SKRIPSI

Oleh:

NURMAULIDA HASANAH

135130101111048

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

PENGARUH IMPLANTASI SCAFFOLD XENOGRAFT

ASELULER, PRP (PLATELET RICH PLASMA) DAN

KOMBINASI KEDUANYA TERHADAP EKSPRESI

INTERLEUKIN-10 DAN JUMLAH SEL FIBROBLAS

DI SUBKUTAN ABDOMEN TIKUS (Rattus norvegicus)

PADA UJI BIOKOMPATIBILITAS

RESPON IMUN AKUT

ii

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoler gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh:

NURMAULIDA HASANAH

135130101111048

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

PENGARUH IMPLANTASI SCAFFOLD XENOGRAFT

ASELULER, PRP (PLATELET RICH PLASMA) DAN

KOMBINASI KEDUANYA TERHADAP EKSPRESI

INTERLEUKIN-10 DAN JUMLAH SEL FIBROBLAS

DI SUBKUTAN ABDOMEN TIKUS (Rattus norvegicus)

PADA UJI BIOKOMPATIBILITAS

RESPON IMUN AKUT

N AKUT

iii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Oleh :

NURMAULIDA HASANAH

135130101111048

Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji

Pada tanggal 9 Agustus 2017

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Pembimbing I

Pembimbing II

Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

NIP. 19600903 198802 2 001

drh. Fajar Shodiq Permata, M. Biotech

NIP. 19870501 201504 1 001

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Brawijaya

Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

NIP. 19600903 198802 2 001

PENGARUH IMPLANTASI SCAFFOLD XENOGRAFT

ASELULER, PRP (PLATELET RICH PLASMA) DAN

KOMBINASI KEDUANYA TERHADAP EKSPRESI

INTERLEUKIN-10 DAN JUMLAH SEL FIBROBLAS

DI SUBKUTAN ABDOMEN TIKUS (Rattus norvegicus)

PADA UJI BIOKOMPATIBILITAS

RESPON IMUN AKUT

N AKUT

iv

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Nurmaulida Hasanah

NIM : 135130101111048

Program Studi : Pendidikan Dokter Hewan

Penulis Skripsi berjudul :

PENGARUH IMPLANTASI SCAFFOLD XENOGRAFT ASELULER, PRP

(PLATELET RICH PLASMA), DAN KOMBINASI KEDUANYA

TERHADAP EKSPRESI INTERLEUKIN-10 DAN JUMLAH

SEL FIBROBLAS DI SUBKUTAN ABDOMEN TIKUS

(Rattus norvegicus) PADA UJI BIOKOMPATIBILITAS

RESPON IMUN AKUT

Dengan ini menyatakan bahwa:

1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri di

bawah payung penelitian dan tidak menjiplak karya orang lain, selain nama-

nama yang termasuk di isi dan tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil

jiplakan, maka saya bersedia menanggung segala risiko yang akan saya

terima.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang, 18 Agustus 2017

Yang menyatakan,

(Nurmaulida Hasanah)

NIM. 135130101111048

v

Pengaruh Implantasi Scaffold Xenograft Aseluler, PRP (Platelet Rich

Plasma), dan Kombinasi Keduanya terhadap Ekspresi Interleukin-10

dan Jumlah Sel Fibroblas di Subkutan Abdomen Tikus (Rattus

norvegicus) pada Uji Biokompatibilitas Respon Imun Akut

ABSTRAK

Implantasi scaffold xenograft aseluler yang biodegradable, platelet rich

plasma allogenic yang mengandung growth factor, dan kombinasi keduanya

memerlukan pegujian biokompatibilitas. Faktor pertumbuhan pada PRP seperti

PDGF dan VEGF akan meningkatkan angiogenesis sehingga sel radang akan

bermigrasi dari pembuluh darah ke jaringan subkutan. Hal tersebut dapat dilihat

dengan menurunnya jumlah ekspresi Interleukin-10 (IL-10) dan jumlah sel

fibroblas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh implantasi

scaffold, PRP, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi IL-10 dan jumlah sel

fibroblas pada uji biokompatibilitas respon imun akut. Penelitian ini

menggunakan metode implantasi graft pada subkutan abdomen tikus. Hewan

coba dibagi menjadi 3 kelompok perlakuan yaitu kelompok implantasi scaffold,

kelompok implantasi PRP, dan kelompok kombinasi scaffold dan PRP.

Parameter yang diamati yaitu ekspresi IL-10 menggunakan metode pewarnaan

imunohistokimia (IHK) serta jumlah sel fibroblas dengan pewarnaan

Hematoxylin-Eosin (HE) dan dianalisis secara statistik kuantitatif. Penelitian ini

menunjukkan secara signifikan (P<0.05) antar perlakuan dapat mempengaruhi

ekspresi IL-10 dan jumlah sel fibroblas, dengan rataan ekspresi IL-10 (%)

sebesar (66.96; 60.00; 43.77) dan jumlah sel fibroblas (sel/bidang pandang)

adalah sebesar (37.70; 17.78; 41.23). Uji biokompatibilitas terbaik pada

subkutan abdomen adalah implantasi scaffold dengan ekspresi IL-10 sebesar

66.96% dan jumlah sel fibroblas sebesar 37.70 sel/bidang pandang. Kesimpulan

dari penelitian ini yaitu implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan

kombinasi keduanya dapat mempengaruhi ekspresi IL-10 dan jumlah sel

fibroblas di subkutan abdomen tikus (Rattus norvegicus) pada uji

biokompatibilitas respon imun akut. Hasil penelitian menunjukkan implantasi

scaffold memiliki efek yang paling baik bagi tubuh hewan coba.

Kata kunci : Scaffold, xenograft, deselularisasi, platelet rich plasma allogenic,

IL-10, dan sel fibroblas.

vi

Implantation Effect of Acellular Xenograft Scaffold, PRP (Platelete Rich

Plasma) and it’s combination toward Interleukin-10 Expression and

Fibroblast Cells Number in Abdominal Subcutaneous of Rat

(Rattus norvegicus) in Biocompatibility Test of Acute

Immune Response

ABSTRACT

Implantation of biodegradable acelullar scaffold, allogenic platelets rich

plasma and it’a combination that containing growth factor require

biocompatibility testing. Growth factors in PRP such as PDGF and VEGF will

increase angiogenesis that causes inflammatory cells will migrate from blood

vessels to subcutaneous tissues. This can be seen by decreasing Interleukin-10

(IL-10) expression and amount of fibroblast cells. This study aims to determine

the effect implantation of scaffold, PRP and both combination on the expression

of IL-10 and amount of fibroblast cells in the biocompatibility test of acute

immune response. This research used graft implantation method in subcutaneous

abdomen of rats. The animals were divided into 4 treatment groups: healthy rats,

scaffold implantation group, PRP implantation group, and combination scaffold

and PRP implantation group. Parameters observed were IL-10 expression using

immunohistochemical staining (IHC) and amount of fibroblast cells with

Hematoxylin-Eosin (HE) staining method and quantitatively analyzed. This

study showed significantly (P <0.05) between treatments can affect the

expression of IL-10 and the number of fibroblast cells, with an average

expression of IL-10 (%) of 66.96, 60.00, 43.77) and the number of fibroblast

cells (cell / field of view) are (37.70; 17.78; 41.23). The best biocompatibility

test in subcutaneous abdomen was scaffold implantation with IL-10 expression

of 66.96% and total cell count of 37.70 cells/field of view. The conclusions of

this study are implantation of acellular xenograft scaffold, PRP and both

combinations can affect the expression of IL-10 and the number of fibroblast

cells in rat abdominal subcutaneous (Rattus norvegicus) in the biocompatibility

test of acute immune response. The experiment showed scaffold implantation

result the best effect in animal model body.

Keywords : Scaffold, xenograft, decellularization, allogenic platelet rich plasma,

IL-10, and fibroblast cell.

vii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis haturkan atas kehadirat Allah SWT, limpahan rahmat

dan ridho-Nya serta sosok panutan dan teladan Nabi Muhammad SAW, sehingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul penelitian “Pengaruh

Implantasi Scaffold Xenograft Aseluler, PRP (Platelet Rich Plasma) dan

kombinasi keduanya terhadap Ekspresi Interleukin-10 dan Jumlah Sel

Fibroblas di Subkutan Abdomen Tikus (Rattus norvegicus) pada Uji

Biokompatibilitas Respon Imun Akut”. Penelitian ini adalah penelitian

payung yang diketuai oleh drh. Fajar Shodiq Permata, M. Biotech.

Penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya kepada seluruh

pihak yang terlibat dalam penyusunan skripsi ini dan secara khusus penulis

menyampaikan terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES selaku dosen pembimbing I dan Dekan

Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya yang telah membimbing,

memberi banyak masukan, kesabaran, waktu, memberikan pelajaran selama

penelitian dan penulisan skripsi dan memberi dukungan demi kemajuan

FKH UB.

2. drh. Fajar Shodiq Permata., M. Biotech selaku pembimbing II atas segala

kesabaran dan keikhlasan yang luar biasa dalam membimbing, memberikan

masukan, arahan, fasilitas dan waktu bagi penulis dan kelompok dalam

melakukan penelitian dan penulisan mulai dari PKM sampai dengan skripsi.

3. drh. Herlina Pratiwi, M.Si., selaku dosen penguji I yang telah bersedia

meluangkan waktu untuk menilai dan memberi kritik, masukan serta arahan

pada penulis dalam penelitian maupun penulisan skripsi.

4. drh. Mira Fatmawati, M.Si selaku dosen penguji II yang telah bersedia

meluangkan waktu untuk menilai dan memberi masukan dan arahan pada

penulis dalam penelitian maupun penulisan skripsi.

5. drh. Dyah Ayu Oktavianie A. P., M. Biotech selaku pembimbing akademik

mulai dari semester satu hingga delapan yang telah memberikan bimbingan,

viii

semangat dan dukungan pada penulis selama melaksanakan kuliah di FKH

UB.

6. Keluarga penulis Ayahanda H. Sutego, Ibunda Hj. Dra. Wasriah serta adik-

adik kandung penulis Sabilla Putri dan Zaffa Latifah Aini untuk kasih

sayang, doa, semangat dan dukungan serta pengorbanan selama ini.

7. Rekan penelitian Resti Vanda Arantika, Kinanthi Az Zahra, dan Dewi

Lutfiana Sari atas super team, perjuangan, kerjasama, semangat dan

kebersamaan yang dilalui selama melakukan penelitian dan penulisan PKM

sampai dengan skripsi.

8. Mbak Ninik, Mas Farid, Mas Anton, Mas Bayu, dan staf Institut Biosains

lain yang telah bersedia membantu penulis selama melakukan penelitian di

Institute Biosains UB. Mas Hilman Nurmahdi yang memberikan bantuan di

Laboratorium Biokimia FMIPA UB serta Mbak Ami dan staf Laboratorium

Biomedik FK UB.

9. Teman-teman CAVITAS (Angkatan 2013 C) yang telah memberikan

persahabatan, semangat, inspirasi, keceriaan dan mimpi-mimpi luar biasa.

10. Kolega seperjuangan Six Sense (Angkatan 2013 FKH UB) yang telah

berjuang bersama sejak mahasiswa baru. Civitas akademik dan non

akademik FKH UB yang telah membantu proses perkuliahan penulis.

11. Kemenristek Dikti untuk pendanaan penelitian pada Program Kreatifitas

Mahasiswa (PKM) 2016.

12. Semua pihak yang telah membantu dalam pelaksanaan dan penyusunan

skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan ini masih jauh dari

kesempurnaan, oleh karena itu kritik dan saran yang membangun diharapkan

demi penyempurnaan selanjutnya. Penulis berharap semoga skripsi inidapat

bermanfaat bagi semua pihak dan dapat menambah pengetahuan baik bagi

penulis maupun bagi pembaca, Aamiin.

Malang, Juni 2017

Penulis

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL DEPAN ..................................................................... i

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii

HALAMAN PERNYATAAN ....................................................................... iv

ABSTRAK .......................................................................................................v

ABSTRACT ................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR .................................................................................. vii

DAFTAR ISI .................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiii

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG ............................................. xiv

BAB 1 PENDAHULUAN ...............................................................................1

1.1 Latar Belakang ...................................................................................1

1.2 Rumusan Masalah ..............................................................................4

1.3 Batasan Masalah.................................................................................4

1.4 Tujuan Penelitian ...............................................................................5

1.5 Manfaat Penelitian .............................................................................5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................7

2.1 Tissue Engineering .............................................................................7

2.2 Scaffold .............................................................................................8

2.2.1 Biokompatibilitas.....................................................................9

2.2.2 Porositas.................................................................................10

2.2.3 Biomekanis dan Biodegradabilitas ........................................10

2.3 Jaringan Xenograft ...........................................................................10

2.4 Teknik Deselularisasi .......................................................................11

2.5 Platelete Rich Plasma (PRP) ............................................................12

2.5.1 Fungsi Platelet .......................................................................13

2.5.2 Kandungan Growth Factor pada PRP ....................................14

2.6 Uji Biokompatibilitas .......................................................................16

2.7 Respon Imun Trhadap Jaringan Xenograft ......................................17

2.8 Sitokin Antiinflamasi Interleukin-10 ...............................................18

2.9 Sel Fibroblas ....................................................................................20

2.10 Hewan Coba Tikus (Rattus novergicus) ..........................................21

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESA PENELITIAN ..........23

3.1 Kerangka Konseptual .......................................................................23

3.2 Hipotesis Penelitian ..........................................................................27

x

BAB 4 METODE PENELITIAN .................................................................28

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ..........................................................28

4.2 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................28

4.2.1 Alat Penelitian .........................................................................28

4.2.2 Bahan Penelitian......................................................................29

4.2.3 Bahan Kimia............................................................................30

4.3 Tahapan Penelitian ...........................................................................30

4.3.1 Penetapan Sampel Penelitian ..................................................30

4.3.2 Rancangan Penelitian ..............................................................31

4.3.3 Variabel Penelitian ..................................................................31

4.4 Prosedur Kerja ..................................................................................32

4.4.1 Persiapan Hewan Coba ...........................................................32

4.4.2 Preparasi dan Koleksi Sampel .................................................33

4.4.3 Perlakuan Deselularisasi .........................................................33

4.4.4 Pembuatan PRP .......................................................................34

4.4.5 Implantasi Bahan Implan pada Hewan Coba (In Vivo) ........35

4.4.6 Pemeliharaan Pasca Implantasi dan Nekropsi Tikus ..............36

4.4.7 Pembuatan Preparat Histopatologi Metode Parafin ................36

4.4.8 Immunohistokimia (IHK) IL-10 .............................................37

4.4.9 Metode Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) .........................38

4.5 Analisis Data ....................................................................................39

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................40

5.1 Ekspresi Interleukin-10 pada Jaringan Subkutan Abdomen Tikus

Rattus norvegicus .............................................................................42

5.2 Jumlah Sel Fibroblas pada Jaringan Subkutan Abdomen Tikus

Rattus norvegicus .............................................................................51

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN .........................................................59

6.1 Kesimpulan ......................................................................................59

6.2 Saran .................................................................................................59

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 60

LAMPIRAN .................................................................................................. 67

xi

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Jenis-jenis faktor pertumbuhan pada PRP ............................................... 14

4.1 Rancangan Kelompok Penelitian ............................................................. 31

5.1 Rata-rata ekspresi IL-10 hasil pewarnaan imunohistokimia .................... 43

5.2 Persentase Homogenitas Protein Kolagen tipe I ...................................... 49

5.3 Rata-rata jumlah sel fibroblas hasil pewarnaan Hematoxylen-Eosin ....... 51

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Ilustrasi grafis prinsip-prinsip yang mendasari rekayasa jaringan

berbasis scaffold ......................................................................................... 7

2.2 Scaffold berpori yang akan dikemas dengan mobilisasi faktor

pertumbuhan ............................................................................................... 9

2.3 Struktur Kimia SDS dan EDTA ......................................................................... 12

2.4 Mekanisme kerja growth factor dari PRP dalam penyembuhan luka

dan regenerasi jaringan ................................................................................... 13

2.5 Gambar inflamasi dikontrol oleh modulasi fenotipe dari sitokin pro-

inflamasi dan anti-inflamasi dalam penyembuhan luka ............................. 18

2.6 Gambar mikroskopis morfologi sel fibroblas perbesaran 400x .............. 20

2.7 Tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar ......................................... 22

3.1 Kerangka konsep penelitian ..................................................................... 26

4.1 Gambar makroskopis dan mikroskopis scaffold xenograft aseluler ......... 29

4.2 Gambaran makroskopis PRP yang akan digunakan ................................ 34

4.3 Gambaran metode implantasi bahan implan ............................................ 35

5.1 Gambaran mikroskopis kulit kambing yang dideselularisasi (scaffold)

dan tanpa deselularisasi (perbesaran lensa objektif) ................................ 40

5.2 Gambaran makroskopik sampel gel PRP yang telah diaktivasi

menggunakan kalsium klorida (CaCl2) .................................................... 41

5.3 Gambar mikroskopis IHK kelompok 1 tikus implantasi scaffold

(perbesaran 400x) ..................................................................................... 44

5.4 Gambar mikroskopis IHK kelompok 2 tikus implantasi PRP

(perbesaran 400x) ..................................................................................... 46

5.5 Gambar mikroskopis IHK kelompok 3 tikus implantasi scaffold dan

PRP (perbesaran 400x) ............................................................................. 47

5.6 Gambar histopatologi pewarnaan HE kelompok 1 tikus implantasi

scaffold (perbesaran 400x) ...................................................................... 52

5.7 Gambar histopatologi pewarnaan HE kelompok 2 tikus implantasi PRP

(perbesaran 400x) ..................................................................................... 54

5.8 Gambar histopatologi pewarnaan HE kelompok 3 tikus implantasi

scaffold dan PRP (perbesaran 400x) ........................................................ 56

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Diagram Allir Tahapan Penelitian ..................................................... 68

2 Preparasi Kulit Kambing .................................................................... 69

3 Pembuatan Phosphat Buffer Saline (PBS) 1 L ................................... 70

4 Pembuatan Larutan Pencucian sebanyak 1 L ..................................... 71

5 Pembuatan Larutan Deselularisasi sebanyak 500 mL ........................ 72

6 Pembuatan Scaffold ............................................................................ 73

7 Jadwal Penggantian Larutan Deselularisasi ....................................... 74

8 Penyiapan PRP ................................................................................... 75

9 Aktivasi PRP Menggunakan CaCl2 .................................................... 76

10 Cara Implantasi bahan-bahan implant di Subkutan (hypodermis)

Abdomen Tikus Rattus norvegicus .................................................... 77

11 Pewarnaan Imunohistokimia (IHK) .................................................. 78

12 Pembuatan Preparat HE ..................................................................... 79

13 Ekspresi IL-10 (IHK) (%) .................................................................. 80

14 Hasil uji ANOVA ekspresi IL-10 pada Subkutan (Hypodermis)

Kulit Tikus Rattus norvegicus ............................................................ 81

15 Jumlah Sel Fibroblas (Sel/bidang pandang) ....................................... 85

16 Hasil uji One-Way Anova terhadap Jumlah Sel Fibroblas pada

Subkutan (Hypodermis) Kulit Tikus Rattus norvegicus .................... 86

17 Keterangan Layak Etik ....................................................................... 90

18 Dokumentasi Penelitian ..................................................................... 91

xiv

DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG

Simbol/singkatan

Keterangan

°C Derajat Celcius

Ang Angiopoietin

ANOVA Analysis of variance

APC Antigen Presenting Cell

Cc Cubic Centimeter

CD Cluster of Differentiation

Cm Centimeter

DAB Diamono Benzidine

dll Dan lain-lain

DNA Deoxyribonucleic Acid

DR, DP, DQ Lokus MHC Kelas II

ECM Extracellular Matrix

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic

EGF Epidermal Growth Factor

FGF Fibroblast Growth Factor

GFS Growth Factor

GM-CSF

Granulocyte Monocyt Colony Stimulating

Factor

H2O2 Hidrogen peroksida

HLA Human Leucocyte Antigen

HRP Horse Radish Peroxidase

IFN Interferon

IGF Insulin Growth Factor

IHC Imunohistochemical

IHK Imunohistokimia

IL Interleukin

kDa Kilo Daltons

KEP Komisi Etik penelitian

Mg Milligram

MHC Mayor Histocompatibility Complex

MIPA Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

mL Milliliter

MMP Matriks Metalo Proteinase

mRNA Messenger-RNA

NaCl Natrium Klorida

NS Normal Saline

P Perlakuan

PBS Phospat Buffer Saline

PDGF Platelet Derived Growth Factor

Pen-Strep Penicillin dan Streptomycin

PRP Platelete Rich Plasma

xv

RAL Rancangan Acak Lengkap

RSIA Rumah Sakit Islam Aisyiyah

SDS Sodium Dodecyl Sulphat

TEC Tissue Engineered Construct

TGF Tumor Growth Factor

Th T helper

TNF Tumor Necrosis Factor

UB Universitas Brawijaya

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dewasa ini penggunaan metode tissue engineering menjadi penting dan

menarik di bidang medis. Pada kasus transplantasi organ atau jaringan, muncul

berbagai masalah seperti terbatasnya kesediaan organ atau jaringan dan terjadinya

imunorejeksi. Tissue engineering sebagai alternatif bertujuan untuk meregenerasi

jaringan yang rusak dan menggantinya dengan mengembangkan substitusi

biologis yang memulihkan, memelihara atau meningkatkan fungsi jaringan. Sel,

scaffold dan growth stimulating signal merupakan komponen tissue engineering.

Scaffold biasanya dibuat dari biomaterial polimer guna memberikan dukungan

struktural untuk perlekatan sel dan perkembangan jaringan selanjutnya (Chan and

Leong, 2008).

Penggunaan biomaterial biologis saat ini mengalami perkembangan yang

pesat dalam beberapa perawatan bedah, seperti penggantian sendi, tulang pipih,

semen tulang, ligamen dan tendon buatan, implan gigi untuk fiksasi gigi, prostesis

pembuluh darah, katup jantung, jaringan buatan, lensa kontak dan dan bahan

implan seiring dengan kemajuan teknologi. Biomaterial merupakan bahan inert

yang ditanamkan ke dalam tubuh sebagai pengganti fungsi jaringan hidup atau

organ (Bhat, 2002). Hal ini disebabkan karena scaffold sintetik yang digunakan

sebelumnya terbatas dalam hal biokompatibilitas dan memicu respon inflamasi

yang kuat (Badylak and Gilbert, 2008).

1

2

Scaffold biologis biasanya diperoleh dari jaringan yang dideselularisasi

sehingga didapatkan jaringan yang tanpa sel (aseluler). Scaffold dapat berupa

jaringan yang diambil dari hewan lain (xenograft). Xenograft memiliki

keunggulan berupa ketersediaan bahan yang melimpah dan ukuran bahan besar.

Kulit asal babi merupakan scaffold padat terdiri dari bundel kolagen yang telah

komersial digunakan dalam kedokteran manusia. Berdasarkan hal tersebut, hewan

lain seperti kambing juga berpotensi dapat digunakan sebagai sumber jaringan

xenograft. Kulit hewan ternak (misalnya sapi, domba atau kambing) merupakan

produk limbah ternak yang jumlahnya banyak dan belum banyak difungsikan

sebagai scaffold. Menurut data Ditjennak (2016), populasi kambing di Indonesia

pada tahun 2015 memiliki populasi ternak tertinggi yaitu sekitar 19.012.794 ekor,

sehingga jumlah yang melimpah inilah akan membantu menyelesaikan jumlah

bahan biomaterial yang terbatas. Selain itu, berdasarkan Bank Protein Data

(Protein Data Base NCBI) tingkat homogenitas protein kolagen type I antara

kambing (Capra hircus) dibandingkan dengan hewan coba tikus (Rattus

norvegicus) sebesar 92%, sehingga berpotensi sebagai bahan biomaterial scaffold.

Namun harus dipertimbangkan juga faktor risiko yang mampu menimbulkan

kontaminasi, yaitu berupa adanya reaksi sistem imun akibat xenograft.

Reaksi imun terjadi karena adanya xenoantigen pada permukaan sel

xenograft. Molekul xenoantigen dapat berupa Major Histocompability Complex I

(MHC I) (Easter, 2008) dimana ketika ditransplantasikan ke jaringan resipien

yang tidak mirip maka akan menimbulkan respon imun dan dapat menyebabkan

kegagalan transplantasi. Mengatasi permasalah tersebut, perlu adanya metode

3

untuk menghilangkan xenoantigen tersebut. Salah satunya yaitu menggunakan

teknik deselularisasi. Teknik deselularisasi bertujuan untuk melarutkan sel tanpa

menghilangkan struktur dari extracellular matrix (ECM) (Cissell, 2014).

Selain scaffold, terdapat bahan lain yang dapat mendukung konstruksi

tissue engineering yaitu faktor pertumbuhan (growth factor). Platelet Rich Plasma

(PRP) adalah plasma yang kaya akan platelet atau trombosit dengan kandungan

berbagai macam growth factor (Marx, 2001). Munculnya dugaan kemampuan

scaffold sebagai konstrtuksi tissue engineering, PRP dapat digunakan sebagai

sumber growth factor, dan kombinasi scaffold dengan PRP dapat digunakan

sebagai biological scaffold sekaligus sebagai promoter regenerasi jaringan,

dimana scaffold akan memberikan ruang untuk growth factor baik autologue

maupun allogenic. Oleh sebab itu, penggunaan scaffold xenograft aseluler, PRP,

dan kombinasi scaffold dengan PRP sebagai bahan implantasi tissue engineering

perlu diujikan dan dilakukan pemeriksaan lanjut terkait respon jaringan subkutan

terhadap bahan implan. Indikator respon imun akut salah satunya adalah

Interleukin–10 (IL-10) dan jumlah sel fibroblas sebagai indikator regenerasi

jaringan. Akibat reaksi inflamasi ini tubuh akan memberikan reaksi imunologi

dengan memproduksi sitokin yang bekerja sebagai antiinflamasi melalui produksi

IL-10 oleh sel-sel makrofag, T helper 2 (Th2), sel B, monosit dan lain-lain (Islam,

2010). Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian terkait ekspresi IL-10 dan

jumlah sel fibroblas pada scaffold asal kulit kambing yang diberi perlakuan

dengan teknik deselularisasi, PRP allogenic dan kombinasi keduanya pada uji

biokompatibilitas akut yang belum pernah dilaporkan.

4

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka rumusan masalah

yang didapat adalah:

1. Apakah implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan kombinasi

keduanya dapat mempengaruhi ekspresi IL-10 pada subkutan abdomen

tikus (Rattus norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun akut?

2. Apakah implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan kombinasi

keduanya dapat mempengaruhi jumlah sel fibroblas pada subkutan

abdomen tikus (Rattus norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun

akut?

1.3 Batasan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini

dibatasi pada:

1. Hewan coba yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan galur

Wistar berumur tiga bulan dengan berat badan 150-200 gr yang berasal

dari breeding tikus Bapak Suwaji, Sudimoro Malang dan telah mendapat

sertifikasi layak etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya

dengan No: 498-KEP-UB (Lampiran 17).

2. Scaffold xenograft yang digunakan berasal dari kulit kambing yang telah

dideselularisasi menggunakan SDS 1% dan EDTA 0,1% (Permata dan

Susilowati, 2013).

3. Platelet Rich Plasma (PRP) yang digunakan yaitu PRP allogenic.

5

4. Tikus pada penelitian ini dilakukan implantasi bahan implan pada daerah

subkutan abdomen bagian ventral.

5. Pengamatan ekspresi IL-10 dengan menggunakan metode pewarnaan

imunohistokimia dan jumlah sel fibroblas menggunakan metode

pewarnaan hematoxylin-eosin di daerah implan yaitu subkutan

(hypodermis) abdomen bagian ventral yang diamati secara kuantitatif.

1.4 Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka tujuan dari

penelitian ini adalah:

1. Mengetahui pengaruh implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan

kombinasi keduanya terhadap ekspresi IL-10 pada subkutan abdomen

tikus (Rattus norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun akut.

2. Mengetahui pengaruh implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan

kombinasi keduanya terhadap jumlah sel fibroblas pada subkutan abdomen

tikus (Rattus norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun akut.

1.5 Manfaat Penelitian

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka manfaat dari

penelitian ini adalah:

1. Dapat mengetahui pengaruh implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP

dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi IL-10 dan jumlah sel fibroblast

pada subkutan abdomen tikus (Rattus norvegicus) pada uji

biokompatibilitas respon imun akut.

6

2. Sebagai bahan informasi penelitian selanjutnya mengenai pengaruh

implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan kombinasi keduanya

terhadap ekspresi IL-10 dan jumlah sel fibroblast pada subkutan abdomen

tikus (Rattus norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun akut.

3. Sebagai dasar lanjutan dan sumber pengetahuan pada pengembangan

penelitian xenograft selanjutnya.

7

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tissue Engineering

Tissue engineering atau rekayasa jaringan adalah gabungan multidisiplin

ilmu yang melibatkan bidang biologi, kedokteran dan teknik yang menciptakan

perbaruan dalam penyembuhan jaringan yang mengalami kerusakan dengan

memulihkan, mempertahankan, atau meningkatkan fungsi jaringan dan organ

(Kanani et al, 2012). Salah satu faktor yang penting dalam tissue engineering

adalah pembuatan biomaterial berupa perancah atau scaffold. Scaffold yang baik

memiliki bentuk tiga-dimensi, biokompatibel, mudah untuk terdegradasi

(biodegradable) serta memiliki kekuatan mekanik (Potorac et al., 2011).

Gambar 2.1 Ilustrasi grafis prinsip-prinsip yang mendasari rekayasa jaringan

berbasis scaffold (Dept of Biomedical Engineering NUS, 2017).

Tabata dan Matsui (2012) mengungkapkan tissue engineering dapat

membantu menggantikan fungsi biologis organ yang rusak dengan memanfaatkan

tiga faktor yaitu sel, faktor pertumbuhan, dan scaffold sebagai template untuk

7

8

pembentukan jaringan yang memungkinkan sel untuk bermigrasi, dan

menghasilkan jaringan. Tujuan dari konstruksi rekayasa jaringan atau Tissue

Engineered Construct (TEC) adalah untuk menumbuhkan suatu jaringan dan

menghasilkan tiruan biologis yang sesuai dengan fungsi normal.

2.2 Scaffold

Scaffold memiliki peran sebagai ruang untuk vaskularisai jaringan baru

dan secara aktif berpartisipasi dalam proses regenerasi melalui pelepasan growth

factor. Saat ini, scaffold merupakan komponen yang penting dalam tissue

engineering. Secara umum scaffold dalam bedah rekonstruksi dibedakan menjadi

dua, yaitu biologis (menggunakan bahan dasar atau preparat biologis yang sudah

diolah dan didesain) dan sintetis (menggunakan bahan sintetis, yang seringkali

bersifat tidak biodegradable dan respon imun terbatas) (Kalista, 2013).

Rekayasa jaringan berperinsip membangun sel-sel pada extracellular

matrix (ECM) buatan yang juga dikenal sebagai scaffold atau biomaterial yang

mendukung pertumbuhan sel, diferensiasi, dan migrasi matriks ekstraseluler

memiliki komponen berupa kolagen. Menurut Singh et al., (2015), ECM sekitar

fibroblas pada jaringan ikat sebagian besar terdiri dari fibril kolagen. Menurut

Wang et al., (2013), kolagen adalah unsur yang penting dan komponen utama dari

jaringan ikat. Selama bertahun-tahun, scaffold atau perancah kolagen berpori telah

banyak digunakan di teknik rekayasa jaringan untuk kulit, tulang rawan, tulang

dan saraf. Keuntungannya mencakup biokompatibilitas yang baik, toksisitas

rendah dan biodegradasi terkendali.

9

Menurut Farrach-Carson and Carson (2007), peranan ECM pada tissue

engineering adalah sebagai kerangka guna fasilitator regenerasi sebuah jaringan

dan pelepasan growth factor dalam pembentukan jaringan in vivo, atau digunakan

sebagai kerangka sebagai wadah dari sel autolog dalam pembentukan jaringan in

vitro.

Gambar 2.2 Scaffold berpori yang akan dikemas dengan mobilisasi faktor

pertumbuhan (Liu et al., 2012)

Keterangan: (A) Growth factor yang mengenali pori scaffold sebagai wadah

(B) Growth factor bergabung dengan scaffold

Syarat yang penting dalam penentuan substansi biomaterial sebagai

scaffold adalah biokompatibilitas, porositas, dan biodegradabilitas.

2.2.1. Biokompatibilitas

Scaffold harus dapat berintegrasi dengan baik dengan jaringan tanpa

menimbulkan respon imun (Sarkar et al, 2006). Biokompatibilitas dapat

dianggap sebagai kemampuan suatu material untuk berinteraksi dengan

sel-sel atau jaringan hidup atau sistem metabolisme yang tidak

10

menyebabkan toksisitas, injuri atau reaksi imun saat berfungsi pada

tempat tertentu (Ma’ruf, dkk., 2013).

2.2.2. Prorositas

Scaffold harus memiliki pori terbuka, struktur pori yang tinggi dengan

permukaan luas sehingga sel dapat tumbuh dan terdistribusi, dan memfasilitasi

neovaskularisasi untuk rekonstruksi di sekeliling jaringan. Selain itu, scaffold

seharusnya memiliki mikroporositas yang cukup untuk pertumbuhan darah

kapiler. Porositas dan interkonektivitas juga penting untuk difusi dari nutrisi

dan gas serta pembuangan residu hasil metabolik dari aktivitas sel yang

tumbuh dalam scaffold (Yudha, 2013).

2.2.3. Biomekanis dan Biodegradabilitas

Penelitian secara in vitro menunjukkan scaffold seharusnya memiliki

kekuatan mekanis yang cukup untuk menahan tekanan hidrostatis dan

mempertahankan pori yang diperlukan untuk pertumbuhan sel dan produksi

matriks. Selanjutnya degradasi scaffold harus selaras dengan pertumbuhan

jaringan baru, sehingga dengan berjalannya waktu, kerusakan akan diperbaiki

secara keseluruhan dan scaffold akan didegradasi dengan sempurna (Yudha,

2013).

2.3 Jaringan Xenograft

Xenotransplantasi adalah transplantasi sel hidup, jaringan, atau organ yang

berasal dari spesies lain. Sel-sel, jaringan dan organ tersebut yang disebut dengan

xenografts (Jacobsen and David, 2009). Bols et al., (2010) dalam Chikwendu dan

Okanya (2013) menyatakan bahwa, studi penelitian mengenai xenograft akan

11

terus dikembangkan guna membuka jalan agar potensial digunakan. Xenograft

mengandung antigen, terutama protein yang dikenali oleh sistem kekebalan tubuh

resipien sebagai benda asing (Cissell., et al, 2014). Bahan jaringan kemudian

diproses untuk menghilangkan sel-sel (deselularisasi), sehingga meninggalkan

matriks kolagen atau ECM saja. Produk turunan yang bersumber dari hewan yang

terdiri dari perancah jaringan (misalnya Unite® BioMatrix Collagen Synovis

Wound Dressing) (Harding et al., 2010).

2.4 Teknik Deselularisasi

Deselularisasi dianggap penting karena berpotensi untuk menghilangkan

respon imun yang merugikan ditimbulkan oleh epitop membran sel, DNA

alogenik atau xenogenik, dan berhubungan dengan kerusakan molekuler pada pola

molekul. Hal penting dalam proses deselularisasi adalah menghapus bahan sel,

dengan menjaga sebanyak mungkin ECM. Tujuan deselularisasi adalah

menghilangkan sel dan menyisakan ECM (Qiong et al., 2015).

Metode deselularisasi yaitu secara fisik maupun secara kimia. Secara fisik

dalam menghilangkan sel yaitu dengan menggunakan metode freezing-thawing

(pembekuan-pencairan). Metode ini mampu melisiskan sel dengan merusak

bagian membrane sel menggunakan kristal es. Metode ini tidak efektif digunakan

untuk menghilangkan sel secara menyeluruh, maka diperlukan proses

deselularisasi secara kimiawi (Gilbert et al., 2006). Proses deselularisasi secara

kimiawi menggunakan bahan kimia untuk menghilangkan sel dalam jaringan.

Bahan yang digunakan yaitu Sodium Dodecyl Sulphat (SDS) dan Ethylene

Diamine Tetra Acetic (EDTA). SDS terdiri atas bahan detergen ionic yang

12

mampu melisiskan sel dengan merusak struktur membran sel maupun membrane

nukleus dan berfungsi juga untuk mendenaturasi protein. Sedangkan EDTA

berfungsi untuk mengikat ion sehingga ikatan sel dengan ECM akan rusak (Crapo

et al., 2011).

Gambar 2.3 Struktur kimia dari SDS (Kumar et al., 2014) (a) dan EDTA

(Nagaraju et al., 2017) (b)

2.5 Platelete Rich Plasma

Saat ini telah banyak penggunaan PRP dalam aplikasi klinis seperti dalam

penyembuhan tulang pada bedah maxilofascial mulut, penyembuhan luka pasca

operasi, dan penyembuhan pada kasus cedera olahraga atau muskuloskeletal

(Pietrzark and Eppley, 2006). Platelete rich plasma memiliki 7 protein mendasar

yaitu Platelet Derived Growth Factors (PDGF), Transforming Growth Factor

(TGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Epidermal Growth Factor

(EGF), and adhesive proteins – fibrin, fibro-nectin, dan vitronectin (Jain and

Gulati, 2016). Interaksi kompleks antara faktor-faktor pertumbuhan, faktor

diferensiasi dengan faktor protein perekat (adhesive protein factor) seperti

fibronektin dan vitronectin berperan penting dalam proses penyembuhan,

mempromosikan proses regenerasi panjang kemotaksis, proliferasi sel, fagositosis

a b

13

Gambar 2.4 Mekanisme kerja growth factor dari PRP dalam penyembuhan luka

dan regenerasi jaringan (Jain and Gulati, 2016)

sisa-sisa jaringan, angiogenesis, pembentukan matriks ekstraseluler, produksi

osteoid dan sintesis kolagen (Yudha, 2013).

2.5.1. Fungsi Platelet

Platelet berfungsi dalam hemoestasis dan inisiasi proses penyembuhan

luka. Platelet menginduksi proses migrasi dan mengundang sel radang dari

sum-sum tulang (bone marrow derived cells) ke daerah angiogenesis, platelet

juga menginduksi diferensiasi sel progenitor endotial menjadi sel endotial

yang matang. Platelet merupakan elemen pertama yang tiba di daerah yang

luka dan berperan aktif pada fase inflamasi proses penyembuhan luka. Sitokin

dasar yang teridentifikasi dalam trombosit berperan penting dalam proliferasi

sel, kemotaksis, diferensiasi sel, regenerasi, dan angiogenesis (Yudha, 2013).

Platelet mengandung berbagai macam faktor pertumbuhan dengan

konsentrasi tinggi yang penting dalam proses regeneratif. Ketika trombosit

diaktifkan, faktor pertumbuhan dilepaskan dari butiran alpha yang

14

mengakibatkan peningkatan konsentrasi faktor pertumbuhan dilingkungan

luka (Toffler et al., 2009).

2.5.2. Kandungan Growth Factor pada PRP

Platelet mengandung berbagai macam faktor pertumbuhan dengan

konsentrasi tinggi yang penting dalam proses regeneratif. Penelitian Fr’echette

dkk dalam Yudha (2013) menunjukkan bahwa pelepasan PDGF, TGF-β, FGF,

dan VEGF secara signifikan dipengaruhi oleh jumlah kalsium dan trombin

yang ditambahkan kedalam PRP.

Tabel 2.1 Jenis-jenis faktor pertumbuhan pada PRP

Faktor pertumbuhan Fungsi

Platelet Derived Growth

Factor (PDGF)

Stimulasi sel fibroblas, kemotaktik, stimulasi

TGF- β, produksi kolagen, peningkatan

sintesis proteoglikan

Transforming Growth Factor

Beta (TGF- β)

Modulasi proliferasi fibroblas, pembentukan

matriks ekstraselular, meningkatkan produksi

kolagen oleh fibroblas, faktor kemotaktik

neutrofil dan makrofag

Basic Fibroblast Growth

Factor (bFGF)

Produksi kolagen, stimulasi angiogenesis,

proliferasi mioblas

Vascular Endothelial Growth

Factor (VEGF)

Memicu angiogenesis

Epidermal Growth Factor

(EGF)

Memicu diferensiasi sel, angiogenesis, serta

proliferasi sel mesenkimal dan epidermal

Insulin-like Growth factor

(IGF)

Memicu proliferasi dan diferensiasi berbagai

jenis sel

(Satriyo dkk., 2011)

Hormon PDGF ditemukan pada tahun 1974 yang berfungsi sebagai

chemotactor untuk monosit, neutrofil, dan fibroblas, berperan dalam

pertumbuhan sel, selular migrasi, efek metabolic, dan modulasi reseptor sel

15

membran. Pertama kali PDGF diidentifikasi sebagai produk trombosit yang

merangsang proliferasi in vitro jenis sel jaringan ikat seperti fibroblas.

Hormon ini terdiri dari empat isoform (PDGF-A, B, C dan D) dan dua rantai

reseptor (PDGFR-alpha dan beta), memainkan peran penting dalam

penyembuhan luka, arterosklerosis, fibrosis, dan keganasan, berperan dalam

berbagai proses patofisiologis, mulai dari proliferasi sel dan migrasi ke

matriks ekstraselullar, produksi mediator pro-inflamasi dan anti-inflamasi,

mempengaruhi permeabilitas jaringan dan regulasi hemodinamik. Pelepasan

PDGF dapat memiliki efek pada monosit kemotaktik, neutrofil, fibroblas, sel

induk, dan osteoblas. Peptide ini merupakan mitogen ampuh untuk sel

mesenkimal termasuk fibroblas (Yudha, 2013).

Hormon VEGF mempromosikan angiogenesis dan dapat

mempromosikan penyembuhan luka kronis dan membantu dalam osifikasi

endokhondral. Faktor pertumbuhan lainnya seperti Epidermal Growth Factor

(EGF), TGF-alpha, IGF-1, angiopoietin-2 (Ang-2), dan interleukin- 1β yang

juga memainkan peran penting dalam penyembuhan luka.

Hormon IGF-1 berperan dalam menginduksi proliferasi, diferensiasi,

dan hipertrofi beberapa sel. Hormon IGF-1 memiliki dua fungsi penting

sebagai kemotaksis untuk sel endotel vaskuler ke dalam luka yang

mengakibatkan angiogenesis dan mempromosikan diferensiasi sel seperti

kondroblas, myoblas, osteoblas, dan sel hematopoietik (Yudha, 2013).

Hormon TGF-β adalah merupakan salah satu protein yang baru

ditemukan. Dua sumber utama protein ini adalah platelet dan makrofag.

16

Hormon TGF-β berfungsi sebagai kemotaktor dan activator monosit,

makrofag, dan fibroblas. Fibroblas yang teraktifasi meningkatkan

pembentukan ECM dan kolagen. Hormon TGF-β beta yang dilepaskan dari

butiran alpha adalah suatu mitogen untuk fibroblas, sel-sel otot polos, dan

osteoblast, juga mempromosikan angiogenesis matriks ekstraseluler dan

produksi matrik ekstraseluler (Yudha, 2013).

2.6 Uji Biokompatibilitas

Uji biokompatibilitas dilakukan untuk menguji sampel material yang akan

berkontak dengan jaringan lunak atau tulang dan untuk mengevaluasi kemampuan

suatu material dapat menimbulkan reaksi inflamasi ( Thorne et al, 2007). Respon

inflamasi biasanya terjadi karena biomaterial dikenali sebagai benda asing

sehingga resipien melakukan mekanisme pembersihan kontaminan untuk

meminimalisasi infeksi melalui fagositosis (Alhasyimi, dkk., 2015).

Dalam terminologi secara umum biokompatibilitas adalah keadaan atau

situasi dimana tidak terjadi interaksi yang berbahaya antara biomaterial dengan

sistim biologis dan sebaliknya (Hakim, 2012). Biokompatibilitas dapat dianggap

sebagai kemampuan suatu material untuk berinteraksi dengan sel-sel atau

jaringan hidup atau sistem metabolisme yang tidak menyebabkan toksisitas,

injuri atau reaksi imun saat berfungsi pada tempat tertentu (Ma’ruf, dkk.,

2013).

Tujuan dari uji biokompatibilitas adalah untuk mengetahui interaksi

antara material terhadap jaringan tubuh . Respon inflamasi ditunjukkan dengan

meningkatnya jumlah sel neutrofil terutama di bagian tepi dari jaringan yang

17

mengalami reaksi toksisitas. Reaksi atau respon imun akan terjadi apabila

terdapat penolakan terhadap bahan implan berupa reaksi hipersensitivitas

(Ma’ruf, dkk., 2013).

2.7 Respon Imun terhadap Jaringan Xenograft

Xenograft ditolak oleh sistem kekebalan tubuh penerima oleh empat

mekanisme penolakan yang berbeda (Hisashi et al., 2008). Hal ini disebut sebagai

hyperacute rejection, acute humoral xenograft rejection, acute cellular xenograft

rejection and chronic rejection. Jika graft ditolak dalam waktu 48 jam setelah

transplantasi penolakan tersebut adalah hiperakut. Jika graft ditolak hingga 7 hari

pasca transplantasi disebut penolakan akut. Penolakan kronis terjadi berbulan-

bulan setelah transplantasi. Penolakan xenograft sering didefinisikan sebagai

hilangnya fungsi organ (Sunesson, 2012).

Seperti halnya untuk respon imun lainnya, reaksi terhadap xenograft

melibatkan kedua reaksi imunitas yaitu imunitas humoral dan seluler. Reaksi

imunologi xenograft melibatkan kehadiran di kedua antibodi alami yaitu imunitas

humoral dan seluler mampu menyebabkan reaksi penolakan hiperakut organ yang

tervaskularisasi. Meskipun antibodi alami telah menimbulkan reaksi pertahanan

untuk xenograft, namun sekarang terdapat banyak metode untuk menghilangkan

antibodi atau mengendalikan efek penolakan, guna menghindari penolakan

hiperakut (Sachs, 1995).

Antigen permukaan sel yang sudah ada merangsang imunitas humoral

dalam pembentukan antibody. Semua graft harus cocok atau akan terjadi reaksi

hiperakut. Antigen MHC kelas 1 (misalnya HLA-A, HLA-B, HLA-C) terdapat

18

pada permukaan sel berinti dan merangsang aktivasi limfosit T CD8 positif

(sitotoksik) pada resipien. Mengoptimalkan kecocokan kelas 1 dapat mengurangi

risiko respon imun akut (Grace dan Neil, 2006). Antigen MHC kelas 2 (misalnya

DR, DP, DQ) ditemukan pada sel seperti makrofag, monosit, dan limfosit B dan

merangsang limfosit T CD4 positif (helper). Mengoptimalkan kecocokan kelas 2

mengurangi risiko rejeksi respon humoral (Grace dan Neil, 2006).

2.8 Sitokin Antiinflamasi Interleukin-10

Sitokin memiliki peran yang penting dalam interaksi dan komunikasi antar

sel (Zhang and An, 2007). Sitokin meregulasi system imun, inflamasi dan

hematopoiesis. Interleukin-10 (IL-10) adalah sitokin anti-inflamasi yang pertama

memanggil sintesis human cytokine faktor inhibitor, IL-10 bermain peran untuk

menghambat sintesis dari banyak sitokin termasuk proses inflamasi (Khan, 2008).

Gambar 2.5 Gambar inflamasi dikontrol oleh modulasi fenotipe dari sitokin pro-

inflamasi dan anti-inflamasi dalam penyembuhan luka (Browne and Pandit, 2015)

Sitokin IL-10 tersusun 36-kDa dimer dari dua ikatan panjang 160-

aminoacid- residue. Gen ini terletak di kromosom 1 pada manusia dan tetap terdiri

dari 5 exon. Sitokin IL-10 menghambat sintesis dari sejumlah sitokin yang terlibat

pada proses inflamasi termasuk IL-2, IL-3, GM-CSF, TNFα dan IFNγ.

19

Berdasarkan pada profil tekanan sitokin, hal ini juga berfungsi sebgai inhibitor

dari presentasi antigen. Menariknya, IL-10 dapat mempromosikan aktivitas sel

mast, sel B dan termasuk sel T. Sitokin IL-10 merupakan sitokin imunoregulator.

Sitokin anti inflamasi yang pertama disintesis oleh faktor penghambat. Sitokin IL-

10 disekresi oleh makrofag, sel Th2 dan sel mast (Khan, 2008). Tujuan utama dari

IL-10 adalah monocyte, dimana ia akan mengeblok aktivasi dan proliferasi, IL-10

juga menghambat fungsi sel dendritic dan aktivasi sel T, kemudian berefek pada

makrofag (Mu Wei et al, 2005).

Sitokin IL-10 adalah sitokin pleitropik yang diproduksi oleh makrofag,

fibroblas atau sel T dan beberapa sel non limfoid seperti keratinosit dan sel tumor.

Sitokin ini juga ikut menekan ekspresi MMP sel selain menghambat sintesis IL-1

dan TNF α melalui promosi dan degradasi mRNA. Sitokin IL-10 memiliki efek

anti inflamasi melalui jalur yang berbeda seperti supresi produksi sitokin monosit.

Makrofag merespon adanya mikroba melalui sekresi sitokin dan ekspresi

kostimulator mengaktivasi sel T dan immune mediated sel. Sitokin IL-10 bekerja

pada aktivasi makrofag, menghentikan respon ini yang mengembalikan sistem ke

dalam keadaan status istirahat. Pada manusia IL-10 diproduksi dan didown

regulated oleh sel Th1 dan Th2 (Abadi, 2008).

2.9 Sel Fibroblas

Sel fibroblas merupakan elemen utama pada proses perbaikan untuk

pembentukan protein structural yang berperan dalam pembentukan jaringan.

Menurut Werner et al (2007), fibroblas berasal dari sel-sel mesenkimal lokal,

20

pertumbuhannya disebabkan oleh sitokin yang diproduksi oleh makrofag dan

limfosit.

Pada keadaan normal, aktivitas pembelahan fibroblas sangat jarang

terlihat, namun ketika terjadi perlukaan sel ini terlihat lebih aktif dalam

memproduksi matriks ekstraseluler. Proliferasi fibroblas dalam proses

penyembuhan luka secara alami distimulasi oleh interleukin-1β, Platelet PDGF,

dan FGF (Sumbayak, 2016). Selain itu menuurt Kanzaki dkk (1998) dalam

Sumbayak (2016) mengungkapkan bahwa migrasi fibroblas pada area perlukaan

distimulasi oleh TGF-β, yaitu faktor pertumbuhan yang dihasilkan oleh jaringan

granulasi yang terbentuk selama proses inflamasi.

Gambar 2.6 Gambar mikroskopis morfologi sel fibroblast perbesaran 400x

Keterangan: (a) Fibroblas biasanya menunjukkan inti yang aktif dan besar

dan eosinophilic sitoplasma meruncing di kedua arah

sepanjang sumbu inti, morfologi biasanya disebut

"berbentuk gelendong." Inti (pada panah) terlihat jelas,

namun sitoplasma menyerupai bundel kolagen.

(b) Fibroblas yang aktif adalah sel besar, sedangkan fibroblas

tidak aktif atau fibrosit lebih kecil dengan kurang menonjol

(Mescher, 2010).

a b

21

Pada jaringan pengikat regular yang padat, fibroblas akan memiliki bentuk

fusiform atau spindle karena terletak diantara serabut kolagen regular. Pada

jaringan pengikat areolar, fibroblas akan berbentuk stellate karena bentuk serabut

kolagen yang tidak beraturan. Individual fibroblas akan berbentuk plleomorfik,

mungkin supaya mereka dapet bergerak di jaringan pengikat (Yudha, 2013).

2.10 Hewan Coba Tikus (Rattus norvegicus)

Penggunaan hewan coba dalam suatu penelitian sangat mendukung suatu

penelitian untuk pengobatan suatu penyakit atau untuk penemuan baru di bidang

medis. Hewan coba yang digunakan harus memiliki kriteria khusus dan mampu

memunculkan kondisi patogenesis dan patofisiologis dari suatu kondisi yang

sedang diteliti (Frode and Medeiros, 2008). Hewan coba yang digunakan untuk

diabetes mellitus dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) starin

Wistar dengan klasifikasi menurut David (2000) :

Kingdom : Animal

Filum : Chordata

Kelas : Mamalia

Subkelas : Theria

Ordo : Rodentia

Famili : Murinae

Genus : Rattus

Spesies : Rattus norvegicus strain Wistar

22

Gambar 2.7 Tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar (David, 2000)

Penggunaan tikus putih (Rattus norvegicus) pada gambar 2.7 banyak

digunakan karena mudah diperoleh. Tikus putih memiliki sifat respon biologik

dan adaptasi yang mirip dengan manusia, mudah untuk dikendalikan, mudah

dipelihara, dan perawatannya yang mudah sehingga membantu dalam penelitian

(Widyastuti, 2000). Tikus putih mencapai umur dewasa ketika berumur 50-60 hari

baik jantan maupun betina, di mana seluruh organ sudah berfungsi secara normal

dan kondisi tubuh sudah stabil, berat badan ideal tikus dewasa unur 60 hari

berkisar 150-250 gram dan akan terus bertambah, pada umur 90 hari bisa

mencapai 275-350 gram (Ai, et al., 2005).

23

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1. Kerangka Konseptual

Kelompok perlakuan implantasi scaffold (kelompok 1) dimana teknik

deselularisasi yang sebelumnya diterapkan pada jaringan kulit kambing

diharapkan mampu meningkatkan biokompatibilitas. Konstruksi scaffold yang

terbentuk diharapkan akan menjadi template sel dan faktor pertumbuhan

autologue resipien itu sendiri dan dapat berinteraksi dengan baik. ECM scaffold

yang terdiri dari bundle kolagen diimplantasikan pada bagian subkutan kulit akan

bersatu dengan jaringan sekitar daerah implantasi. Reaksi imunitas yang merespon

benda asing akan mengaktifkan makrofag. Disisi lain setelah respon inflamasi

terjadi dilanjutkan dengan penurunan sitokin proinflamasi, hal tersebut

menyebabkan terjadi penekanan limfosit T menyebabkan hiporesponsif limposit T

sehingga dapat menyebabkan penurunan sel T CD4+ yang dapat menurunkan

produksi Th1 dan Th2. Sel Th1 akan menurun sehingga produksi sitokin

proinflamasi seperti IL-1, IL-6, dan TNF-α yang muncul akibat adanya respon

inflamasi akan segera ditekan oleh sitokin antiinflamasi. Sehingga membuat

produksi IL-10 lebih mengalami peningkatan sehingga tidak terjadi immune

rejection dan akan meningkatkan kompatibilitas scaffold yang aman untuk

diimplankan. Degradasi scaffold akan terjadi secara perlahan dan bergabung atau

kompatibel terhadap jaringan sekitarnya dengan bantuan growth factor autologue.

Pemberian aplikasi PRP (kelompok 2) yang diimplantasikan ke jaringan

subkutan tikus Rattus norvegicus, dimana PRP banyak mengandung growth factor

23

24

diantaranya VEGF bertindak sebagai stimulator dan pemicu angiogenesis. Selain

itu, PDGF dan TGF dapat bertindak sebagai kemoatraktan untuk sel radang.

Meskipun terdiri dari berbagai macam faktor pertumbuhan, kita tidak dapat

mengetahui persentase masing-masing faktor partumbuhan. Hal tersebut

menyebabkan adanya growth factor yang mensuport angiogenesis lebih dominan

dan meningkatnya angiogenesis terjadi. Angiogenesis yang tinggi akan

menyebabkan meningkatnya migrasi sel radang pada saat proses inflamasi. Saat

itulah sitokin proinflamasi seperti IL-1, IL-6, dan TNF-α akan meningkat dan

sitokin antiinflamasi seperti IL-10 akan menurun. Disaat yang sama kemoatraktan

akan memanggil sel-sel radang sehingga terjadi nonkompatibel pada bahan

implan.

Pada kelompok kombinasi scaffold dan PRP (kelompok 3), degradasi

scaffold akan terstimulasi akibat adanya PRP yang mengandung beberapa faktor

pertumbuhan sehingga akan menyebabkan degradasi berlebih. Faktor

pertumbuhan seperti PDGF dan VEGF akan meningkatkan angiogenesis sehingga

sel radang akan bermigrasi dari pembuluh darah ke jaringan subkutan. Hal

tersebut dapat dilihat dengan meningkatnya jumlah ekspresi sitokin proinflamasi

seperti IL-1, IL-6 dan TNF-α. Sel Th1 akan meningkat sehingga produksi sitokin

proinflamasi juga mengalami peningkatan. Sehingga membuat produksi IL-10

mengalami penurunan.

Selain itu, percepatan degradasi scaffold akan menurunkan kolagen dermis

scaffold dan tentunya akan menurunkan jumlah ekspresi sel fibroblast.

Menurunnya ekspresi IL-10 dan ekspresi sel fibroblas menyebabkan terjadi

25

penurunan respon biokompatibilitas atau implantasi scaffold xenograft aseluler

asal kulit kambing yang dikombinasikan dengan PRP. Kerangka konseptual

penelitian akan digambarkan pada (gambar 3.1), dimana terjadinya

nonbiokompatibel bahan implantasi.

26

Angiogenesis

IL-10

Gambar 3.1 Kerangka konsep penelitian

Keterangan :

: Pengaruh implantasi scaffold : Variabel terikat

: Pengaruh kombinasi PRP dan scaffold : Variabel bebas

: Pengaruh implantasi PRP

Degradasi Scaffold

Oleh Sel Radang

Migrasi Sel

Radang

VEGF

Scaffold

(Extracelullar Matrix)

Implantasi di subkutan

tikus Rattus novergicus

PRP

(Platelete Rich Plasma)

Jumlah sel fibroblas

PDGF

Perlekatan Sel

Radang

Kolagen

Hipodermis

Kombinasi

Scaffold & PRP

27

3.2 Hipotesis Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah yang telah ada, maka hipotesis yang dapat

diajukan adalah sebagai berikut ini :

1. Implantasi scaffold, PRP dan kombinasi keduanya dapat mempengaruhi

ekspresi Interleukin-10 (IL-10) pada subkutan abdomen tikus (Rattus

norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun akut.

2. Implantasi scaffold, PRP dan kombinasi keduanya dapat mempengaruhi jumlah

sel fibroblas pada subkutan abdomen tikus (Rattus norvegicus) pada uji

biokompatibilitas respon imun akut.

28

BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat penelitian dilakukan yaitu Institut Biosains Universitas Brawijaya,

Laboratorium Histologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas

Brawijaya, Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,

Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, dan

Laboratorium Patologi Anatomi Kasima Medika RSIA Malang. Penelitian ini

dilakukan pada bulan April 2016 hingga bulan Juni 2017.

4.2 Alat dan Bahan Penelitian

4.2.1 Alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: kandang mencit

berupa kotak berukuran 44 cm x 30 cm x 12 cm yang dipisahkan dengan kawat

strimin, masing – masing berisi 4 ekor mencit yang diberi pakan dan minum,

sentrifuge, gunting, pinset, micro tube 1,5 mL, gelas ukur, magnetic stirer,

vortex, refrigerator, lemari es, inkubator, scalpel blade, tisu, glove dan pH meter.

4.2.2 Bahan Penelitian

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jenis Rattus

novergicus galur wistar jantan umur 3 bulan dengan berat badan 150-200 gr.

Segmentasi kulit kambing yang telah dideselularisasi dengan ukuran 1 cm x 1 cm

28

29

digunakan untuk bahan scaffold xenograft aseluler. PRP yang digunakan berasal

dari darah allogenic hewan coba (tikus Rattus norvegicus).

Gambar 4.1 Gambar hasil makroskopis dan mikroskopis

scaffold xenograft aseluler pasca deselularisasi

Keterangan: (a) Sampel kulit kambing pasca deselularisasi dengan

dimensi lebar 1 cm dan panjang 1 cm.

(b) Gambaran mikroskopik secara histologi jaringan

kulit kambing pasca deselularisasi (scaffold

xenograft aseluler) dengan perbesaran 40x lensa

objektif.

4.2.3 Bahan Kimia

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah penicillin, streptomycin,

akuades, NaCl Fisiologis, 0,1% SDS, 1% EDTA, PBS, PRP, formaldehyde 10%,

larutan etanol, xylol, parafin, gelatin coated slide, H2O2 0,3%, Bio Care kit

(terdiri atas blocking solution, antibodi sekunder polyvalent, HRP, substrat,

DAB), antibodi primer anti mouse IL-10, dan Hematoxylin-Eosin.

1x1 cm 40X

(a) (b)

30

4.3 Tahapan Penelitian

4.3.1 Penetapan Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini menggunakan hewan coba berupa tikus Rattus

norvegicus galur wistar jantan berumur 3 bulan dengan berat badan sekitar 150-

200 gr. Hewan coba diaklimatisasi selama tujuh hari untuk menyesuaikan dengan

kondisi di laboratorium. Hewan coba harus dalam kondisi sehat (berambut cerah,

aktivitas baik, tidak ada abnormalitas anatomis, dan nafsu makan baik) serta

mendapatkan persetujuan dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya,

serta belum pernah digunakan penelitian. Sampel berupa kulit kambing yang

berumur sekitar 1,5 tahun dan dipotong 1 cm x 1 cm.

Estimasi besar sampel dihitung berdasarkan rumus Federer

(Kusriningrum,2008) :

t (n-1) ≥ 15

3 (n-1) ≥ 15

3n-43 ≥ 15

n ≥ 18

n ≥ 18/3

n ≥ 6

Berdasarkan perhitungan di atas, maka untuk 3 macam kelompok

perlakuan diperlukan jumlah tikus minimal sebanyak 6 kali dalam setiap

kelompok, sehingga dibutuhkan 18 ekor tikus wistar sebagai hewan coba.

Keterangan :

t = jumlah kelompok perlakuan

n = jumlah ulangan yang diperlukan

31

4.3.2 Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental, yaitu kegiatan percobaan (experiment)

yang bertujuan untuk mengetahui pengaruh yang timbul sebagai akibat dari

adanya perlakuan tertentu menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) post

test control design. Kelompok penelitian ditunjukkan dalam (Tabel 4.1) sebagai

berikut :

Tabel 4.1 Rancangan Kelompok Penelitian

Kelompok Keterangan

K1 (Implantasi Scaffold) Tikus diimplantasi scaffold pada subkutan

K2 (Implantasi PRP) Tikus diimplantasi PRP pada subkutan

K3 (Implantasi Scaffold & PRP) Tikus diimplantasi kombinasi scaffold dan PRP

4.3.3 Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

a. Pemberian bahan implantasi scaffold xenograft aseluler

b. Pemberian bahan implantasi PRP

c. Pemberian bahan implantasi kombinasi scaffold dan PRP

2. Variabel terikat

a. Ekspresi IL-10 pada hipodermis dalam preparat histopatologi

kulit

b. Jumlah sel fibroblast hipodermis dalam preparat histopatologi

kulit

32

3. Variabel kontrol

a. Homogenitas tikus (jenis kelamin jantan, berat badan 150-200

gram, umur 3 bulan), kandang (panjang 44 cm, lebar 30 cm,

dan tinggi 12 cm didalamnya dibagi menjadi 4 bagian yang

isekat dengan kawat, sekam kayu) dan pakan (pellet diberikan

setiap dua hari sekali).

Adapun tahapan penelitian yang dilakukan antara lain :

1. Persiapan (Pembagian Kelompok dan aklimatisasi hewan coba)

2. Preparasi kulit kambing

3. Deselularisasi kulit kambing

4. Pembuatan PRP

5. Uji Biokompatibilitas secara in vivo (Implantasi Subkutan Tikus)

6. Nekropsi Tikus Paska Implantasi

7. Pembuatan Preparat Histopatologi

8. Pewarnaan Immunohistokimia (IHK) IL-10 dan Hematoxylen

Eosin

9. Analisa data

4.4 Prosedur Kerja

4.4.1 Persiapan Hewan Coba

Tikus yang digunakan untuk penelitian diadaptasi atau aklimatisasi

terhadap lingkungan selama 7 hari. Tikus ditempatkan pada bak plastik

berukuran 44 cm x30 cm x 12 cm yang dilengkapi penutup kawat, lantai kandang

33

yang mudah dibersihkan, berlokasi pada tempat yang bebas dari suara tidak

nyaman dan terjaga dari polutan. Hewan coba harus memiliki kondisi sehat

(berambut cerah, aktivitas baik, tidak ada abnormalitas anatomis, dan nafsu

makan baik), lulus proses sertifikasi layak etik penelitian oleh komisi etik

Universitas Brawijaya, dan belum pernah digunakan penelitian. Pemberian pakan

tikus berupa pelet yang sudah disediakan di Laboratorium Biosains, Universitas

Brawijaya.

4.4.2 Preparasi dan Koleksi Sampel

Segmen kulit bagian paha dari kambing jantan berumur sekitar 1,5 tahun

yag didapat dari rumah potong kambing milik bapak Cholik dengan alamat Jalan

Pesantren gang 2 Sanan Watugede Singosari- Malang. Kulit kambing

disegmentasi dengan dimensi sampel 1 cm x 1 cm dengan perlakuan proses

deselularisasi guna menjadi kulit acellular.

4.4.3 Perlakuan Deselularisasi

1. Kulit kambing segar diambil dan dibawa ke laboratorium dalam 0,1% Pen-

Strep dalam NS agar terhindar dari kontaminasi. Kulit kambing dipotong

menjadi segmen kulit. Total segmen yang dibutuhkan sebanyak 12, tetapi

dilebihkan untuk pembuatan preparat histopatologi guna pemeriksaan ECM

pasca deselularisasi. Segmen kulit diberi perlakuan teknik deselularisasi

berdasarkan metode Wang et al., (2010) dan Permata dan Susilowati, (2013),

menggunakan perendaman dalam larutan 1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS),

1% Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA), dan 0,1% Pen-Strep dalam

34

PBS pH 7,4 selama 22 hari. Larutan tersebut diganti setiap tiga hari sekali.

Sampel post deselularisasi dapat disimpan dan direndam dalam larutan PBS

pH 7,4 dan Pen-Strep 0,1% di pot sampel pada suhu -20oC.

4.4.4 Pembuatan PRP

Penyiapan PRP dilakukan menggunakan metode Buffy Coat.Langkah

pertama adalah pengambilan darah tikus dilakukan melalui vena retroorbita

menggunakan hematokrit dan intracardia meggunakan spuit 3 cc. Kemudian

darah ditampung ke dalam tube Natrium Citrate-containing dan dihomogenkan

dengan antikoagulan. Tabung lalu disentrifuge pada suhu 4°C dengan kecepatan

1000G selama 10 menit. Setelah itu pindahkan plasma dan buffy coat serta

sedikit lapisan teratas eritrosit ke tabung ependorf lain. Kemudian disentrifuge

kembali pada suhu 4°C dengan kecepatan 2100G selama 10 menit. Terakhir

pindahkan supernatan ke tabung lain dan simpan pada suhu 4°C. Supernatan

inilah bagian yang kaya akan platelet atau PRP.

Gambar 4.2 Gambaran platelet rich plasma allogenic yang akan digunakan

35

4.4.5 Implantasi Bahan Implan pada Hewan Coba (In Vivo)

Gambar 4.3 Gambaran metode implantasi bahan implan

Keterangan: (a) Implantasi scaffold xenograft aseluler pada subkutan abdomen

tikus (Kelompok 1)

(b) Implantasi Platelet Rich Plasma (PRP) pada subkutan abdomen

tikus (Kelompok 2)

(c) Implantasi kombinasi scaffold PRP pada subkutan abdomen

tikus (Kelompok 3)

Sebanyak 18 ekor tikus jantan umur 3 bulan terlebih dahulu ditimbang dan

dianestesi menggunakan ketamin-xylazine 100 mg/kg BB dengan xylazine 5

mg/kg BB (Plumb, 2008). Pada daerah abdomen diinsisi dari kulit hingga linea

alba. Sebelum ditutup terlebih dahulu dalam rongga abdomen disemprot dengan

larutan PBS Pen-Strep 0,1% agar organ terhidrasi dan mencegah infeksi.

Aplikasi variable pada kelompok 2, 3 dan 4. Pada linea alba dijahit menggunakan

benang chromic 3.0 dengan teknik simple interrupted. Sampel tiap kelompok

diimplatasikan ke subkutan tikus. Kemudian kulit ditutup dengan jahitan benang

a b

c

36

plain cat gut 3.0 dengan teknik simple interrupted dilanjutkan dengan bandage

menggunakan kasa dan plester. Treatment post operasi pada tikus adalah dengan

pemberian antibiotik amoxicillin 500 mg yang dilarutkan dalam 500 ml air secara

add libitum. Tikus dieuthanasia setelah 2 minggu dan jaringan kulit sekitar

implantasi dikoleksi lalu direndam dalam formaldehyde 10%.

4.4.6 Pemeliharaan Pasca Implantasi dan Nekropsi Tikus

Tikus paska implantasi dan perawatan selama 2 minggu kemudian

dieuthanasi dengan cara dislokasi leher. Jaringan kulit sekitar implantasi

dikoleksi dan dimasukkan dalam larutan formaldehyde 10%.

4.4.7 Pembuatan Preparat Histopatologi Metode Parafin

Pembuatan preparat histopatologi dengan metode parafin dilakukan

menurut Junquiera dan Carneiro (2007). Jaringan kulit difiksasi dengan PFA

10% selama 18-24 jam. Tujuan dilakukan fiksasi adalah untuk mempertahankan

susunan jaringan kulit agar tidak berubah oleh proses biokimia karena enzim atau

pembusukan oleh bakteri. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan etanol

bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 95%. Proses dehidrasi bertujuan untuk

mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang telah difiksasi

sehingga jaringan dapat diisi dengan parafin atau zat lain yang digunakan untuk

blok preparat. Tahap selanjutnya adalah clearing.Jaringan dimasukan dalam

larutan alkohol xylol selama 1 jam berfungsi untuk mengeluarkan alkohol dari

jaringan dan menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan

parafin. Tahap berikutnya adalah proses impegnasi yang dilakukan dalam parafin

37

cair dan embedding ke dalam blok. Pembenaman (impregnasi) adalah proses

yang berfungsi mengeluarkan cairan pembening (clearing agent) dari jaringan

kemudian diganti dengan parafin. Dalam tahap ini jaringan harus benar-benar

bebas dari clearing agent karena sisa cairan tersebut dapat mengkristal dan ketika

dipotong dengan mikrotom akan mengakibatkan jaringan menjadi mudah robek.

Selanjutnya proses blocking, yaitu pembuatan blok preparat agar dapat dipotong

dengan mikrotom.

Jaringan pada blok parafin dipotong dengan microtome setebal 5 mikron.

Hasil potongan lalu dipindahkan ke dalam air 38°-40°C menggunakan kuas yang

bertujuan untuk membuka lipatan dan meluruskan kerutan halus pada sampel

organ. Potongan yang sudah rata kemudian diambil dan diletakkan pada object

glass, kemudian dikeringan di atas hot plate yang bersuhu 38°-40°C.

Penyimpanan dilakukan di dalam inkubator dengan suhu 38° - 40°C dan siap

dilakukan pewarnaan Hematoxilin-Eosin (HE).

4.4.8 Pewarnaan Immunohistokimia (IHK) IL-10

Potongan jaringan kulit tiap kelompok kemudian diwarnai IHK (Star Trek

Universal Detection, Biocare, Canada). Slide diproses deparafinisasi, rehidrasi,

dicucidengan PBS lalu diinkubasi dengan H2O2 0,3% 5 menit lalu dicuci dengan

PBS. Selanjutnya dilakukan blocking background dengan casein (Sniper/protein

blocker) selama 15 menit suhu kamar, lalu diinkubasi dengan antibodi primer.

Slide pertama akan diinkubasi dengan antibodi primer IL-10. Potongan blok

jaringan jantung diwarnai IHC sebagai control positif. Waktu inkubasi antibodi

38

primer adalah semalaman pada suhu 40C. Slide kemudian dicuci dengan PBS,

lalu diinkubasi dengan antibody sekunder dengan Trekkie Universal Link

(Biocare) selama 20 menit pada suhu kamar. Slide dicuci lalu diinkubasi dengan

Trek-Avidin HRP (Biocare) selama 10 menit, lalu diinkubasi dengan Betazoid

DAB chromogen solution (Biocare) selama 3-5 menit hingga menunjukkan

warna cokelat yang berarti positif. Slide kemudian dicelupkan dalam

hematoxylin sebagai counterstaining, kemudian dilakukan proses rehidrasi,

clearing, dan mounting.

Hasil pewarnaan kemudian diamati di mikroskop dan dilihat ada tidaknya

reaksi positif. Slide kemudian diambil foto sebanyak 5 bidang pandang dengan

perbesaran obyektif 40x, dan dihitung jumlah sel yang masing-masing

mengekspresikan IL-10. Perhitungan ekspresi IL-10 dengan menggunakan

Imunorasio (Penkowa, et al.,2003).

4.4.8 Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin (HE)

Pewarnaan HE dilakukan dengan menggunakan zat pewarna Hematoxylin-

Eosin untuk memberi warna biru pada inti sel dan eosin merupakan

counterstaining Hematoxylin digunakan untuk mewarnai sitoplasma dan jaringan

penyambung.Eosinakan memberikan warna merah muda. Proses pewaraan

diawali dengan proses deparafinasi menggunakan xylol dilanjutkan dengan

proses rehidrasi dengan memasukkan preparat dalam alkohol bertingkat.

Konsentrasi alkohol yang digunakan 95%, 90%, 80%, 70% secara berurutan,

masing-masing selama 3 menit bertujuan untuk mengisi cairan ke dalam jaringan

39

agar zat pewarna dapat masuk ke dalam jaringan. Selajutnya dicuci dengan air

mengalir dan dilanjutkan denga merandam ke dalam aquades selam 5

menit.Sediaan diwarnai dengan pewarna Hematoxylin selama 1 menit, kemudian

dicuci degan air megalir selama 10 menit dan aquades selama 5

menit.Selanjutnya dilakukan pewarnaan menggunakan Eosin selama 5 menit dan

dicuci dengan air mengalir selama 10 menit dan aquades selama 5 menit.

Kemudian dilakukan dehidrasi dengan alkohol 70%, 80%, 90% dan 95% masing-

masing selama beberapa detik dan dilanjutkan dengan alkohol absolut I, II,, dan

III masing-masing 2 menit yang bertujuan untuk menghilangkan air di dalam

jaringan. Selanjutnya dilakukan proses clearing dengan xylol I, II, dan III selama

3 menit.Langkah terakhir adalah mounting menggunakan Entellan serta ditutup

menggunakan cover glas.

Hasil pewarnaan kemudian diamati di mikroskop. Slide kemudian diambil

foto sebanyak 5 bidang pandang dengan perbesaran obyektif 40x, dan dihitung

jumlah sel menggunakan aplikasi Image Raster guna memudahkan.

4.5 Analisis Data

Data kuantitafif berupa ekspresikan IL-10 dan jumlah sel fibroblast dianalisis

menggunakan statistik dengan metode one-way ANOVA dan diteruskan dengan uji

BNJ (Tukey Test) dengan nilai signifikan kedua parameter yang digunakan adalah

p<0,05 dengan membandingkan antar kelompok menggunakan perangkat lunak IBM

SPSS Statistics ver.22.

40

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambaran hasil mikroskopis scaffold xenograft aseluler asal kulit kambing

sebelum implantasi sangat diperlukan sebagai konfirmasi terhadap perubahan

jaringan kulit pasca deselularisasi. Gambar 5.1 menunjukkan perbandingan

gambaran mikroskopis kulit kambing yang telah dideselularisasi yaitu scaffold

xenograft aseluler dengan kulit kambing tanpa perlakuan deselularisasi.

Gambar 5.1 Gambaran mikroskopis kulit kambing yang dideselularisasi

(scaffold) dan tanpa deselularisasi (perbesaran 100x dan 400x)

Keterangan : (a) dan (b) Gambaran mikroskopik jaringan kulit kambing dengan

perlakuan deselularisasi (scaffold), tanda panah menunjukkan

ekstraselular matrik atau jaringan aseluler

(c) dan (d) Gambaran jaringan kulit kambing tanpa perlakuan

deselularisasi (kulit segar), tanda panah menunjukkan sel-sel

yang masih memiliki inti

(a) (b)

(c) (d)

100x 400x

100x 400x

41

Gambar (a) dan (b) ditandai dengan tidak adanya inti sel, hal ini

dikarenakan dalam teknik deselularisasi terdapat larutan SDS yang berfungsi

untuk menghancurkan sel-sel pada jaringan kulit. Hal ini dapat diperjelas dengan

penelitian Cissel (2014) yaitu teknik deselularisasi bertujuan melarutkan sel tanpa

menghilangkan struktur dari ECM. Gambar (c) dan (d) menunjukkan kulit tanpa

perlakuan deselularisasi yang ditandai dengan terlihatnya inti sel dengan terlihat

inti sel berwarna ungu. Perlakuan ini sesuai dengan pernyataan Crapo et al., 2011,

proses deselularisasi secara kimiawi menggunakan bahan kimia untuk

menghilangkan sel dalam jaringan. Bahan yang digunakan yaitu SDS dan EDTA.

SDS terdiri atas bahan detergen ionic yang mampu melisiskan sel dengan

merusak struktur membran sel maupun membrane nukleus dan berfungsi juga

untuk mendenaturasi protein. Sedangkan EDTA berfungsi untuk mengikat ion

sehingga ikatan sel dengan ECM akan rusak. Selain scaffold bahan implan

menggunakan PRP.

Sebelum penggunaan PRP sebagai bahan impalan, PRP diaktivasi terlebih

dahulu menggunakan Calcium Chloride (CaCl2) 2%. Gambaran makroskopik

PRP yang telah diaktivasi menggunakan CaCl2 (gambar 5.2).

Gambar 5.2 Gambaran makroskopik sampel gel PRP yang telah diaktivasi

menggunakan kalsium klorida (CaCl2)

42

Gambaran makroskopik PRP yang telah diaktivasi menggunakan CaCl2

adalah terbentuknya gel seperti yang ditunjukkan pada (gambar 5.2). Gel PRP

siap digunakan sebagai bahan impantasi independen atau kombinasi. Aktivasi

PRP sebelum pengaplikasian adalah parameter lain yang memerlukan

pembahasan lebih lanjut. Platelet rich plasma yang dapat diaktivasi oleh CaCl2

2% sesuai dengan penelitian Rodriguez dkk., 2014. Untuk mencapai efek yang

dinginkan, PRP dapat diaktivasi secara eksogen oleh thrombin, kalsium klorida

(CaCl2), atau trauma mekanis. Konsentrasi CaCl2 2% mampu digunakan sebagai

agen untuk degranulasi platelet dimana akan menginduksi growth factor dan

protrombin. Setelah aktivasi, jaringan tertramolekular platelet akan meningkatkan

growth factor (Dohan, 2009). Selain itu protrombin yang akan diubah menjadi

enzim trombin yang selanjutnya diubah menjadi fibrin-fibrinogen yang akan

menimbulkan terjadinya bentukan gel/clothing (Dohan, 2009).

5.1 Ekspresi Interleukin-10 pada Jaringan Subkutan Abdomen Tikus

Rattus norvegicus

Ekspresi IL-10 disekitar area implantasi dapat diintepretasikan dengan

pewarnaan IHK. Karakteristik pewarnaan IHK menggunakan bahan pewarna

berupa DAB (3,3’-diaminobenzidine) akan terlihat berwarna cokelat pada

preparat. Preparat yang terwarnai cokelat akan dihitung persentase (%) warna

menggunakan Imunoratio.

Hasil analisa uji ANOVA menunjukkan bahwa terdapat perbedaan

rataan ekspresi IL-10 antar perlakuan (Tabel. 5.1). Kelompok implantasi

scaffold memiliki nilai rata-rata yang relatif sama dengan kelompok perlakuan

43

implantasi PRP. Sedangkan, kelompok implantasi kombinasi scaffold dan PRP

memiliki nilai rata-rata paling rendah dibandingkan kelompok perlakuan

implantasi lain. Hasil tersebut menunjukkan bahwa implantasi kombinasi

scaffold dan PRP mampu menurunkan ekspresi IL-10. Menurut Islam (2007),

penurunan ekspresi interleukin-10 (IL-10) atau disebut juga Cytokine

Shynthesis Inhibitory Factor (CSIF) berhubungan dengan respon inflamasi

terhadap bahan implan. Peran IL-10 adalah menghambat TNF-α, IL-1,

kemokin, dan IL-12 yang diproduksi makrofag; kedua, berfungsi paling banyak

menghambat berbagai fungsi makrofag teraktivasi melalui aktivitas sel T dan

merupakan umpan balik negatif. Pemberian PRP yang mengandung growth

factor seperti VEGF akan menstimulasi neovaskuler serta proses angiogenesis

(Gurtner, 2007) sehingga scaffold sebagai template akan menyimpan growth

factor lebih lama dan respon inflamasi akan terfasilitasi oleh adanya

angiogenesis yang berlebih pada scaffold. Semakin tinggi kondisi inflamasi

pada daerah impantasi maka sitokin antiinflamasi seperti ekspresi IL-10 tidak

mampu menghambat prolifersi sitokin pro inflamasi.

Tabel 5.1 Rata-rata ekspresi IL-10 hasil pewarnaan imunohistokimia

Kelompok Perlakuan

Ekspresi Interleukin-10

(IL-10)

Mean (%) ± SD

Kelompok 1 (K1) Implantasi scaffold 66.96 ± 0.07 b

Kelompok 2 (K2) Implantasi PRP 60.00 ± 0.07 b

Kelompok 3 (K3) Implantasi kombinasi

scaffold dan PRP 43.77 ± 0.03 a

Keterangan: Perbedaan yang signifikan (p<0.05) antar kelompok perlakuan implantasi

44

Kelompok implantasi scaffold menunjukkan ekspresi IL-10 yang

paling tinggi ditandai dengan tingginya ekspresi IL-10 disekitar area implantasi

(Gambar 5.3).

Gambar 5.3 Gambar mikroskopis IHK kelompok 1 tikus implantasi scaffold

(perbesaran 400x) Keterangan: Tanda panah menunjukkan sel yang terekspresi IL-10

Pewarnaan imunohistokimia area implantasi scaffold memperlihatkan

hasil jaringan yang terekspresi IL-10 berwarna cokelat sangat tinggi, hal ini

dikarenakan pada perlakuan deselularisasi akan menghilangkan dan melarutkan

xenoantigen asal kulit xenograft dan hanya menyisakan ECM saja. Hal ini

sesuai dengan pernyataan Crapo et al., 2011, proses deselularisasi secara

kimiawi menggunakan bahan kimia untuk menghilangkan sel dalam jaringan.

Gambaran mikroksopis histopatologi dengan pewarnaan IHK jaringan

subkutan kulit pasca implantasi di subkutan tikus Rattus norvegicus yang

menunjukkan ekspresi IL-10 yang sangat tinggi (Gambar 5.3).

45

Gambar 5.3 merupakan gambaran IHK subkutan tikus Rattus

norvegicus pasca implantasi scaffold yang menunjukkan peradangan sangat

sedikit ditandai dengan paling tingginya ekspresi IL-10 disekitar area

implantasi ditandai dengan warna cokelat yang terbentuk paling banyak. Proses

deselularisasi yang dilakukan berhasil menghilangkan protein xenoantigen

sehingga dapat diterima oleh tubuh resipien.

Bahan yang digunakan untuk deselularisasi yaitu SDS dan EDTA. SDS

terdiri atas bahan detergen ionik yang mampu melisiskan sel dengan merusak

struktur membran sel maupun membrane nukleus dan berfungsi juga untuk

mendenaturasi protein. Sedangkan EDTA berfungsi untuk mengikat ion

sehingga ikatan sel dengan ECM akan rusak. Sehingga bahan implantasi tidak

akan menimbulkan respon imun yang negatif.

Kelompok implantasi PRP saja menunjukkan ekspresi IL-10 yang

cukup tinggi ditandai dengan tingginya ekspresi IL-10 disekitar area implantasi

(Tabel 5.1). Kelompok implantasi PRP memiliki nilai rata-rata yang relatif

sama dengan kelompok perlakuan implantasi scaffold. Pewarnaan

imunohistokimia area implantasi scaffold terlihat hasil jaringan yang

terekspresi IL-10 sama-sama menunjukkan warna cokelat yang cukup tinggi

(Gambar 5.4), hal ini menunjukkan hal yang positif yaitu tingginya sitokin

antiinflamasi (IL-10) dapat diartikan bahan implan menunjukkan respon imun

yang baik.

46

Gambar 5.4 Gambar mikroskopis IHK kelompok 2 tikus implantasi PRP

(perbesaran 400x) Keterangan: Tanda panah menunjukkan sel yang terekspresi IL-10

Sitokin dasar yang teridentifikasi dalam platelet berperan penting dalam

proliferasi sel, kemotaksis, diferensiasi sel, regenerasi, dan angiogenesis

(Yudha, 2013). Dibutuhkannya faktor pertumbuhan pada kondisi regenerasi

jaringan mencetuskan alternatif penggunaan PRP yang kaya akan kandungan

faktor pertumbuhannya, sebagai substitusi untuk merangsang proses regenerasi

jaringan. Berdasarkan penelitian Creeper dan Ivanovski (2012), PRP diusulkan

sebagai metode untuk memberikan faktor pertumbuhan guna untuk

meningkatkan regenerasi, unggul dalam hal mendorong migrasi sel-sel dan

tidak ada perbedaan yang berarti antara penggunaan PRP autologue atau

allogenic pada fungsi sel, keduanya aman digunakan.

Kelompok implantasi kombinasi scaffold dan PRP ditandai dengan

rendahnya ekspresi IL-10 disekitar area implantasi (Tabel 5.1). Pewarnaan

imunohistokimia area implantasi scaffold dan PRP menunjukkan hasil sel yang

47

terekspresi IL-10 yaitu berwarna cokelat rendah dan lebih sedikit dibandingkan

dengan kelompok perlakuan lain (Gambar 5.5).

Gambar 5.5 Gambar mikroskopis IHK kelompok 3 tikus implantasi scaffold

dan PRP (perbesaran 400x) Keterangan: Tanda panah menunjukkan sel yang terekspresi IL-10

Perlakuan implantasi kombinasi scaffold dan PRP menunjukkan

penurunan ekspresi IL-10 jika dibandingkan dengan antar kelompok perlakuan

implantasi. Penurunan ekspresi IL-10 pada kelompok 3 disebabkan karena

pada implantasi kombinasi scaffold dan PRP menunjukkan tingginya kondisi

inflamasi pada daerah implan. Tingginya respon inflamasi yang ditandai

dengan sedikitnya ekspresi sitokin antiinflamasi seperti IL-10 karena

disebabkan banyaknya sitokin pemicu peradangan pada kelompok implantasi

kombinasi scaffold dan PRP. Menurut Wahyuniati (2015), IL-10 bekerja untuk

menginhibisi dari kerja sel radang, dan hal ini akan menghambat sekresi

sitokin pro inflamasi TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 dan G-CSF. Interleukin-10 juga

48

menghambat presentasi antigen oleh sel radang (monosit/makrofag). IL-10

menghambat proliferasi dan juga sintesis sitokin sel T CD4+, termasuk

produksi IL-2 dan IFN-γ oleh Th 1 dan IL-4 dan IL-5 oleh Th2. Sejalan dengan

pendapat Cotran et al (1999), terjadinya proses regenerasi jaringan dan

diterimanya bahan implantasi tidak terlepas dari peran faktor pertumbuhan dan

sitokin, salah satunya yaitu Interleukin-10 (IL-10). Menurut Bardram (1995),

IL-10 adalah salah satu sitokin anti inflamasi yang berfungsi menghambat

produksi beberapa jenis sitokin lain (TNFα, IL-1, chemokine, dan IL-12) selain

itu juga menghambat fungsi makrofag dalam membantu aktivasi sel T. Hasil

akhir dari aktivasi IL-10 adalah hambatan reaksi imun non spesifik maupun

spesifik yang diperantarai oleh sel T.

Terjadinya proses regenerasi jaringan dan diterimanya bahan implantasi

tidak terlepas dari peran faktor pertumbuhan dan sitokin, salah satunya yaitu

Interleukin-10 (IL-10) (Cotran et al., 1999). Ekspresi IL-10 sebagai sitokin

antiinflamasi yang rendah mengakibatkan sitokin proinflamasi (IL-1β, IL-6,

dan TNF-α) meningkat dan tingginya reaksi inflamasi dalam tubuh resipien.

Penyebab rendahnya IL-10 dan meningkatnya sitokin proinflamasi dikarenakan

adanya VEGF yang memicu proses angiogenesis. Melalui proses angiogenesis,

stimulasi neovaskuler akan memanggil growth factor seperti VEGF untuk lebih

bayak dan migrasinya sel radang (Gurtner, 2007). Vaskularisasi yang

meningkat memungkinkan meningkatnya sel radang (makrofag dan sel-sel

radang lain) serta sitokin proinflamasi seperti IL-1β, IL-6, dan TNF-α sehingga

49

ekspresi IL-10 sebagai sitokin antiinflamasi yang seharusnya menghambat

sitokin proinflamasi akan menurun..

Respon inflamasi yang tinggi diakibatkan oleh adanya ketidakcocokan

bahan implantasi dengan resipien dan PRP turut yang memfasilitasi sel-sel

radang sehingga reaksi inflamasi akan meningkat. Menurut Salter (1995),

kolagen type 1 merupakan komponen penyusun kolagen utama kulit, tendon,

pembuluh darah, organ, dan tulang. Perbedaan susunan polipeptida pada

penyusun kolagen type I antara kulit kambing dengan jaringan subkutan kulit

tikus dapat menyebabkan terjadinya efek respon imun terhadap bahan implan.

Namun tidak sepenuhnya susunan polipeptida pada kolegen type I tersebut

berbeda, terdapat kesamaan yang dihitung berdasarkan tingkat homogenitas

protein (Tabel 5.2).

Tabel 5.2 Persentase Homogenitas Protein Kolagen tipe I

Tipe Hewan Accession number Similarity

Collagen, type I

[Rattus

norvegicus]

Rattus

norvegicus NP-445756.1

92 %

Collagen type I

[Capra hircus] Capra hircus XP-017920382.1

Tingkat homogenitas protein kolagen type I antara kambing (Capra

hircus) dibandingkan dengan tikus (Rattus norvegicus) dapat dilihat

menggunakan aplikasi Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Bank

Protein Data (Protein Data Base NCBI) (Tabel 5.2). Kolagen Type I antara

kambing (Capra hircus) dibandingkan dengan tikus (Rattus norvegicus)

berdasarkan (Tabel 5.2) memiliki homogenitas protein penyusun sebanyak

50

92% dan perbedaan sebanyak 8%. Pada implantasi scaffold saja 8% perbedaan

protein penyusun kolagen dapat diatasi dengan respon inflamasi yang tidak

terlalu berlebih. Namun pada implantasi kombinasi scaffold dan PRP, PRP

akan memfasilitasi sel-sel radang sehingga inflamasi meningkat.Adanya

perbedaan protein penyusun kolagen dan stimulasi vaskularisasi akibat

tambahan PRP menimbulkan migrasi makrofag dan sel-sel radang lainnya yang

berasal dari pembuluh-pembuluh ke dalam jaringan subkutan.

Makrofag yang aktif akan menghasilkan sitokin proinflamasi dan

menurunnya sitokin antiinflamasi. Makrofag aktif akan menghancurkan

protein-protein ECM xenograft yang berbeda susunan proteinnya. Mekanisme

degradasi struktur ECM disebut dengan Biodegradable. Biodegradable

umumnya berlangsung lama atau kronis. Menurut Badylack (2008), jaringan

Graft secara natural akan melalui proses degradasi, ketika adanya

ketidakcocokkan protein penyandi jaringan implan dengan jaringan resipien.

Sekitar 60% jaringan graft akan didegradasi selama 4 minggu pasca implantasi.

Degradasi secara keseluruhan biasanya akan berlangsung selama 3 bulan

(kronis). Produk degradasi akan diserap oleh tubuh untuk dirubah menjadi

senyawa lainnya. Sisa degradasi yang tidak dipergunakan oleh tubuh akan

sekresikan melalui urin.

Akibat vaskularisasi yang berlebih, respon makrofag dan sel radang

lainnya untuk mendegradasi scaffold lebih cepat karena scaffold dianggap

benda yang asing dan harus segera dihilangkan dari tubuh resipien sehingga

kolagen pada subkutan tikus Rattus norvegicus menurun. Keadaan inilah yang

51

menjadikan pemberian perlakuan kombinasi scaffold xenograft aseluler dan

PRP menimbulkan reaksi inflamasi tinggi dan penolakan bahan implan

tersebut.

5.2 Jumlah Sel Fibroblas pada Jaringan Subkutan Abdomen Tikus

Rattus norvegicus

Penilaian terhadap jumlah sel fibroblas pada daerah implan subkutan

kulit tikus Rattus norvegicus bagian abdomen diamati dengan menggunakan

metode pewarnaan HE. Menurut Fawcett (2002), fibroblas dapat dilihat dengan

jelas pada pengecatan hematoxylen eosin. Kriteria sel fibroblas menurut

Falanga (2004), memiliki sitoplasma berbentuk elips dan memiliki satu inti

atau lebih dari satu inti berwarna ungu. Menurut Brown (2015), pewarnaan HE

digunakan untuk mewarnai jaringan. Prinsip dari pewarnaan HE yaitu inti yang

bersifat asam akan menarik zat/larutan yang bersifat basa sehingga akan

berwarna biru. Sitoplasma bersifat basa akan menarik zat/larutan yang bersifat

asam sehingga berwarna merah. Hasil penelitian berdasarkan uji ANOVA

(Tabel 5.3) menyatakan bahwa terdapat perbedaan rata-rata antar perlakuan.

Tabel 5.3 Rata-rata jumlah sel fibroblas hasil pewarnaan Hematoxylen-Eosin

Kelompok Perlakuan

Jumlah Sel Fibroblas

Rata-rata (sel/bidang

pandang) ± SD

Kelompok 1(K1) Implantasi scaffold 37.70 ± 0.64b

Kelompok 2(K2) Implantasi PRP 17.78 ± 1.02a

Kelompok 3(K3) Implantasi kombinasi

scaffold dan PRP 41.23 ± 0.73c

Keterangan: Perbedaan yang signifikan (p<0.05) antar kelompok perlakuan implantasi

52

Kelompok implantasi kombinasi scaffold dan PRP memiliki nilai rata-

rata paling tinggi dibandingkan kelompok perlakuan implantasi lain. Kelompok

implantasi scaffold memiliki nilai rata-rata lebih rendah dibandingkan dengan

implantasi kombinasi scaffold dan PRP. Sedangkan implantasi PRP memiliki

rata-rata paling rendah dibandingkan kelompok perlakuan implantasi lain.

Adanya proliferasi fibroblas menandakan adanya degradasi scaffold. Scaffold

yang terdegradasi akan diganti oleh sel-sel fibroblas. Menurut Ratanavaraporn

et al., (2006), kecepatan degradasi scaffold yang ideal yaitu sama dengan

kecepatan pembentukan jaringan. Degradasi scaffold juga berperan sebagai

kontrol pelepasan faktor pertumbuhan selama proses penyembuhan

berlangsung.

Gambaran histopatologi jaringan subkutan kulit pasca implantasi

scaffold xenograft menggunakan metode pewarnaan HE (Gambar 5.6).

Gambar 5.6 Gambar histopatologi pewarnaan HE kelompok 1 tikus

implantasi scaffold (perbesaran 400x)

Keterangan: ( ) sel fibroblas, ( ) sel radang

53

Gambar (Gambar 5.6) merupakan gambaran histopatologi jaringan

subkutan kulit pasca implantasi scaffold di subkutan tikus Rattus norvegicus

yang menunjukkan jumlah sel fibroblas yang cukup tinggi pada kelompok

implantasi scaffold didukung oleh proses penyembuhan luka dimana fase

proliferasi berlangsung dan terjadi regenerasi jaringan dan degradasinya

scaffold biomaterial. Menurut Kiernan (2008), hal ini sejalan yaitu fibroblas

terakumulasi di daerah luka melalui angiogenesis yang merupakan sala satu

faktor regenerasi jaringan. Degradasi scaffold yang akan terjadi sejalan dengan

pembentukan jaringan. Menurut perubahan karakteristik scaffold, proses

degradasi scaffold melewati tiga tahapan yaitu tahap I, tahap II, dan tahap III.

Tahap I terbagi menjadi dua sub-tahap yaitu tahap I-1 dan I-2. Tahap I-1

ditandai dengan peningkatan sifat mekanis dan menurunnya dimensi porus

scaffold dengan berat perancah yang konstan, pada tahap I-2 semua bagian

kecuali berat molekut tidak terjadi perubahan yang signifikan. Tahap II

ditandai dengan meluasnya area molecular weight distribution dan penurunan

drastis mechanical properties dengan berat dan dimensi scaffold yang konstan.

Tahap III tergambar jelas dengan hilangnya berat molekul, penurunan dimensi

dan akhirnya terjadi kerusakan pada keseluruhan scaffold. Scaffold berpori

memiliki kecepatan degradasi yang lebih lambat dibandingkan dengan scaffold

berstruktur padat (Wu dan Ding, 2004).

Jumlah rataan proliferasi sel fibroblas pada kelompok 2 yang cukup

tinggi namun tidak terlalu tinggi bila dibandingkan dengan kelompok 3

dikarenakan bahan implan scaffold akan bekerjasama hanya dengan growth

54

factor yang digunakan sebagai agen pemicu proliferasi sel fibroblas berasal

dari individu itu sendiri (autologue), berbeda dengan kelompok 3 dimana

scaffold sebagai template growth factor yang dikombinasikan dengan PRP

sebagai sumber growth factor.

Kelompok implantasi PRP menunjukkan rataan jumlah sel fibroblas

yang paling rendah dibandingkan dengan kelompok perlakuan implantasi lain

(Tabel 5.1). Hasil penelitian menunjukkan jumlah sel fibroblas pada

kelompok implantasi PRP adalah yang sangat rendah. Berikut merupakan

gambaran histopatologi jaringan subkutan kulit pasca implantasi PRP di

jaringan subkutan abdomen tikus Rattus norvegicus (Gambar 5.7). Terlihat

bahwa jumlah sel fibroblas paling sedikit bila dibandingkan dengan kelompok

implantasi lain.

Gambar 5.7 Gambar histopatologi pewarnaan HE kelompok 1 tikus

implantasi PRP (perbesaran 400x)

Keterangan: ( ) sel fibroblas, ( ) sel radang

55

Gambar 5.7 merupakan gambar mikroskopis (histopatologi)

subkutan tikus Rattus norvegicus yang diimplantasikan PRP. Gambar 5.7

menunjukkan jumlah sel fibroblas yang paling rendah, hal tersebut

dikarenakan seluruh faktor pertumbuhan (growth factor) termasuk FGF akan

dilepas secara cepat setelah aktivasi menggunakan CaCl2 sehingga tidak

meninggalkan sisa. Menurut pendapat Rodriguez et al., (2014) hal ini sejalan,

faktor pertumbuhan yang mengalami pelepasan cepat ini akan hilang sebelum

menstimulasi sel. Pelepasan masal faktor pertumbuhan, yaitu 70% pelepasan

dalam 10 menit dan hampir 100% pelepasan faktor pertumbuhan dalam 1 jam.

Jaringan subkutan abdomen tikus Rattus norvegicus terlihat sedikitnya

proliferasi sel fibroblas dan adanya sel-sel lemak yang menunjukkan ciri khas

daerah subkutan. Growth factor dibutuhkan guna menstimulasi proliferasi sel

fibroblas. Bila dibandingkan dengan kelompok 4 atau implantasi kombinasi

scaffold dan PRP, terdapat tempat (template) untuk menyimpan platelet rich

plasma sehingga growth factor dapat dilepas secara perlahan seiring dengan

degradasi scaffold.

Kelompok implantasi kombinasi scaffold dan PRP menunjukkan nilai

rataan jumlah sel fibroblas yang paling tinggi dibandingkan dengan kelompok

perlakuan implantasi lainnya (Tabel 5.1). Gambaran histopatologi jaringan

subkutan kulit pasca implantasi kombinasi scaffold dan PRP di jaringan

subkutan abdomen tikus Rattus norvegicus yang menunjukkan jumlah sel

fibroblas dapat diidentifikasi dengan metode pewarnaan HE. Hasil penelitian

menunjukkan jumlah sel fibroblas yang paling tinggi (Gambar 5.8).

56

Gambar 5.8 Gambar histopatologi pewarnaan HE kelompok 1 tikus

implantasi kombinasi scaffold dan PRP (perbesaran 400x)

Jumlah sel fibroblas pada kelompok implantasi scaffold dan PRP

(Gambar 5.8) menunjukkan jumlah yang paling tinggi diantara kelompok

perlakuan lainnya. Tabel 5.3 menunjukkan hasil pemberian implantasi

kombinasi scaffold dan PRP dapat meningkatkan jumlah sel fibroblas pada

daerah implan di jaringan subkutan tikus pasca implantasi. Pada setiap

perlakuan menunjukkan adanya perbedaan jumlah sel fibroblas.

Jumlah sel fibroblas tinggi dikarenakan PRP yang mengandung

growth factor salah satunya FGF yang akan menstimulasi proliferasi sel

fibroblas. Kalsium klorida (CaCl2) yang digunakan sebagai bahan aktivasi

dapat mengaktivasi dan membentuk bekuan PRP dengan membentuk trombin

autogenus dari protrombin yang meyebabkan terjadinya pembentukan matriks

fibrin longgar yang akan melepaskan faktor pertumbuhan lebih dari 7 hari

(Rodriguez dkk., 2014). Aplikasi PRP yang telah diaktifkan dengan CaCl2 dan

Keterangan: ( ) sel fibroblas, ( ) sel radang, ( ) pembuluh darah

57

dikombinasikan dengan scaffold akan menyimpan produk PRP dan akan

melepaskan faktor pertumbuhan secara perlahan akibat peran scaffold sebagai

template growth factor salah satunya FGF. Growth factor pada PRP akan

memberikan pengaruh lebih lama akibat adanya scaffold sebagai tempat

penyimpanan PRP. Menurut Bai et al (2013) dan Ueda et al (2007), scaffold

tidak hanya berperan sebagai framework, namun juga untuk mengisi ruang

dan mengontrol pelepasan growth factor, sehingga proses proliferasi sel

fibroblas akan lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya. Menurut

Hamilton et al., (2013), kalsium klorida memiliki efek yang signifikan dalam

penginduksian platelet tetapi tidak dijelaskan secara pasti growth factor apa

yang mengalami induksi terbaik.

Berdasarkan pembahasan ekspresi IL-10 dan jumlah sel fibroblas pada

masing-masing kelompok perlakuan implantasi, hasil penelitian kelompok 3

menunjukkan rendahnya ekspresi IL-10 pada pemeriksaan imunohistokimia dan

tingginya proliferasi sel fibroblas pada pemeriksaan histopatologi pewarnaan HE,

hal itu disebabkan inflamasi yang tinggi karena degradasi scaffold terjadi lebih

cepat akibat tingginya migrasi sel radang dan makrofag yang berasal dari

vaskularisasi baru yang terstimulasi oleh growth factor VEGF dalam PRP.

Menurut Darwin (2016), seharusnya proses aktivitas sintesis dan degradasi

kolagen dengan PRP berada dalam keseimbangan seiring kesembuhan jaringan.

Fase ini berlangsung mulai 3 minggu sampai 2 tahun. Degradasi scaffold

kelompok 3 terjadi lebih cepat, sehingga degradasi scaffold pada kondisi

kelompok 3 akan digantikan oleh sel-sel fibroblas dan penyusun jaringan ikat.

58

Kelompok 1 atau implantasi scaffold saja memiliki kelebihan antara lain

waktu degradasi scaffold yang tidak terlalu cepat, sedikit menimbulkan reaksi

inflamasi ditandai dengan tingginya sitokin antiinflamasi (IL-10) dan jumlah sel

fibroblas yang cukup tinggi. Kelompok 2 memiliki kelebihan respon inflamasi

yang rendah ditandai dengan cukup tingginya sitokin antiinflamasi (IL-10),

namun memiliki jumlah sel fibroblas yang rendah akibat waktu pelepasan growth

factor yang terlalu cepat. Kelompok 3 memiliki kekurangan respon inflamasi

yang tinggi ditandai dengan rendahnya sitokin antiinflamasi (IL-10), serta scaffold

cepat terdegradasi tidak sejalan dengan waktu regenerasi jaringan. Selain itu biaya

tambahan akibat perlakuan tambahan PRP dapat menjadi pertimbangan yang

berarti. Bahan implantasi akan menginduksi berbagai respon imun yang dilakukan

percobaan pada hewan model. Data yang diperoleh menunjukkan implan scaffold

saja memiliki efek yang baik bagi tubuh.

59

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulankan

bahwa:

1. Implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan kombinasi keduanya dapat

mempengaruhi ekspresi IL-10 di subkutan abdomen tikus (Rattus

norvegicus) pada uji biokompatibilitas respon imun akut.

2. Implantasi scaffold xenograft aseluler, PRP dan kombinasi keduanya dapat

mempengaruhi jumlah sel fibroblas pada subkutan abdomen tikus (Rattus

norvegicus) dalam uji biokompatibilitas respon imun akut.

3. Berdasarkan data yang diperoleh menunjukkan implantasi scaffold

memiliki efek yang paling baik bagi tubuh.

6.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terkait respon imun kronis pada

bahan implantasi berupa scaffold xenograft acellular dan platelet rich plasma

guna melihat apakah sitokin antiinflamasi IL-10 mampu mempertahankan bahan

implan dalam jangka waktu yang lama.

60

DAFTAR PUSTAKA

Abadi, S. 2008. Hubungan Antara Rasio Kadar TNF-α dan IL-10 Cairan Sendi

dengan Derajat Osteoartritis. [Thesis]. Ilmu Bagian dalam : Fakultas

Kedokteran Universitas Hasanuddin. Makasar.

Ai, J., N. Wang., M. Yang., Z.M. Du., Y.C. Zhang and B.F. Yang. 2005.

Development of Wistar Rat Model of Insulin Resistance. World Journal

Gastroenterology. 11(24): 3675-3679.

Alhasyimi, A.A., S. Sunarintyas., dan M.H.N.E. Soesatyo. 2015. Pengaruh

Implantasi Subkutan Logam Kobalt Kromium sebagai Bahan Alternatif

Mini Screw Orthodontics terhadap Reaksi Jaringan Kelinci Albino.

Majalah Kedokteran Gigi Indonesia. 1(1): 94-101.

Badylak, Stephen F., Gilbert, Thomas W. 2008. Immune Response to Biologic

Scaffold Materials. Seminars of Immunology. 20: 109-116.

Bai, Y, Yin G, Huang Z. 2013. Localized Delivery of Growth Factors for

Angiogenesis and Bone Formation in Tissue Engineering. Int

Immunopharmacol. 16(2): 214-223.

Bardram L, Funch-Jensen P, Kehlet H. 1995. Recovery After Laparoscopic

Colonic Surgery with Epidural Analgesia and Early Oral Nutrition and

Mobilization. Lancet Journal. 345: 763-764.

Bhat, S.V. 2002. Biomaterials. Kluwer Academic Publishers Ltd. Boston.

Brown, R.A. 2013. Extreme Tissue Engineering: Concepts and Strategies for

Tissue Fabrication. John Wiley & Sons Ltd. United Kingdom.

Browne, S dan A. Pandit. 2015. Biomaterial-mediated modification of the local

inflammatory environment. Front Bioeng Biotechnol. 3(67): 1-14.

Chan, B. P and Leong, K. W. 2008. Scaffolding in Tissue Engineering: General

Approaches and Tissue-Spesific Consideration. European Spine Journal.

17(4): 467-479.

Chikwendu, E.V and O.C. Laureta. 2013. Organ Transplantation And Its

Physiological Implications – A Review. Animal Research International.

10(3): 1752 – 1778.

Cissell, D.D., J.C Hu., L.G. Griffiths., and K.A. Athanasiou. 2014. Antigen

Removal for the Production of Biomechanically Functional, Xenogenic

Tissue Graft. Journal Biomech National Institute of Health. 47(9): 1987-

1996.

61

Cotran RS, Kumar V, Collins T. 1999. Pathology basic of disease. 6th ed.

Philadelphia WB Saunders C0. 21-201.

Crapo, P. M., T. W. Gilbert, and S.G. Badylak. 2011. An Overview of Tissue and

Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials National

Institute of Health. 32(12): 3233-3243.

Creeper, F and Ivanovski. 2012. Effect of Autologues and Allogenic Platelet Rich

Plasma on Human Ginggival Fibroblast Function. Oral Des.18(5): 494-

500.

Darwin, C. O. 2016. Gambaran Sel Darah Putih pada Respon Inflamasi Pasca

Pemasangan Implan yang Dilapisi Platelet Rich Plasma dan Tanpa

Dilapisi Platelet Rich Plasma. [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Gigi

Universitas Hasanuddin. Makasar.

David, M.M. 2000. Laboratory Animal Medicine and Science series II. Health

Sci. Coni. Edu. USA. Washington University.

Departemen of Biomedical Engineering NUS. 2017. Biomaterials or Regenerative

Medicine.http://www.bioeng.nus.edu.sg/research/Keyresearch/keysrh1.h

tml. [1 April 2017].

Ditjennak, 2016. Populasi Kambing Menurut Provinsi.

http://www.pertanian.go.id/NAK-2016fix/Pop_Kambing_Prop_2016.pdf

[4 Januari 2017].

Dohan. 2009. Classification of Platelet Concentrates: From Pure Platelet Rich

Plasma (P-PRP) to Leucocyte and Platelet Rich Fibrin (L-PRF). Trends

in Biotechnology. 158-167.

Easter, D and G. Jacobsen. 2008. Allograft vs. Xenograft: Practical Considerations

for Biologic Scaffolds. University of California. San Diego.

Falanga, V. 2004. The Cronic Wound: Impaired Healing and Solutions in the

Context Of Wound Bed Preparation. Blood cells, Molecules, and

Diseases Journals. 32(1): 88-94.

Farach-Carson, M.C. and D.D Carson. 2007. Perlecan—a multifunctional

extracellular proteoglycan scaffold. J of Glycobiology. 17(9): 897–905.

Fawcett, D. W. 2002. Buku Ajar Histology Edisi 12. Penerbit Buku Kedokteran.

EGC. Jakarta.

Frode, T.S and Y.S. Medeiros. 2008. Animal Models to Test Drugs with Potential

Antidiabetic Activity. Journal of Ethnopharmacology. 115: 173-183.

62

Gilbert, T.W., T.L. Sellaro and S.F. Badylak. 2006. Desellularization of Tissue

and Organs. Biomaterials. 27: 3675-3683.

Grace, P. A and Neil R. B. 2006. Surgery At A Glance. Edisi Ketiga. Penerbit

Erlangga.

Gurtner, G. C. 2007. Wound Healing Normal and Abnormal. In: Thorne CH,

Beasly, R. W., Aston, S. J., Gurtner, G. C., Spear, S. L. Grabb and

Smith’s plastic Surgery. 6th ed. Philadelphia: Lippincont William and

Wilkins. p:15-22.

Hakim, F. 2012. Biomaterial Mampu Luruh Alami Fe-Mn-C Diproduksi Melalui

Metalurgi Serbuk Ferromangan Canai Dingin dan Re-Sinter. [Skripsi].

Universitas Indonesia. Depok.

Hamilton, B., J. L. Tol., W. Knez, and H. Chalabi. 2013. Exercise and The

Platelet Activator Calcium Chloride Both Influence The Growth Factor

Content of PRP: Overlooked Biochemical Factors that Could Influence

PRP Treatment. Br Journal Sport Med. P:1-5.

Harding, K., R. Kirsner., D. Lee., G. Mulder., and T. Serena. 2010. International

Consensus: Acellular matrices for The Treatment of Wounds. An Expert

Working Group Review. Wounds International. London.

Hisashi, Y., K. Yamada., K. Kuwaki., Y. L. Tseng., F. J. M. F. Dor., S. L.

Houser., S. C. Robson., H. J. Schuurman., D. K. C. Cooper., D. H.

Sachs., R. B. Colvin., dan A. Shimizu. 2008. Rejection of Cardiac

Xenografts Transplanted from Alpha1,3-Galactosyltransferase Gene-

Knockout (GalT-KO) Pigs to Baboons. American Journal of

Transplantation: Official Journal of the American Society of

Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons.

8(12): 2516-2526.

Islam, A. A. 2007. Rasio TNF-α/IL-10 Serum Awal Sebagai Prediktor Luaran

pada Operasi Epidural Hematom. Maj Kedokteran Indonesia. 57(12).

101

Jacobsen, G and D. Easter. 2009. Allograft vs Xesograft-Pratical Consideration

for Biologic Scaffold. School of Medicine. University of California. San

Diego.

Jain , N.K., dan M. Gulati. 2016. Platelet-Rich Plasma: A Healing Virtuoso. Blood

Research. 5(1): 3-5.

Junqueira, Luiz C. U., J. Carneiro. 2007. Basic Histology: Text and Atlas.

McGraw-Hill.

63

Kalista, D. 2013. Pengaruh Penambahan Bovive Collagen pada Kekuatan

Biomekanis Dini dari Tendon Achilles Kelinci yang Dilakukan Tindakan

Repair Tendon. [Karya Akhir Program Pendidikan Dokter Spesialis].

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Malang.

Kanani, A., S.H. Bahrami., A.S. Kochaksaraie., H.A. Tafti., S. Rabbani., A.

Kororian., E. Erfani. 2012. Effect Of Tissue-Engineered Chitosan-

Poly(Vinyl Alcohol) Nanofibrous Scaffolds on Healing of Burn Wounds

of Rat Skin. The Institution of Engineeringand Technology. 6(4): 129–

135.

Khan, M. 2008. Role of Cytokines Immunopharmacology. Springer Science and

Business Media.

Kiernan, J. A. 2008. Histological and Histochemical Methods: Theory And

Practice. 4th edition. Bloxham Scion. UK.

Kumar, K.R., S. Xiavour, S. Latha, V. Kumar, and Sukumaran. 2014. Anti-

Human IgG-Horseradish Peroxidase Conjugate Preparation and its Use

in ELISA and Western Blotting Experiments. Journal of

Chromatography Separate Technique. 5(1): 1-20.

Liu ,Yuchun., J.K.Y. Chan, and S.H. Teoh . 2012. Review of vascularised bone

tissue-engineering strategies with a focus on co-culture system. Journal

of Tissue Engineering and Regenerative Medicine.

Ma’ruf, M.T., I. Siswomihardjo., M.H.N.E. Soesatyo., A.E. Tontowi. 2013. Uji

Biokompatibilitas Komposit Polivinil Alkohol-Hidroksiapatit Dengan

Penguat Catgut Sebagai Bahan Penyambung Patah Tulang. Jurnal

Tekno Sains. 3(1):51-65.

Marx, R. E. 2001. Platelet-Rich Plasma (PRP) : What is PRP and what is not

PRP ?. Journal of Implant Dentistry. 10: 225-228.

Mescher, A.L. 2010. Junqueira's Basic Histology Twelfth Edition. The McGraw-

Hill Companies, Inc. United States of America.

Mu, W., X. Ouyang., A. Agarwal., L. Zhang., D.A. Long., P.E. Cruz., C.A.

Roncal., O.Y. Glushakova., V.A. Chiodo., M.A. Atkinson‖., W.W.

Hauswirth., T.R. Flotte., B.R. Iturbe and R.J. Johnson. 2005. IL-10

Suppresses Chemokines, Inflammation and Fibrosis in A Model of

Chronic Renal Disease. Journal of the American Society of Nephrology

16: 3651–3660.

Nagaraju, C., U.K. Ray, and S. Vidavalur. 2017. Cost Effective Quantification of

Trace Level EDTA (Ethylene Di-amine Tetra Acetic Acid) by Titrimetry

64

in Active Pharmaceutical Ingredients. Der Chemica Sinica. 8(1):175-

183.

Penkowa, M., Keller, C., Keller, P., Jauffred, S., and Pedersen, B. K. 2003.

Immunohistochemical Detection of Interleukin 6 in Human Skeletal

Muscle Fibers Following Exercise. Journal Faseb. 17: 2166-2168.

Permata, F. S dan R. Susilowati. 2013. Karakterisasi Makroskopik, Mikrostruktur,

dan Kekuatan Mekanis Saraf Tepi Domba dan Babi Kondisi Segar dan

Pasca Deselularisai. Doctoral dissertation. Universitas Gadjah Mada.

Yogyakarta.

Pietrzark, W.S and B.L. Eppley. 2006. Platelet Rich Plasma: Biology and New

Technology. Journal of Craniofacial Surgery Warsaw. 16(6):1043-

1054.

Plumb DC. 2008. Plump’s Veterinary Drug Handbook 6th Edition. Iowa:

Blackwell Publishing

Potorac, S., M. Popa., M. Zagnat., L. Verestiuc. 2011. Porous Hydrogels Based on

Itaconic Anhydride Modified Collagen/HEMA for Skin Tissue

Engineering. Proceedings of the 3rd International Conference on E-

Health and Bioengineering - EHB 2011. 24th-26th November 2011 in

Iasim Romania.

Qiong, W., J. Bao., Y. Zhou., Y. Wang., Z. Du., Y. Shi., L. Li., and H. Bu. 2015.

Optimizing Perfusion-Decellularization Methods of Porcine Livers for

Clinical-Scale Whole-Organ Bioengineering. BioMed Research

International. 2015: 1-9.

Ratanavaraporn, J., S. Damrongsakkul, N. Sanchavanakit, T. Banaprasert, and S.

Kanokpanont. 2006. Comparison of gelatin and collagen scaffolds for

fibroblast cell culture. Journal of Metals, Materials and Minerals. 16(1):

31-36.

Rodriguez, I. A, E. A. Growney Kalaf, G. L. Bowlin, and S. A. Sell. 2014.

Platelet-Rich Plasma in Bone Regeneration: Engineering the Delivery

for Improved Clinical Efficacy. BioMed Research International. 1-15.

Sachs, David H. 1995. The Immunologic Response to Xenografts. ILAR Journal

Harvard Medical School. Boston.3(1): 16-21

Sarkar, M.R., P. Augat., S.J. Shefelbine., S. Schorlemmer., M.H. Lang., L.

Claesb., L. Kinzla., and A. Ignatius. 2006. Bone Formation in A Long

Bone Defect Model Using A Platelet-Rich Plasma-Loaded Collagen

Scaffold. Journal of Biomaterials. 27: 1817-1823.

65

Satriyo, A., E.K. Djukardi, F. Zubier. 2011. Peran Plasma Kaya Trombosit

(Platelet Rich Plasma) di Bidang Dermatologi. MDVI. 38(1): 22-28.

Sheeran, P and G. M. Hall. 1997. Cytokines in Anesthesia. British Journal of

Anesthesia. 78:201-219.

Singh, Deepti ., D. Singh, and S. Soo Han. 2016. 3D Printing of Scaffold for Cells

Delivery: Advances in Skin Tissue Engineering. Polymers. 8(19): 1-17.

Sumbayak, E.M. 2016. Fibroblas: Struktur dan Peranannya dalam

Penyembuhan Luka. Universitas Kristen Krida Wacana. Jakarta.

Sunesson, Kristina Westberg. 2012. A Survey of Xenograft Rejection Mechanisms.

Veterinary and animal science university, Swedish University of

Agricultural Sciences. Swedish.

Tabata, Y., dan Matsui, M., 2012. Enchaned angiogenesis by multiple release

of platelet-rich plasma contents and basicfibroblast growh factor from

gelarin hydrogels. Acta Biomaterial Inc. Published by Elsevier.

Thorne., C.H. M., G.C. Guntner., K. Chung., A. Gosain. B. Mehrara. P. Rubin.

S.L. Spear. 2007. Grabb and Smith's Plastic Surgery. 6th Edition.

Philadelphia.

Toffler, M., N. Toscano, D. Holtzclaw., M.D. Corso, and D.D. Ehrenfest. 2009.

Introducing Choukroun’s Platelet Rich Fibrin (PRF) to the

Reconstructive Surgery Milieu. The Journal of Implant & Advanced

Clinical Dentistry. 1(6): 21-31.

Ueda, M., Sumi Y, Mizuno H. 2000. Tissue Engineering: Application for

Maxillofascial Surgery. Mater Sci Eng. P: 7-14.

Wahyuniati, N dan R. Maulana. 2015. Peran Interleukin-10 Pada Infeksi Malaria.

Jurnal Kedokteran Syiah Kuala. 15 (2): 95-102

Wang, H.M., Y.T. Chou., Z.H. Wen., Z.R. Wang., C.H. Chen., M.L. Ho. 2013.

Novel Biodegradable Porous Scaffold Applied to Skin Regeneration.

Plos One Fragrance and Cosmetic Science. 8(6): 1-11.

Werner, S., T. Krieg., and H. Smola. 2007. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in

Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127:998–1008.

Widyastuti, S.K. 2000. Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) sebagai

Model Diabetes Melitus: Pengaruh Hiperglikemia pada Lipid Darah,

Serum Oksida Nitrik (No) dan Tingkah Laku Klinis. [Thesis]. Program

Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.

66

Wu, L. and J. Ding. 2004. In Vitro Degradation of Three-Dimensional Porous

Poly (D,L-lactide-co-glycolide) Scaffold for Tissue Engineering.

Biomaterials. 25: 5821–5830.

Yudha, G.C.P. 2013. Pengaruh Kombinasi Bovine Kolagen Tipe 1 dan Plasma

Rich Platelet (PRP) terhadap Penyembuhan Fraktur Femur Tikus

(Rattus novergicus Strain Wistar) dalam Kondisi Hiperglikemi (Studi

Eksperimental Laboratoris). [Karya Akhir Spesialis Ortopedi dan

Traumatologi]. Fakultas Kedokteran. Universitas Brawijaya. Malang.

Zhang J., and J. An. 2007. Cytokines, Inflammation and Pain. International

Anesthesiol Clinic. 45(2): 27-37.