PENENTUAN FLAVONOID TOTAL TEMPUYUNG (Sonchus arvensis L.) SECARA CEPAT DENGAN TEKNIK SPEKTROSKOPI INFRAMERAH DAN KEMOMETRIK

ANNISA WAHYUNINGRUM

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2006

ABSTRAK

ANNISA WAHYUNINGRUM. Penentuan Flavonoid Total Tempuyung (Sonchus arvensis L.) secara Cepat dengan Teknik Spektroskopi Inframerah dan Kemometrik. Dibimbing oleh ETI ROHAETI dan RUDI HERYANTO. Kehadiran spektrometer inframerah transformasi Fourier (FTIR) pada dasawarsa terakhir mampu meningkatkan aplikasi radiasi inframerah untuk analisis kuantitatif contoh yang rumit. Penelitian ini menggunakan teknik spektroskopi FTIR dan kemometrik sebagai alternatif metode analisis kandungan flavonoid total tempuyung (Sonchus arvensis L.). Analisis dilakukan secara cepat menggunakan serbuk tempuyung tanpa proses pemisahan terlebih dahulu. Serbuk contoh tempuyung dari tiga tempat tumbuh yang berbeda dianalisis dengan FTIR. Informasi spektrumnya (spektrum asli dan spektrum hasil proses pendahuluan dengan dan tanpa segmentasi) diolah dengan teknik kemometrik analisis komponen utama (principal component analysis, PCA) dan proyeksi struktur laten (partial least square, PLS). PCA digunakan untuk mengelompokkan tempuyung berdasarkan perbedaan tempat tumbuhnya, sedangkan PLS digunakan untuk membangun model prediksi flavonoid total tempuyung. Pengelompokan dan pembentukan model prediksi flavonoid total tempuyung yang cukup baik dihasilkan dari data spektrum hasil proses pendahuluan pada kisaran bilangan gelombang 3751-2815 cm-1. PCA mengekstraksi data spektrum segmen ini menjadi tujuh komponen utama pertama yang menggambarkan 99% total variasi tempuyung. Model regresi PLS dari segmen ini cenderung lebih stabil daripada model yang lain. Model ini dapat digunakan untuk memprediksi flavonoid total contoh tempuyung yang belum diketahui (r kalibrasi = 0.974, r validasi = 0.742, RMSEC = 0.023, RMSEP = 0.076, SEC = 0.023, bias kalibrasi = 0.000, SEP = 0.078, bias prediksi = -0.001, dan jumlah komponen utama = 7).

3

ABSTRACT

ANNISA WAHYUNINGRUM. Rapid Determination of Total Flavonoid Tempuyung (Sonchus arvensis L.) by Infrared Spectroscopy and Chemometrics. Under the direction of ETI ROHAETI and RUDI HERYANTO. Fourier transformed infrared (FTIR) spectrometer can improve the application of infrared radiation for quantitative analysis of complex sample in the latest decades. This research used FTIR spectroscopy and chemometrics techniques as an alternative method in analyzing total flavonoid in tempuyung (Sonchus arvensis L). The rapid analysis was carried out using tempuyung powder without any separation process. Tempuyung sample powder from three different geographical origins was analysed by FTIR. The spectrum information (the original and preprocessed spectrum with and without segmentation) was processed by principal component analysis (PCA) and partial least square (PLS) chemometrics method. PCA was used to cluster tempuyung based on their different geographical origins, whereas PLS was used to build tempuyung’s total flavonoid prediction model. The best clustering and best modelling was resulted from preprocessed data spectrum in the wavenumber 3751-2815 cm-1 range. PCA extracted this data spectrum to seven principal components which represent 99% of tempuyung’s total variation. The PLS regression modelling from this segment was more stable than the others. This model can be used to predict the unknown tempuyung’s total flavonoid (r calibration = 0.974, r validation = 0.742, RMSEC = 0.023, RMSEP = 0.076, SEC = 0.023, bias calibration = 0.000, SEP = 0.078, bias prediction = -0.001, and principal components = 7).

4

PENENTUAN FLAVONOID TOTAL TEMPUYUNG (Sonchus arvensis L.) SECARA CEPAT DENGAN TEKNIK SPEKTROSKOPI INFRAMERAH DAN KEMOMETRIK

ANNISA WAHYUNINGRUM

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2006

5 5

6

PRAKATA

Alhamdulillahirrabbil’aalamiin, penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan mulai September 2005 hingga Januari 2006 di Laboratorium Kimia Analitik FMIPA IPB dan Laboratorium Instrumentasi Pusat Studi Biofarmaka dengan judul Penentuan Flavonoid Total Tempuyung (Sonchus arvensis L.) secara Cepat dengan Teknik Spektroskopi Inframerah dan Kemometrik. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Dra. Eti Rohaeti, M.S. dan Bapak Rudi Heryanto, S.Si., M.Si. selaku pembimbing atas segala bimbingan dan ilmu yang diberikan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Program Penelitian Dasar Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional melalui Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB yang telah memberikan bantuan dana penelitian dan Bapak Ir. Jajang, M.S. atas bantuan arahan pengolahan data kemometrik. Terima kasih tak terhingga kepada keluarga tercinta, keluarga di Perla, dan sahabat-sahabat terbaik yang selalu memberikan doa, dorongan semangat, dan kesabaran kepada penulis. Penghargaan tak lupa penulis sampaikan kepada Om Eman dan staf Laboratorium Kimia Analitik atas segala fasilitas dan kemudahan yang telah diberikan, Kak Atep dan rekan-rekan dari Pusat Studi Biofarmaka, Indah, teman-teman Analitik 38, dan teman-teman Kimia 38 atas persahabatan yang terjalin selama ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Maret 2006

Annisa Wahyuningrum

7

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Depok pada tanggal 8 April 1984 dari ayah Raden Ahmad Hatta dan ibu Roviah Supriyati. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMUN 2 Depok kemudian melanjutkan pendidikan pada Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bidang yang diminati penulis ialah kimia analitik. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia Dasar I, Kimia Analitik Teknik Pangan dan Gizi, Kimia Analitik III, Elektroanalitik untuk Program Studi D3 Analisis Kimia, dan Kimia untuk Program Studi D3 Analisis Lingkungan. Penulis juga menjabat sebagai staf Departemen Pengembangan Organisasi, Ikatan Mahasiswa Kimia IPB Tahun Kepengurusan 2002/2003. Tahun 2004 penulis melaksanakan praktik lapangan di Balai Penelitian Tanah, Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanah dan Agroklimat.

8

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ...................................................................................................... .. viii DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. .. viii DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................... .. ix PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Tempuyung ........................................................................................................... 1 Flavonoid .............................................................................................................. 2 Penentuan Flavonoid Metode Kolorimetri ............................................................. 2 Spektroskopi FTIR ................................................................................................ 3 Kemometrik ........................................................................................................... 4 BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan ...................................................................................................... 5 Metode ................................................................................................................... 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Flavonoid Total dengan Metode Depkes RI ............................................ 6 Analisis Spektrum FTIR ....................................................................................... 7 Analisis Kemometrik ............................................................................................. 7 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan................................................................................................................ 11 Saran ...................................................................................................................... 12 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 12 LAMPIRAN .................................................................................................................... 14

9

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kadar flavonoid total tempuyung ............................................................................... 6

2 Pemanfaatan wilayah spektrum IR untuk analisis kemometrik ................................... 8

3 Hasil analisis PCA spektrum IR tempuyung................................................................ 8

4 Tampilan parameter model prediksi flavonoid total tempuyung ................................. 10

5 Hasil prediksi kadar flavonoid total tempuyung dari model derivat

segmen 1 ...................................................................................................................... 11

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Tanaman tempuyung.................................................................................................... 2

2 Struktur umum flavonoid dan contoh flavonoid: kuersetin ......................................... 2

3 Skema kerja FTIR ........................................................................................................ 3

4 Ilustrasi model regresi univariat dan multivariat ......................................................... 4

5 Prinsip PLS .................................................................................................................. 5

6 Spektrum IR tempuyung JawaTengah, Cimanggu, dan Leuwiliang............................ 7

7 Spektrum IR tempuyung hasil proses pendahuluan ..................................................... 8

8 Spektrum kuersetin dan tempuyung Leuwiliang ......................................................... 9

9 Plot skor dua dimensi dua komponen utama spektrum IR asli dan derivat

segmen 1 ...................................................................................................................... 9

10 Plot skor PLS antara kadar flavonoid prediksi dan referensi dari data spektrum IR

derivat segmen 1 .......................................................................................................... 11

10

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Bagan alir penelitian .................................................................................................... 15

2 Hasil pengukuran kadar air simplisia tempuyung........................................................ 15

3 Rendemen ekstrak tempuyung..................................................................................... 16

4 Hasil uji fitokimia tempuyung ..................................................................................... 16

5 Kurva standar kuersetin pada panjang gelombang 367 nm ........................................ 17

6 Hasil pengukuran kadar flavonoid total metode Depkes RI ........................................ 18

7 Plot skor dua dimensi dua komponen utama pertama PCA........................................ 22

8 Plot skor PLS tempuyung ............................................................................................ 23

9 Langkah pengolahan data dengan Unscramble 9.1...................................................... 24

10 Hasil uji F dan uji t antara metode Depkes RI dan metode PLSR............................. 26

PENDAHULUAN Tempuyung (Sonchus arvensis L.) merupakan salah satu dari ketigabelas spesies yang ditetapkan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan sebagai spesies unggulan bahan asli obat Indonesia (Deptan 2002). Dalam pengobatan tradisional, masyarakat mengenal tempuyung sebagai peluruh air seni, penghancur batu ginjal, obat antiradang atau bengkak, dan berkhasiat lipotriptik (Soedibyo 1998). Beberapa penelitian melaporkan peranan penting senyawa flavonoid yang dikandung tempuyung dalam mekanisme pengobatan. Flavonoid tempuyung diketahui mampu membentuk kompleks dengan batu ginjal berkalsium, suatu mekanisme yang berhubungan dengan efek peluruhan batu ginjal (Pramono et al. 1993). Praperlakuan flavonoid fraksi etil asetatnya diinformasikan dapat menghambat hepatotoksisitas CCl4 (Liestyaningsih 1991, diacu dalam Soedibyo 1998). Selain itu, flavonoid tempuyung juga dikabarkan berpotensi sebagai komponen antiinflamasi dan antihiperurisemia (meng-hambat pembentukan asam urat) (Heryanto 2003). Metode analisis komponen tumbuhan memegang peranan penting dalam pengem-bangan produk kesehatan berbasis tumbuhan obat. Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), kromatografi gas, kromatografi lapis tipis, dan spektroskopi massa adalah beberapa metode yang biasa digunakan untuk menganalisis komponen tumbuhan obat. Metode–metode tersebut mampu menghadir-kan informasi definitif untuk identifikasi dan kuantifikasi komponen, tetapi membutuhkan standar otentik yang bervariasi, tahapan analisis yang panjang, dan waktu analisis yang cukup lama (Chang et al. 2002). Spektrometer inframerah transformasi Fourier (Fourier transformed infrared, FTIR) dapat melakukan pengukuran secara cepat tanpa merusak contoh dan mampu menganalisis beberapa komponen secara serentak. Penggunaan FTIR dalam analisis tumbuhan masih terbatas karena matriks dan spektrum yang dihasilkan cukup kompleks. Saat ini, dengan kehadiran kemometrik, suatu metode yang mengintegrasikan model statistik dan matematika untuk mengekstrak informasi yang relevan dari data spektrum inframerah (IR), sulitnya interpretasi spektrum dapat diatasi. Dukungan kemometrik tersebut memperluas potensi spektroskopi FTIR

sebagai metode alternatif untuk menganalisis komponen tumbuhan. Kemometrik memanfaatkan karakteristik serapan IR yang khas dari setiap molekul untuk mengklasifikasi contoh atau untuk membuat model kalibrasi multivariat (dengan melibatkan data referensi) yang dapat digunakan dalam memprediksi hasil pe-ngukuran suatu contoh (Naes et al. 2002). Aplikasi kemometrik dalam analisis tumbuhan obat antara lain telah dilakukan oleh Chew et al. (2004) untuk mengklasifikasi teh jawa (Orthosiphon stamineus Benth) dari beberapa tempat dan varietas yang berbeda, Jajang (2004) dalam pengelompokan ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.), Baranska et al. (2005) pada kendali mutu ekstrak dan produk farmasi Harpagophytum procumbens, dan Zou et al. (2005) pada proses kendali mutu beberapa tumbuhan obat yang digunakan dalam pengobatan tradisional Cina. Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode cepat untuk mengelompokkan tempu-yung dari tempat tumbuh yang berbeda dan untuk menentukan flavonoid total tempuyung menggunakan spektroskopi FTIR dan kemo-metrik. Hipotesis dari penelitian ini adalah kolaborasi teknik FTIR dan kemometrik dapat digunakan untuk analisis kuantitatif flavonoid tempuyung.

TINJAUAN PUSTAKA

Tempuyung

Tempuyung (Gambar 1) yang dikenal juga dengan nama jombang, lempung, rayana, galibug, niu she tou (Cina), laitron des champs (Perancis), atau sow thistle (Inggris) merupakan terna tahunan, tingginya berkisar 0.6-2 m, berakar tunggang, batang berusuk dan bergetah putih. Daunnya tunggal, berbentuk lanset atau lonjong, ujung runcing, pangkal berbentuk jantung, tepi menyirip tidak teratur, panjang 6-48 cm, lebar 3-12 cm, dan berwarna hijau muda. Daun bagian bawah tumbuh berkumpul pada pangkal membentuk roset akar. Bunganya berwarna kuning, berbentuk bonggol yang tergabung dalam malai, dan mahkotanya berbentuk jarum. Batang muda dan daunnya berasa pahit dan dingin (Soedibyo 1998).

Tumbuhan dari keluarga Asteraceae ini tumbuh liar di tempat terbuka yang terkena sinar matahari atau sedikit terlindung, seperti di tebing-tebing, pematang, tepi saluran air,

2

tanah terlantar, atau di daerah yang cukup banyak curah hujannya pada ketinggian 50-1650 m dari permukaan laut. Terkadang tempuyung sengaja ditanam sebagai tumbuhan obat (BPPT 2002). Keaneka-ragaman tempuyung dapat dilihat dari bentuk daunnya, yang berdaun kecil dikenal dengan sebutan lempung dan yang berdaun besar dengan tinggi mencapai 2 m disebut rayana. Perbanyakan tempuyung dapat dilakukan dengan biji.

Gambar 1 Tanaman tempuyung.

Daun tempuyung mengandung ion-ion mineral silika, kalium, magnesium, natrium, dan senyawa organik seperti flavonol (kempferol, kuersetin), kumarin (skepoletin), taraksasterol, inositol, dan asam fenolat (sinamat, kumarat, dan vanilat) (Soedibyo 1998). Selain itu, dilaporkan pula bahwa tempuyung juga mengandung flavon (luteolin-7-O-glukosida dan apigenin-7-O-glukosida), minyak, dan minyak atsiri (Heryanto 2003).

Tempuyung sudah lama dikenal dan dimanfaatkan oleh penduduk Tawangmangu, Surakarta, Jawa Tengah, sebagai jamu untuk memulihkan kesehatan fisik bagi perempuan yang selesai bersalin. Di Cina, selain sebagai tumbuhan obat, tumbuhan ini digunakan juga sebagai insektisida (Rosita & Soediarto 1993).

Flavonoid

Flavonoid merupakan senyawaan fenol yang dimiliki oleh sebagian besar tumbuhan hijau dan biasanya terkonsentrasi pada biji, buah, kulit buah, kulit kayu, daun, dan bunga. Flavonoid pada sejumlah tumbuhan obat dilaporkan memiliki sifat antibakteri, antiinflamasi, antialergi, antimutagenik, antiviral, antineoplastik, antitrombotik, dan memiliki aksi vasodilatori (Miller 1996).

Struktur umum flavonoid terdiri atas dua cincin benzena dalam rangkaian tiga cincin karbon yang membentuk susunan C6-C3-C6 (Gambar 2). Adanya sistem aromatik yang terkonjugasi menunjukkan pita serapan kuat

pada daerah spektrum ultraviolet (UV) dan spektrum tampak.

Kombinasi yang beragam dari gugus hidroksil, gula, oksigen, dan metil pada struktur ini menjadi dasar pembagian golongan flavonoid menjadi flavonol, flavanon, flavon, flavan-3-ol (katekin), antosianidin, biflavonoid, kalkon, auron, dan isoflavon (Markham 1988; Miller 1996). Penggolongan jenis flavonoid ini dalam jaringan tumbuhan mula-mula didasarkan pada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna. Flavon dan flavonol terdapat universal sedangkan isoflavon dan biflavonol hanya terdapat pada beberapa suku tumbuhan (Harborne 1996).

Flavonoid dalam tumbuhan jarang ditemukan dalam bentuk tunggal, tetapi dalam bentuk campurannya. Senyawa ini merupakan golongan yang larut dalam air dan dalam tumbuhan terikat sebagai glikosida dan aglikon. Oleh karena itu, analisis flavonoid biasanya dilakukan dengan memeriksa aglikon yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis sebelum memperhatikan kerumitan glikosida yang mungkin terdapat dalam ekstrak asal (Harborne 1996).

(a) (b)

Gambar 2 Struktur umum flavonoid (a) dan

contoh flavonoid: kuersetin (b). Segi penting dari penyebaran flavonoid dalam tumbuhan ialah adanya kecenderungan kuat bahwa tetumbuhan yang secara taksonomi berkaitan akan menghasilkan flavonoid yang jenisnya serupa. Informasi yang berguna tentang jenis flavonoid yang mungkin ditemukan pada tumbuhan yang sedang ditelaah sering kali dapat diperoleh melalui pustaka tentang flavonoid yang telah ditelaah lebih dulu dalam tumbuhan yang berkaitan, dari marga atau suku yang sama (Markham 1988). Penentuan Flavonoid Metode Kolorimetri

Metode yang biasa digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif flavonoid adalah metode KCKT. Metode ini cukup baik untuk proses kuantisasi, tetapi seringkali penerapannya terhambat oleh keterbatasan

3

standar otentik yang tersedia. Oleh sebab itu, untuk proses analisis rutin, metode kolorimetri lebih sering digunakan.

Penentuan flavonoid total berdasarkan parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat Departemen Kesehatan Republik Indonesia (Depkes RI) (2000) menggunakan metode kolorimetri aluminium klorida. Metode ini melibatkan pembentukan kompleks antara flavonoid dan AlCl3. AlCl3 membentuk kompleks yang stabil dengan grup keto C-4 dan grup hidroksil dari C-3 atau C-5 dari flavon dan flavonol. Banyaknya kompleks yang terbentuk diketahui dari hasil pengukuran spektrofotometer UV-tampak. Hukum Lambert-Beer menyatakan perbandingan lurus antara absorbans dan kadar analit (Chang et al. 2002).

Spektroskopi FTIR

Radiasi IR berada pada kisaran panjang gelombang 0.78-1000 μm atau bilangan gelombang 12 800-10 cm-1. Spektrumnya terbagi atas radiasi inframerah dekat (12 800-4000 cm-1), menengah (4000-200 cm-1), dan jauh (200-10 cm-1). Daerah spektrum yang paling banyak digunakan untuk berbagai keperluan praktis seperti analisis dalam bidang industri, bahan pertanian, dan kendali mutu adalah pada 4000-670 cm-1 atau daerah IR tengah (Skoog et al. 1998).

Energi radiasi IR digunakan terbatas hanya pada transisi molekul yang melibatkan vibrasi dan rotasi. Efek dari vibrasi ini menyebabkan perubahan momen dipol. Radiasi medan listrik yang berubah-ubah akan berinteraksi dengan molekul dan akan menyebabkan perubahan amplitudo salah satu gerakan molekul (molekul dalam padatan dan cairan berotasi secara terbatas sedangkan dalam gas tidak). Perwujudan interaksi tersebut menghasilkan serapan yang khas dari setiap komponen atau struktur molekul. Serapan grup fungsional berada pada kisaran 4000-1500 cm-1 sedangkan fenomena intra-molekular yang bersifat sangat spesifik untuk setiap materi antara 1500-400 cm-1 (daerah sidik jari) (Khopkar 2002).

FTIR merupakan gabungan instrumen dispersif konvensional IR dengan komputer dan mikroprosesor. Komponen instrumen FTIR serupa dengan spektrometer UV-tampak, namun sumber, detektor, dan komponen optiknya sedikit berbeda. Pengukuran dengan FTIR melibatkan kombinasi interferensi konstruktif dan destruktif yang senantiasa berubah mengikuti

beberapa λ yang datang untuk menghasilkan spektrum (modulasi interferometrik dari radiasi). Interferometer mengubah frekuensi yang masuk menjadi bentuk khusus yang dapat diamati oleh detektor (Gambar 3). Data yang diperoleh sangat kompleks dan masing-masing poin membawa informasi untuk λ yang berbeda dan tumpang tindihnya data. Proses matematika dengan transformasi Fourier mengkonversi data tersebut agar dapat digunakan (Naumann 1998; Wartewig 2003).

Gambar 3 Skema kerja FTIR.

Analisis dengan FTIR lebih cepat dan lebih sensitif daripada IR dispersif. Penggunaan interferometer Michelson mampu mengatasi kekurangan sistem dispersif dalam penggunaan energi (keuntungan Jaquinot) karena pada sistem dispersif banyak energi yang terbuang akibat penggunaan model deteksi pemindaian. FTIR juga memiliki perbaikan dari segi laju koleksi sinyal (keuntungan Felgett), keakuratan data terkait dengan hasil pengukuran laser dari kaca bergerak (keuntungan Connes), linearitas absorbans karena tidak ada penghamburan cahaya (keuntungan penghamburan cahaya), dan penyimpanan serta mutu data melalui peningkatan resolusi atau koreksi garis dasar (keuntungan penanganan data) (Naumann 1998).

Kehadiran FTIR pada dasawarsa terakhir mampu meningkatkan aplikasi radiasi menengah IR tidak hanya untuk analisis kualitatif organik dan penentuan struktur, tetapi juga untuk analisis kuantitatif contoh yang kompleks. Model analisis kuantitatif ini dikembangkan dengan memanfaatkan informasi pola sidik jari yang bersifat khas sebagai variabel yang mempengaruhi penampakan kimiawi seperti aktivitas biologis, konsentrasi, dan polarisabilitas (Wold et al. 2001).

Pemecah

gelombang

Detektor

Analisis Fourier

contoh

Perbedaan berkas

Interferometer Michelson

Sumber radiasi Jejak

IRKaca bergerak

Kaca Panjang gelombang

4

Kemometrik

Kemometrik merupakan aplikasi prosedur matematika untuk memproses, mengevaluasi, dan menginterpretasi sejumlah besar data. Kemometrik biasa digunakan untuk menemukan korelasi statistik antara data spektrum dan informasi yang telah diketahui dari suatu contoh. Metode ini memungkinkan penggunaan model analisis multivariat dalam penerapannya. Model analisis multivariat adalah suatu model yang melibatkan lebih dari satu masukan (variabel x) untuk menghasilkan suatu efek tertentu (variabel y). Analisis komponen utama (principal component analysis, PCA), proyeksi struktur laten (partial least square, PLS), dan jaringan syaraf tiruan (artificial neural network, ANN) adalah beberapa contoh model multivariat. Model analisis multivariat memiliki persamaan:

yi= boi+b1ix1+b2ix2+............. Analisis Komponen Utama (PCA)

PCA dikenal juga sebagai metode pereduksi atau penekan data terkait dengan tujuannya yang mengurangi jumlah variabel dalam suatu matriks untuk menghasilkan variabel baru dengan tetap mempertahankan informasi yang dimiliki oleh data. PCA memudahkan visualisasi pengelompokan data, evaluasi awalan kesamaan antar-kelompok atau kelas, dan menemukan faktor atau alasan di balik pola yang teramati melalui korelasi dengan sarana kimia atau fisika-kimia contoh (Chew et al. 2004). Setiap variabel baru (skor atau PC) yang dihasilkan PCA merupakan kombinasi linear variabel asli pengukuran (Miller & Miller 2000). Skor dinilai bersama dengan satu set vektor yang disebut loading. Loading mengukur hubungan di antara variabel. Antara skor dan loading terhubung dalam fungsi

X = TP’ + E ≈ TP’

X adalah matriks data awal, T merupakan matriks dengan kolom berupa skor, P’ adalah matriks dengan kolomnya berupa loading, dan E adalah matriks residual. Skor disusun berdasarkan proporsi utama varian. Skor pertama mewakili bagian yang paling penting dalam varian. Skor selanjutnya mewakili varian yang lebih kecil daripada skor sebelumnya. Biasanya, jumlah skor yang berguna kurang dari jumlah variabel asli (Miller & Miller 2000).

Proyeksi Struktur Laten (PLS)

PLS lebih umum digunakan dalam kalibrasi multivariat karena mutu model kalibrasi yang dihasilkan dan kemudahan penerapannya (Kuno & Matsuo 2000). PLS mampu menganalisis data dengan jumlah yang cukup banyak, memiliki tingkat kolinearitas tinggi, sejumlah besar variabel x, dan beberapa variabel respons y (Wold et al. 2001). Ide utama PLS adalah menghitung nilai prinsipal komponen data matriks X dan Y dan membangun model regresi antarnilai (dan dari data perkiraan) (Gambar 4). X adalah matriks penduga yang berisi data hasil sumber percobaan, sedangkan Y merupakan matriks respons dengan data yang dapat menginformasikan tentang proses percobaan. Pada PLS, variabel penduga yang menunjukkan korelasi yang tinggi dengan variabel respons akan diberikan penekanan ekstra karena lebih efektif diprediksi (Miller & Miller 2000).

x y (a)

(b) Gambar 4 Ilustrasi model regresi univariat

(a) dan multivariat (b). Model regresi PLS (PLSR) merupakan cara untuk memperkirakan parameter dalam model sains dengan dasar linear. Model PLSR konsisten dengan efek yang menyebabkan perubahan dalam sistem yang sedang ditinjau. Variabel laten atau faktor yang dimiliki berhubungan langsung dengan efek tersebut. Model linear PLS melibatkan beberapa variabel baru yang dibuat dari variabel laten atau hasil rotasi variabel laten (Gambar 5) sehingga disamping diperoleh skor dalam matriks X dan Y, juga dihasilkan satu set skor ketiga yang biasanya disebut sebagai pembobot (W). Skor-skor ini kemudian digunakan untuk menghitung skor X dan memaksimalkan korelasi antara model skor dari X dan Y. Persamaan umum model analisis PLS:

X = TP’ + E Y = UC’ + F

y

x

x

x

t 2

t 1

5

U = T + H T dan U merupakan matriks skor, P’ dan C’ adalah matriks loading, E dan F adalah matriks residual, dan H adalah hubungan dalam (Wold et al. 2001).

Gambar 5 Prinsip PLS.

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan untuk penelitian ini, yaitu spektrometer FTIR Tensor 37 (Bruker Spectrospin), komputer pengolah data (Prosesor AMD Pro2000+, 1.3 GHz, 256 MB), spektrofotometer UV-tampak Genesys 10, kuvet, perangkat maserasi dan refluks, radas penguap berputar, penangas air, neraca analitik, labu ukur 25, 50, dan 100 mL, pipet Mohr dan volumetrik berbagai ukuran, corong pisah, gelas ukur, gelas arloji, dan gelas piala. Bahan-bahan yang dibutuhkan ialah simplisia daun tempuyung dari tiga tempat tumbuh yang berbeda (Jawa Tengah, Cimanggu, dan Leuwiliang), etanol, larutan heksametilenatetramina 0.5% b/v, aseton, HCl 25%, etil asetat, asam asetat glasial 5% v/v (dalam metanol), larutan AlCl3 2% dalam asam asetat glasial 5%, standar kuersetin (Sigma), akuades, kapas, dan serbuk KBr.

Metode

Tempuyung yang telah dihaluskan dibagi menjadi lima kelompok kecil. Setiap kelompok kecil dianalisis dengan FTIR dan diukur kadar flavonoidnya dengan metode Depkes RI sehingga dari tiga contoh tempuyung dihasilkan 15 pasang data, yaitu pasangan data kadar flavonoid dengan spektrum FTIR (Lampiran 1).

Analisis Flavonoid Total Metode Depkes RI (2000)

Ekstraksi. Sebanyak 10 g serbuk daun tempuyung dimaserasi menggunakan sejumlah etanol (merendam seluruh serbuk) selama 6 jam di atas alat kocok. Hasil maserasi disaring, setelah itu residunya direfluks selama 3 jam dengan etanol. Sesudah direfluks, contoh disaring dan ampasnya ditambah etanol lalu direfluks kembali selama 3 jam. Ekstrak hasil refluks dan maserasi kemudian dipekatkan dengan radas penguap berputar hingga terbentuk ekstrak kental. Ekstrak kental ini kemudian ditimbang.

variabel

Penggambaran struktur (spektrum)

Aktivitas terukur (kadar)

Penetapan kadar flavonoid total. Ekstrak etanol yang setara dengan 200 mg simplisia ditimbang dan dimasukkan ke labu bulat. Sistem hidrolisis berupa 1.0 mL larutan heksametilenatetramina 0.5% b/v, 20 mL aseton, dan 2 mL HCl 25% ditambahkan ke dalam labu tersebut. Selanjutnya, ekstrak dihidrolisis dengan pemanasan hingga mendidih selama 30 menit. Campuran hasil hidrolisis disaring menggunakan kapas ke dalam labu ukur 100 mL. Residunya kemudian ditambahkan 20 mL aseton dan dididihkan kembali (dilakukan 2 kali dan filtrat dikumpulkan ke dalam labu ukur lalu ditera). Sebanyak 20 mL filtrat hasil hidrolisis dan 20 mL akuades dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu diekstraksi dengan etil asetat (ekstraksi yang pertama dengan 15 mL etil asetat, ekstraksi kedua dan ketiga dengan 10 mL etil asetat). Fraksi etil asetatnya dikumpulkan dalam labu ukur 50 dan 25 mL kemudian ditera. Ekstraksi dengan corong pisah dilakukan duplo untuk setiap filtrat hasil hidrolisis. Pengukuran spektrofotometri. Seba-nyak 10 mL larutan fraksi etil asetat dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu direaksikan dengan 1 mL larutan AlCl3 2% b/v dan ditera dengan larutan asam asetat glasial 5% v/v (triplo untuk setiap fraksi etil asetat). Pengukuran larutan dilakukan pada panjang gelombang 367 nm. Kurva standar dibuat dengan kuersetin murni dengan konsentrasi 3, 6, 12, 15, dan 24 ppm.

Spektroskopi FTIR

Sebanyak 0.5 mg serbuk daun tempuyung dicampurkan dengan 185 mg KBr, dihomogenisasi, lalu dibentuk pelet menggunakan hand press Shimadzu (tekanan 8 ton selama 10 menit). Pengukuran spektrum

6

FTIR dilakukan pada daerah IR tengah (4000-400 cm-1) dengan melibatkan pengontrol kerja berupa personal komputer yang dilengkapi perangkat lunak OPUS versi 4.2. Spektrum dihasilkan dengan kecepatan 32 detik dan resolusi 4 cm-1. Tampilan data spektrum yang me-ngandung 1866 titik serapan kemudian diubah ke dalam format DPT (data point table) untuk keperluan pengolahan data. Data ini dapat dibuka dengan program Microsoft Excel. Selanjutnya, data dengan 1789 titik serapan (telah dihilangkan serapan CO2-nya pada 2399-2252 cm-1) diolah dengan program Unscrambler versi 9.1 (Camo Inc.) yang dijalankan dengan sistem operasi Microsoft Windows XP Professional. Selain data spektrum asli, dihasilkan pula data dengan perlakuan pendahuluan berupa koreksi garis dasar, normalisasi (nilai absorbans diatur sehingga absorbans tertinggi bernilai satu dan absorbans terendah bernilai nol), derivatisasi, dan penghalusan dengan metode Savitsky Golay 13 poin.

Analisis Data Kemometrik Model kalibrasi multivariat dibuat dengan program Unscrambler 9.1 menggunakan teknik PCA dan PLS. Data yang diolah adalah data absorbans spektrum asli dan spektrum dengan proses pendahuluan yang melibatkan seluruh fitur serapan maupun sebagian data serapan (sesuai daerah segmentasi spektrum). Pengelompokan contoh dilakukan oleh PCA dengan memanfaatkan data serapan spektrum FTIR yang terukur, sedangkan pembentukan model prediksi flavonoid total dilakukan oleh PLS dengan melibatkan variabel x (absorbans hasil pengukuran FTIR) dan variabel y (kadar flavonoid hasil analisis metode Depkes RI). Kalibrasi dan validasi model analisis multivariat dilakukan dengan teknik validasi silang. Keberhasilan pengelompokan contoh tempuyung dilihat pada jumlah komponen utama yang terlibat, total variasi yang terwakili, dan visualisasi plot skor, sedangkan keakuratan model prediksi flavonoid total tempuyung diukur dengan nilai korelasi dan nilai galat yang dihasilkan. Model prediksi flavonoid total dapat digunakan bila memiliki nilai galat (standard error calibration SEC, standard error of cross validation SECV atau standard error of prediction SEP) rendah dan nilai korelasi tinggi (Farkas et al 2004).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisis Flavonoid Total dengan Metode Depkes RI

Pengukuran kadar flavonoid total dengan metode Depkes RI diawali dengan penetapan kadar air terhadap simplisia contoh. Hasil penetapan kadar air memperlihatkan kaandungan air yang dimiliki simplisia contoh tempuyung berkisar antara 6-8%. Hasil penetapan kadar air tersebut tersaji pada Lampiran 2. Tahapan berikutnya merupakan tahap penyiapan ekstrak. Tempuyung Jawa Tengah menghasilkan rendemen ekstrak etanol sebesar 8%, tempuyung Cimanggu sebesar 14%, dan tempuyung Leuwiliang sebanyak 11%. Lampiran 3 memperlihatkan perolehan rendemen ketiga contoh tempuyung. Berdasarkan metode analisis Depkes RI, flavonoid total yang terukur merupakan sumbangan dari golongan flavon dan flavonol yang terdapat pada ekstrak, karena hanya kedua kelompok inilah yang mampu membentuk kompleks stabil dengan AlCl3 (Chang et al. 2002). Tabel 1 memperlihatkan hasil pengukuran flavonoid total tempuyung. Dari tabel tersebut teramati bahwa tempuyung asal Cimanggu memiliki kadar flavonoid yang cukup berbeda dari kedua tempuyung lainnya. Tempuyung Jawa Tengah dan Leuwiliang mengandung sekitar 0.8% flavonoid, sedangkan tempuyung Cimanggu hanya 0.6%.

Tabel 1 Kadar flavonoid total tempuyung

Contoh Ulangan Kadar flavonoid (% b/b)

Rerata kadar

(% b/b) 1 0.84 2 0.81

Jawa 3 0.89 0.804 Tengah 4 0.74

5 0.74 1 0.67 2 0.60

Cimanggu 3 0.59 0.622 4 0.65 5 0.60 1 0.85 2 0.82

Leuwiliang 3 0.86 0.824 4 0.82 5 0.77

Kecenderungan perbedaan kadar

flavonoid tersebut turut teramati secara visual pada penapisan fitokimia tempuyung (Lampiran 4). Intensitas warna flavon dan flavonol yang terdeteksi pada tempuyung

7

Jawa Tengah dan Leuwiliang, baik pada simplisia maupun pada ekstrak etanol, terlihat cenderung lebih tinggi daripada intensitas warna flavon dan flavonol pada tempuyung Cimanggu. Adanya perbedaan ini salah satunya mencerminkan variasi informasi kimiawi contoh yang timbul akibat perbedaan asal dan kondisi lingkungan. Hal ini sejalan dengan penelitian Chew et al. (2004) yang menyatakan bahwa asal contoh yang berbeda memiliki pengaruh yang dominan terhadap variasi kandungan kimia contoh.

Day dan Underwood (1993) meng-golongkan perolehan analit hasil analisis kuantitatif dalam tiga kelompok, yaitu analit yang merupakan konstituen utama, konstituen minor, dan konstituen jejak atau runut. Analisis kuantitatif flavonoid pada tempuyung memperlihatkan keberadaan flavonoid sebagai konstituen minor karena kadar yang dimilikinya berada di antara 0,01-1%. Artinya, walaupun flavonoid tempuyung berperan strategis dalam mekanisme pengobatan, jumlahnya dalam tempuyung tidak begitu banyak. Lampiran 5 memberikan persamaan kurva standar kuersetin yang digunakan untuk menentukan kadar flavonoid tempuyung, sedangkan perhitungan kadar flavonoid totalnya terdapat pada Lampiran 6.

Analisis Spektrum FTIR

Pola spektrum FTIR sel utuh sampel bio-logis (serbuk contoh) merupakan pola spektrum sidik jari hasil serapan vibrasi dari seluruh konstituen yang ada dalam sel, seperti protein, lipid, karbohidrat, dan beragam metabolit sekunder (Naumann 1998). Pola inilah yang terlihat pada spektrum FTIR tempuyung (Gambar 6).

Bilangan gelombang (cm-1)

Abs

orba

ns

Gambar 6 Spektrum IR tempuyung Jawa

Tengah (hijau), Cimanggu (merah), dan Leuwiliang (biru).

Spektrum IR tempuyung tidak memperlihatkan adanya perbedaan pola serapan yang signifikan dari ketiga contoh. Semua spektrum menunjukkan antara lain keberadaan gugus OH melalui puncak yang cukup lebar pada daerah 3500 cm-1, vibrasi C-H dan vibrasi tarik C-H metoksi pada 2925 cm-1 dan 2853 cm-1 (puncak yang tajam, sempit, dan berdekatan), vibrasi tarik C=O karbonil pada 1600-1760 cm-1, dan ikatan C=C aromatik pada 1500-1600 cm-1. Perbedaan intensitas dan karakteristik serapan konstituen yang sangat halus terutama pada daerah sidik jari tidak dapat teramati, informasi ini hanya dapat diamati oleh teknik kemometrik.

Analisis Kemometrik

Analisis Komponen Utama (PCA)

Penggunaan spektrum FTIR sebagai alat bantu untuk penentuan struktur molekul suatu senyawa kimia biasanya terbatas hanya melibatkan informasi serapan pada daerah-daerah tertentu saja sebagai tanda pengenal gugus fungsi tertentu. Pemanfaatan ini membatasi informasi lain yang dimiliki oleh suatu spektrum IR, terlebih lagi bila spektrum tersebut merupakan spektrum yang bersifat multidimensi seperti spektrum sel utuh dari suatu bagian tumbuhan. Spektrum multidimensi mengandung informasi kuantitatif yang dapat menggambarkan ciri khas suatu spesies. Informasi ini tidak dapat diamati dengan melihat pola serapan spektrum saja, tetapi membutuhkan alat bantu berupa teknik ekstraksi pola spektrum atau teknik kemometrik. Teknik kemometrik yang digunakan untuk mengenali pola spektrum tanpa pengelompokan terlebih dahulu, seperti teknik PCA, dikenal sebagai teknik pengenalan pola tak terawasi. Spektrum sel utuh setiap contoh tempuyung juga memiliki perbedaan informasi kuantitatif, informasi yang tidak dapat diekstrak hanya dengan melihat pola serapan spektrum tempuyung. Untuk mendapatkan informasi perbedaan secara sederhana dari kelimabelas spektrum tempuyung tersebut, digunakanlah analisis PCA. PCA mereduksi variabel-variabel yang dimiliki oleh spektrum menjadi beberapa variabel utama saja. Proses reduksi ini dapat menyebabkan contoh tempuyung terkelom-pokkan berdasarkan korelasi informasi variabel yang dimiliki dalam grup.

8

Analisis PCA tempuyung dilakukan tidak hanya menggunakan data spektrum asli, tetapi juga melibatkan data spektrum hasil proses pendahuluan. Perlakuan pendahuluan terhadap spektrum dimaksudkan untuk menghindari masalah akibat geseran garis dasar dan untuk meningkatkan resolusi spektrum yang berimpitan (perbaikan informasi data) (Stchur 2002). Gambar 7 adalah spektrum IR tempuyung yang telah mengalami proses pendahuluan.

Bilangan gelombang (cm-1)

Abs

orba

ns

Selain menggunakan seluruh data absorbans spektrum IR tempuyung, analisis PCA juga dilakukan terhadap spektrum pada kisaran bilangan gelombang tertentu, baik pada spektrum asli maupun spektrum dengan proses pendahuluan. Segmentasi ini dilakukan untuk melihat keberadaan konstituen-konstituen kunci yang berperan secara signifikan dalam analisis kemometrik. Tabel 2 memperlihatkan pemanfaatan wilayah spektrum untuk analisis kemometrik (PCA dan PLS).

Gambar 7 Spektrum IR tempuyung hasil proses pendahuluan.

Keterangan: Hijau : tempuyung Jawa Tengah Merah : tempuyung Cimanggu Biru : tempuyung Leuwiliang Hasil analisis PCA dikatakan baik bila dengan jumlah komponen utama yang sedikit mampu menggambarkan total variasi yang besar. Tabel 3 memberikan penjelasan hasil analisis PCA spektrum IR asli dan spektrum IR dengan proses pendahuluan. Berdasarkan data tabel tersebut terlihat bahwa spektrum asli membutuhkan komponen utama yang lebih sedikit untuk menjelaskan total variasi karakteristik contoh yang hampir sama dengan spektrum proses pendahuluan (kode spektrum: derivat).

Tabel 2 Pemanfaatan wilayah spektrum IR untuk analisis kemometrik

Spektrum Wilayah bilangan gelombang (cm-1)

Jumlah titik serapan

Utuh 3999 - 399 1789 Gabungan segmen

3751-2815 dan 1903-399

1267

Segmen 1 3751-2815 486 Segmen 2 1903-399 781

Sekilas dapat diasumsikan bahwa pengelompokan tempuyung berdasarkan perbedaan tempat tumbuh dapat dilakukan dengan baik menggunakan data spektrum asli. Akan tetapi, pola visualisasi PCA ternyata tidak memberikan dukungan terhadap asumsi tersebut (Lampiran 7). Pengelompokan tempuyung tampak dengan jelas pada plot skor dua dimensi data spektrum derivat. Hal ini dapat terjadi karena proses pendahuluan menyebabkan karakter khas dari spektrum menjadi lebih terkuantisasi sehingga faktor-faktor penciri menjadi semakin spesifik. Kespesifikan ini ditandai dengan meningkat-nya jumlah komponen utama yang terlibat. Sedikitnya jumlah komponen utama spektrum asli ternyata tidak cukup untuk menggambarkan penggolongan tempuyung secara jelas. Faktor gangguan matriks yang cukup kuat dari sel utuh tempuyung dapat menjadi salah penyebabnya. Faktor ini muncul dalam bentuk gangguan serapan yang berdampak pada menurunnya korelasi antar-variabel grup.

Tabel 3 Hasil analisis PCA spektrum IR

tempuyung Kode

Spektrum Jumlah

komponen utama

Total variasi

terwakili (%) Asli 2 98 Asli gabung 2 99 Asli segmen 1 2 100 Asli segmen 2 2 99 Derivat 7 98 Derivat gabung 7 98 Derivat segmen1 7 99 Derivat segmen2 7 99

Tabel 3 selain menunjukkan perbedaan hasil pengelompokan tempuyung dengan data spektrum asli dan data spektrum hasil proses pendahuluan juga memperlihatkan pengaruh segmentasi spektrum dalam analisis PCA. Zou et al. (2005) menyatakan bahwa segmentasi selain meningkatkan mutu analisis spektrum IR melalui pengurangan wilayah spektrum yang banyak mengandung derau juga dapat

9

menurunkan hasil analisis melalui eliminasi informasi penting yang dimiliki spektrum. menurunkan hasil analisis melalui eliminasi informasi penting yang dimiliki spektrum. Segmentasi pada spektrum IR tempuyung tidak menghilangkan informasi penting yang dimiliki spektrum karena berdasarkan data tabel 3 teramati bahwa jumlah komponen utama hasil analisis PCA dari data spektrum dengan segmentasi, baik segmen 1, 2, ataupun segmen gabung, sama dengan jumlah komponen utama yang ditampilkan oleh spektrum yang melibatkan seluruh fitur serapan. Hal ini mengindikasikan bahwa setiap wilayah spektrum IR tempuyung mengandung informasi penting yang dapat diekstrak sebagai bagian dari variabel komponen utama.

Segmentasi pada spektrum IR tempuyung tidak menghilangkan informasi penting yang dimiliki spektrum karena berdasarkan data tabel 3 teramati bahwa jumlah komponen utama hasil analisis PCA dari data spektrum dengan segmentasi, baik segmen 1, 2, ataupun segmen gabung, sama dengan jumlah komponen utama yang ditampilkan oleh spektrum yang melibatkan seluruh fitur serapan. Hal ini mengindikasikan bahwa setiap wilayah spektrum IR tempuyung mengandung informasi penting yang dapat diekstrak sebagai bagian dari variabel komponen utama.

Abs

orba

ns

Bilangan gelombang (cm-1)

Segmen 1 merupakan daerah spektrum yang memberikan total variasi terbaik dari seluruh data spektrum. Total variasi yang digambarkan oleh spektrum ini mencapai 100% (PC1 = 98%, PC2 = 2%) untuk data spektrum asli dan 99% (PC1 = 71%, PC2 = 15%, PC3 = 7%, PC4 = 3%, PC5 = 2%, PC6 = 1%, PC7 = 0%) untuk data spektrum dengan proses pendahuluan. Sumbangan konstituen yang berperan besar pada pengelompokan ini diduga berasal dari gugus OH, C-H, dan CH metoksi dari sampel. Gambar 8 menunjukkan spektrum IR dari contoh tempuyung dan standar kuersetin.

Segmen 1 merupakan daerah spektrum yang memberikan total variasi terbaik dari seluruh data spektrum. Total variasi yang digambarkan oleh spektrum ini mencapai 100% (PC1 = 98%, PC2 = 2%) untuk data spektrum asli dan 99% (PC1 = 71%, PC2 = 15%, PC3 = 7%, PC4 = 3%, PC5 = 2%, PC6 = 1%, PC7 = 0%) untuk data spektrum dengan proses pendahuluan. Sumbangan konstituen yang berperan besar pada pengelompokan ini diduga berasal dari gugus OH, C-H, dan CH metoksi dari sampel. Gambar 8 menunjukkan spektrum IR dari contoh tempuyung dan standar kuersetin.

Gambar 8 Spektrum kuersetin (a) dan tempuyung Leuwiliang (b).

Komponen utama pertama dari plot skor PCA derivat segmen 1 (Gambar 9) mampu membedakan tempuyung Cimanggu dari kedua tempuyung lainnya (daerah negatif dari PC1), sedangkan komponen utama kedua memisahkan tempuyung Leuwiliang dari tempuyung Jawa dan Cimanggu (daerah negatif dari PC2). Pada plot skor daerah spektrum ini, contoh tempuyung dengan kadar flavonoid cukup rendah daripada kedua tempuyung lainnya, yaitu tempuyung Cimanggu, terletak pada daerah negatif PC1 dan positif PC2, sedangkan tempuyung Jawa

dan Leuwiliang sebagian besarnya berada pada wilayah positif PC1. Kondisi pengelompokan ini dapat terjadi sebagai hasil identifikasi PCA terhadap variasi komposisi konstituen kimia contoh yang dapat disebabkan adanya perbedaan pengaruh unsur hara, intensitas cahaya, suhu, dan kelembaban pada metabolisme tumbuhan (Soetedjo & Kartasapoetra 2002). Proyeksi Struktur Laten (PLS)

Bila PCA mengekstrak informasi spektrum secara keseluruhan, PLS mengekstrak informasi spektrum yang relevan dengan suatu karakter kimia tertentu yang dibutuhkan. Sebagai salah satu metode pengenalan pola terawasi (pola spektrum dikenali dengan proses pengelompokan terlebih dahulu), model regresi PLS mencari korelasi linear antara variabel x hasil pengukuran spektrum (variabel prediktor) dan variabel y hasil penampakan kimiawi atau aktivitas biologis contoh (variabel respons). Pada analisis flavonoid tempuyung, variabel x merupakan nilai absorbans pada bilangan gelombang tertentu sedangkan variabel y-nya merupakan kadar flavonoid total tempuyung hasil analisis metode Depkes RI.

(a)

b

a

(b) Gambar 9 Plot skor dua dimensi dua

komponen utama spektrum IR asli (a) dan derivat (b) segmen 1.

10

Tabel 4 Tampilan parameter model prediksi flavonoid total tempuyung Kode Spektrum Korelasi Galat Faktor

Kalibrasi Validasi SEC RMSEC BIAS RMSEP SEP BIAS

Asli 0.926 0.564 0.039 0.038 0.000 0.091 0.094 0.009 5

Asli gabung 0.969 0.701 0.026 0.025 0.000 0.084 0.087 0.003 7

Asli segmen 1 0.975 0.806 0.023 0.022 0.000 0.061 0.063 - 0.004 8

Asli segmen 2 0.978 0.844 0.021 0.021 0.000 0.055 0.057 - 0.003 7

Derivat 0.996 0.864 0.009 0.009 0.000 0.052 0.054 0.003 9

Derivat gabung 0.996 0.853 0.009 0.009 0.000 0.054 0.056 0.004 9

Derivat segmen 1 0.974 0.742 0.023 0.023 0.000 0.076 0.078 - 0.001 7

Derivat segmen 2 0.996 0.849 0.010 0.009 0.000 0.055 0.057 0.004 9

Analisis PLSR untuk tempuyung dilakukan dengan teknik PLS-1 karena hanya melibatkan satu komponen respons dari spektrum, yaitu dalam bentuk kadar flavonoid total. Kesahihan model yang terbentuk diuji dengan validasi silang. Teknik validasi silang bermanfaat untuk menentukan jumlah komponen yang optimal dari jumlah contoh yang sedikit, selain juga mampu melakukan tes secara independen (Stchur et al. 2002). Suatu model PLS dikategorikan sebagai model yang dapat dipercaya bila nilai parameter yang dihasilkan, di antaranya berupa nilai korelasi dan nilai galat, serupa untuk setiap tahapan pembuatan model. Korelasinya (r) harus bernilai tinggi sedangkan galatnya bernilai rendah (Baranska et al. 2005). Model prediksi yang memiliki nilai galat validasi yang lebih besar daripada galat kalibrasi digolongkan sebagai model yang overfitted (Naes et al. 2002). Model yang overfitted menghasilkan terlalu banyak variasi yang spesifik untuk proses kalibrasi dan melibatkan jumlah komponen yang terlalu tinggi. Kondisi overfitted menyebabkan penurunan kemampuan prediksi model. Tabel 4 memberikan informasi tampilan parameter model prediksi flavonoid total tempuyung yang terbentuk dari setiap wilayah segmentasi spektrum. Secara umum, tampilan parameter hasil kalibrasi lebih tinggi daripada hasil validasi. Kondisi parameter model prediksi flavonoid tempuyung ini, selain memperlihatkan kondisi model yang overfitted juga menyiratkan ketidakstabilan dari model yang terbentuk. Ketidakstabilan membuat ketidakhadiran dari satu contoh akan menghasilkan model yang berbeda nyata dari model yang sebenarnya (Davies 1998). Flavonoid pada tempuyung tergolong komponen minor (kandungan komponen <1%). Permasalahan penting yang terjadi saat

memprediksi komponen minor dengan IR adalah masalah pengaruh kuatnya matriks terhadap serapan spesifik analit sehingga serapan spesifik analit dengan serapan matriks tidak dapat dibedakan dengan jelas (Schulz 2003). Fenomena inilah yang tampak mempengaruhi pembentukan model prediksi flavonoid tempuyung menggunakan data spektrum asli. Hasil kalibrasi dan validasi data spektrum asli terlihat lebih rendah daripada hasil kalibrasi dan validasi spektrum dengan proses pendahuluan. Proses pendahuluan, selain meningkatkan daya beda pada PCA ternyata juga meningkatkan tampilan parameter model melalui pengurangan perubahan latar belakang. Gambar 10 memperlihatkan plot skor PLS antara kadar flavonoid prediksi dan referensi dari data spektrum IR segmen 1. Plot skor PLS dari data spektrum lainnya terdapat pada Lampiran 8. Lampiran 9 menggambarkan langkah pengolahan data dengan Unscrambler 9.1. Tampilan parameter model dari spektrum berkode derivat terlihat cukup menonjol di antara tampilan parameter model yang lain (Tabel 4). Model dari data spektrum ini memiliki nilai korelasi kalibrasi dan validasi yang sedikit lebih tinggi (r kalibrasi: 0.996, r validasi: 0.864) dengan nilai galat yang juga lebih rendah (RMSE kalibrasi: 0.009, validasi: 0.052) daripada model derivat lainnya. Model inilah yang diperkirakan dapat diambil sebagai model prediksi flavonoid total dengan FTIR. Namun, perhitungan lebih dalam memperlihatkan bahwa model dari wilayah spektrum ini ternyata tidak stabil. Hal ini dibuktikan oleh nilai galat validasinya yang lima kali lipat lebih besar daripada nilai galat kalibrasi. Selain itu, model ini juga melibatkan faktor yang lebih banyak daripada model yang lain (9 buah faktor).

11

Oleh karena itu, kecenderungan peman-faatan model beralih kepada model dari data spektrum derivat segmen 1. Model ini, walaupun memiliki nilai korelasi yang jauh lebih rendah daripada nilai korelasi spektrum derivat, tingkat kestabilannya cenderung lebih baik. Hal ini diperlihatkan oleh nilai galat validasinya yang hanya berkisar tiga kali lipat daripada nilai galat kalibrasinya (RMSEC = 0.023, RMSEP = 0.076). Model ini juga hanya melibatkan 7 faktor utama sebagai komponen utama penciri flavonoid.

Gambar 10 Plot skor PLS antara kadar

flavonoid prediksi dan referensi dari data spektrum IR derivat segmen 1.

Keterangan: Biru : plot skor kalibrasi Merah : plot skor validasi

Tabel 5 memperlihatkan kadar flavonoid total hasil prediksi menggunakan model dari data spektrum derivat segmen 1. Secara umum, nilai prediksi kelimabelas kadar flavonoid total yang diperoleh dari model PLSR tidak berbeda nyata dari nilai referensinya. Lampiran 10 menyajikan hasil uji F dan uji t dari metode Depkes RI dan model PLSR. Model PLSR menghasilkan ketepatan sebesar ≥ 90% dengan korelasi kadar flavonoid yang diprediksi dengan kadar flavonoid referensi sebesar 0.9879 (persamaan regresi: y = 1.003x). Nilai korelasi tersebut menghasilkan nilai koefisien determinasi sebesar 0.975 sehingga dapat dikatakan bahwa 97,5% di antara keragaman dalam nilai-nilai y dapat dijelaskan oleh hubungan linearnya dengan x. Menurut Schulz et al. (1999) model tersebut dikategorikan sebagai model yang memiliki tingkat korelasi yang sangat tinggi dengan data referensi.

Tabel 5 Hasil prediksi kadar flavonoid total tempuyung dari model derivat segmen 1

Contoh Ulangan

Nilai prediksi

Nilai referensi

Deviasi prediksi

1 0.870 0.840 0.04128

2 0.784 0.810 0.04071

Jawa 3 0.856 0.890 0.04135

Tengah 4 0.741 0.740 0.05286

5 0.759 0.740 0.04540

1 0.636 0.670 0.03911

2 0.593 0.600 0.04379 Cimanggu

3 0.622 0.590 0.04096

4 0.622 0.650 0.04597 5 0.612 0.600 0.04532

1 0.830 0.850 0.03913

2 0.848 0.820 0.03921 Leuwiliang

3 0.878 0.860 0.04371

4 0.800 0.820 0.03662

5 0.759 0.770 0.04371

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

FTIR dan kemometrik dapat digunakan untuk menentukan flavonoid total tempuyung dan membedakan tempuyung berdasarkan tempat tumbuhnya. Kemometrik mengekstrak data spektrum FTIR dengan memanfaatkan informasi spektrum yang khas sebagai variabel yang mempengaruhi penampakan kimiawi atau aktivitas biologis contoh. Pengelompokan tempuyung terbaik diperoleh dari data spektrum segmen 1 dengan proses pendahuluan. Konsistensi penampilan data segmen 1 tersebut juga diperlihatkan pada pembentukan model regresi PLS (r kalibrasi = 0.974, r validasi = 0.742, SEC dan RMSEC = 0.023, RMSEP 0.076, SEP = 0.078, dan bias prediksi = -0.001). Model dari spektrum ini dapat digunakan untuk menentukan kadar flavonoid total suatu contoh tempuyung. Prediksi dapat dilakukan dengan memasukkan data spektrum FTIR dengan proses pendahuluan dari sel utuh atau serbuk tempuyung ke dalam model regresi PLS sebagai data uji.

12

Saran

Perlu dilakukan penambahan jumlah contoh yang terlibat untuk mengurangi efek overfitted dan memperbaiki tingkat presisi dan akurasi model serta perlu dilakukan pengujian dengan teknik kemometrik lain seperti teknik jaringan syaraf tiruan atau artificial neural network (ANN) untuk melihat kestabilan dan kemampuan prediksi model.

DAFTAR PUSTAKA

Baranska W et al. 2005. Quality control of Harpagophytum procumbens and its related phytopharmaceutical products by means of NIR-FT-Raman spectroscopy. Biopolymers 77:1-8.

[BPPT] Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. 2002. Tanaman obat Indonesia. http://iptek.net.id [22 Apr 2005].

Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. 2002. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complemen-tary colorimetric methods. J Food Drug Anal 10:178-182.

Chew OS, Hamdan MR, Ismail Z, Ahmad MN. 2004. Assessment of herbal medicine by chemometrics: assisted interpretation of FTIR spectra. J Anal Chem Acta, in press.

Davies AMC. 1998. Cross validation: do we love it too much?. Spectroscopy Europe 10:24-25.

Day RA, Underwood AL. 1993. Analisis Kimia Kuantitatif. Soendoro R, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Ter-jemahan dari: Quantitative Analysis.

[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Depkes RI.

[Deptan] Departemen Pertanian Republik Indonesia, Direktorat Jenderal Bina Produksi Hortikultura. 2002. Rumusan forum koordinasi kelembagaan produksi aneka tanaman. Di dalam: Prosiding Forum Koordinasi Kelembagaan Produksi Aneka Tanaman; Jakarta, 13-16 November 2002. Jakarta: Deptan RI. hlm. 11-14.

Farkas O, Jakus J, Heberger K. 2004. Quantitative structure antioxidant activity relationships of flavonoid coumpounds. Molecules 9:1079-1088.

Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Padmawinata K dan Soediro I, penerjemah; Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.

Heryanto R. 2003. Biofarmaka: definisi dan fungsinya dalam pengobatan gout. Di dalam: Materi Pelatihan Tanaman Obat dan Produksi Obat Tradisional (Swamedikasi) Pengobatan Asam Urat (Gout). Bogor, 1-2 Maret 2003. Bogor: Biofarmaka. hlm. 7-10.

Jajang. 2004. Penerapan Analisis Artificial Neural Network (ANN) dalam Pengelompokan Ekstrak Daun Jati Belanda (Guazoma ulmifolia Lamk.) [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Khopkar SM. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo A, penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry.

Kuno A, Matsuo M. 2000. Nondestructive specication of solid mixtures by multivariate calibration of x-ray absorption near edge structure using artificial neural networks and partial least square. Analytical Science 16:597-602.

Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinata K, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Techniques of flavonoid Identification.

Miller AL. 1996. Antioxidant flavonoids: structure, function, and clinical usage. Alt Med Rev 1(2):103-111.

Miller JN, Miller JC. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry 4th Edition. Harlow: Pearson Education.

Naes T, Isaksson T, Fearn T, Davies T. 2002. A User Friendly Guide to Multivariate Calibration and Classification. Chichester: NIR Publication

Naumann D. 1998. Infrared spectroscopy in microbiology. Di dalam: Meyers RA, editor Encyclopedia of Analytical Chemistry. Berlin: J Wiley. hlm 1-28.

13

Pramono S, Sumarno, Wahyono S. 1993. Flavonoid daun Sonchus arvensis L. senyawa aktif pembentuk kompleks dengan batu ginjal berkalsium. Warta Tumbuhan Obat Indonesia 2 (3):5-7.

Rosita, Soediarto. 1993. Tumbuhan Obat Indonesia: Penggunaan dan Khasiatnya. Bogor: Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat.

Schulz H. 2003. Can NIR replace quantitative

methods? Example: Echinacea species.Di dalam: 51th Annual Congress of The Society for Medicinal Plant Research. Kiel, 31 August-4 September 2003. Quedlinburgh: Institute Plant Analysis.

Schulz H, Drews H, Kruger H, 1999. Rapid determination of quality parameters in leaves and isolated essential oils of Mentha species. J Essent Oil Res 11: 185-190.

Skoog DA, Hooler FJ, Nieman TA. 1998. Principles of Instrumental Analysis.Ed ke-5. Orlando: Saunders College Pub.

Soedibyo M. 1998. Alam Sumber Kesehatan: Manfaat dan Kegunaan. Jakarta: Balai Pustaka.

Stchur P, Cleveland D, Zhou J, Michel RG. 2002. A review of recent aplications of near infrared spectroscopy and of the caracteristics of novel Pbs CCD arraybased NIR spectrometers. App Spect Rev 37:383-428.

Sutedjo MM, Kartasapoetra. 2002. Pengantar Ilmu Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.

Wold S, Sjostrom M, Eriksson L. 2001. PLS-regression: a basic tool of chemometrics. Chem Intel Lab Syst 58:109-130.

Wartewig S. 2003. Infrared and Raman Spectroscopy Fundamental Process. Weinheim: J Wiley.

Zou et al. 2005. Progress in quality control of herbal medicine with IR fingerprint spectra. Anal Lett 38:1457-1475.

LAMPIRAN

15

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Serbuk tempuyung

FTIR Metode Depkes (2000)

Spektrofotometer Spektrum

Konsentrasi sampel

Variabel x Variabel y PLS PCA

Lampiran 2 Hasil pengukuran kadar air simplisia tempuyung

Asal Ulangan Bobot kosong

Bobot awal

Bobot total

Bobot akhir

Bobot akhir

Kadar air

Rerata kadar

(g) contoh

(g) (g) wadah

(g) contoh

(g) (%) (%) 1 3.6848 3.0020 6.6868 6.4372 2.7524 8.31

Jawa 2 3.7075 3.0239 6.7314 6.4804 2.7729 8.30 8.33 Tengah 3 3.7832 3.0050 6.7882 6.5362 2.7530 8.39

1 3.6851 3.0015 6.6866 6.4200 2.7349 8.88 Cimanggu 2 3.7097 3.0061 6.7158 6.4496 2.7399 8.86 8.87 3 3.7834 3.0074 6.7908 6.5243 2.7409 8.86 1 3.6857 3.0025 6.6882 6.5013 2.8156 6.22 Leuwiliang 2 3.7092 3.0020 6.7112 6.5242 2.8150 6.23 6.18 3 3.7854 3.0016 6.7870 6.6040 2.8186 6.10

Kadar air = Bobot awal contoh-Bobot akhir contoh x 100% Bobot awal contoh

16

Lampiran 3 Rendemen ekstrak tempuyung

Asal Ulangan Bobot wadah (g) Bobot isi Bobot Rendemen kosong akhir (g) simplisia (g) (%)

Jawa Tengah 1 37.2745 38.1850 0.9105 10.0028 9.10 2 36.6570 37.5249 0.8679 10.0029 8.68

3 37.8458 38.7441 0.8983 10.0028 8.98 4 36.9122 37.7208 0.8086 10.0026 8.08 5 37.7179 38.5860 0.8681 10.0027 8.68

Cimanggu 1 37.5884 39.0346 1.4462 10.0029 14.46 2 36.6385 37.9304 1.2919 10.0027 12.92 3 36.0635 37.3519 1.2884 10.0028 12.88 4 37.1337 38.3600 1.2263 10.0028 12.26 5 36.9086 38.5031 1.5945 10.0029 15.94 Leuwiliang 1 37.5431 38.7052 1.1621 10.0029 11.62

2 36.5257 37.6505 1.1248 10.0028 11.24 3 36.9373 38.0920 1.1547 10.0028 11.54 4 36.6152 37.7550 1.1398 10.0028 11.39

Rendemen = Bobot isi x 100% Bobot simplisia Lampiran 4 Hasil uji fitokimia tempuyung

Serbuk Ekstrak etanol Golongan Senyawa Jawa Tengah Cimanggu Leuwiliang Jawa Tengah Cimanggu Leuwiliang

Flavonoid - flavonol - flavon - kalkon - auron - antosianin

+++ +++

- - -

++ ++ - - -

+++ +++

- - -

+++ +++

- - -

++ ++ - - -

+++ +++

- - -

Alkaloid + + + + + + Saponin - - - - - - Kuinon - - - - - - Tanin +++ ++ +++ + + + Steroid + + + + + +

Keterangan : + keberadaan senyawa terdeteksi - keberadaan senyawa tidak terdeteksi

intensitas dinyatakan dengan jumlah +

17

Lampiran 5 Kurva standar kuersetin pada panjang gelombang 367 nm Untuk contoh J1, J2, J3

No Konsentrasi (ppm)

Absorbans Persamaan Garis

1 3 0.108 2 6 0.240 3 12 0.502 4 15 0.627 5 24 1.032

y = -0.0250 + 0.0439 x

r = 0.9999

Untuk contoh J4, J5, C3

No Konsentrasi (ppm)

Absorbans Persamaan Garis

1 3 0.110 2 6 0.243 3 12 0.507 4 15 0.630 5 24 1.036

y = -0.0225 + 0,0439 x

r = 0.9999

Untuk contoh C1

No Konsentrasi (ppm)

Absorbans Persamaan Garis

1 3 0.116 2 6 0,249 3 12 0.520 4 15 0.644 5 24 1.054

y = -0.0186 + 0.0446 x

r = 0.9999

Untuk contoh C2, C4

No Konsentrasi (ppm)

Absorbans Persamaan Garis

1 3 0.117 2 6 0.249 3 12 0.521 4 15 0.644 5 24 1.058

y = -0.0191+ 0.0447 x

r = 0.9999

Untuk contoh C5, L1, L2

No Konsentrasi (ppm)

Absorbans Persamaan Garis

1 3 0.121 2 6 0.246 3 12 0.484 4 15 0.631 5 24 1.015

y = -0.0121+ 0.0426 x

r = 0.9997

Untuk contoh L3, L4, L5

No Konsentrasi (ppm)

Absorbans Persamaan Garis

1 3 0.111 2 6 0.243 3 12 0.506 4 15 0.634 5 24 1.033

y = -0.0209+ 0.0438 x

r = 0.9999

18

Lampiran 6 Hasil pengukuran kadar flavonoid total metode Depkes RI

Tempuyung Jawa Tengah Sampel Ulangan Absorbans Intersep Kemiringan Konsentrasi Kadar flavonoid Rendemen Bobot Rerata Kadar

(ppm) (% b/b) (%) hidrolisis (g) (%) 1 1a 0.053 -0.0250 0.0439 1.7768 0.83 9.10 0.0182 0.055 -0.0250 0.0439 1.8223 0.85 9.10 0.0182 0.052 -0.0250 0.0439 1.7540 0.82 9.10 0.0182 0.84 1b 0.054 -0.0250 0.0439 1.7995 0.84 9.10 0.0182 0.054 -0.0250 0.0439 1.7995 0.84 9.10 0.0182 0.055 -0.0250 0.0439 1.8223 0.85 9.10 0.0182 2 2a 0.052 -0.0250 0.0439 1.7540 0.82 8.68 0.0174 0.049 -0.0250 0.0439 1.6856 0.79 8.68 0.0174 0.051 -0.0250 0.0439 1.7312 0.81 8.68 0.0174 0.81 2b 0.052 -0.0250 0.0439 1.7540 0.82 8.68 0.0174 0.051 -0.0250 0.0439 1.7312 0.81 8.68 0.0174 0.050 -0.0250 0.0439 1.7084 0.80 8.68 0.0174 3 3a 0.058 -0.0250 0.0439 1.8907 0.89 8.98 0.0179

0.058 -0.0250 0.0439 1.8907 0.89 8.98 0.0179 0.059 -0.0250 0.0439 1.9134 0.90 8.98 0.0179 0.89

3b 0.058 -0.0250 0.0439 1.8907 0.89 8.98 0.0179 0.058 -0.0250 0.0439 1.8907 0.89 8.98 0.0179 0.058 -0.0250 0.0439 1.8907 0.89 8.98 0.0179 4 4a 0.046 -0.0225 0.0439 1.5604 0.73 8.08 0.0162 0.048 -0.0225 0.0439 1.6059 0.75 8.08 0.0162 0.045 -0.0225 0.0439 1.5376 0.72 8.08 0.0162 0.74 4b 0.047 -0.0225 0.0439 1.5831 0.74 8.08 0.0162 0.047 -0.0225 0.0439 1.5831 0.74 8.08 0.0162

0.048 -0.0225 0.0439 1.6059 0.75 8.08 0.0162 5 5a 0.049 -0.0225 0.0439 1.6287 0.76 8.68 0.0174 0.049 -0.0225 0.0439 1.6287 0.76 8.68 0.0174 0.048 -0.0225 0.0439 1.6059 0.75 8.68 0.0174 0.74 5b 0.045 -0.0225 0.0439 1.5376 0.72 8.68 0.0174

0.045 -0.0225 0.0439 1.5376 0.72 8.68 0.0174 0.045 -0.0225 0.0439 1.5376 0.72 8.68 0.0174

19

Tempuyung Cimanggu Sampel Ulangan Absorbans Intersep Kemiringan Konsentrasi Kadar flavonoid Rendemen Bobot Rerata

(ppm) (% b/b) (%) hidrolisis (g) Kadar (%) 1 1a 0.044 -0.0186 0.0446 1.4036 0.66 14.46 0.0287 0.044 -0.0186 0.0446 1.4036 0.66 14.46 0.0287 0.044 -0.0186 0.0446 1.4036 0.66 14.46 0.0287 0.67 1b 0.045 -0.0186 0.0446 1.4260 0.67 14.46 0.0287 0.045 -0.0186 0.0446 1.4260 0.67 14.46 0.0287 0.045 -0.0186 0.0446 1.4260 0.67 14.46 0.0287 2 2a 0.039 -0.0191 0.0447 1.2998 0.61 12.92 0.0258 0.037 -0.0191 0.0447 1.2550 0.59 12.92 0.0258 0.038 -0.0191 0.0447 1.2774 0.60 12.92 0.0258 0.60 2b 0.037 -0.0191 0.0447 1.2550 0.59 12.92 0.0258 0.037 -0.0191 0.0447 1.2550 0.59 12.92 0.0258 0.037 -0.0191 0.0447 1.2550 0.59 12.92 0.0258 3 3a 0.033 -0.0225 0.0439 1.2642 0.59 12.88 0.0258

0.032 -0.0225 0.0439 1.2415 0.58 12.88 0.0258 0.034 -0.0225 0.0439 1.2870 0.60 12.88 0.0258 0.59

3b 0.030 -0.0225 0.0439 1.1959 0.56 12.88 0.0258 0.036 -0.0225 0.0439 1.3326 0.62 12.88 0.0258 0.034 -0.0225 0.0439 1.2870 0.60 12.88 0.0258 4 4a 0.042 -0.0191 0.0447 1.3669 0.64 12.26 0.0245 0.044 -0.0191 0.0447 1.4116 0.66 12.26 0.0245

0.041 -0.0191 0.0447 1.3445 0.63 12.26 0.0245 0.65 4b 0.043 -0.0191 0.0447 1.3893 0.65 12.26 0.0245 0.043 -0.0191 0.0447 1.3893 0.65 12.26 0.0245 0.042 -0.0191 0.0447 1.3669 0.64 12.26 0.0245 5 5a 0.042 -0.0121 0.0426 1.2700 0.60 15.95 0.0319 0.041 -0.0121 0.0426 1.2465 0.58 15.95 0.0319 0.042 -0.0121 0.0426 1.2700 0.60 15.95 0.0319 0.60 5b 0.042 -0.0121 0.0426 1.2700 0.60 15.95 0.0319

0.043 -0.0121 0.0426 1.2934 0.61 15.95 0.0319 0.042 -0.0121 0.0426 1.2700 0.60 15.95 0.0319

20

Tempuyung Leuwiliang Sampel Ulangan Absorbans Intersep Kemiringan Konsentrasi Kadar flavonoid Rendemen Bobot Rerata Kadar

(ppm) (% b/b) (%) hidrolisis (g) (%) 1 1a 0.061 -0.0121 0.0426 1.7160 0.81 11.62 0.0232 0.064 -0.0121 0.0426 1.7864 0.84 11.62 0.0232 0.062 -0.0121 0.0426 1.7394 0.82 11.62 0.0232 0.82 1b 0.061 -0.0121 0.0426 1.7160 0.81 11.62 0.0232 0.061 -0.0121 0.0426 1.7160 0.81 11.62 0.0232 0.065 -0.0121 0.0426 1.8099 0.85 11.62 0.0232 2 2a 0.062 -0.0121 0.0426 1.7394 0.82 11.25 0.0225 0.057 -0.0121 0.0426 1.6221 0.76 11.25 0.0225 0.059 -0.0121 0.0426 1.6690 0.78 11.25 0.0225 2b 0.056 -0.0121 0.0426 1.5986 0.75 11.25 0.0225 0.77 0.057 -0.0121 0.0426 1.6221 0.76 11.25 0.0225 0.057 -0.0121 0.0426 1.6221 0.76 11.25 0.0225 3 3a 0.061 -0.0209 0.0438 1.8699 0.88 11.54 0.0231 0.061 -0.0209 0.0438 1.8699 0.88 11.54 0.0231 0.059 -0.0209 0.0438 1.8242 0.85 11.54 0.0231 0.85 3b 0.058 -0.0209 0.0438 1.8014 0.84 11.54 0.0231 0.057 -0.0209 0.0438 1.7785 0.83 11.54 0.0231 0.057 -0.0209 0.0438 1.7785 0.83 11.54 0.0231 4 4a 0.057 -0.0209 0.0438 1.7785 0.83 11.39 0.0228 0.058 -0.0209 0.0438 1.8014 0.84 11.39 0.0228 0.056 -0.0209 0.0438 1.7557 0.82 11.39 0.0228 0.82 4b 0.055 -0.0209 0.0438 1.7329 0.81 11.39 0.0228 0.054 -0.0209 0.0438 1.7100 0.80 11.39 0.0228 0.055 -0.0209 0.0438 1.7329 0.81 11.39 0.0228 5 5a 0.057 -0.0209 0.0438 1.7785 0.83 11.46 0.0229

0.057 -0.0209 0.0438 1.7785 0.83 11.46 0.0229 0.057 -0.0209 0.0438 1.7785 0.83 11.46 0.0229 0.86

5b 0.061 -0.0209 0.0438 1.8699 0.88 11.46 0.0229 0.059 -0.0209 0.0438 1.8242 0.86 11.46 0.0229 0.066 -0.0209 0.0438 1.9840 0.93 11.46 0.0229

21

Contoh perhitungan: y = a + bx a = intersep y = absorbans b= kemiringan x = konsentrasi

Tempuyung Jawa Tengah ulangan 1a y= -0.0250 + 0.0439x r = 0.9999 absorbans = 0.053

Konsentrasi flavonoid = (absorbans terukur + intersep)/kemiringan = ( 0,053 + 0.0250) = 1.7768 ppm 0.0439 Kadar flavonoid total = [flavonoid] mg/L x 1L x 25 ml x 75 ml x 100 ml x rendemen

1000 ml 10 ml 20 ml 100 x bbt hidrolisis (mg) = 1.7768 mg/L x 1L x 25 ml x 75 ml x 100 ml x 9,10 1000 ml 10 ml 20 ml 100 x 0.0182x103 mg = 0.83 % b/b

22

Lampiran 7 Plot skor dua dimensi dua komponen utama pertama PCA

Spektrum asli Spektrum derivat

Spektrum asli gabung Spektrum derivat gabung

Spektrum asli segmen 1 Spektrum derivat segmen 1

PC2 Scores

PC1

Spektrum asli segmen 2 Spektrum derivat segmen 2

pca derivat seg…,X-expl: 98%,1%

Keterangan: J : tempuyung Jawa Tengah C : tempuyung Cimanggu L : tempuyung Leuwiliang

23

Lampiran 8 Plot skor PLS tempuyung

Spektrum asli Spektrum derivat

Spektrum asli gabung Spektrum derivat gabung

Spektrum asli segmen 1 Spektrum derivat segmen 1

Spektrum asli segmen 2 Spektrum derivat segmen 2

Keterangan: : plot skor kalibrasi : plot skor validasi

24

Lampiran 9 Langkah pengolahan data dengan Unscrambler 9.1 Analisis Komponen Utama (PCA)

1. Data dari Excel dikopi ke dalam Unscrambler kemudian icon Task diklik, dipilih menu PCA.

2. Pada tampilan isi menu PCA, bagian sampel set diisi dengan jumlah contoh yang digunakan, bagian variabel diisi dengan jumlah dan jenis data variabel yang dipakai (spektra atau non spektra). Teknik validasi silang dipilih sebagai model validasi dengan jumlah komponen utama sebanyak 10 komponen.

3. Setelah semua pilihan diisi, tombol OK diklik, lalu ditunggu beberapa saat hingga

sistem selesai mengolah data. Tampilan data dapat dilihat dengan mengklik tombol View.

25

Proyeksi Struktur Laten (PLS)

1. Data dari Excel dikopi ke dalam Unscrambler kemudian icon Task diklik, dipilih menu regression. Pada menu ini model PLS-1 dklik lalu bagian menu x-variables diisi dengan data spektrum dan y-variables diisi dengan data kadar flavonoid (kolom terakhir pada kolom data). Teknik validasi silang dipilih sebagai model validasi dengan jumlah komponen utama sebanyak 10 komponen

2. Setelah semua pilihan diisi, tombol OK diklik, lalu ditunggu beberapa saat hingga

sistem selesai mengolah data. Tampilan data dapat dilihat dengan mengklik tombol View.

26

Lampiran 10 Hasil uji F dan uji t antara metode Depkes RI dan metode PLSR

Contoh Jawa Tengah Cimanggu Leuwiliang Metode Depkes RI Metode PLSR Metode Depkes RI Metode PLSR Metode Depkes RI Metode PLSR Rerata kadar ( x ) 0.802 0.804 0.617 0.622 0.823 0.824 Varian (σ2) 0.0033585 0.00423 0.000253 0.00127 0.002081 0.00123 Simpangan Baku (SB) 1.12 x 10-5 1.78 x 10-5 6.40x 10-8 1.61 x 10-6 4.33 x 10- 6 1.51 x 10-6

Uji F n N (n-1)

5 4

5 4

5 4

F hitung 0.7940 0.1992 1.6919 F tabel (n-1 = 4, 95%) 6.388 6.388 6.388 Simpulan (Fhitung < F tabel) tidak berbeda nyata tidak berbeda nyata tidak berbeda nyata Uji t n N (n1+n2-2)

5 8

5 8

5 8

t hitung 0.1613 0.4061 0.0994 t tabel (N = 8, 95%) 2.306 2.306 2.306 Simpulan (t hitung < t tabel) tidak berbeda nyata tidak berbeda nyata tidak berbeda nyata

Keterangan: S1 = SB metode Depkes RI S2 = SB metode PLSR

F hitung = (σ2 1) / (σ2

2) t hitung =

21

21

11)(

nns

xx

+

− s =

)2()1()1(

21

22

22

211

−+−+−

nnsnsn