektrokimia yang

didasarkan pada pengukuran arus listrik sebagai fungsi aliran potensial, dengan

potensial awal sama dengan potensial akhir (Hattu 2009). Analisis voltammetri

siklik sering dilakukan untuk analisis kimia salah satunya mempelajari reaksi

katalisis enzimatik dimana lebih ditekankan pada kinetika dan dinamika reaksi

(Skoog dkk.1998).

Optimasi aktivitas sel bakteri dilakukan beberapa variasi seperti suhu dan

pH larutan bufer fosfat (Lampiran 2). Campuran kemudian ditambahkan dengan

larutan XO dan xantina. Penambahan XO dan xantina pada bakteri akan terjadi

reaksi enzimatis xantina dengan xantina oksidae menghasilkan radikal

superoksida. Radikal superoksida akan didismutasi membentuk O2 dengan katalis

enzim SOD sebagai reaksi :

2H

+ + 2O2

•- O2 + H2O2

Persamaan tersebut menjelaskan reaksi oksidasi-reduksi dalam

voltamogram yang secara bertahap menyebabkan kenaikan arus. Voltamogram

merupakan grafik hubungan antara arus dan potensial listrik dengan reaksi reduksi

dan oksidasi didalamnya (Hattu 2009). Berdasarkan hasil voltamogram, arus

puncak oksidasi meningkat seiring ditambahkan larutan. Hal ini menandakan

adanya aktivitas antioksidan berupa transfer elektron antara enzim dari sel E. coli

pada larutan dengan permukaan elektrode pasta karbon.

Hasil voltamogram menunjukan terjadi peningkatan arus oksidasi yang

menandakan bahwa zeolit mempengaruhi aktivitas antioksidan sel bakteri

(Gambar 6). Kondisi tersebut disebabkan zeolit memiliki kemampuan adsoprsi

terhadap adsorbat tertentu. Selain itu, kapasitas tukar ion dan selektivitas yang

tinggi dalam zeolit bisa digunakan untuk pengembangan biosensor (Valdes et al.

2006).

Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan menggunakan elektrokimia

antara lain radikal bebas yang telah terikat dengan enzim SOD akan menghasilkan

elektron-elektron. Elektron-elektron tersebut akan ditangkap oleh mediator dan

terjadi reaksi bolak-balik yang akan menghasilkan elektron bebas. Elektron bebas

akan ditangkap oleh permukaan elektrode dan dikirimkan kepada transduser untuk

diolah menjadi data, dalam bentuk voltamogram.

SOD

11

Gambar 6 Voltamogram siklik sel bakteri dengan penambahan zeolit

Hasil analisis RSM menunjukkan plot kontur yang baik dengan bulatan

sempurna pada bulatan lebih gelap yang menjelaskan nilai arus tertinggi. Kontur

merupakan garis-garis yang menunjukan nilai ekspektasi respon aktivitas berupa

arus minimum hingga maksimum. Plot kontur menunjukan Hold Values yang

akan digunakan sebagai Starting Value pada Response Optimizer. Response

Optimizer berfungsi untuk menganalisis kondisi optimum aktivitas antioksidan

dari sel bakteri. Hasil optimum yang diperoleh untuk sel bakteri dengan zeolit,

yaitu suhu 30 oC, pH 9, dan zeolit 150 mg (Gambar 7).

Hasil optimasi sel bakteri dengan penambahan zeolit ini berbeda dengan

hasil penelitian Weniarti (2011). Weniarti (2011) menunjukan bahwa dengan

menggunakan sel bakteri Deinococcus radiodurans dengan variasi pH, suhu, dan

zeolit yang sama, plot kontur tidak menunjukan nilai puncak maksimum sehingga

bakteri tidak memiliki aktivitas untuk meningkatkan puncak oksidasi. Sehingga

dapat disimpulkan bahwa sel bakteri E. coli lebih baik digunakan sebagai

komponen pengenal hayati biosensor antioksidan dibandingkan dengan

Deinococcus radiodurans.

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

-60

-40

-20

0

20

40

60

Aru

s (

A)

Potensial (V) Vs Ag/AgCl

PK nonfer

PK fer

PK fer+fer

bufer+fer+XO

bufer+fer+xo+xan

12

Gambar 7 Kontur sel bakteri dengan penambahan zeolit

Optimasi ekstrak kasar bakteri dengan penambahan zeolit

Bakteri E. coli mengandung beberapa enzim, antara lain enzim glukosa

dehidrogenase (GDH), enzim betalaktamase, enzim protease, dan enzim SOD.

Enzim SOD yang terkandung dalam E. coli terdiri dari dua jenis, yaitu Mn-SOD

yang terdapat dalam sitoplasma dan Cu/Zn-SOD yang terdapat dalam periplasma

(Gort 1999). Pada pengukuran optimasi ekstrak, dilakukan pemecahan sel bakteri

utuh (tanpa pemurnian). Hal ini dilakukan untuk memperoleh kandungan enzim

SOD yang lebih banyak. Selain itu, enzim merupakan komponen makhluk hidup

yang secara bertahap akan kehilangan aktivitasnya. Sehingga dibutuhkan

komponen tambahan lain berupa matriks imobilisasi seperti silika dan zeolit.

Pengukuran ekstrak kasar bakteri dengan penambahan zeolit dilakukan

variasi jumlah ulangan yang sama persis dengan sel bakteri utuh. Hasil plot kontur

pada metode ini memberikan nilai Hold Values dengan suhu 30 oC, bufer fosfat

pH 9, dan jumlah zeolit 150 mg (Gambar 8). Namun, arus maksimum tidak

terlihat pada grafik, tidak terjadi bulatan sempurna seperti pada plot kontur sel

bakteri, dan tidak memberikan nilai Response Optimizer. Hal dapat disebabkan

oleh rusaknya enzim SOD pada ekstrak kasar E. coli selama proses pengukuran.

Hasil penelitian apabila dibandingkan dengan Liyonawati (2013) sangat

berbeda, dimana ekstrak kasar E. coli memberikan nilai Response Optimizer

dengan suhu 40 oC, pH 7, dan jumlah zeolit 30 mg. Perbedaan tersebut disebabkan

oleh perbedaan proses pengukuran aktivitas. Liyonawati (2013) menggunakan

teknik imobilisasi enzim dimana ekstrak kasar dengan zeolit ditaruh dalam

permukaan elektrode pasta karbon. Berdasarkan hasil ini disimpulkan bahwa

perlakuan ekstrak kasar E. coli tidak cocok untuk dianalisa secara langsung.

13

Gambar 8 Kontur ekstrak SOD dengan zeolit

Aktivitas Antioksidan Sel E.coli

Uji aktivitas optimum substrat xantina dilakukan pada rentang 0.20-1.00

mM (interval 0.1 mM) menggunakan bufer fosfat pH 9.14, suhu 25 oC, zeolit

142.9293 mg. Variasi konsentrasi xantina dilakukan untuk mengetahui selisih arus

maksimum aktivitas antioksidan terhadap xantina. Suhu yang digunakan sebesar

25 oC bertujuan untuk memudahkan aplikasi biosensor antioksidan sehingga dapat

langsung digunakan pada suhu ruang.

Gambar 9 menunjukan grafik hasil variasi konsentrasi xantina terhadap

aktivitas antioksidan sel bakteri E. coli dengan penambahan zeolit yang identik

dengan kurva Michaelis-Menten. Gambar 9 memperlihatkan aktivitas antioksidan

yang berubah-ubah pada konsentrasi 0.5 mM dan 0.8 mM mengalami penurunan

arus. Pada konsentrasi selanjutnya arus mengalami peningkatan hingga mencapai

arus tertinggi di konsentrasi substrat xantina 0.7 mM. Hasil ini diambil rentang

linieritas sel bakteri E. coli 0.2-0.7 mM.

Hasil ini berbeda dengan reaksi katalisis oleh enzim pada berbagai

konsentrasi substrat yang seharusnya mengalami 2 fase, yaitu (1) jika konsentrasi

substrat masih rendah, daerah yang aktif pada enzim tidak semuanya terikat

substrat (2) jika jumlah molekul substrat meningkat maka daerah yang aktif terikat

seluruhnya oleh substrat (Trivadilla 2011). Jadi dapat disimpulkan bahwa aktivitas

antioksidan sel bakteri yang mengandung SOD belum seluruhnya terikat dengan

substrat xantina.

14

Gambar 9 Hubungan konsentrasi xantina dengan aktivitas antioksidan sel E. coli

dengan zeolit

Gambar 10 Rentang linier antara xantina dengan aktivitas antioksidan sel E. coli

dengan zeolit

Gambar 10 menunjukkan linieritas xantina dan aktivitas sel E. coli. Nilai

kisaran linieritas yang diperoleh masih cukup rendah sebesar 0.726. Hal ini

disebabkan hanya kandungan enzim SOD dalam periplasma E. coli yang berikatan

dengan substrat. Enzim SOD pada sitoplasma belum seluruhnya berinteraksi

dengan substrat.

Penentuan kinetika enzim menggunakan parameter konstanta Michaelis-

Menten (KM app) dan laju reaksi maksimum nyata (Vmaks app). Parameter tersebut

dimasukkan ke dalam metode Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf, dan Eadie-

Hofstee. Berdasarkan nilai koefisien determinasi (R2), nilai metode Hanes-Woolf

lebih besar dibandingkan dengan kedua metode lainnya sehingga pada penelitian

sel E. coli + zeolit secara langsung mengikuti metode Hanes-Woolf.

Berdasarkan metode Hanes-Woolf diperoleh persamaan garis y=0.847x +

0.228 dengan R2=0.851. Melalui persamaan ini diperoleh nilai KM app sebesar

0.2691 mM dan Vmaks sebesar 1.1806 µA. Nilai KM app merupakan nilai perkiraan

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Akti

vit

as A

nti

oksi

dan

Sel

E. co

li

(µA

)

[xantina] (mM)

y = 0.475x + 0.501

R² = 0.726

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Ak

tivit

as A

nti

ok

sid

an S

el E

. co

li

((µ

A)

[xantina] (mM)

15

disosiasi konstan antara enzim dengan substrat, semakin kecil nilai KM app maka

semakin kuat enzim mengikat substrat. Nilai Vmaks adalah indikator aktivitas enzim

dimana semakin besar nilainya maka semakin tinggi aktivitas enzim. Dari nilai KM

app dapat dikatakan bahwa enzim SOD E. coli lebih kuat mengikat substrat xantina

dan melalui nilai Vmaks dapat dikatakan bahwa aktivitas enzim SOD E. coli sangat

tinggi.

Nilai KM app ini lebih kecil dibandingkan nilai KM app pada penelitian Weniarti

(2011), yaitu 1.096 mM hampir mendekati nilai KM app SOD murni sebesar 0.355

mM (Sigma-Aldrich 2011). Perbedaan nilai tersebut berhubungan dengan

perbedaan jenis bakteri penghasil SOD dan tingkat kemurnian enzim. Pada sel

bakteri E. coli, enzim SOD terdapat dalam periplasma tubuh dengan jumlah yang

lebih kecil sehingga enzim bisa lebih kuat mengikat substrat. Dapat disimpulkan

bahwa perbedaan sumber enzim akan mempengaruhi nilai aktivitas karena adanya

pengaruh respon terhadap lingkungan.

Gambar 11 Plot Hanes – Woolf sel bakteri E. coli dengan zeolit

Stabilitas Biosensor Antioksidan Sel Bakteri E. coli

Stabilitas aktivitas bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain

kestabilan elektrode, pengaruh matriks imobilisasi, serta pengaruh lingkungan

seperti suhu dan pH. Salah satu elektrode kerja yang memiliki kestabilan cukup

tinggi yaitu elektrode pasta karbon termodifikasi ferosena. Beberapa hal yang

perlu diperhatikan pada pemilihan elektrode kerja, antara lain sifat redoks analit,

arus latar belakang pada daerah potensial pengukuran, keberulangan permukaan

elektrode, dan biaya pembuatannya (Wang 2000). Penambahan ferosena berfungsi

sebagai mediator untuk meningkatkan sensitivitas karena sifatnya stabil, memiliki

potensial redoks yang lebih rendah dari potensial analat, tidak bereaksi langsung

dengan substrat enzim, dan kurang sensitif terhadap pH dan efek kekuatan ion

(Trivadilla 2011). Selain itu, pemilihan matriks imobilisasi menggunakan zeolit

alam yang memiliki sisi aktif pada permukaan pori untuk lebih melindungi bakteri

dari perubahan suhu dan pH ekstrem.

y = 0.847x + 0.228

R² = 0.851

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

[xan

tin

a]/I

[xantina] (mM)

16

Pengukuran stabilitas aktivitas bakteri E.coli dilakukan dengan konsentrasi

maksimum substrat xantina 0.7 mM, pH 9.14, suhu 25 oC, dan zeolit sebanyak

150 mg dengan waktu pengukuran selama 8 jam. Kurva stabilitas (Gambar 12)

menunjukan hubungan antara waktu pengukuran dengan aktivitas antioksidan

(%). Hasil stabilitas menunjukan nilai grafik yang cenderung menurun setiap dua

jamnya. Pada dua jam pertama, nilai stabilitas aktivitas stabil, namun, pada jam

ke-4 stabilitas mulai turun hingga mencapai 56.35%, nilai ini masih dikatakan

cukup stabil karena masih berada diatas 50%. Pada jam ke-enam, nilai stabilitas

mulai menurun drastis hingga mencapai 31.33% dan terus menurun hingga

24.83%. Berdasarkan nilai ini dapat disimpulkan bahwa aktivitas bakteri E. coli

secara langsung yang diukur dengan metode elektrokimia hanya stabil selama 2 -

4 jam.

Gambar 12 Kurva stabilitas biosensor antioksidan berbasis sel bakteri E. coli

dengan penambahan zeolit

100.00 97.86

56.35

31.3324.83

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8

Ak

tivit

as a

nti

ok

sid

an r

elat

if (

%)

Waktu (jam)

17

SIMPULAN

Simpulan

SOD pada sel bakteri dengan penambahan zeolit alam menghasilkan

optimasi aktivitas yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak kasar bakteri yang

ditambahkan zeolit alam. Nilai Km app sel bakteri E. coli dengan zeolit sebesar

0.2691 mM dengan kestabilan aktivitas yang selama 2 - 4 jam. Hal ini

menunjukan bahwa pengukuran aktivitas sel bakteri E. coli lebih baik secara

langsung dibandingkan dengan proses imobilisasi.

Saran

Penelitian lanjutan menggunakan matriks imobilisasi selain zeolit alam serta

penggunaan mikroba lain selain E. coli sebagai penghasil enzim SOD perlu

dilakukan untuk meningkatkan kestabilan dan kinerja biosensor antioksidan.

Penggunaan jenis bakteri E. coli selain ATC220 untuk melihat seberapa banyak

kandungan enzim SOD didalam sel. Selain itu, penambahan rentang konsentrasi

substrat untuk memperoleh nilai maksimum aktivitas sel bakteri E. coli sebagai

biosensor antioksidan.

DAFTAR PUSTAKA

Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bagan media

pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen. [Tesis]. Bogor: Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Balal K, Mohammad H, Bahareh, Ali B, Maryam H, Mozhgan Z. 2009. Zeolite

nanoparticle modified carbon paste elektrode as a biosensor for

simultaneous determination of dopamine and tryptophan. J Chin Chem 56:

789-796.

Battista JR et al. 2003. The structure of Deinococcus radiodurans. Science 302:

567-568.

Bhatia R, Gupta AK, Anup KS, Brinker CJ. 2000. Aqueous sol-gel process for

protein encapsulation. Chem. Mater 12: 2434-2441.

Benov LT, Beyer Jr WF, Stevens RD, Fridovich I. 1996. Purification and

characterization of the Cu, Zn SOD from Escherichia coli. Free Rad Bio

Med 21 (1): 117-121.

Bjelakovic G et al. 2007. Mortality in randomized trials of antioxidant

supplements for primary and secondary prevention: systematic review and

meta-analysis. JAMA 297 (8): 842-857.

18

Brooks BW, Murray RCE. 1981. Nomenclature for Micrococcus radiodurans and

other radiation-resistant cocci: Deinococcaceae fam. nov. and Deinococcus

gen. nov., including five species. J of Sys Bact 31: 353-360.

Buyukuslu N, Celik O, Atak C. 2006. The effect of magnetic field on the activity

of superoxide dismutase. J Cell Mol Bio 5: 57 – 62.

Campanella L, Bonnani A, Tommaseti M. 2004. Biosensors for determination of

total and natural antioxidant capacity of red and white wines: comparison

with other spectrophotometric and flourimetric methods. J Biosen Bioelect

19 : 641-651.

Campanella L, Martini E, Tommaseti M. 2005. Antioxidant capacity of the algae

using a biosensor method. J Talanta. 902-911.

Cortina-Puig M & Camp M. 2007. Electrochemichal biosensors as a tool for

antioxidant capacity assessment. J Sens Actup 129:459 – 466.

Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytochrome c immobiliced on

a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. J Elec Act 49:2139-

2144.

Dalimartha S and Soedibyo M. 1998. Awet Muda dengan Tumbuhan Obat dan

Diet Suplemen. Trubus Agriwidya. Jakarta

Donnelly JK, McLellan KM, Walker JL, Robinson DS. 1989. Superoxide

Dismutase in Foods. A Review. J Food Chem 33: 243 - 270.

Dyatmiko W, Santosa MH, Hafid AF. 2000. Aktifitas Penangkapan Radikal

Bebas dalam Sistem Molekuler dan Seluler Sari Air Rimpang Tanaman

Obat Zingiberaceae. Lembaga Penelitian Universitas Airlangga. Pusat

Penelitian Obat Tradisional Univ. Airlangga. Surabaya.

Emregul E. 2005. Development of a new biosensor for superoxide radicals. Anal

Bioanal Chem 383 : 947 – 954.

Goriushkina TB, Kurc BA, Jr. AS, Dzyadevych SV. 2010. Application of zeolites

for immobilization of glucose oxidase in amperometric biosensors. Sensors

Electronics and Microsystem Technologies 1:36-42.

Gort AS, Ferber DM, Imlay JA. 1999. The regulation and role the periplasmatic

copper, zinc superoxide dismutase of Escherichia coli. Molecular

Microbiology 32 (1) 179-191.

Hadiyawarman, Rijal A, Nuryadin BW, Abdullah M, Khairurrijal. 2008. Fabrikasi

Material Nanokomposit Superkuat, Ringan dan Transparan Menggunakan

Metode Simple Mixing. J Nano Nanotek 1:14 – 21.

Hamdan H. 2005. Nanomaterials as catalysts in the production of fine chemicals.

Akta Kimindo 1:1 – 10.

Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis antihistamin setirezin dihidroklorida

dan deksklorfeniramin maleat dalam medium surfaktan menggunakan

elektroda pasta karbon. Bandung: Institut Teknologi Bandung.

Hudson BJF. 1990. Food Antioxidants. Elsevier Applied Science. New York.

Holt et al. 1994. Determinative Bacteriology. NSA: Lippincot William & Wilkins.

Ikeda et al. 1998. Electrochemical monitoring of in vivo recronstitution of glucose

dehydrogenase in Escherichia coli cells with externally added

pyrroloquinoline quinone. J. Electroanal. Chem. 449: 219–224.

19

Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011. Glucose biosensor using selected

Indonesia bacteria. Microbiology Indonesia 5:9-14.

Kirdeciler SK et al. 2011. A novel urea conductometric biosensor based on zeolite

immobilized urease. J Talanta 85:1435-1441.

Li H, Liu S, Dai Z, Bao J, Yang X. 2009. Applications of Nanomaterials in

Electrochemical Enzyme Biosensors. Sensors. 9. : 8547-8561.

Liu ZQ, Ma L, Zhou B, Yang L, Liu Z. 2000. Antioxidative effects of green tea

polyphenols on free radical initiated and photosensitized peroxidation of

human low density lipoprotein. J. Chem Phy Lip. 106 : 53-63.

Liu Song, Guo Xuefeng. 2012. Carbon nanomaterials field-effect-transistor-based.

Biosensors. NPG Asia Materials E23 (4)

Liyonawati. 2013. Aktivitas dan Stabilitas Superoksida Dismutase dari Ekstrak

Escherichia coli Diimobilisasi pada Zeolit Alam sebagai Biosensor

Antioksidan. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Institut Pertanian Bogor.

Makarova KS, Aravind L, Wolf YI, Tatusov RL, Minton KW, Koonin EV, Daly

MJ. 2001. Genome of the extremely radiation resistant bacterium

Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of comparative

genomics. Microbiol Mol Biol Rev 65: 44-79.

Marraza G, Chianella I, Mascini M. 1999. Disposable SNA electrochemical

sensor for hybridization detection. Bisens. Bioelectron 14:43-51.

Martin C. 2011. Prinsip biosensor. [terhubung berkala].

http://www.newsmedical.net.health/Biosensor-Principle-(Indonesian).aspx.

[2 April 2012].

Mateo C, Palono JM, Fernandez-Lorente G, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R.

2007. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via

immobilization techniques. J. enzmictec 40:1451-1463.

McCord JM, Fridovich I. 1969. Superoxide dismutase An enzyme for

eryrhrocuprein (hemocuprein). J. Biol. Chem. 224 (22): 6049–6055.

Nazaruddin. 2007. Biosensor Urea Berbasis Biopolimer Khitin sebagai Matriks

Imobilisasi. Jurnal Rekayasa Kimia dan Lingkungan 6: 41-44.

Purwoko T. 2007. Fisiologi Mikroba. Jakarta: Bumi Aksara.

Putzbach W, Ronkainen NJ. 2013. Immobilization Techniques in the Fabrication

of Nanomaterial-Based Electrochemical Biosensors: A Review. Sensors 13:

4811-4840

Rivas G, Pedano ML, Ferreyra N. 2005. Electrochemical biosensor for sequence-

specific DNA detection. Anal. Letters 38:2653-2703.

Saiapina OY et al. 2011. Conductometric enzyme biosensors based on natural

zeolite clinoptilolite for urea determination. J Mat Sci Eng 31:1490-1497.

Sigma-Aldrich. 2011. Product information. [terhubung berkala].

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Datasheet/2/s8160d

at.Par.0001.File.tmp/s8160dat.pdf. [2 des 2012]

Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. 1998. Principles of Instrumentals Analysis, 5th

Edition. New York: Saunders College Publishing.

20

Supandi, Purwanto A, Laz T. 1998. Analisis Struktur Zeolit Alam Bayah dengan

Metoda Rietan. Prosiding Pertemuan Ilmiah Ilmu Pengetahuan dan

Teknologi Bahan. 1999. Puslitbang Iptek Bahan – BATAN : 1411-2213.

Tawaha K, Alali FQ, Gharaibeh M, Mohammad M, El-Elimat T. 2007.

Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant

species. J. Foodchem 104: 1372-1378.

Trivadilla. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase

Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada permukaan elektroda pasta

karbon dan parameter kinetikanya. [Tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana,

Institut Pertanian Bogor.

Valdes MG, Perez-Cordoves AI, Diaz-Garcia ME. 2006. Zeolites and zeolite

based materials in analytical chemistry. J Trends Anal Chem 25: 24-30.

Wang J. 2000. Analytical Electrochemistry 2nd

Edition, John Wiley & Sons

Publishers. Inc., USA

Wei Di, Ivaska A. 2006. Electrochemical biosensors based on polyaniline. Chem

Anal 51: 839-852.

Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase

Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam

Indonesia. [Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Institut Pertanian Bogor.

Yuan WY, Bing T, Yuejin H. 2007. A novel gene of Deinococcus radiodurans

responsible for oxidative stress. Chin Sci Cul 15:2081 – 2087.

21

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Penumbuhan dan Peremajaan Mikrob

Panen Mikrob

Ekstraksi Protein Sitoplasma

Escherichia coli

Aktivasi Zeolit

Uji Aktivitas

Antioksidan Sel E. coli

dengan penambahan

zeolit

Optimasi Aktivitas

Antioksidan Sel E.coli

dan Ekstrak kasar E.

coli

Penentuan Stabilitas

Elektrode

Pembuatan Elektrode Pasta

Karbon Termodifikasi

Pengukuran dengan Metode Voltammetri Siklik

22

Lampiran 2 Kombinasi faktor-faktor peubah bebas Bakteri E. coli dengan

penambahan zeolit

Suhu (°C) pH Zeolit (mg)

24.05 7.81 90.540

35.95 7.81 90.540

24.05 10.19 90.540

35.95 10.19 90.540

24.05 7.81 209.460

35.94 7.81 209.460

24.05 10.19 209.460

35.95 10.19 209.460

20.00 9.00 150.000

40.00 9.00 150.000

30.00 7.00 150.000

30.00 11.00 150.000

30.00 9.00 50.000

30.00 9.00 250.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

23

Lampiran 3 Hasil optimasi bakteri E. coli dengan penambahan zeolit

Suhu pH Zeolit (mg) I (µA)

24.05 7.81 90.540 0.9783

35.95 7.81 90.540 1.8017

24.05 10.19 90.540 1.1633

35.95 10.19 90.540 1.865

24.05 7.81 209.460 0.9517

35.95 7.81 209.460 1.055

24.05 10.19 209.460 1.1967

35.95 10.19 209.460 1.7067

20.00 9.00 150.000 0.755

40.00 9.00 150.000 2.215

30.00 7.00 150.000 1.2033

30.00 11.00 150.000 1.6667

30.00 9.00 50.000 1.5033

30.00 9.00 250.000 0.935

30.00 9.00 150.000 8.815

30.00 9.00 150.000 1.8283

30.00 9.00 150.000 1.815

30.00 9.00 150.000 2.0167

30.00 9.00 150.000 1.97

30.00 9.00 150.000 2.355

24

Lampiran 4 Kombinasi faktor peubah bebas ekstrak kasar SOD E.coli dengan

penambahan zeolit

Suhu (°C) pH Zeolit (mg)

24.05 7.81 90.540

35.95 7.81 90.540

24.05 10.19 90.540

35.95 10.19 90.540

24.05 7.81 209.460

35.95 7.81 209.460

24.05 10.19 209.460

35.95 10.19 209.460

20.00 9.00 150.000

40.00 9.00 150.000

30.00 7.00 150.000

30.00 11.00 150.000

30.00 9.00 50.000

30.00 9.00 250.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

30.00 9.00 150.000

25

Lampiran 5 Hasil optimasi ekstrak kasar SOD E.coli dengan penambahan zeolit

Suhu (°C) pH Zeolit (mg) I (µA)

24.05 7.8108 90.540 1.1450

35.95 7.8108 90.540 2.4283

24.05 10.1892 90.540 1.8683

35.95 10.1892 90.540 3.3750

24.05 7.8108 209.460 1.4300

35.95 7.8108 209.460 3.0433

24.05 10.1892 209.460 1.4000

35.95 10.1892 209.460 2.6933

20.00 9.0000 150.000 0.5883

40.00 9.0000 150.000 3.3833

30.00 7.0000 150.000 3.3650

30.00 11.0000 150.000 1.8283

30.00 9.0000 50.000 2.2300

30.00 9.0000 250.000 2.1317

30.00 9.0000 150.000 2.2900

30.00 9.0000 150.000 2.4267

30.00 9.0000 150.000 1.8783

30.00 9.0000 150.000 1.9367

30.00 9.0000 150.000 2.7050

30.00 9.0000 150.000 1.9700

26

Lampiran 6 Hasil pengukuran optimasi substrat xantina rentang konsentrasi 0.2-

1.0 mM

[xantina]

(mM)

Aktivitas Antioksidan

(µA)

0.2 0.5983

0.3 0.7017

0.4 0.7167

0.5 0.6100

0.6 0.8283

0.7 0.8800

0.8 0.8000

0.9 0.8483

1.0 1.0917

27

Lampiran 7 Analisis kinetika dasar optimasi E.coli dengan metode Hanes-Woolf

[xantina]

(mM) I (µA)

1/[xantina]

(mM-1

)

1/I

(µA-1

)

[xantina]/I

(mM/µA)

I/[xantina]

(µA/mM)

0.2 0.5983 5.0000 1.6714 0.3342 2.9915

0.3 0.7017 3.3333 1.4251 0.4275 2.3390

0.4 0.7167 2.5000 1.3952 0.5581 1.7917

0.5 0.6100 2.0000 1.6393 0.8196 1.2200

0.6 0.8283 1.6700 1.2072 0.7243 1.3805

0.7 0.8800 1.4300 1.1363 0.7954 1.2571

0.8 0.8000 1.2500 1.2500 1.0000 1.0000

0.9 0.8483 1.1100 1.1788 1.0609 0.9425

1.0 1.0917 1.0000 0.9160 0.9160 1.0917

Metode Hanes-Woolf

Metode Lineweaver & Burk

y = 0.847x + 0.228

R² = 0.851

00.20.40.60.8

11.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2[xan

tin

a]/I

p(m

M/µ

A)

[xantina] (mM)

y = 0.144x + 1.004

R² = 0.594

0

0.5

1

1.5

2

0 1 2 3 4 5 6

1/I

p(µ

A-1

)

1/[xantina] (mM-1)

28

Metode Eadie-Hofstee

Kinetika ekstrak kasar SOD E. coli terimobilisasi mengikuti plot Hoones-Wolf:

[S]

v=

1

Vmaks app[S]+

KM app

Vmaks app

Dengan asumsi Imaks app = Vmaks app, berdasarkan persamaan garis y = 0.847x +

0.228, maka:

I maks app = 1.1806 µA

KM app = 0.2691 mM

y = -0.133x + 0.994

R² = 0.370

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

I p(µ

A)

Ip/[xantina] (µA/mM)

29

Lampiran 8 Stabilitas aktivitas bakteri E.coli menggunakan [xantina] 0.7 mM

Waktu (jam) Arus (µA) (%)

0 2.9483 100

2 2.8788 97.85

4 1.6261 56.35

6 1.0039 31.33

8 0.7622 24.83

30

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bekasi, 10 Maret 1991 sebagai anak tunggal dari Ayah

H. Zulkarnain Bakri dan Ibu Hj. Sri Hardiyah. Penulis lulus dari SMA N 1

Subang pada tahun 2008 dan diterima melalui jalur PMDK di Institut Pertanian

Bogor Departemen Kimia.

Selama masa perkuliahan, penulis pernah menjadi Asisten Praktikum Kimia

TPB tahun 2009 dan Asisten Praktikum Kimia Lingkungan tahun 2012. Penulis

melakukan praktik lapangan di PT Indofood Sukses Makmur Bogasari Flour Mill

periode 2011/2012 yang berjudul Analisis Mutu By Product Industri Tepung

Terigu (Bran, Industrial Flour, Pollard, dan Pelet) di PT ISM Bogasari Flour

Mills.

Penulis pada masa kuliah juga pernah meraih beberapa prestasi di bidang

olahraga salah satunya menjadi atlet kontingen Jawa Barat dalam Pekan Olahraga

Mahasiswa Nasional di Palembang, Sumatera Selatan pada tahun 2009, medali

perunggu pada Babak Kualifikasi PORDA Jawa Barat tahun 2009, atlet kontingen

daerah Subang pada Pekan Olahraga Daerah tahun 2010, dan medali perunggu

pada Kejuaraan Terbuka Gubernur Cup Jawa Barat tahun 2012. Selain itu, penulis

menjadi wakil delegasi Indonesia dan IPB dalam kegiatan International Youth

Forum for Policy, Change, and Development di Noida, India pada tahun 2012.