PENETAPAN KADAR KURKUMIN PADA SEDIAAN HERBAL YANG …repository.ub.ac.id/167726/1/Rifky Afrizal Fajar... · 2019. 5. 8. · several herbal medicine contains turmeric. The method was

PENETAPAN KADAR KURKUMIN PADA SEDIAAN HERBAL YANG

MENGANDUNG Curcuma longa DENGAN METODE ULTRA HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS

SPECTROMETRY (UHPLC-MS/MS)

TUGAS AKHIR

Untuk Memenuhi Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

Oleh :

Rifky Afrizal Fajar Kurniawan

NIM 155070500111011

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2018

ii

HALAMAN PENGESAHAN

TUGAS AKHIR

Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung

Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid

Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS)

Oleh:

Rifky Afrizal Fajar Kurniawan

NIM: 155070500111011

Telah diuji pada: Hari : Rabu Tanggal : 12 Desember 2018

dan dinyatakan lulus oleh :

Penguji-I,

Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm.,Apt. NIP.2011068502181001

Pembimbing-I/Penguji-II, Pembimbing-II/Penguji-III,

Bachtiar Rifai P, M.Farm.,Apt Ika Putri N, S.Farm., M.Sc., Apt.

NIP. 2012058709291001 NIP. 2013048909152001

Mengetahui, Kepala Program Studi Farmasi,

Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm.,Apt. NIP. 2011068502181001

iii

PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN

Saya yang bertandatangan di bawahini:

Nama : Rifky Afrizal Fajar Kurniawan

NIM : 155070500111011

Program Studi : Program StudiFarmasi

FakultasKedokteranUniversitasBrawijaya

MenyatakandengansebenarnyabahwaTugasAkhir yang sayatulisinibenar-

benarkaryasayasendiri, bukanmerupakanpengambilalihantulisanataupikiran

orang lain yang sayaakuisebagaitulisanataupikiransaya. Apabila di

kemudianharidapatdibuktikanbahwaTugasAkhiriniadalahhasiljiplakan,

makasayabersediamenerimasanksiatasperbuatantersebut

Malang, Desember 2018

Yang menyatakanpernyataan,

(Rifky Afrizal Fajar Kurniawan)

NIM.155070500111011

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur kapada Allah SWT atas karunia dan rahmat-Nya sehingga

penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir yang berjudul “Penetapan Kadar

Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan

Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

(UHPLC-MS/MS)” dengan lancar untuk memenuhi persyaratan menyelesaikan

studi di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

Ketertarikan penulis terhadap topik yang dibahas didalam penelitian ini

didasarkan pada banyaknya sediaan herbal khususnya yang mengandung kunyit

telah beredar di masyarakat dan tingkat konsumsinya yang meningkat pada.

Oleh karena itu diperlukan pemantauan kualitas dari sediaan tersebut. Salah

satu parameter pemantauan kualitas sediaan herbal secara spesifik yaitu

penetapan kadar senyawa marker yaitu kurkumin dalam sediaan tersebut

dengan metode UHPLC-MS/MS. Sehingga kadar kurkumin yang terkandung

dalam sediaan herbal mengandung Curcuma longa dapat diketahui .

Dengan selesainya Tugas Akhir ini, penulis ingin mengucapkan

terimakasih kepada seluruh pihak yang telah membantu penyelesaiannya, antara

lain:

1. Dr. dr. Sri Andarini, M. Kes, selaku dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya yang telah memberikan kesempatan untuk

menuntut ilmu di Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

2. Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm., Apt, selaku Ketua Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya yang telah

memberikan kesempatan untuk menyelesaikan studi dengan baik

3. Bachtiar Rifai Pratita Ihsan, S.Farm., M.Farm.,Apt., selaku dosen

pembimbing pertama yang telah memberikan pengarahan,

bimbingan dan saran-saran yang membangun selama penulisan

Tugas Akhir ini.

4. Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc.,Apt., selaku dosen pembimbing

kedua yang telah memberikan pengarahan, bimbingan dan saran-

saran yang membangun selama penulisan Tugas Akhir ini.

v

5. Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm., Apt. Sebagai penguji yang

telah memberi masukan dan wawasan terhadap penelitian ini

6. Hananditia Rachma Pramestutie.,S.Farm.,M.Farm.Klim.,Apt., selaku

ketua tim Tugas Akhir Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya.

7. Orang tua penulis, bapak Agung Saptono, S.Si, dan ibu Nurul

Hidayati, serta saudara penulis Raditya Afreyzha Ramadhany yang

senantiasa memberikan dukungan dan doa kepada penulis sehingga

Tugas Akhir ini tidak mungkin selesai tanpa bantuan mereka.

8. Teman teristimewa, Winfika Wibisono Putri yang selalu memberikan

dukungan dan bantuan serta doa selama proses penyelesaian Tugas

Akhir ini.

9. Teman-teman penghuni grima, Arip, Birrul, Abu, Panji, Alif, Adit, Dio,

Danil, Bidin, Sandi, Ramen, Wisnu yang selalu menyediakan tawa

ceria di setiap sore hari di kampus.

10. Teman-teman Farmasi UB 2015 yang telah bersama berjuang di

farmasi sejak mahasiswa baru.

11. Kakak-kakak tingkat yang telah memberikan banyak ilmunya kepada

penulis dan adik-adik tingkat yang siap meneruskan perjuangan dan

inovasi penulis.

12. Segenap keluarga organisasi tempat saya menambah ilmu dan

pengalaman yaitu HMF Aecus Prospisio.

13. Semua Pihak yang telah membantu dan tidak dapat disebutkan satu

persatu.

Penulis sadar bahwa tidak ada yang sempurna di dunia ini, demikian

pula dengan penelitian Tugas Akhir yang penulis yakin masih sangat jauh dari

kesempurnaan. Sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang

membangun. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua.

Malang, 20 Desember 2018

Penulis

vi

ABSTRAK

Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS).Tugas Akhir, Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Bachtiar Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc., Apt.

Kunyit banyak dipilih sebagai agen antiinflamasi dan antikanker secara tradisional. Terdapat banyak produk herbal mengandung kunyit untuk mengatasi antiinflamasi atau meredakan nyeri. Senyawa yang paling berperan memberikan efek farmakologis yaitu kurkumin dalam kunyit tersebut. Perlu dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS karena memiliki hasil pemisahan senyawa dan deteksi senyawa yang sangat baik. Serta perlu dilakukan monitoring kualitas dengan penetapan kadar kurkumin dalam sediaan herbal tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas medote analisis kurkumin yang digunakan dan mengetahui kadar kurkumin dalam beberapa sediaan herbal guna memenuhi monitoring kualitas sediaan tersebut. Sampel dipilih dengan cara metode purposive sampling dengan beberapa kriteria tertentu. Dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS dengan fase gerak gradien A (0,1% asam format dalam aquabidest) dan B (0,1% asam format dalam acetonitrile) serta fase diam yaitu Kinetex EVO C18 100oA. Metode analisis dinyatakan valid dengan memenuhi parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas (r=0,9997), akurasi (% perolehan kembali = 98,63-101,76%), presisi (%RSD=0,38-5,7%), LOD (0,11µg/ml) dan LOQ (0,34µg/ml). Berikutnya dilakukan penetapan kadar kurkumin dalam 3 sampel sediaan herbal mengandung kunyit. Kadar yang didapatkan sampel serbuk (0,03%), sampel kapsul (4,78%), dan sampel cair (0,03%).

Kata kunci: Kunyit, Kurkumin, UHPLC-MS/MS, Validasi Metode, Sediaan Herbal

vii

ABSTRACT

Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Determination of Curcumin in Herbal

Medicine Containing Curcuma longa Using Ultra High Performance Liquid

Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). Final Assignment,

Pharmacy Program, Medical Faculty Brawijaya University. Advisers: (1) Bachtiar

Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm.,

M.Sc., Apt.

Turmeric (Curcuma longa) widely used as the main ingredient of some herbal medicines to relieve pain and inflammation. Curcumin is the main secondary metabolites of Curcuma longa that has also shown some therapeutic activities such as anti-inflammatory and anti-cancer agent. An efficient, sensitive and precise Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) was developed to determine curcumin content in several herbal medicine contains turmeric. The method was validated for linearity, selectivity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Thus, the method can be used to determine curcumin content in herbal medicine to control herbal medicine quality. Objective of this research is to validate the method of curcumin analysis and determine curcumin content in herbal medicine. Validation was done through curcumin analysis using UHPLC-MS/MS with the gradient mobile phase A (0.1% format acid in aquabidest) and B (0.1% format acid in acetinitrile), while the static phase was Kinitex EVO C18 100o A. The method was finally recognized as valid by fulfilling several validation parameters such selectivity showed 3,2 minute as Retention Time (RT) also 285 m/z and 177 m/z as quantifier and qualifier product mass of curcumin , linearity (r=0.9997), accuracy (% recovery = 98,63-101.76%), precision (%RSD=0,38-5,70%), LOD (0,11 µg/ml) and LOQ (0,34 µg/ml). Curcumin level in three samples was determined from the herbal medicines containing turmeric. It showed that each herbal medicines sample contain curcumin 0.03%, 4,78% and liquid 0.03% for powder, capsule and liquid dosage form respectively. This research showed that the proposed method may be useful as an accurate, effective and sensitive for quantitative determination of curcumin content.

Keywords: Turmeric, Curcumin, UHPLC-MS/MS, Method Validation, Dosage Form

viii

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN................................................................................. ii

PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN ............................................................... iii

KATA PENGANTAR .......................................................................................... iv

ABSTRAK .......................................................................................................... vi

ABSTRACT ....................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ...................................................................................................... vii

DAFTAR TABEL ................................................................................................ ix

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xi

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiiii

DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xiii

BAB 1 PENDAHULUAN .......................................... Error! Bookmark not defined.

1.1 Latar belakang .................................... Error! Bookmark not defined.

1.2 Rumusan Masalah .............................. Error! Bookmark not defined.

1.3 Tujuan ................................................ Error! Bookmark not defined.

1.4 Manfaat .............................................. Error! Bookmark not defined.

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .................................. Error! Bookmark not defined.

2.1. Obat Tradisional ................................. Error! Bookmark not defined.

2.2. Kunyit ................................................. Error! Bookmark not defined.

2.3. Kurkumin ............................................ Error! Bookmark not defined.

2.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Error! Bookmark

not defined.

2.5. Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

(UHPLC-MS/MS) ................................ Error! Bookmark not defined.

2.6. Validasi Metode Analisis ..................... Error! Bookmark not defined.

BAB 3 KERANGKA KONSEP ................................. Error! Bookmark not defined.

3.1. Kerangka Konsep ............................... Error! Bookmark not defined.

ix

BAB 4METODE PENELITIAN .................................. Error! Bookmark not defined.

4.1. Rancangan Penelitian ..................... Error! Bookmark not defined.

4.2. Populasi dan sampel ........................ Error! Bookmark not defined.

4.3. Lokasi dan Waktu Penelitian ............ Error! Bookmark not defined.

4.3.1. Lokasi Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.

4.3.2. Waktu Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.

4.4. Bahan dan Alat Penelitian ................ Error! Bookmark not defined.

4.4.1. Bahan Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.

4.4.2. Alat / Instrumen Penelitian .... Error! Bookmark not defined.

4.5. Prosedur Penelitian .......................... Error! Bookmark not defined.

4.5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MSError! Bookmark not

defined.

4.5.2. Pembuatan larutan baku kurkuminError! Bookmark not

defined.

4.5.3. Preparasi Sampel ................. Error! Bookmark not defined.

4.5.3.1 Sediaan Cair. ......... Error! Bookmark not defined.

4.5.3.2. Sediaan Serbuk........ Error! Bookmark not defined.

4.5.3.3. Sediaan Kapsul ........ Error! Bookmark not defined.

4.5.4. Validasi metode analisis ........ Error! Bookmark not defined.

4.5.5. Analisis data ......................... Error! Bookmark not defined.

BAB 5HASIL DAN ANALISA DATA ........................ Error! Bookmark not defined.

5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS Error! Bookmark not defined.

5.2. Validasi Metode Analisa ................... Error! Bookmark not defined.

5.3. Penetapan Kadar Kurkumin pada Sediaan HerbalError! Bookmark

not defined.

BAB 6 PEMBAHASAN ............................................ Error! Bookmark not defined.

6.1 Pembahasan .................................... Error! Bookmark not defined.

6.2 Implikasi Penelitian........................... Error! Bookmark not defined.

6.3 Keterbatasan Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.

BAB 7 PENUTUP ..................................................... Error! Bookmark not defined.

7.1 Kesimpulan ...................................... Error! Bookmark not defined.

7.2 Saran ............................................... Error! Bookmark not defined.

DAFTAR PUSTAKA ................................................. Error! Bookmark not defined.

x

LAMPIRAN ............................................................... Error! Bookmark not defined.

xi

DAFTAR TABEL

Table 2.1. Kategori Metode Pengujian (United States Pharmacopeial Convention,

2007). ................................................... Error! Bookmark not defined.

Table 2.2. Parameter Analisis yang Dibutuhkan Dalam Validasi Metode Analisis

(United States Pharmacopeial Convention, 2007).Error! Bookmark

not defined.

Tabel 2.3. Kriteria Rentang Recovery yang Dapat Diterima (AOAC, 2002) .. Error!

Bookmark not defined.

Tabel 2.4. Kriteria Akurasi dan Presisi yang Masih Dapat Diterima (AOAC, 2002).

............................................................. Error! Bookmark not defined.

Tabel 4.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak ........... Error! Bookmark not defined.

Tabel 5.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak ........... Error! Bookmark not defined.

Tabel 5.2. Optimasi Parameter Massa untuk CurcuminError! Bookmark not

defined.

Tabel 5.3. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Waktu RetensiError! Bookmark

not defined.

Tabel 5.4. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Detektor MS/MS ............... Error!


Tabel 5.5. Kriteria Batas Perolehan Kembali yang DapatError! Bookmark not

defined.

Tabel 5.6. Kriteria Batas %RSD yang Dapat Diterima (AOAC, 2002) .......... Error!


Tabel 5.7. Tabel Hasil Akurasi dan Presisi ............ Error! Bookmark not defined.

Tabel 5.8. Tabel Hasil Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sampel .............. Error!


xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Logo-logo sediaan jamu (A), Obat Herbal Terstandart (B) dan

Fitofarmaka (C) (BPOM, 2015) ...... Error! Bookmark not defined.

Gambar 2.2. Struktur Kimia Kurkumin (a), Demetoksikurkumin (b), dan

Bisdemetoksikurkumin (c) (Sethi at al, 2009)Error! Bookmark not

defined.

Gambar 2.3. Skema Instrumen HPLC (Ahuja dan Dong, 2005).Error! Bookmark

not defined.

Gambar 2.4.. Skema Injektor (a) posisi pada saat memuat sampel dan (b) posisi

saat menyuntikkan sampel (Ahuja dan Dong, 2005) ............. Error!


Gambar 2.5 . Skema Pompa Piston Tunggal Pada HPLC (Ahuja dan Dong, 2005)

...................................................... Error! Bookmark not defined.

Gambar 2.6 . Efektifitas kolom dengan perbandingan besar ukuran partikel pada

masing-masing dekakde plot van Deemter (Seelam, 2013). . Error!


Gambar 2.7. Sistem Kerja MS/MS pada UHPLC-MS/MS (Kang, 2015). ..... Error!


Gambar 5.1. Hasil Waktu Retensi antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)


Gambar 5.2. Hasil Detektor MS/MS antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)


Gambar 6.1. Residual Silanol Pada Kolom UHPLC (Crawford, 2016) .......... Error!


Gambar 6.2. Sistem Kerja ESI-Triple Quadrupole (Kang, 2015)Error! Bookmark

not defined.

Gambar 6.3. Produk Mass Curcumin pada ESI-MS/MS Mode Ion Positif. (A)

spektra kurkumin dalam plasma darah. (A’) spektra kurkumin oleh

SRM ESI-MS/MS (Wang, 2012) ..... Error! Bookmark not defined.

Gambar 6.4. Fragmentasi Kurkumin pada MS a. (Liu, 2016) b.( Albert, 2018)


xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Kromatogram Standar Kurkumin ....... Error! Bookmark not defined.

Lampiran 2. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Sediaan Serbuk

Mengandung Curcuma longa ......... Error! Bookmark not defined.

Lampiran 3. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Cair Serbuk Mengandung

Curcuma longa............................... Error! Bookmark not defined.

Lampiran 4. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Kapsul Serbuk Mengandung

Curcuma longa............................... Error! Bookmark not defined.

Lampiran 5. Kondisi Sistem UHPLC-MS/MS ......... Error! Bookmark not defined.

Lampiran 6. Tabel data Area Respon Kromatogram dan Waktu Retensi Sampel

Sediaan Herbal dan Standar KurkuminError! Bookmark not

defined.

Lampiran 7. Tabel Perhitungan Kadar Kurkumin dalam Sampel Sediaan Herbal


Lampiran 8. Tabel Perhitungan Akurasi, Presisi, LOD, dan LOQ Standar

Kurkumin ........................................ Error! Bookmark not defined.

xiv

DAFTAR SINGKATAN

UHPLC-MS/MS = Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

OHT = Obat Herbal Terstandar

LOD = Limit of Detection

LOQ = Limit of Quantification

ESI =Electrospray Ionization

SRM = Selected Reaction Monitoring

vi

ABSTRAK

Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS).Tugas Akhir, Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Bachtiar Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc., Apt.

Kunyit banyak dipilih sebagai agen antiinflamasi dan antikanker secara tradisional. Terdapat banyak produk herbal mengandung kunyit untuk mengatasi antiinflamasi atau meredakan nyeri. Senyawa yang paling berperan memberikan efek farmakologis yaitu kurkumin dalam kunyit tersebut. Perlu dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS karena memiliki hasil pemisahan senyawa dan deteksi senyawa yang sangat baik. Serta perlu dilakukan monitoring kualitas dengan penetapan kadar kurkumin dalam sediaan herbal tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas medote analisis kurkumin yang digunakan dan mengetahui kadar kurkumin dalam beberapa sediaan herbal guna memenuhi monitoring kualitas sediaan tersebut. Sampel dipilih dengan cara metode purposive sampling dengan beberapa kriteria tertentu. Dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS dengan fase gerak gradien A (0,1% asam format dalam aquabidest) dan B (0,1% asam format dalam acetonitrile) serta fase diam yaitu Kinetex EVO C18 100oA. Metode analisis dinyatakan valid dengan memenuhi parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas (r=0,9997), akurasi (% perolehan kembali = 98,63-101,76%), presisi (%RSD=0,38-5,7%), LOD (0,11µg/ml) dan LOQ (0,34µg/ml). Berikutnya dilakukan penetapan kadar kurkumin dalam 3 sampel sediaan herbal mengandung kunyit. Kadar yang didapatkan sampel serbuk (0,03%), sampel kapsul (4,78%), dan sampel cair (0,03%).

Kata kunci: Kunyit, Kurkumin, UHPLC-MS/MS, Validasi Metode, Sediaan Herbal

vii

ABSTRACT

Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Determination of Curcumin in Herbal

Medicine Containing Curcuma longa Using Ultra High Performance Liquid

Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). Final Assignment,

Pharmacy Program, Medical Faculty Brawijaya University. Advisers: (1) Bachtiar

Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc.,

Apt.

Turmeric (Curcuma longa) widely used as the main ingredient of some herbal medicines to relieve pain and inflammation. Curcumin is the main secondary metabolites of Curcuma longa that has also shown some therapeutic activities such as anti-inflammatory and anti-cancer agent. An efficient, sensitive and precise Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) was developed to determine curcumin content in several herbal medicine contains turmeric. The method was validated for linearity, selectivity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Thus, the method can be used to determine curcumin content in herbal medicine to control herbal medicine quality. Objective of this research is to validate the method of curcumin analysis and determine curcumin content in herbal medicine. Validation was done through curcumin analysis using UHPLC-MS/MS with the gradient mobile phase A (0.1% format acid in aquabidest) and B (0.1% format acid in acetinitrile), while the static phase was Kinitex EVO C18 100o A. The method was finally recognized as valid by fulfilling several validation parameters such selectivity showed 3,2 minute as Retention Time (RT) also 285 m/z and 177 m/z as quantifier and qualifier product mass of curcumin , linearity (r=0.9997), accuracy (% recovery = 98,63-101.76%), precision (%RSD=0,38-5,70%), LOD (0,11 µg/ml) and LOQ (0,34 µg/ml). Curcumin level in three samples was determined from the herbal medicines containing turmeric. It showed that each herbal medicines sample contain curcumin 0.03%, 4,78% and liquid 0.03% for powder, capsule and liquid dosage form respectively. This research showed that the proposed method may be useful as an accurate, effective and sensitive for quantitative determination of curcumin content.

.

Keywords: Turmeric, Curcumin, UHPLC-MS/MS, Method Validation, Dosage

Form

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam dan

dikenal sebagai negara yang mengandung unsur kebudayaan daerah terbanyak

di dunia. Budaya-budaya tersebut masih melekat hingga era modern ini. Salah

satu budaya yang masih dipertahankan yaitu tradisi pengobatan alami, atau

biasa dikenal dengan jamu. Budaya minum jamu ini tidak hanya menonjol pada

bidang kesehatan tapi juga bidang kebudayaan karena sifatnya yang turun

temurun dari generasi ke generasi berikutnya. Antusiasme masyarakat terhadap

jamu masih cukup besar. Berdasarkan Data Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas),

pada tahun 2013 menyebutkan bahwa 30,4% rumah tangga di Indonesia

memanfaatkan pelayanan kesehatan tradisional, dengan rincian 77,8%

menggunakan keterampilan kesehatan tradisional tanpa alat dan 49% rumah

tangga memanfaatkan ramuan (Kemenkes RI, 2013). Menurut Badan Pengawas

Obat dan Makanan (BPOM), obat herbal diklasifikasikan secara umum menjadi 3

bagian besar yaitu jamu yang merupakan ramuan bahan tumbuhan yang

digunakan secara turun-temurun, OHT atau Obat Herbal Terstandar merupakan

sediaan herbal yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah,

dan Fitofarmaka yang telah diujikan secara praklinik dan uji klinik serta bahan

baku dan produk jadinya telah distandarisasi (BPOM, 2005).

Indonesia merupakan negara agraria. Tanahnya yang subur menghasilkan

beragam tanaman yang tentunya memiliki banyak manfaat dalam kehidupan

2

sehari-hari. Hasil-hasil agraria tersebut banyak dimanfaatkan ke berbagai aspek

umum kehidupan seperti, sandang, pangan dan papan, termasuk aspek khusus

yaitu kesehatan. Terdapat sekitar 25% obat modern atau obat konvensional

berasal dari tumbuhan obat (WHO,2013). Berdasarkan Riset Tumbuhan Obat

dan Jamu (RISTOJA) oleh Kementrian Kesehatan pada tahun 2015

menjelaskan bahwa terdapat data informasi tumbuhan obat sebanyak 19.871,

16.218 diantaranya terdiri dari 1.559 spesies meliputi 156 famili. Salah satunya

adalah penggunaan kunyit (Curcuma longa) di bidang medis atau pengobatan

dan sebagai bahan pangan. Kunyit termasuk dalam salah satu ramuan terbanyak

yaitu sejumlah 462 informasi (Kemenkes RI, 2015).

Kunyit merupakan salah satu produk jamu yang banyak dikonsumsi oleh

masyarakat. Terdapat beberapa ramuan kunyit untuk berbagai penyakit. Pada

Etnis Jawa di Yogyakarta terdapat 50 ramuan mengandung kunyit yang

digunakan untuk terapi pasca persalinan. Pada Etnis Jawa daerah Jawa Tengah

terdapat 29 ramuan mengandung kunyit untuk mengatasi penyakit Jaundice atau

gangguan pada organ hati. Pada Etnis Simalungun daerah Sumatera terdapat 1

ramuan untuk pengobatan HIV/AIDS, dan 26 ramuan untuk pengobatan kanker

pada Etnis Suku Hutan Provinsi Riau (Kemenkes RI, 2015). Kunyit memiliki efek

farmakologis antara lain, sebagai antiinflamasi, sebagai agen hipotensi,

pengobatan pada dispepsia antikanker, antikoagulan, antiprotozoa,

antinematoda dan hepatoprotektor (Simanjuntak, 2012). Efektifitas kunyit sebagai

terapi beberapa penyakit sudah banyak dilakukan. Kunyit dosis 200 dan 600

mg/kg akan efektif digunakan sebagai antiinflamasi (Chuang, 2000). 1% dan

0,2% diet kunyit mampu memberikan inhibisi pada expresi gen Rasp21 dan

Fosp62 pada kanker kulit dan menurunkan level dari pailoma (EMA, 2009).

3

Penggunaan secara oral 100 mg/kg dapat mengatasi ulcer pada permukaan

lambung dengan membentuk lapisan protektif (Simanjuntak, 2012).

Penyembuhan sekresi empedu pada saluran empedu yang terhambat dapat

dilakukan dengan pemberian 25 mg/kg natrium

kurkuminat.Kemampuanantiprotozoapadakunyitmemilihiefekhambatyaitusebesar

65% dengandosispemberian 9µg/ml. Senyawa aktif yang terkandung dalam

kunyit adalah kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin, dimetoksi kurkumin,

desmetoksi kurkumin, trietil kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin (Rukmana,

2005). Senyawa kurkumin terpilih menjadi senyawa marker pada kunyit, karena

merupakan senyawa yang bersifat khas, mempunyai struktur kimia yag jelas,

stabil, tersedia, dapat diisolasi dan memiliki efek farmakologis (Patterson, 2006).

Seiring dengan meningkatnya konsumsi produk herbal terutama jamu

mengandung kunyit, maka monitoring kualitas sediaan tersebut juga menjadi

sangat penting demi menjaga keamanan produk, kualitas produk dan efikasi dari

produk yang terdapat di pasaran. Monitoring kualitas sangat diperlukan guna

menjamin produk dapat tepat indikasi dan memiliki efikasi yang maksimal ketika

dikonsumsi oleh pasien (Oka, 2017). Dosis atau takaran maksimal konsumsi

kunyit pada tubuh manusia berdasarkan WHO monograf menyatakan bahwa

serbuk kunyit maksimal 3 gram/harinya, sedangkan pada sediaan tinktur (1:10)

yaitu 3 ml per harinya (WHO Monographs, 1999).Untuk menghindarkan dan

memberikan tindakan preventif serta edukatif terhadap produksi dan konsumsi

jamu serta menghindarkan pasien dari resiko toksisitas, resiko kurangnya efek

obat atau efikasi yang dibawah nilai ambang, atau efek samping yang tidak

diinginkan akibat inkompatibilitas dari sediaan akibat kualitasnya tidak terjamin.

Berdasarkan pendapat yang telah dijelaskan maka perlu dilakukan validasi

4

metode analisis kurkumin sebagai salah satu dari tahap penjaminan mutu

sediaan kefarmasian baik herbal maupun sediaan oral dan non-oral lainnya.

Analisis suatu sediaan atau senyawa sangat diperlukan dalam proses

produksi, bergantung pada spesifikasi sediaan atau senyawa yang akan diuji.

Efektifitas dalam proses analisis sangatlah diperlukan,salah satu faktor utama

yang berperan dalam efektifitas dan efisien suatu proses analisis adalah metode

dan kromatogram yang digunakan. Banyak pilihan dalam melakukan analisis

suatu senyawa, seperti menggunakan GC-MS, NMR, KLT-Densitometri,

Spektrofotometri UV-Vis. Analisis kurkumin telah banyak dilakukan dengan

menggunakan beragam metode kromatografi, diantaranya adalah analisis

kurkumin menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

dengan optimasi isokratik pada ekstrak kunyit komersial (Wichitnithad, 2009),

validasi metode HPLC analisis kurkumin dalam sediaan sirup (Sumule, 2007)

dan beberapa penelitian penetapan kadar kurkumin pada beberapa bentuk

sediaan yang mengandung kurkumin menggunakan HPLC (Ida, 2010). Dari

beberapa metode analisis yang digunakan tersebut, yang paling efektif adalah

menggunakan HPLC karena memiliki pemisahan puncak yang paling spesifik,

serta memberikan informasi yang lengkap dibandingkan metode kromatogram

lainnya. Berdasarkan penjelasan tersebut, maka pada penelitian ini analisis

dilakukan menggunakan HPLC. Metode HPLC dipilih karena HPLC memiliki

sensitivitas dan selektivitas yang lebih baik terhadap suatu molekul kimia

dibandingkan dengan metode analisis kromatografi yang lainnya. HPLC mampu

memisahkan senyawa dengan sangat baik, teliti dan spesifik. Tidak hanya

berlaku untuk obat saja, HPLC sangat bermanfaat dan efektif untuk analisis

herbal sebgai bentuk identifikasi kandungan senyawa dalam herbal tersebut. Hal

5

ini dibuktikan dengan kemampuan daya pisah molekul yang baik dan mendeteksi

analit dalam jumlah yang kecil (Parwa, 1991). Efektifitas sebuah analisis

senyawa dalam sampel dapat meningkat dengan menggunakan Ultra High

Performance Liquid Chromatography (UHPLC). UHPLC memiliki diameter kolom

6

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui metode analisis kurkumin dalam kunyit dengan

metode UHPLC-MS/MS dapat memenuhi parameter validasi metode

yaitu selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, LOD dan LOQ.

2. Untuk mengetahui kadar kurkumin pada sediaan herbal mengandung

Curcuma longa di Kota Malang.

1.4 Manfaat

1.4.1 Manfaat Akademik

1. Membantu dan mendukung perkembangan ilmu pengetahuan dan

teknologi di bidang kesehatan khususnya di bidang farmasi dalam

penentuan dosis yang tepat dalam penggunaan jamu kurkumin.

2. Sebagai acuan dalam validasi metode penetapan kadar kurkumin

dalam sediaan jamu di Kota Malang

1.4.2 Manfaat Praktisi

Bagi tenaga kesehatan utamanya apoteker dapat menentukan

dosis yang tepat untuk pasien dalam mengkonsumsi sediaan jamu

kurkumin yang ada di Kota Malang, guna mencapai efektifitas terapi

dan menghindari toksisitas.

7

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Obat Tradisional

Berdasarkan Pasal 1 peraturan Kepala Badan POM No.

HK.00.05.4.1384 Tahun 2005 tentang Kriteria dan Tata Laksana

Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka,

maka obat tradisional tersebut diklasifikasikan menjadi :

1. Jamu berasal dari kata “jampi”, sebuah kata dalam bahasa

Jawa Krama. Kata jampi tersebut secara bahasa memiliki

makna ramuan ajaib. Sedangkan kata menjampi berarti

menyembuhkan dengan magis/mantera oleh dukun pada era

kuno (Tilaar et al, 2010). Jamu adalah obat tradisional

Indonesia yang dibuat dari tumbuhan, bahan hewan, bahan

mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan-

bahan tersebut, yang telah digunakan secara turun-temurun

untuk pengobatan berdasarkan pengalaman.

2. Obat Herbal Terstandar adalah obat tradisional yang disajikan

dari ekstrak atau penyarian bahan alam yang dapat berupa

tanaman obat, binatang maupun mineral yang telah dibukukan

keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji praklinik

dan bahan bakunya telah di standarisasi.

3. Fitofarmaka adalah sediaan obat bahan alam yang telah

dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji

praklinik dan uji klinik, bahan baku dan produk jadinya telah di

standardisasi.

8

A B C

1.1 Gambar 2.1. Logo-logo sediaan jamu (A), Obat Herbal Terstandart

(B) dan Fitofarmaka (C) (BPOM, 2015)

2.2. Kunyit

Kunyit adalah tanaman tropis yang banyak terdapat di benua Asia.

Mayoritas masyarakat menggunakan kunyit sebagai zat pewarna dan zat

pemberi aroma pada makanan. „Ayurvedic‟ menuliskan bahwa kunyit

berperan sebagai aromatika, stimulan, dan sebagai sumber warna merah

tua. Dan pada era yang baru ini menyebutkan bahwa kunyit berperan

besar dalam penyakit yang berhubungan dengan empedu maupun

hepatobilliary disorders, sinusitis, penyakit hepatik dan diabetes

(Simanjuntak, 2012). Kunyit dapat bertahan hidup sampai lebih dari 2

tahun dan termasuk dalam keluarga Zingiberaceae. Kunyit banyak

tumbuh di wilayah tropis seperti Indonesia, Cina dan India. Kunyit dapat

tumbuh subur di dataran rendah antara 90 meter sampai dengan 2000

meter di atas permukaan laut (Labban, 2014). Menurut Linnaeus,

klasifikasi kunyit adalah :

Kingdom : Plantae

Phylum : Magnoliophyta

Kelas : Liliopsida

Subkelas : Zingiberidae

Ordo : Zingiberales

9

Famili : Zingiberaceae

Genus : Curcuma

Spesies : Curcuma longa Linn.

Kandungan utama dalam rimpang kunyit yaitu kurkuminoid yang

terdiri dari kurkumin, demektosikurkumin dan bisdemetoksikurkumin.

Selain itu, kunyit juga mengandung minyak atsiri, senyawa yang

terkandung dalam minyak atsiri antara lain, Tumerone, Curlone, Curdione,

Turmeronol B, 1,8 cineole, α-zingiberene, β-pinene, β-bisabolene, p-

cynene, Curcumene (Jayaprakasha, 2005).

Kunyit memiliki banyak manfaat di bidang kesehatan, seperti

berperan sebagai anti-inflamasi dengan mekanisme menghambat LOX,

COX fosfolipase, leukotrien, pembentukan prostalglandin, collagenase

dan TNF (Labban, 2014). Peradangan pada hati dapat diberi alternatif

terapi yaitu 200 mg/kg atau 600 mg/kg kurkumin (Agruim, 2012).

Kombinasi antara 480 mg kurkumin dengan 20 mg quercetin dalam 1

kapsul, telah diuji pada 43 pasien transplantasi ginjal, 71% pasien pada

kelompok dosis rendah mengalami penurunan serum kreatinin. Peran

kurkumin besar dalam pengobatan ini yaitu sebagai agen antiinflamasi

dan antioksidan, dengan mekanisme induksi enzim hemeoksigenase dan

sitokin pro-inflmasi yang berbanding lurus dengan tingkat kerusakan pada

sel (Labban, 2014).

Kunyitjugadimanfaatkansebagaiterapialternatifkanker,

atausebagaiagen anti-tumor.Kunyitmenginhibisi 3

tahapdalamcarsinogenesis, yaitufaseinitiasi,

10

fasepromosidanfaseprogresi.Selamafaseinsiasidanfasepromosi,

kurkumindalamkunyitbekerjadenganmengontrol factor transkripsifase I

dan II, menurunkansitokin pro-inflamasi, menurunkan metabolism

asamarachidonatjalurlipoxygenasedanvicyclooxygenase.Efektifitasdarikur

kumin yang diberikansebesar 0,2% dan 1% telahdiujipadaDimetylbenz (α)

Antrasen (DMBA) dan12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetate(TPA)

tumor, ditemukanbahwapapilomapadagrup yang

diberikanterapikukurminmengalamipenurunanataukadarnyalebihrendahda

rikelompoklainnya, serta ditemukanjugaekspresidari gen p21danp62

jugamenurun (EMA, 2009).

Padastudikliniklainmenyebutkanbahwadosisuntuksetiapjeniskankeradalah

berbeda, 100 mg kurkumindiberikanuntukkankerprostatdengankombinasi

40 mg isolavonselama 6 bulan. Pengobatanuntukkankerususdiberikan

360 mg kurkumin 3 kali sehariselama 10-30 hari, untukpasien yang

belummengalamioperasipengangkatankanker. Dosis 8000

mg/haridiberikanuntukpasien yang menderitakanker pancreas,

dalamstudiinijugamenyebutkanbahwacurcuminamandikonsumsihingga

8000mg/harinya (Muthu, 2015). Kunyit juga dapat berperan sebagai

antioxidan dan hepatoprotektor, antidiabetes, anti kanker, dispepsia dan

antimikroba (Labban, 2014).

2.3. Kurkumin

Kurkumin merupakan senyawa aktif yang dominan dalam

Curcuma longa. Kurkumin merupakan salah satu turunan dari

kurkuminoid, turunannya yang lain yaitu demetoksikurkumin dan

bisdemetoksikurkumin.

11

A B C

1.2 Gambar 2.2. Struktur Kimia Kurkumin (a), Demetoksikurkumin (b),

dan Bisdemetoksikurkumin (c) (Sethi at al, 2009)

Kurkumin mempunyai rumus molekul C21H20O6. Kurkumin

termasuk dalam senyawa flavonoid yang tidak larut dalam air tetapi larut

dalam ethanol, dimethilsulfoxid dan aseton. Titik didih kurkumin yaitu

183oC dengan berat molekul 368,37 g/mmol (Sethi at al, 2009). Kurkumin

akan terdegradasi dalam kondisi pH diatas 6,5 dan paparan cahaya

matahari yang berlebih (Tonnesen dan Karlsen, 1985). Kurkumin akan

berwarna kuning hingga jingga pada kondisi asam dan pada kondisi basa

akan berwarna merah. Kurkumin pada kondisi basa dengan pH 8,5-10,0

pada waktu yang relatif lama dapat mengalami proses disosiasi, kurkumin

akan terdegradasi membentuk asam ferulat dan feruloilmetan. Apabila

kurkumin terkena cahaya maka akan juga terjadi reaksi degradasi

fitokimia. Gugus metilen tersebut akan aktif diantara 2 gugus keton pada

senyawa tersebut (Sethi at al, 2009).

2.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography merupakan salah satu

alat analisis yang berprinsip pada pemisahan dengan kecepatan dan

efisiensi yang tinggi sampel terhadap fase gerak dan fase diam,

12

dengan optimalisasi kondisi tertentu. Fase gerak dialirkan melalui

kolom dengan tekanan dari pompa, sehingga alirannya cepat,

kemudian sampel akan dideteksi dengan detektor (Hendyana, 2006).

Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak

dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

1.3 Gambar 2.3. Skema Instrumen HPLC (Ahuja dan Dong, 2005).

Alat ini didukung dengan sistem pompa tekanan tinggi dan

detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga dapat memunculkan

peak yang sensitif dan beragam senyawa yang spesifik dalam suatu

molekul. Metode HPLC ini telah luas diterima untuk analisis dan

pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel, karena merupakan

metode yang tidak destruktif dan selektif (Gandjar dan Rohman, 2007).

Titik berat dari analisis menggunakan kromatografi adalah pada senyawa

yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak

dapat dianalisis menggunakan kromatografi gas. Kelebihan lainnya dalam

penggunaan HPLC yaitu, kolom dapat digunakan kembali, memiliki

resolusi yang baik, dapat menghindari adanya dekomposisi, mudah

melakukan sample recovery, serta dapat menggunakan berbagai macam

detektor (Effendy, 2004).

13

Banyak tipe dari HPLC berdasarkan prinsip kerjanya, seperti

kromatografi partisi, kromatografi adsorpsi, kromatografi pertukaran ion

dan kromatografi eklusi. Kromatografi partisi terbagi menjadi 2 jenis, yaitu

HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. HPLC fase normal

menggunakan fase diam yang lebih polar dibandingkan dengan fase

geraknya, sedangkan HPLC fase terbalik menggunakan fase diam yang

lebih non-polar dibandingkan dengan fase geraknya (Synder, 2010).

Fase gerak yang digunakan dalam HPLC biasanya terdiri dari

satu pelarut atau campuran beberapa pelarut yang berperan dalam daya

elusi dan resolusi, sedangkan daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh

polaritas pelarut tersebut, polaris fase diam dan sifat sampel yang diuji.

Terdapat 2 tipe elusi pada HPLC yaitu, cara isokratik dan cara gradien.

Cara isokratik berprinsip pada ketetapan fase gerak selama proses elusi

berlangung, sedangkan pada cara gradien berprinsip pada gradien

komposisi fase gerak yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kebanyakan fase diam pada HPLC yang dipilih berupa silika yang

dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer

stiren dan divinil benzen. Sifat pada permukaan silika bersifat polar dan

sedikit asam akibat adanya residu dari gugus silanol (Si-OH). Salah satu

jenis silika yang dimodifikasi yaitu oktadesil silika (ODS atau C18). ODS

banyak digunakan karena dapat memisahkan senyawa yang memiliki

tingkat kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Gandjar dan Rohman,

2007).

HPLC memiliki bagian-bagian terpentingnya, yaitu reservoir

pelarut, pompa, injektor, kolom dan detektor. Reservoir pelarut terbuat

14

dari kaca atau stainless steel yang mampu memuat 200-1000 mL pelarut.

Reservoir dilengkapi dengan degasser yang berfungsi untuk

menghilangkan gas terlarut pada fase gerak yang digunakan, kebanyakan

gas tersebut adalah oksigen dan nitrogen yang berpotensi kuat untuk

mengganggu proses analisis akibat pembentukan gelembung pada kolom

dan sistem detektor. Reservoir juga dilengkapi dengan penyaring milipore

yang mampu menyaring partikel halus yang terdapat pada pelarut.

Penyaring ini berfungsi untuk menghindari kerusakan berupa sumbatan

pada kolom, injektor, dan pompa (Susanti, 2017). Injektor atau alat

penyuntik sampel pada HPLC terbuat dari tembaga tahan karat dan katup

teflon. Sampel akan dimasukkan melewati keluk sampel, katup akan

diputar sehingga fase gerak akan melewati keluk sampel dan membawa

sampel ke dalam kolom (Gandjar dan Rohman, 2007)

1.4 Gambar 2.4.. Skema Injektor (a) posisi pada saat memuat sampel

dan (b) posisi saat menyuntikkan sampel (Ahuja dan Dong, 2005)

Pompa pada HPLC terbuat dari gelas, baja tahan karat, teflon,

dan batu nilam. Sifat pompa ini haruslah inert atau tidak bereaksi

terhadap samel maupun fase gerak yang digunakan. Pompa yang

15

digunakan sebaiknya memiliki kemampuan memberikan tekanan hingga

5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak degnan kecepatan 3

mL/menit. Fungsi adanya pompa adalah menjamin penghantaran fase

gerak dapat berlangsung secara tepat, konstan dan terbebas dari adanya

gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007).

1.5 Gambar 2.5 . Skema Pompa Piston Tunggal Pada HPLC (Ahuja dan

Dong, 2005)

Kolom merupakan tempat terjadinya senyawa tersebut terpisah

dari ikatannya akibat interaksi penyerapan molekul antara fase gerak dan

fase diam dengan prinsip kepolaran molekul. Kolom merupakan salah

satu kunci utama dalam proses kromatografi yang baik. Silika merupakan

bahan pengisi kolom yang terdiri dari ikatan siloksan (Si-O-Si). Silanol

pada permukaan dalam kolom memiliki sifat polar. Namun pada sistem

HPLC fase terbalik, fase diam akan bersifat lebih non polar dikarenakan

adanya penambahan hidrokarbon pada permukaan silika (Moffat, 2011).

Kolom yang digunakan pada sistem HPLC pada umumnya memiliki

panjang 5-25 cm dengan diameter bagian dalam sebesar 4,6 mm, ukuran

partikel 5µm dan mengandung 40.000 sampai 70.000 plat/meter (Skoog,

2007).

16

Oven pada sistem HPLC berfungsi untuk menentukan suhu yang

digunakan atau kontrol suhu pada sistem HPLC. Terutama pada sistem

HPLC fase terbalik, suhu akan memengaruhi waktu retensi dan

selektivitas. Kisaran suhu yang digunakan untuk analisis adalah 30o

sampai 50o C (Ahuja dan Dong, 2005). Detektor diperlukan untuk

mendeteksi komponen yang terdapat dalam kolom serta untuk mengukur

jumlah konsentrasi komponen tesebut. Detektor yang baik adalah

detektor yang memenuhi persyaratan sensitivitas yang tinggi dengan

rentang sensitivitas 10-8 -10-15 gram solut per detik, kestabilan dan

reprodusibilitas yang sangat baik, respon yang linear terhadap

konsentrasi solut, dapat bekerja dari temperatur kamar sampai 400oC,

tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut

pengembang, mudah didapat, mudah dipakai operator, selektif terhadap

macam-macam linarut dalam pelarut pengembang dan tidak merusak

sampel (Mulja dan Suharman, 1995).

2.5. Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

(UHPLC-MS/MS)

Prinsip kerja HPLC dengan UHPLC adalah sama, pemisahan

larutan berdasarkan daya ikatnya antara fase diam dan fase gerak dalam

sebuah kolom. Kelebihan UHPLC dibandingkan dengan HPLC adalah

memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, efisiensi dan resolusi yang lebih

baik dibandingkan dengan HPLC. UHPLC pada dasarnya menggunakan

ukuran partikel sebesar

17

meningkat. Ketika dikombinasikan dengan kolom yang pendek atau aliran

fase gerak yang cepat. Resolusi yang dihasilkan oleh kolom juga

mengingkat antar puncak. Tingkat resolusi kolom dengan ukuran partikel

sebesar 1,7 µm membaik sebesar 70% dibandingkan dengan ukuran

partikel 5 µm (Seelam, 2013).

1.6 Gambar 2.6 . efektifitas kolom dengan perbandingan besar ukuran partikel

pada masing-masing dekakde plot van Deemter (Seelam, 2013).

Hasil kromatogram pada UHPLC akan lebih baik dibandingkan HPLC

yang memiliki nilai tekanan sebesar 2500-5000 PSI. UHPLC dapat

konsisten menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik dengan

tekanan yang diberikan yaitu 8.000-15.000 PSI (Seelam, 2013).

Deteksi menggunakan MS akan memiliki efektifitas analisis yang

lebih tinggi dibandingkan deteksi menggunakan UV(Ultraviolet)-visible.

Karena detektsi analit menggunakan instrumen MS akan memberikan

kepastian selektivitas terhadap analit yang ingin di analisis atau diteliti.

Pada prinsipnya MS dapat menyusun molekul gas(ion) berdasarkan

massanya. MS bekerja dengan mengionisasi atom-atom atau molekul-

18

molekul kemudian menyeleksi dan mendeteksi ion berdasarkan

perbandingan massa terhadap muatannya. MS dan sistem UPLC

dihubungkan dengan alat pengionisasi dengan teknik ionisasi

berdasarkan tekanan atmosfer (API, Atmospheric Pressure Ionization).

Salah satu teknik API yang sering digunakan adalah ESI (Electrospray

Ionization) untuk campuran yang bersifat ion atau sangat polar, tidak

stabil terhadap suh tinggi atau yang memiliki berat molekul lebih tinggi

dari 100 (Watson, 2007).

1.7 Gambar 2.7. Sistem Kerja MS/MS pada UHPLC-MS/MS (Kang, 2015).

MS/MS memiliki beberapa tipe instrumen berdasarkan

fungsionalnya dalam analisis tertarget dan analisis tidak tertarget. Analisis

tertarget menggunakan beberapa instrumen seperti QqQ atau biasa

disebut dengan Triple Quadrupoleyang merupakan jenis analisis massa

yang menggunakan osilasi medan listrik yang digunakan digunakan untuk

menyeleksi ion yang stabil atau tidak stabil yang melewati frekuensi radio.

Quadrupole yang pertama bertindak sebagai mass filter, yang bertugas

19

untuk mengirimkan ion masuk ke dalam qudrupole kedua. Tugas dari

quadrupole yang kedua yaitu terjadi tumbukan ion yang mengalami

pemecahan. Sedangkan quadrupole ketiga memiliki tugas sebagai mass

filter yang mengirimkan ion hasil pemecahan ke detektor. Analisis

tertarget bermakna bahwa senyawa kimia lain tidak akan dimunculkan

pada kromatogram karena telah ditarget suatu senyawa yang akan di

analisis. Metode yang biasanya digunakan adalah SRM (Selected

Reaction Monitoring). Sedangkan analisis yang tidak tertarget, akan

banyak keluar senyawa kimia yang lain pada kromatogram, sehingga

tidak spesifik terhadap senyawa yang sedang akan dianalisis. Insrumen

MS yang digunakan pada analisis tidak tertarget yaitu salah satunya TOF

(Time-of-flight) dengan prinsip penembakan laser dengan panjang

gelombang tertentu kepada matriks yang akan menyerap cahaya

tersebut. Tegangan pulsa laser ditembakkan ke pelar target untuk

mempercepat sampel terionisasi menuju analyzer massa time of flight

(Kang, 2015).

2.6. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah proses pembuktian yang

meyakinkan bahwa performa karakteristik suatu metode telah memenuhi

persyaratan untuk aplikasi analisis (United States Pharmacopeial

Convention, 2007). Menurut Harmita (2004), bahwa validasi metode

adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu

berdasarkan percobaan labolatorium untuk membuktikan bahwa metode

tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi metode

analisis ini berfokus pada beberapa parameter tertentu, seperti ketepatan

20

(akurasi), ketelitian (presisi), selektivitas, limit deteksi, limit kuantitasi,

lineartitas dan rentang (United States Pharmacopeial Convention, 2007).

Tujuan dari dilaksanakannya validasi metode ini adalah menjamin

bahwa metode analisis yang dikembangkan dapat memberikan hasil

pengukuran yang cermat, tepat dan sesuai dengan yang diharapkan

secara konsisten. Untuk menghindari penurunan kualitas produk, dalam

upaya menjaga kualitas, keamanan dan efikasi dari produk yang akan

dikonsumsi oleh masyarakat.

Table 2.1. Kategori Metode Pengujian (United States Pharmacopeial Convention,

2007).

Kategori Keterangan

I

Metode untuk penetapan kadar komponen utama bahan baku atau

bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk jadi sediaan

farmasi

II Metode analisis untuk penetapan ketidakmurnian bahan baku atau

hasil degradasi dalam produk jadi sediaan farmasi

III Metode analisis untuk penetapan karakteristik performa (seperti

disolusi, pelepasan obat)

IV Uji identifikasi

21

Table 2.2. Parameter Analisis yang Dibutuhkan Dalam Validasi Metode Analisis

(United States Pharmacopeial Convention, 2007).

Karateristik

Analisis Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV

Akurasi Y Y - - T

Presisi Y Y T Y T

Batas deteksi Y Y Y - Y

Selektivitas T T Y - T

Batas kuantitasi T Y T - T

Linieritas Y Y T - T

Rentang Y Y - - T

a. Selektivitas

Selektivitas merupakan salah satu kemampuan untuk mengukur

analit secara spesifik, cermat dan seksama dengan adanya komponen

yang mungkin ada dalam sampel. Selektivitas dinyatakan dalam derajat

bias dari hasil yang diperoleh dengan membandingkan dengan

impuritas, produk degradasi atau senyawa kimia yang mirip. Selektivitas

ditentukan dengan menginjeksikan sampel pada sistem kromatografi,

puncak yang lain tidak tercampur dengan puncak yang lain, dinyatakan

dalam perhitungan resolusi (Yuwono dan Indrayanto, 2005).

Nilai resolusi (Rs) yang diterima yaitu >1,5 (baseline resolution),

artinya puncak sudah terpisah dan senyawa tersebut telah murni

terdeteksi tanpa adanya kontaminasi dengan bahan lain (Pescok, 1976)

22

b. Linieritas dan rentang

Linieritas adalah kemampuan metode analisis untuk menunjukkan

hasil uji yang secara langsung dengan grafik atau secara perhitungan

matematis proporsional atau sebanding dengan kenaikan konsentrasi

analit dalam sampel pada beberapa sampel atau pada rentang tertentu.

Minimal jumlah konsentrasi atau sampel yang dibutuhkan adalah 4

sampel, untuk menghasilkan nilai resolusi. Linieritas digambarkan dalam

bentuk persamaan regresi linear yaitu y=bx+a. Hasil slope (b), intersep

(a) dan resolusi (r) menggambarkan informasi linieritas. Intersep

menunjukkan tingkat kepekaan analisis instrumen yang digunakan

(Harmita, 2004). Nilai koefisien yang diterima yaitu sebesar 0,999, jika

nilai koefisien kurang dari 0,999 maka perlu dilakukan perhitungan

parameter lain yaitu Vxo ≤5 (Yuwono dan Indrayanto, 2005)

Rentang merupakan jarak antara kadar terendah dengan kadar

tertinggi analit yang sudah ditujukkan dapat diterapkan dengan

ketepatan, ketelitian dan linieritas yang dapat diterima sesuai ketentuan-

ketentuan. Rentang dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil

yang diperoleh dengan metode analisis (Harmita, 2004).

c. Ketepatan (akurasi)

Ketepatan diartikan dengan kedekatan antara hasil analisis

dengan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan dalam

23

persen perolehan kembali (% recovery). Banyak faktor-faktor yang

mempengaruhi tingkat ketepatan, seperti kalibrasi alat, peraksi dan

pelarut yang tidak menimbulkan residual atau kontaminan, kontrol suhu,

dan pelaksanaan praktikan yang handal (Harmita, 2004). Secara

Internasional, terdapat 3 cara yang digunakan untuk mengevaluasi

ketepatan metode analisis kimia, yaitu dengan bahan rujukan baku

(SRM/Standart Reference Material), menggunakan baku sebagai

pembanding (standart method) dan recovery dengan menempatkan

analit plasebo (Spiked plasebo recovery) (Synder, 1997).

Tabel 2.3. Kriteria Rentang Recovery yang Dapat Diterima (AOAC, 2002)

Konsentrasi analit (%) Akurasi (recovery, %)

100 98-101

10 95-102

1 92-105

0,1 90-108

0,01 85-110

10 µg/g (ppm) 80-115

1 µg/g 75-120

10 µg/kg (ppb) 70-120

d. Kecermatan (presisi)

Ketelitian menunjukkan ukuran kesesuaian antara hasil uji

individual diukur melalui penyebaran hasil individual kemudian di rata-

24

rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel yang diambil

dari campuran yang homogen (Synder, 1997). Ketelitian dinyatakan

sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (Harmita, 2004).

Suatu metode tersebut akan memenuhui syarat apabila nilai

koefisian variasinya (KV) yaitu

25

BAB 3

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1. Kerangka Konsep

Gambar 3.1. Kerangka Konsep

Prevalensi penggunaan obat tradisional mencapai 30,4%

masyarakat Indonesia (Kemenkes RI, 2013)

Ramuan mengandung kunyit mencapai 86

ramuan di berbagai etnis (Kemenkes RI, 2015)

monitoring mutu sediaan obat tradisional

Analisis menggunakan UHPLC-MS/MS

Validasi metode

analisis

Linieritas Selektivitas Akurasi Presisi LOD &

LOQ

Penetapan kadar kurkumin pada sediaan

obat tradisional di Kota Malang

Kurkumin(senyawa marker)

Efek Farmakologi yang tinggi

26

Prevalensi dari penggunaan obat tradisional meningkat pada

dekade ini, terdapat banyak ramuan obat tradisional di berbagai etnis di

Indonesia. Salah satu pemegang jumlah ramuan terbanyak yaitu tanaman

kunyit. Pada penelitian ini, dilakukan validasi metode analisa kurkumin

yang terkandung dalam kunyit, sehingga metode analisa kurkumin pada

kunyit dapat valid untuk dilakukan. Parameter validasi yang

dipertimbangkan adalah selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, LOD dan

LOQ. Kemudian dilakukan penetapan kadar pada sediaan herbal

mengandung kunyit di Kota Malang. Hal ini bertujuan untuk menetapkan

kadar kurkumin pada sediaan tersebut dan menjamin efikasi, keamanan

dan kualitas dari sediaan herbat tersebut ketika dikonsumsi oleh pasien.

Validasi metode ini dilakukan menggunakan HPLC yang telah dioptimasi

kondisinya, fase gerak dan fase diamnya.

27

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1. Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan mengikuti jenis penelitian observasional,

dengan rancangan penelitian deskriptif, karena pada penelitian ini tidak

dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya mendeskripsikan

keadaan yang ada.

4.2. Populasi dan sampel

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah produk herbal

yang mengandung kunyit (Curcuma longa). Sampel didapatkan atau

diperoleh dari kios-kios jamu yang ada di Kota Malang. Sampel diambil

secara purposive sampling, dapat berupa jamu, OHT atau fitofarmaka.

Sampel yang diambil yaitu sejumlah 3 produk, masing-masing dari merk

atau produk yang berbeda. Kriteria pemilihan sampel yaitu sebagai

berikut :

- Mengandung tanaman Curcuma longa

- Sampel dapat berupa jamu, OHT atau fitofarmaka

- Sampel dapat berupa sediaan serbuk, kapsul atau tablet dan

sediaan cair

4.3. Lokasi dan Waktu Penelitian

4.3.1. Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Labolatorium Bahan Alam,

Program Studi Farmasi Universitas Brawijaya dan di Labolatorium

28

Analisis Instrumen, Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri

Malang.

4.3.2. Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli-Oktober 2018

4.4. Bahan dan Alat Penelitian

4.4.1. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku

standar kurkumin TCI (Tokyo Chemical Industry), sampel produk

herbal yang diambil secara acak sejumlah 3 sampel di Kota

Malang, metanol pro HPLC, asam format 0,1% pro HPLC dalam

aquabidest pro HPLC, asam format 0,1% pro HPLC dalam

asetonitril 0,1% pro HPLC.

4.4.2. Alat / Instrumen Penelitian

Alat yang digunakan adalah UHPLC merk ACCELLA tipe

1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser vakum,

pompa quartener, autosampler termostatik, MS/MS Triple Q

(quadrupole) spektrometer massa TSQ QUANTUM ACCESS MAX

dari Thermo Finnigan, Personal Computer (PC) dengan perangkat

lunak x-calibur 2.1 dan software TSQ Tune mode ionisasi positif,

kolom Kinetex EVO c18 100oA (50mmx2,1 mm x 1,7 µm.

disposable filter dengan ukuran pori 0,2 mikrometer, neraca

analitik Shimadzu ® AUW 220, pipet volume, labu ukur, gelas

ukur, gelas kimia, mikropipiet, neraca Metler AE® 200),

mikropipet sentrifuge Orcgon® LC-04S, sonikator DAWE®.

29

4.5. Prosedur Penelitian

4.5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS

Fase gerak yang digunakan yaitu fase gerak A dan fase

gerak B. Fase gerak A terdiri dari 0,1% asam format dalam

aquabidest dan Fase gerak B terdiri dari 0,1% asam format

dalam Acetonitrile. Gradien kecepatan fase gerak yang

dipakai adalah 300 µl/menit dengan pengaturan fase gerak

sebagai berikut :

Tabel 4.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak

No. Time A% B% µl/min 0 0.00 75.0 25.0 300.0 1 0.50 75.0 25.0 300.0 2 3.00 25.0 75.0 300.0 3 4.00 25.0 75.0 300.0 4 4.50 75.0 25.0 300.0 5 6.00 75.0 25.0 300.0

Kromatogram yang digunakan yaitu UHPLC merk

ACCELLA tipe 1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri

dari degasser vakum, pompa quartener, autosampler

termostatik dikendalikan Personal computer melalui program

x-calibur 2.1. Kolom yang digunakan dengan spesifikasi

Kinetex EVO C18 100OA (50mm x 2.1mm x 1.7µm). Kolom

dikontrol pada suhu 30oC dan kompartemen sampel ditetapkan

pada suhu 16oC.

Sebagai pendukung data secara kuantifikasi dan kualifikasi,

digunakan MS/MS Triple Q (quadrupole) spektrometer massa

30

TSQ QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan

dengan sumber ionisasi ESI (Electrospray Ionization)

dikendalikan oleh software TSQ Tune yang dioperasikan

dengan ionisasi mode positive. Penentuan senyawa yang

ditarget dengan metode SRM (Selected Reaction

Monitoring)diatur pada Tabel 1.

Tabel 1. Optimasi parameter massa untuk Curcumin

Komponen Parent mass (m/z) Product mass (m/z)

Qualifier Quantifier

Curcumin 369 177 285

Kondisiionisasi ESIadalah sebagai berikut:

Teganganspray 3kV

Suhupenguapan275◦C

Suhukapiler, 300◦C

Nitrogensebagaisheath gas pressure 40 psi

Aux gas pressure10 psi dengan gas argon.

4.5.2. Pembuatan larutan baku kurkumin

Ditimbang baku kurkumin sebanyak 1,6; 3,3; 7,5; 15; 30 mg

Dilarutkan dengan metanol dalam labu takar 10 ml hingga

tanda sehingga diperoleh konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3

mg/ml sebagai larutan baku kurkumin

Semua larutan baku tersebut disonikasi selama 10 menit

Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 10

menit

31

Supernatan dipipet, kemudian larutan diencerkan kembali

dengan metanol pro HPLC

Larutan kemudian disaring dengan disposable filter berukuran

0,2 µm

Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan volume 2µl,

dengan replikasi pada masing-masing injeksi yaitu 3 kali

4.5.3. Preparasi Sampel

Terdapat 3 sampel yang digunakan yaitu sampel sediaan cair,

sediaan kapsul dan sediaan serbuk.

4.5.3.1. Sediaan Cair

Ditimbang sampel sediaan cair sebanyak 1,0882 g

Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu

takar 10 ml hingga tanda

Disonikasi selama 10 menit

Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm

selama 10 menit

Supernatan dipipet sebanyak 100 µl kemudian

ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan

tersebut dipipet sebanyak 200 µl kemudian

ditambahkan dengan 1000 µl metanol sehingga

diperoleh faktor pengenceran sebanyak 660 ml

Larutan kemudian disaring dengan disposable filter

berukuran 0,2 µm

32

Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan

volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing

injeksi yaitu 5 kali

4.5.3.2. Sediaan Serbuk

Ditimbang sampel sediaan serbuk sebanyak 0,1203 g





selama 10 menit


ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Sehingga

diperoleh faktor pengenceran sebanyak 60 ml


berukuran 0,2 µm




4.5.3.3. Sediaan Kapsul

Diambil sejumlah 20 kapsul, serbuk kapsul

dikeluarkan dari cangkang kapsul

Ditimbang serbuk dari 20 kapsul sehingga diperoleh

9,84 g

Ditimbang sampel serbuk kapsul sebanyak 0,1095 g

33





selama 10 menit



tersebut dipipet sebanyak 100 µl kemudian


tersebut dipipet kembali sebanyak 100 µl kemudian

ditambahkan dengan 1000 µl metanol Sehingga

diperoleh faktor pengenceran sebanyak 13.310 ml


berukuran 0,2 µm




4.5.4. Validasi metode analisis

4.5.4.1. Uji Selektivitas

Sebanyak 2 µl larutan sampel cair, sampel kapsul dan

sampel sediaan serbuk serta larutan baku diinjeksikan

ke UHPLC

Dilakukan pengamatan terhadap waktu retensi,

resolusi, dan match factor antara larutan baku dan

masing-masing larutan sampel

34

4.5.4.2. Uji Linieritas

Sebanyak 2 µl larutan baku kurkumin dengan

konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3 mg/ml diinjeksikan

pada sistem HPLC

Dilakukan 3 kali injeksi pada setiap larutan baku

kurkumin

Diamati luas area pada masing-masing konsentrasi

dan replikasi.

Persamaan kurva baku dari setiap replikasi ditetapkan

dari hasil analisis regresi linear antara konsentrasi

terhadap luas area yang diperoleh.

Kemudian dipilih kurva terbaik dengan nilai koefisien

korelasi (r) >0,999.

4.5.4.3. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin

Sebanyak 2 µl larutan baku kurkumin dengan

konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3 mg/ml diinjeksikan

pada sistem HPLC

Dilakukan 3 kali injeksi pada setiap larutan baku

kurkumin

Diamati luas area pada masing-masing konsentrasi

dan replikasi.

Luas area yang didapatkan, dimasukkan kembali ke

dalam persamaan linear yang telah dipilih pada uji

linieritas

Hitung perolehan kembali konsentrasi dan %RSD

35

4.5.4.4. Penentuan Limit of Detection (LOD) dan Limit of

Quantification (LOQ)

Sebanyak 2 µl larutan baku konsentrasi 0,16; 0,33;

0,75; 1,5; 3 mg/ml ke sistem HPLC

Dilakukan pengamatan terhadap luas area yang

muncul pada detektor

Dihitung nilai LOD dan LOQ

4.5.5. Analisis data

4.5.5.1. Selektivitas

Selstivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs)

(Harmita, 2004). Rumus perhitungan resolusi :

𝑟𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑅𝑠 = (𝑡𝑅1 − 𝑡𝑅2)

12 (𝑊1 + 𝑊2)

Keterangan : Rs = resolusi

tR1 = waktu retensi puncak analit

pertama

tR2 = waktu retensi puncak

analit kedua

W1 = lebar dasar puncak

pertama

W2 = lebar dasar puncak

kedua

36

4.5.5.2. Linieritas

Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r) yang

didapatkan dari persamaan regresi y=bx+a. (b)

merupakan nilai slope dari persamaan dan (a)

merupakan nilai intersep dari persamaan. Persamaan

regersi didapatkan dari hasil plot konsentrasi larutan

baku kurkumin terhadap luas area (AUC) pada

kromatogram.

4.5.5.3. Akurasi

Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali

(% recovery). Rumus menghitung % recovery:

%𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎 𝑥 100%

4.5.5.4. Presisi

Presisi dihitung sebagai simpangan deviasi relatif

(RSD) atau koefisien variasi (KV). Rumus perhitungan

KV:

𝐾𝑉 = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)

𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥) 𝑥 100%

4.5.5.5. LOD dan LOQ

Penentuan LOD dan LOQ dapat dilakukan melalui

penghitungan rumus sebagai berikut:

𝐿𝑂𝐷 =3.

𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑦 𝑆𝑦

𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥)

𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒

𝐿𝑂𝑄 =10.

𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑦 𝑆𝑦

𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥)


37

4.5.5.6. Perhitungan Kadar Sampel

Kadar sampel dapat diketahui dengan memasukkan

nilai luas area ke dalam rumus persamaan linier

y=bx+a. Rumus perhitungan kadar sampel yaitu:

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 % =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 µg/ml 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 (𝑚𝑙)

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑔 𝑥 1000000𝑥100%

38

BAB 5

HASIL DAN ANALISA DATA

5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS

Validasi metode analisa dilakukan dengan kondisi fase gerak yang

digunakan yaitu fase gerak A dan fase gerak B. Fase gerak A terdiri dari

0,1% asam format dalam aquabidest dan Fase gerak B teridiri dari 0,1%

asam format dalam Acetonitrile. Gradien kecepatan fase gerak yang

dipakai adalah 300 µl/menit dengan pengaturan fase gerak sebagai

berikut :

Tabel 5.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak

Waktu

(menit) A% B% µl/menit

0 75 25 300

0,5 75 25 300

3 25 75 300

4 25 75 300

4,5 75 25 300

6 75 25 300

Kromatogram yang digunakan yaitu UHPLC merk ACCELLA tipe

1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser vakum, pompa

quartener, autosampler termostatik dikendalikan Personal Computer

melalui program X-Calibur 2.1. Kolom yang digunakan dengan spesifikasi

Kinetex EVO C18 100OA (50mm x 2.1mm x 1.7µm). Kolom dikontrol pada

suhu 30oC dan kompartemen sampel ditetapkan pada suhu 16oC.

39

Sebagai pendukung data secara kuantifikasi dan kualifikasi,

digunakan MS/MS Triple Q (quadrupole) spektrometer massa TSQ

QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan® dengan sumber

ionisasi ESI (Electrospray Ionization) dikendalikan oleh software TSQ

Tune yang dioperasikan dengan ionisasi mode positive. Penentuan

senyawa yang ditarget dengan metode SRM (Selected Reaction

Monitoring) diatur pada Tabel 1.

Tabel 5.2. Optimasi Parameter Massa untuk Curcumin

Komponen Parent mass (m/z) Product mass (m/z)

Qualifier Quantifier

Curcumin 369 177 285

Kondisi ionisasi ESIadalah sebagai berikut:

Teganganspray 3kV

Suhupenguapan275◦C

Suhukapiler, 300◦CN

Nitrogensebagaisheath gas pressure 40 psi

Aux gas pressure10 psi dengan gas argon.

5.2. Validasi Metode Analisa

5.2.1. Selektivitas

Selektivitas dinyatakan dengan waktu retensi dan match factor

antara baku kurkumin dengan sampel sediaan herbal yang

mengandung kurkumin. Uji selektivitas bertujuan untuk menganalisis

dan memastikan adanya senyawa target pada sampel dibandingkan

dengan standar.

40

Tabel 5.3. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Waktu Retensi

Jenis Sediaan

Waktu Retensi Rata-rata (menit)

Sediaan serbuk

3,19

Sediaan Kapsul

3,32

Sediaan Cair

3,22

Baku Kurkumin

3,20

Gambar 5.1. Hasil Waktu Retensi antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)

Waktu retensi pada tabel diatas menunjukkan bahwa sampel

mengandung kurkumin ditunjukkan dengan waktu retensi yang sama

yaitu sekitar 3,2-3,3 menit. Dapat diamati pada gambar 5.1 bahwa

(a)

(b)

41

waktu retensi antara standar dan sampel serbuk menunjukkan TR

yang sama yaitu 3,2 dan 3,22 menit. Dari data tabel dan gambar

tersebut bermakna bahwa sampel mengandung kurkumin ditunjukkan

dengan waktu retensi yang sama. Sehingga selektivitas kurkumin

dapat dinyatakan memenuhi syarat berdasarkan kesamaan waktu

retensi.

Tabel 5.4. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Detektor MS/MS

Gambar 5.2. Hasil Detektor MS/MS antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)

Jenis Sediaan

Product mass (m/z) Sampel

Product mass (m/z) Baku %

Qualifier Quantifier Qualifier Quantifier

Sediaan serbuk

177 285 177 285 100

Sediaan Kapsul

177 285 177 285 100

Sediaan Cair

177 285 177 285 100

(b) (a)

42

Detektor MS akan mendeteksi setiap bagian yang terpecah

menjadi bentuk ion dari senyawa kurkumin. Dari tabel diatas dapat

diamati bahwa sampel sediaan herbal mengandung kurkumin

ditunjukkan dengan berat molekul pecahan senyawa kurkumin yang

sama dengan standar yaitu 285 m/z sebagai berat molekul kuantifier

dan 177 m/z sebagai kualifier, sehingga dapat dinyatakan selektivitas

memenuhi syarat berdasarkan waktu retensi yang sama dan pecahan

ion tertarget yang muncul pada detektor.

5.2.2. Linieritas

Linieritas bertujuan untuk mengetahui korelasi antara

perubahan konsentrasi terhadapat luas area yang muncul pada

sistem UHPLC. Linieritas yang baik ditunjukkan dengan nilai koefisien

korelasi (r2) yaitu lebih dari 0,999 (AOAC, 2002)

Linieritas diperoleh dengan menginjeksi 5 konsentrasi larutan

baku yang berbeda yaitu 0,16; 0,33; 0,75; 1,5 dan 3 mg/mlkemudian

didapatkan persamaan linear yaitu y=59.563,83x+638,72 dengan nilai

koefisien korelasi yaitu 0,9997, yang bermakna perubahan luas area

yang muncul berbanding lurus terhadap perubahan konsentrasi

larutan baku. Nilai Vxo atau relatif standar deviasi yaitu

2,93%dinyatakan memenuhi persyaratan yaitu dibawah 5% (Yuwono

& Indrayanto, 2005). Sehingga dapat dinyatakan uji linieritas

memenuhi persyaratan.

𝑆𝑥𝑜 = 𝑆𝑦

𝑏 𝑉𝑥𝑜 =

𝑆𝑥𝑜

𝑥 𝑥 100%

43

𝑆𝑥𝑜 = 2.005,25

59.563,83= 0,03 𝑉𝑥𝑜 =

0,03

1,15𝑥100% = 2,93%

Gambar 5.3. Grafik Linieritas Larutan Standar Kurkumin dengan Konsentrasi

0,16; 0,33; 0,75; 1,5 dan 3 mg/ml

5.2.3. Akurasi dan Presisi

Akurasi dapat didefinisikan sebagai kedekatan nilai antara nilai

hasil uji terhadap nilai yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan

dengandinyatakan dengan persen perolehan kembali analit. Terdapat

3 konsetrasi larutan yang diinjeksi yaitu 0,75; 1,5 dan 3 mg/ml dengan

3 kali replikasi di setiap konsentrasinya. Merujuk pada tabel 5.7, hasil

perolehan kembali yang didapatkan dari uji parameter akurasi metode

analisis kurkumin yaitu 98,63% pada konsentrasi 0,75 mg/ml,

101,06% pada konsentrasi 1,5 mg/ml dan 101,76% pada konsentrasi

3 mg/ml. Rentang hasil %perolehan kembali yang didapatkan yaitu

98,63%-101,76%. Dari tabel 5.5 dapat diamati bahwa akurasi dari

setiap % perolehan kembali konsentrasi memenuhi persyaratan

merujuk pada tabel 5.5 yaitu di dalam rentang 75-120%.

y = 59.563,83x + 638,72R² = 0,9997

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

- 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

Lu

as A

rea

Konsentrasi (mg/ml)

Linieritas

44

Tabel 5.5. Kriteria Batas Perolehan Kembali yang Dapat Diterima

(AOAC, 2002)

Konsentrasi Batas Perolehan Kembali

100% 98-101%

10% 95-102%

1% 92-105%

0,1% 90-108%

0,01% 85-110%

10 µg/g (ppm) 80-115%

1 µg/g 75-120%

10 µg/kg (ppb) 70-125%

Presisi merupakan kedekatan antar nilai dalam pengukuran

secara berulang. Presisi dinyatakan dengan simpangan baku (SD)

atau simpangan baku relatif (RSD). Pesisi yang baik dari suatu

analisis ditandai dengan nilai %RSD dibawah persyaratan sesuai

dengan kondisi analisis. Hasil %RSD yang diperoleh dari uji presisi

metode analisis kurkumin yaitu 0,38-5,7%. Dari tabel 5.6 dapat

diamati bahwa %RSD dari setiap konsentrasi larutan baku memenuhi

persyaratan merujuk pada tabel 5.6 yaitu kurang dari 8%.

Tabel 5.6. Kriteria Batas %RSD yang Dapat Diterima (AOAC, 2002)

Konsentrasi Batas %RSD

100% 1%

10% 1,5%

1% 2%

0,1% 3%

0,01% 4%

10 µg/g (ppm) 6%

1 µg/g 8%

10 µg/kg (ppb) 15%

45

Tabel 5.7. Tabel Hasil Akurasi dan Presisi

No Kons.

(mg/mL) Area

KONS. THT

(mg/mL)

%Perolehan kembali

Rata-rata%perolehan

kembali

Deviasi Standart

%Deviasi Standart Relatif

1

0,16 10.483,93 0,165 101,40

99,04 2,15 2,17 0,16 10.203,98 0,161 98,52

0,16 10.076,62 0,158 97,21

2

0,33 23.014,25 0,376 115,59

114,11 2,52 2,21 0,33 22.165,10 0,361 111,20

0,33 23.003,60 0,375 115,53

3

0,75 44.588,03 0,738 98,38

98,63 0,38 0,38 0,75 44.618,92 0,738 98,45

0,75 44.893,26 0,743 99,06

4

1,50 96.862,08 1,615 107,70

101,06 5,76 5,70 1,50 88.294,71 1,472 98,11

1,50 87.627,88 1,460 97,36

5

3,00 183.015,70 3,062 102,06

101,76 1,01 0,99 3,00 180474,04 3,019 100,64

3,00 183.954,39 3,078 102,59

5.2.4. LOD dan LOQ

LOD bertujuan untuk mengetahui jumlah terkecil analit pada

suatu sampel yang memberikan respon yang signifikan

dibandingkan dengan blanko sedangkan LOQ bertujuan untuk

mengetahui nilai analit dalam sampel minimal yang terhitung oleh

sistem kromatogram. LOD dan LOQ didapatkan dengan

menggunakan persamaan:

SD = (𝑦 − 𝑦𝑖)2

𝑁 − 2

SD = 12.063.112,71

3

46

SD = 2005,25

𝐿𝑂𝐷 =3. 𝑆𝐷

𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒𝐿𝑂𝑄 =

10.𝑆𝐷


𝐿𝑂𝐷 =3.2005,25

59.563,83𝐿𝑂𝑄 =

10.2005,25

59,563,83

𝐿𝑂𝐷 = 0,11 µ𝑔/𝑚𝑙𝐿𝑂𝑄 = 0,34 µ𝑔/𝑚𝑙

Sehingga didapatkan nilai LOD 0,11µg/ml dan LOQ yaitu 0,34 µg/ml.

5.3. Penetapan Kadar Kurkumin pada Sediaan Herbal

Penetapan kadar kurkumin dilakukan untuk mengetahui kadar

kurkumin pada sediaan herbal mengandung kunyit. Sampel serbuk

ditimbang sebanyak 0,1203 gram, sampel kapsul ditimbang sebanyak

0,1095 gram dan sampel cair ditimbang sebanyak 1,088 gram, ketiga

sampel masing-masing dilarutkan dalam 10 ml metanol. Dilakukan

sonikasi selama 10 menit dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan

kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Analisis dilakukan menggunakan

UHPLC-MS/MS sehingga diperoleh kadar kurkumin dari setiap sampel

yaitu 0,03% kurkumin terkandung pada sampel serbuk, 4,78% kurkumin

terkandung dalam sediaan kapsul dan 0,03% sediaan cair.

Tabel 5.8. Tabel Hasil Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sampel

No Jenis Sediaan Persamaan

Linear Kadar

Kurkumin(µg/g)

Rata-rata Kadar

Kurkumin (%)

1 Sediaan Serbuk 25 mg

(mengandung 5 gram ekstrak kunyit)

y=58.350,2x-1.080,65

299,71 0,03

2 Sediaan Kapsul 500 mg

(mengandung 500 mg ekstrak y=59563,83x+638,72

47.835,10

4,78

47

kunyit)

3 Sediaan Cair150 ml

(mengandung 30 gram rimpang kunyit)

y=58.350,2x-1.080,65

295,58 0,03

48

BAB 6

PEMBAHASAN

6.1 Pembahasan

Konsumsi sediaan herbal oleh masyarakat semakin meningkat,

terutama sediaan herbal mengandung kunyit. Sediaan herbal itu sendiri

terbagi menjadi 3 kategori yaitu jamu, OHT dan fitofarmaka. Kunyit memiliki

banyak efikasi yang diperlihatkan oleh beberapa ramuan tradisional kunyit di

beberapa daerah di Indonesia. Pada Etnis Jawa di Yogyakarta terdapat 50

ramuan mengandung kunyit yang digunakan untuk terapi pasca persalinan.

Pada Etnis Jawa daerah Jawa Tengah terdapat 29 ramuan mengandung

kunyit untuk mengatasi penyakit jaundiceatau gangguan pada organ hati.

Pada Etnis Simalungun daerah Sumatera terdapat satu ramuan untuk

pengobatan HIV/AIDS, dan 26 ramuan untuk pengobatan kanker pada Etnis

Suku Hutan Provinsi Riau (Kemenkes RI, 2015). Kunyit memiliki efek

farmakologis yang paling populer yaitu sebagai anti-inflamasi. Efek

farmakologi lain dari kunyit yaitu sebagai agen hipotensi, anti kanker, anti

koagulan dan hepatoprotektor (Simanjutak, 2012).

Tujuan dilakukan penelitian ini yaitu mengetahui validitas metode

analisis kurkumin dalam kunyit dengan metode UHPLC-MS/MS dan

mengetahui kadar kurkumin dalam sediaan herbal mengandung kunyit.

Seiring dengan meningkatnya konsumsi produk herbal terutama jamu

mengandung kunyit, maka monitoring kualitas sediaan tersebut juga menjadi

sangat penting demi menjaga keamanan produk, kualitas produk dan efikasi

dari produk yang terdapat di pasaran. Monitoring kualitas sangat diperlukan

49

guna menjamin produk dapat tepat indikasi dan memiliki efikasi yang

maksimal ketika dikonsumsi oleh pasien (Oka, 2017). Monitoring kualitas

sediaan tersebut dilakukan dengan validasi metode analisis kurkumin

dengan parameter uji selektivitas, linieritas, akurasi presisi, LOD dan LOQ.

Kemudian dilakukan penetapan kadar kurkurmin pada beberapa sampel

sediaan herbal mengandung kunyit menggunakan UHPLC-MS/MS. Sampel

diambil dengan metode Purposive Sampling karena terdapat beberapa

kriteria pemilihan sampel yaitu sediaan herbal mengandung Curcuma longa,

sediaan herbal yang digunakan dapat dalam bentuk sediaan serbuk, kapsul

atau tablet dan dapat berupa jamu, OHT dan fitofarmaka, serta memiliki label

lengkap yang berisi kandungan ekstrak atau rimpang kunyit yang digunakan

dan indikasi sediaan herbal tersebut. Sampel yang dipilih adalah jamu

mengandung kunyit dalam sediaan serbuk, jamu mengandung kunyit dalam

sediaan kapsul dan OHT mengandung kunyit dalam sediaan cair.

Optimasi kondisi UHPLC-MS/MS perlu dilakukan untuk menunjang

efektifitas analisis. Sistem kromatografi yang digunakan yaitu fase terbalik,

yang memiliki fase diam yang non polar dan fase gerak yang lebih polar.

Optimasi yang dilakukan pada sistem UHPLC salah satunya yaitu fase

gerak. Beberapa pertimbangan diberikan pada pemilihan fase gerak

berdasarkan polaritas fase gerak. Kepolaran analit, fase gerak dan fase diam

akan mempengaruhi adanya perbedaan kecepatan migrasi masing-masing

senyawa akibat perbedaan distribusi atau afinitas relatif senyawa analit

tersebut pada fase diam dan fase gerak. Sifat senyawa yang polar akan

cenderung terdistribusi pada fase yang polar, sedangkan senyawa analit

yang non polar akan cenderung terdistribusi pada fase yang non-

50

polar.Pelarut A adalah pelarut air dengan 0,1% asam dan pelarut B adalah

pelarut organik seperti asetonitril, metanol dan propanol dengan 0,1% asam

(Jiang, 2012).

Fase gerak A terdiri dari 0,1% asam format dalam aquabidest, fase B

terdiri dari 0,1% asam format dalam Acetonitrile. Terdapat penambahan

asam format pada kedua tipe larutan yang memiliki fungsi untuk

memperjelas bentuk puncak pada kromatogram dan untuk menjadi sumber

proton dalam LC/MS fase terbalik. Asam format akan membuat larutan

memiliki pH yang rendah. Kondisi pH yang rendah ini akan menjaga residu

silanol dalam kondisi yang tidak terpisahkan, sehingga akan menghindarkan

adanya adsorpsi serta tidak terjadinya tailing. Selain itu, asam format

memiliki tingkat kontaminasi yang paling rendah, sehingga tidak menggaggu

proses analisis yang memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi (Ayuchecaria,

2016).

Gambar 6.1. Residual Silanol Pada Kolom UHPLC (Crawford, 2016)

Pada larutan B dipilih Asetonitril karena bersifat polar. Gugus nitrogen

terpolarisasi akibat perbedaan elektronegativitas antara atom karbon dan

nitrogen, sehingga menghasilkan 3 ikatan dari 2 atom tersebut. Oleh karena

itu asetonitril memiliki ikatan dipol yang kuat. Asetonitile juga memiliki jumlah

2 elektron bebas pada atom nitrogen yang dapat mengikat hidrogen atau

51

oksigen sekalipun. Selain kepolaran asetonitril, tingkat viskositas dari

astonitril lebih baik daripada metanol, sehingga dapat memproduksi droplet

yang lebih baik pula ada analisis menggunakan MS.Terdapat proses re-

equilibrasi pada menit akhir yaitu menit 4.5 dan 6. Re-equilibrasi dilakukan

dengan inisiasi komposisi larutan A (0,1% asam format dalam aquabidest)

sebelum analisis berikutnya. Fungsinya yaitu untuk menghasilkan

reprodusibilitas analisis yang tinggi.

Optimasi berikutnya yaitu pada MS/MS. Jenis yang digunakan

adalahTriple Q (quadrupole) Spektrometer Massa TSQ QUANTUM ACCESS

MAX dari Thermo Finnigan® dengan sumber ionisasi ESI (Electrospray

Ionization) yang dioperasikan dengan ionisasi mode positif. TSQ Quantum

secara primer didesain untuk mendapatkan hasil a

Documents

PENETAPAN KADAR KURKUMIN PADA SEDIAAN HERBAL YANG …repository.ub.ac.id/167726/1/Rifky Afrizal Fajar... · 2019. 5. 8. · several herbal medicine contains turmeric. The method was