Pengaruh Metode Ekstrusi dan Sonikasi terhadap

Pengaruh Metode Ekstrusi dan Sonikasi terhadap Karakteristik Liposom Meropenem Steril

Alfredo Fernando; Iskandarsyah

Fakultas Farmasi Universitas Indonesia

[email protected]

Abstrak

Berbagai aplikasi reduksi ukuran partikel liposom telah dilakukan untuk memperoleh liposom SUV dengan pertimbangan distribusi sistemik yang baik dan pemenuhan kriteria filtrasi steril. Ekstrusi dan sonikasi merupakan metode reduksi ukuran partikel yang umum digunakan. Penelitian ini bertujuan melihat pengaruh metode ekstrusi dan sonikasi terhadap karakteristik liposom bila ditinjau dari morfologi, ukuran partikel, efisiensi penjerapan, dan sterilitas. Liposom dibuat secara hidrasi lapis tipis. Liposom hasil hidrasi diberikan dua perlakuan berbeda: ekstrusi 5 siklus dengan membran polikarbonat 0,45 µm dan sonikasi 2 kali 5 menit. Liposom terekstrusi dan tersonikasi disterilisasi filtrasi dengan teknik ekstrusi 1 siklus menggunakan membran polikarbonat 0,22 µm secara aseptik. Citra TEM menunjukkan bentuk sferis unilamelar dari globul liposom tersonikasi dan variasi bentuk globul pada liposom terekstrusi. Ekstrusi 5 siklus dan sonikasi menghasilkan liposom dengan rata-rata ukuran partikel berturut-turut 445,3 (PDI=0,49) dan 75,5 nm (PDI=0,323). Sterilisasi filtrasi 1 siklus cenderung meningkatkan rata-rata ukuran partikel dan keseragaman liposom terekstrusi, tetapi tidak berpengaruh terhadap liposom tersonikasi. Jumlah meropenem terjerap dalam liposom terhidrasi, terekstrusi, dan tersonikasi berturut-turut sebesar 67,99%, 32,93%, dan 72,76%. Proses ekstrusi steril menurunkan efisiensi penjerapan liposom terekstrusi (25,94%) dan tersonikasi (35,02%). Pengujian sterilitas dengan medium tioglikolat dan agar darah mengindikasikan adanya pertumbuhan bakteri.

Effects of Extrusion and Sonication Methods to The Characterizatic of Sterile Meropenem Liposome

Abstract

Various applications of liposome particle size reduction have been made to obtain SUV liposome with consideration of better systemic distribution and sterile filtration criteria fulfillment. Extrusion and sonication are two common methods of particle size reduction. This study aims to observe the effect of extrusion and sonication methods on the characterizatic of liposomes in terms of morphology, particle size, entrapment efficiency, and sterility. Liposome was produced by thin film hydration method. Hydrated liposome was given two different treatments: 5 cycles extrusion with 0.45 µm polycarbonate membrane and 2 sonication cycles for 5 minutes each. Furthermore, extruded and sonicated liposome were sterilized by filtration using 1 cycle extrusion techniques with 0.22 µm polycarbonate membrane aseptically. TEM image shows the unilamellar spherical globule of sonicated liposome and various globule forms of extruded liposome. 5 cycles extrusion and sonication produce liposome’s globule with mean particle size of 445.3 nm (PDI = 0.49) and 75.5 nm (PDI = 0.323) respectively. Sterile filtration increased mean particle size and uniformity of the extruded liposomes, but it didn’t influence the sonicated liposome. Meropenem entrapped in hydrated, extruded, and sonicated liposomes were respectively 67.99%, 32.93%, and 72.76%. Sterile extrusion process decreased the entrapment efficiency of extruded (25.94%) and sonicated (35.02%) liposome. Sterility testing with thioglikolat medium and blood agar indicate the presence of bacterial growth. Keywords : extrusion; liposome; meropenem; sonication

Pengaruh metode …, Alfredo Fernando, Ffarmasi UI, 2013

Pendahuluan

Liposom sebagai salah satu sistem carrier menawarkan sejumlah keuntungan dalam

sistem penghantaran obat: sebagai pembawa obat, baik hidrofilik maupun hidrofobik,

merupakan salah satu solusi dalam mengatasi masalah buruknya bioavailabilitas obat (Jufri,

Anwar, dan Djajadisatra, 2004); sifatnya yang biodegradable dan biocompatible (Sharma dan

Sharma, 1997); pembawa berbagai zat aktif farmakologis (Lasic, 1998). Namun, liposom

memiliki kekurangan terkait instabilitas fisika dan kimianya terhadap pH, garam empedu, dan

enzim pencernaan, yang menjadi masalah dalam penghantaran obat (Jufri, 2004). Berbasis

pada aplikasi liposom untuk penghantaran sistemik, secara parenteral pada khususnya,

liposom harus memenuhi persyaratan sterilitas (Zuidam, et al., 2003). Bila instabilitas fisika-

kimia cenderung mengarah pada pemberian oral, maka dalam hal pemberian parenteral,

masalah yang dihadapi adalah bagaimana memformulasi sediaan liposom yang steril dengan

metode sterilisasi yang tersedia.

Potensi degradasi komponen penyusun liposom akibat pemanasan dan radiasi

menyebabkan metode sterilisasi panas dan radiasi gamma tidak dapat diterapkan untuk proses

sterilisasi liposom. New (1990) telah menyarankan filtrasi steril sebagai satu-satunya metode

yang cocok dalam preparasi liposom steril. Filtrasi steril melalui membran filtrasi berukuran

0,22 µm tidak akan merusak liposom SUV (Small Unilamellar Liposome), tetapi aplikasinya

terbatas hanya untuk liposom berukuran lebih kecil dari 0,22 µm serta memiliki kemungkinan

kontaminasi tambahan pada kemasan akhir (Torchilin dan Weissig, 2003). Oleh karena itu,

diperlukan metode reduksi ukuran partikel sebelum sterilisasi filtrasi dan pengerjaan aseptik

untuk mengatasi keterbatasan tersebut.

Ukuran partikel liposom merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi

biodistribusi liposom pasca pemberian sistemik. Pada umumnya, liposom berukuran besar

dieliminasi lebih cepat dari sirkulasi darah dibandingkan liposom berukuran kecil. Kecepatan

eliminasi liposom oleh sistem retikuloendotelial meningkat seiring dengan pertambahan

ukuran partikel (Ishida, Harashima, Kiwada, 2002). Oleh karena itu, di samping pertimbangan

perolehan liposom berukuran lebih kecil supaya dapat menembus membran filtrasi steril,

metode reduksi ukuran partikel juga bertujuan untuk memperoleh distribusi sistemik yang

lebih baik.

Metode pengecilan ukuran partikel liposom yang umum dilakukan adalah ekstrusi dan

sonikasi (Walde, Namani, Morigaki, Hauser, 2007). Penelitian terdahulu telah mengkaji

berbagai aspek terkait pengaruh metode sonikasi dan ekstrusi terhadap karakteristik fisik


liposom. Aspek morfologi dari liposom tersonikasi telah diteliti menggunakan TEM

(Zasadzinski, 1986). Sejumlah aspek terkait metode ekstrusi juga telah diteliti, yakni: jenis

alat ekstruder, ukuran pori filter, jumlah siklus ekstrusi, dan penambahan siklus freeze-thaw

dalam proses ekstrusi (Berger, et al., 2001). Perbedaan karakteristik fisik dan optik liposom

juga ditemukan pada sonikasi dan ekstrusi (Lapinski, et al., 2007).

Pemilihan meropenem sebagai model antibiotik didasarkan penelitian terdahulu yang

menunjukkan bahwa enkapsulasi liposom dapat meningkatkan aktivitas antibakteri (Rolanda,

2012) dan diharapkan menghasilkan sediaan liposom yang efektif dalam penatalaksanaan

infeksi Pseudomonas aeruginosa. Penambahan asam oleat diharapkan dapat meningkatkan

fleksibilitas dan deformabilitas liposom dalam melewati pori kecil pada membran ekstrusi

(Venuganti dan Perumal, 2009) serta meningkatkan aktivitas penghantaran sitoplasmik obat

(Torchilin, Lukyanov, dan Klibanov, 1992). Penelitian ini akan melihat bagaimana pengaruh

penggunaan metode ekstrusi dan sonikasi sebagai metode pengecilan ukuran partikel liposom

terhadap karakteristik fisik (morfologi dan ukuran), efisiensi penjerapan, dan sterilitas

liposom yang dihasilkan.

Tinjauan Teoritis

Definisi liposom telah diinterpretasikan dalam berbagai aspek sejak penemuan

pertamanya oleh Bangham pada tahun 1964. Bangham dan Horne (1964) menyebutkan bahwa

liposom merupakan pembawa mikropartikulat atau koloidal, berdiameter 0,05 – 5,0 µm, dan

terbentuk secara spontan ketika lipid tertentu dihidrasi dengan medium aqueous. Liposom

merupakan vesikel artifisial kecil berbentuk sferis atau bulat dengan membran tersusun dari

fosfolipid lapis ganda dan kolesterol, yang mampu mengenkapsulasi obat hidrofilik dan

hidrofobik (Swarbrick, 2007). Berbasis pada sifat ampifil dari lipid lapis ganda sebagai bahan

penyusun liposom, liposom dapat digunakan sebagai pembawa obat yang bernilai. Zat aktif

obat yang bersifat hidrofilik akan terjerap pada bagian aqueous (bagian inti) dari vesikel

sedangkan obat lipofilik akan terjerap pada bagian lipid (bagian membran) dari vesikel

(Windholz, 1976).

Komponen dasar penyusun liposom terdiri dari berbagai variasi lipid dan

campurannya. Liposom dibentuk dari lipid alami (fosfolipid) maupun sintetik sebagai

konstituen utama (Jufri, 2004), dan juga mengandung bahan sebagai konstituen tambahan

membran lapis ganda seperti kolesterol dan lipid terkonjugasi polimer hidrofilik (Sharma dan

Sharma, 1997). Fosfolipid merupakan jenis lipid yang sering digunakan dalam formulasi


liposom. Dalam berbagai formulasi liposom, fosfolipid alami sering menjadi pilihan utama,

terutama fosfatidilkolin (Jufri, 2004).

Liposom dapat diklasifikasikan berdasarkan komposisi penyusunnya dan berdasarkan

ukuran serta jumlah lamelarnya. Berdasarkan komposisi dan tipe penghantaran obatnya,

liposom dapat dikelompokkan menjadi 7 jenis, yakni: liposom konvensional, liposom sensitif

pH, liposom sensitif temperatur, liposom kationik, stealth liposome, imunoliposom, dan

liposom magnetik. Berdasarkan ukuran dan jumlah lamelar, liposom diklasifikasikan menjadi:

Multilamellar Vesicles (MLV), Large Unilamellar Vesicles (LUV), dan Small Unilamellar

Vesicles (SUV) (Varun, Sonia, Bharat, 2012; Sharma dan Sharma, 1997).

Metode Penelitian

Bahan: Fosfatidilkolin telur (Sigma), kolesterol (Sigma), asam oleat (Merck),

meropenem (Zhuhai Utd. Lab.), kloroform (Merck), metanol (Mallinckrodt), natrium klorida

(Mallinckrodt), aquadest demineralisata (Brataco), gas nitrogen (teknis), medium tioglikolat

cair (Difco), agar darah (Citotest). Alat: Timbangan analitik (Sartorius), pH meter (Eutech),

spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu UV-1800), rotary evaporator (Hahn Shin), vortex mixer

(Health H-VM-300), mini extruder set (Avanti Polar Lipids), syringe gas tight (Hamilton),

membran polikarbonat 0,45 dan 0,22 µm (Whatman), bath-sonicator (Elmasonic S-60-H),

Transmission Electron Microscope (JEOL JEM-1400), mikroskop optik (Olympus), Particle

Size Analyzer (Beckman Coulter Delsa Nano C), sentrifugator (Kubota 5100), kamera digital

(Canon PS A2200), glass beads, termometer, tabung sentrifugasi (Corning-Sigma), labu bulat,

dan peralatan gelas lainnya.

Liposom dibuat dengan menggunakan metode hidrasi lapis tipis. Fosfatidilkolin,

kolesterol, dan asam oleat (perbandingan molar 5:5:1 mol) ditimbang dan dilarutkan dalam 25

mL kloroform. Larutan dalam kloroform tersebut dievaporasi menggunakan alat rotary

evaporator dengan suhu +60oC, kecepatan 60-160 rpm, dan kondisi vakum untuk

menguapkan kloroformnya hingga terbentuk lapisan tipis. Lapisan tipis yang telah terbentuk

kemudian dialiri dengan gas nitrogen, dan didiamkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, lapisan

tipis di dalam labu evaporator dihidrasi dengan larutan 1 mg/mL meropenem dalam larutan

NaCl 150 mM sambil dikelupas dengan glass beads dengan kecepatan rotary evaporator

sebesar 60 rpm tanpa penggunaan vakum hingga terbentuk suspensi berwarna putih susu

hingga kekuningan. Suspensi kemudian di vortex selama 15 menit dan disimpan di dalam vial

selama 24 jam di dalam lemari pendingin (Drulis-Kawa, 2006).


Liposom hasil hidrasi diberikan dua perlakuan berbeda, yakni ekstrusi dan sonikasi.

Proses ekstrusi dilakukan menggunakan rangkaian alat mini extruder set dengan membran

polikarbonat 0,45 µm sebanyak 5 siklus. Dalam proses sonikasi, dispersi liposom diletakkan

dalam suatu bath-sonicator tepat di bagian tengah sonikator yang berdimensi 30 cm x 15,1 cm

x 15 cm, berdaya input sebesar 150W, dan memiliki frekuensi sebesar 37 kHz. Temperatur

selama proses sonikasi dipertahankan pada angka 60oC, dimana temperaturnya dapat diatur

secara otomatis pada sonikator. Prosedur sonikasi dilakukan sebanyak 2 kali selama masing-

masing 5 menit dengan interval istirahat 3 menit (Kim, et al., 2007; Memoli, Palermiti,

Travagli, Alhaique, 1994). Selanjutnya, liposom terekstrusi dan tersonikasi disterilisasi filtrasi

dengan teknik ekstrusi secara aseptik. Proses ekstrusi steril sebanyak 1 siklus dilakukan

dengan membran polikarbonat 0,22 µm dan pengerjaannya dilakukan di bawah aliran udara

laminar (LAF).

Evaluasi karakteristik morfologi, ukuran partikel, dan efisiensi penjerapan dilakukan

terhadap liposom terhidrasi, liposom terekstrusi, liposom tersonikasi, liposom terekstrusi

steril, dan liposom tersonikasi steril. Evaluasi morfologi liposom dilakukan menggunakan

mikroskop optik sebagai interpretasi awal pada liposom terhidrasi, terekstrusi, dan tersonikasi,

serta TEM pada liposom terhidrasi, terekstrusi steril, dan tersonikasi steril. Pengukuran rata-

rata dan distribusi ukuran partikel dilakukan menggunakan PSA.

Penentuan efisiensi penjerapan dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000

rpm, selama 60 menit, pada temperatur 2oC untuk memisahkan liposom dari obat bebas (tak

terjerap). Selanjutnya, sedimen liposom didestruksi dengan penambahan metanol, dan

supernatan metanol diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 297,4 nm. Efisiensi penjerapan dihitung dengan membandingkan konsentrasi obat

terjerap pada supernatan metanol dengan konsentrasi meropenem yang ditambahkan di awal

(1 mg/mL).

Uji sterilitas liposom terekstrusi dan tersonikasi steril dilakukan menggunakan

medium tioglikolat cair dan agar darah. Penggunaan agar darah sebagai media uji bertujuan

untuk menghindari biasnya interpretasi hasil uji sterilitas karena kekeruhan sampel uji yang

berupa suspensi liposom. Sebelum uji sterilitas dilakukan, perlu dilakukan purifikasi terhadap

sediaan liposom dengan sentrifugasi pada kondisi kecepatan, waktu, dan temperatur yang

sama saat pemisahan untuk penentuan efisiensi penjerapan. Indikasi pertumbuhan bakteri

dapat dilihat melalui adanya kekeruhan pada medium tioglikolat pasca 1 hari inkubasi pada

suhu 37oC dan munculnya koloni bakteri pada medium agar darah pasca periode inkubasi

yang sama.


Hasil dan Pembahasan

Tampilan visual liposom hasil semua perlakuan dapat dilihat pada gambar 1. Secara

visual, diperoleh sediaan liposom hasil hidrasi dengan warna kuning muda (Pantone 3945U).

Liposom hasil ekstrusi berwarna kuning muda hampir sama warnanya bila dibandingkan

dengan liposom hasil hidrasi (Pantone 3945U). Liposom hasil sonikasi berwarna kuning muda

tetapi lebih muda dibandingkan dengan liposom hasil hidrasi (Pantone 393U).

Gambar 1. Tampilan visual liposom hasil hidrasi (a), liposom terekstrusi (b-kiri), liposom tersonikasi (b-kanan), liposom terekstrusi steril (c-kiri), dan liposom tersonikasi

steril (c-kanan)

Pada gambar 2 dapat dilihat bahwa proses sonikasi dapat meningkatkan persen

efisiensi penjerapan, sementara proses ekstrusi cenderung menurunkan efisiensi penjerapan

liposom hasil hidrasi. Meningkatnya penjerapan pasca sonikasi disebabkan terjadinya re-

enkapsulasi meropenem saat proses sonikasi. Penembakkan gelombang ultrasonik yang

dilakukan di atas temperatur transisi lipid dapat menyebabkan meropenem bebas yang tidak

terjerap setelah proses hidrasi dapat kembali terjerap. Komponen lipid akan berada dalam fase

gel dan pada saat konsentrasinya berada di atas Critical Aggregate Concentration (CAC) akan

membentuk lipatan secara spontan dan menjerap meropenem bebas.

Sementara itu, penurunan angka efisiensi penjerapan pasca ekstrusi disebabkan dua

hal: pecahnya liposom pasca ekstrusi dan tertahannya meropenem pada membran ekstrusi.

Tekanan yang terlalu kuat saat pendorongan syringe dapat menyebabkan liposom yang

terbentuk pecah atau leaky sehingga meropenem akan lepas menjadi obat bebas. Setelah


terlepas, kemungkinan enkapsulasi kembali oleh komponen lipid tidak terjadi karena afinitas

meropenem pada membran polikarbonat, yang menyebabkan meropenem tidak ikut

terekstrusi dan tertahan pada membran.

Penjabaran terkait ekstrusi di atas didukung oleh data efisiensi penjerapan hasil

ekstrusi dan sonikasi steril, dimana pasca ekstrusi steril melewati membran berukuran 0,22

µm, nilai efisiensi penjerapan keduanya berkurang. Semakin kecil ukuran pori membran

ekstrusi, maka akan semakin kuat pula tekanan yang dibutuhkan untuk melewatkan liposom

yang berukuran lebih besar melalui membran ekstrusi. Akibatnya, kemungkinan leaky-nya

obat terjerap dari liposom menjadi semakin besar, sehingga penjerapannya menurun.

Gambar 2. Pengaruh ekstrusi dan sonikasi serta sterilisasi filtrasi terhadap efisiensi penjerapan meropenem dalam liposom

Citra liposom hasil hidrasi dapat dilihat pada gambar 3. Gambar 3A menunjukkan

suatu citra globul liposom tunggal yang diprediksi multilamelar dan berukuran kurang dari

500 nm akibat kaburnya citra dan kontras yang tidak terlalu baik. Citra yang blur dapat

disebabkan oleh konsentrasi sampel uji yang terlalu pekat dan keberadaan komponen non-

liposom dalam jumlah banyak yang menutupi obyek lain pada bagian yang lebih tebal dari

film kaca TEM. Komponen non-liposom tampak pada gambar 3B pada obyek yang diberi

tanda panah. Obyek ini dinamakan face-on disks atau circular disk-like structure sebagai

globul dari campuran misel atau bentuk intermediet misel-liposom yang berasal dari

komponen lipid yang terlepas dari bilayer (Almgren, Edwards, Karlsson, 2000; Bergstrand,

2003).

67.99 72.76

32.93 35.02

25.94

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

Hidrasi Sonikasi Ekstrusi Sonikasi Steril

Ekstrusi Steril

Persen

tase Pen

jerapa

n (%

)


Keterangan : A. MLV dengan ukuran ± 400 nm; B. face-on disk (tanda panah).

Gambar 3. Citra TEM liposom hasil hidrasi

Pencitraan TEM untuk liposom hasil ekstrusi steril dapat dilihat pada gambar 4. Pada

bagian A, dapat dilihat persebaran globul liposom hasil ekstrusi, dimana bentuk globul yang

dihasilkan beragam, ada yang sferis (bulat), elongated (memanjang), dan tidak beraturan.

Pada globul yang sferis, liposom yang dihasilkan terlihat unilamelar. Bentuk globul yang

tidak beraturan disebabkan oleh interaksi tarik-menarik globul-globul kecil membentuk

agregat yang tidak teratur. Kecenderungan globul liposom hasil ekstrusi steril untuk

beragregasi terlihat pada gambar 4D. Bagian B menunjukkan bentuk globul liposom yang

hampir sferis dengan sedikit undulasi pada permukaan bilayernya (Zasadzinski, 1986). Pada

bagian C, terlihat obyek berbentuk semacam garis halus (tanda panah) yang merupakan globul

dari campuran misel seperti pada liposom hasil hidrasi. Bentuk obyek tersebut dinamakan

edge-on disk atau side-on disk. Perbedaan face-on dan egde-on disk terletak pada visualisasi

gambar dua dimensi dari struktur tiga dimensi pasca proses vitrifikasi (Almgren, Edwards,

Karlsson, 2000).


Keterangan : A. Globul berbentuk sferis unilamelar (tanda panah), memanjang, dan tak beraturan; B. Globul liposom sferis; C. edge-on disk (tanda panah); D. Globul yang saling beragregasi

Gambar 4. Mikroskopik liposom hasil ekstrusi steril dengan TEM

Pencitraan TEM pada liposom hasil sonikasi steril menunjukkan globul liposom sferis

yang unilamelar. Pada gambar 5A, dapat dilihat globul-globul liposom sferis yang tersebar

hampir merata. Pada perbesaran 40.000 kali, diperoleh satu globul liposom sferis yang

unilamelar dengan permukaan lamelar yang rata (Gambar 5B). Walaupun dihasilkan bentuk

morfologi yang jelas, ukuran diameter globul yang dihasilkan dari citra TEM tidak sesuai

dengan interpretasi data PSA, dimana pada citra TEM ukuran globul yang dihasilkan jauh

lebih besar dibandingkan data PSA. Perbedaan hasil ukur ini disebabkan oleh agregasi dari

globul liposom akibat faktor temperatur dan waktu penyimpanan. Kecenderungan globul

liposom untuk saling beragregasi dapat terlihat pada bagian D, dimana tiga globul liposom

kecil hendak bergabung membentuk suatu agregat yang lebih besar. Semakin lama waktu

penyimpanan dengan temperatur yang kurang sesuai, maka akan terjadi perubahan struktur

globul liposom menjadi semakin besar (Almgren, Edwards, Karlsson, 2000).


Keterangan : A. Persebaran globul liposom hasil sonikasi steril; B. Globul liposom sferis unilamelar; C. Threadlike micelles (tanda panah); D. Liposom SUV (tanda panah hitam) dan agregasi globul liposom (anak panah putih).

Gambar 5. Mikroskopik liposom hasil sonikasi steril dengan TEM

Indikasi produk hasil degradasi juga terlihat pada gambar 5C. Struktur seperti

anyaman benang (threadlike micelles) pada bagian yang ditunjuk tanda panah mengacu pada

pembentukkan produk hidrolisis fosfolipid. Namun, proses hidrolisis yang terjadi baru pada

tahap awal dan menyebabkan kerusakan minor pada sebagian struktur globul liposom. Ketika

sebagian fosfolipid terhidrolisis, liposom unilamelar masih terbentuk di sekitar kerusakan

lamelar yang menyerupai anyaman benang tersebut (Bergstrand, 2003).

Berdasarkan data pada grafik 6A, dapat dilihat bahwa liposom hasil hidrasi memiliki

diameter rata-rata globul sebesar 2.059,4 nm. Setelah dilakukan proses ekstrusi dengan

membran polikarbonat 0,45 µm sebanyak 5 siklus dapat dilihat terjadi penurunan ukuran


menjadi sebesar 445,3 nm, sementara itu proses sonikasi selama 2 kali 5 menit menghasilkan

globul dengan diameter rata-rata 75,5 nm. Berdasarkan data tersebut dapat disimpulkan bahwa

proses sonikasi dapat menghasilkan liposom dengan rata-rata ukuran partikel hampir 5 kali

lebih kecil dibandingkan proses ekstrusi dengan membran berukuran 0,45 µm sebanyak 5

siklus. Pada dasarnya, ekstrusi akan menghasilkan globul liposom dengan ukuran rata-rata

partikel mendekati ukuran pori membran ekstrusi.

Gambar 6. Pengaruh ekstrusi dan sonikasi serta sterilisasi filtrasi terhadap rata-rata (A) dan distribusi (B) ukuran partikel liposom

Proses ekstrusi dengan membran polikarbonat berukuran 0,22 µm sebanyak 1 siklus

(sterilisasi filtrasi) terhadap liposom hasil ekstrusi meningkatkan rata-rata ukuran partikel

menjadi 691,9 nm. Peningkatan ukuran partikel tersebut dapat terjadi karena ketika


pendorongan syringe dihasilkan tekanan yang lebih besar dan lebih kuat untuk melewatkan

partikel liposom melalui membran berukuran 0,22 µm dibandingkan 0,45 µm. Tekanan yang

kuat dan kontinu akan menyebabkan globul liposom yang lebih besar tertahan pada membran

yang berukuran pori lebih kecil. Ketika melewati membran, globul-globul liposom akan

berkontak dan terjadi agregasi membentuk globul dengan ukuran yang lebih besar. Selain itu,

faktor agregasi juga didorong oleh jumlah siklus ekstrusi yang hanya terdiri dari satu siklus.

Proses ekstrusi satu siklus tidak dapat mereduksi ukuran partikel karena masih terdapat

globul-globul liposom dengan ukuran besar setelah melewati membran ekstrusi dan tidak

mengalami proses ekstrusi lebih lanjut. Kurangnya jumlah siklus ekstrusi didukung penelitian

terdahulu yang menyatakan bahwa pada umumnya, perubahan struktur liposom terjadi pada 5

siklus pertama (Hope, 1993).

Pada liposom hasil sonikasi, proses ekstrusi dengan membran polikarbonat 0,22 µm

tidak memiliki pengaruh yang berarti terhadap rata-rata ukuran partikel, dimana hanya terjadi

pertambahan ukuran sebesar 4,5 nm pada liposom hasil sonikasi steril. Hal tersebut

disebabkan karena ukuran partikel liposom hasil sonikasi (75,5 nm) sudah lebih kecil dari

ukuran pori membran ekstrusi steril (0,22 µm) sehingga proses ekstrusi steril tidak

menyebabkan reduksi ukuran, melainkan hanya meloloskan globul-globul liposom hasil

sonikasi yang ukurannya sudah lebih kecil. Walaupun tidak berpengaruh terhadap ukuran

partikel, esensi ekstrusi dengan membran berukuran 0,22 µm tetap terarah pada jaminan

sterilitas sediaan.

Indeks polidispersitas (PDI) yang tertuang pada gambar 6B menunjukkan distribusi

ukuran partikel globul liposom. Semakin kecil nilai PDI, maka suatu sediaan dikatakan

semakin seragam atau homogen ukuran partikelnya. Liposom hasil hidrasi memiliki PDI

sebesar 0,585. Dengan proses ekstrusi 5 siklus dengan membran polikarbonat 0,45 µm dan

sonikasi 2 kali 5 menit, tingkat keseragaraman ukuran partikel liposom hasil hidrasi menurun

menjadi berturut-turut 0,490 dan 0,323. Semakin seragamnya ukuran globul liposom dengan

proses ekstrusi dan sonikasi menunjukkan bahwa proses reduksi ukuran partikel dapat

menghasilkan liposom dengan ukuran yang lebih kecil dan lebih seragam. Bila dibandingkan

data PDI liposom hasil ekstrusi dan sonikasi, proses sonikasi dapat menghasilkan distribusi

ukuran yang lebih seragam dibandingkan proses ekstrusi. Hal tersebut disebabkan oleh waktu

dan jumlah siklus sonikasi yang dilakukan. Dengan 2 kali proses sonikasi selama masing-

masing 5 menit, probabilitas vesikel lipid yang terkena tembakan ultrasonik juga meningkat

sehingga jumlah vesikel lipid dengan ukuran kecil juga meningkat dan diperoleh distribusi

ukuran partikel yang lebih seragam. Proses ekstrusi 5 siklus dengan membran polikarbonat


0,45 µm menghasilkan tingkat polidispersitas yang lebih tinggi daripada sonikasi karena

masih terdapat globul liposom dengan ukuran yang lebih besar dari ukuran pori membran

ekstrusi akibat agregasi.

Proses sterilisasi filtrasi terhadap liposom hasil sonikasi tidak memiliki pengaruh yang

berarti karena globul liposom hasil sonikasi sudah berukuran lebih kecil daripada pori

membran ekstrusi 0,22 µm, dimana indeks polidispersitas liposom hasil sonikasi steril

menunjukkan angka 0,322. Sementara itu, proses ekstrusi dengan membran 0,22 µm telah

berhasil menurunkan angka PDI liposom hasil ekstrusi (0,490) menjadi 0,286. Hal tersebut

menunjukkan bahwa proses ekstrusi steril dengan membran polikarbonat berukuran 0,22 µm

sebanyak 1 siklus dapat meningkatkan keseragaman ukuran partikel globul liposom di

samping esensinya untuk proses sterilisasi.

Pengujian sterilitas dilakukan terhadap liposom hasil ekstrusi steril dan sonikasi steril.

Sebelum pengujian dilakukan, setiap komponen alat dan bahan yang digunakan untuk

pengujian sterilitas diupayakan sedapat mungkin steril supaya tidak mengganggu pengamatan

hasil sterilitas. Kedua sampel liposom juga harus dipisahkan terlebih dahulu dari obat bebas

secara sentrifugasi yang prosesnya diupayakan se-aseptik mungkin supaya tidak membiaskan

interpretasi hasil uji sterilitas. Pengujian sterilitas media dilakukan dengan menginkubasi

tabung berisi medium tioglikolat pada temperatur 37oC selama 1 hari.

Pelaksanaan uji sterilitas dilakukan triplo dengan menggunakan 3 kelompok uji, yakni

kelompok kontrol, sampel liposom hasil ekstrusi steril, dan sampel liposom hasil sonikasi

steril. Tiap tabung reaksi diisi dengan 9 mL medium tioglikolat cair dan 40 µL sampel

liposom. Tabung reaksi yang hanya berisi medium tioglikolat saja digunakan sebagai kontrol.

Semua tabung reaksi diinkubasi pada temperatur 37oC selama 1 hari. Setelah inkubasi,

penggoresan pada medium agar darah dilakukan untuk semua tabung berisi sampel dan

kontrol. Selanjutnya, medium agar darah yang telah digores diinkubasi pada temperatur dan

periode waktu yang sama dengan medium tioglikolat.

Pengamatan hasil uji sterilitas setelah 1 hari inkubasi terhadap kelompok inkubasi

medium tioglikolat pada 37oC menunjukkan hasil yang negatif pada kedua sampel liposom.

Seluruh tabung berisi 40 µL sampel liposom menunjukkan gejala kekeruhan seperti kapas

yang menandakan adanya pertumbuhan bakteri. Sementara itu, kelompok kontrol yang hanya

berisi medium tioglikolat tetap jernih.

Penggunaan medium agar darah bertujuan untuk menghindari biasnya interpretasi

hasil uji sterilitas dengan medium tioglikolat karena keruhnya sampel liposom yang diuji.

Hasil pengamatan media agar darah berisi sampel yang telah diinkubasi adalah terbentuknya


koloni bakteri berwarna putih pada goresan kelompok sampel berisi liposom ekstrusi dan

sonikasi steril, sementara pada goresan kelompok kontrol yang hanya berisi medium

tioglikolat tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni. Berdasarkan pengamatan

menggunakan medium tioglikolat dan penggoresan pada agar darah, dapat disimpulkan bahwa

sampel liposom uji (liposom ekstrusi steril dan sonikasi steril) tidak memenuhi kriteria

sterilitas.

Faktor penyebab hasil uji sterilitas sediaan liposom hasil ekstrusi dan sonikasi yang

negatif adalah proses pengerjaan sterilisasi filtrasi dan pemurnian liposom dengan sentrifugasi

secara aseptik dilakukan tidak maksimal. Pertama, waktu pengerjaan sterilisasi filtrasi yang

cukup lama dan proses pemindahan sediaan berulang dari alat extruder ke dalam vial steril

memungkinkan timbulnya kontaminasi. Kedua, metode sterilisasi alat-alat penunjang yang

digunakan untuk proses sterilisasi filtrasi kurang memadai. Sebagai contoh, komponen alat

mini extruder yang hanya disterilisasi dengan penyinaran sinar UV di dalam LAF dan

pembilasan dengan alkohol 70%. Ketiga, kondisi ruang steril yang digunakan belum

divalidasi sterilitasnya ketika hendak digunakan untuk proses sterilisasi sediaan liposom.

Keempat, kondisi tube sentrifugator tanpa tutup yang sesuai turut memicu masuknya

kontaminan. Parafilm yang digunakan sebagai penutup tube juga tidak dapat menjamin

sterilitas karena potensi rusak atau bocornya plastik parafilm selama proses sentrifugasi.

Terakhir, proses transportasi tube berisi sediaan liposom uji yang cukup jauh dengan alat

sentrifugator juga diprediksi berpotensi menimbulkan kontaminasi.

Kesimpulan

Citra TEM liposom hasil sonikasi steril menunjukkan globul unilamelar sferis dan

indikasi terjadinya hidrolisis, sedangkan pada citra liposom hasil ekstrusi steril, globul

liposom tampak sferis, memanjang, dan tidak beraturan, serta adanya indikasi komponen lipid

yang tidak membentuk membran bilayer. Proses sonikasi meningkatkan efisiensi penjerapan

meropenem pada liposom hasil hidrasi, sedangkan proses ekstrusi 5 siklus dan sterilisasi

filtrasi cenderung menurunkan efisiensi penjerapan meropenem dalam liposom. Persentase

efisiensi penjerapan liposom hasil hidrasi, ekstrusi, sonikasi, ekstrusi steril, dan sonikasi steril

berturut-turut adalah 67,99%, 32,93%, 72,76%, 25,94%, dan 35,02%. Proses sonikasi

menghasilkan liposom dengan rata-rata ukuran partikel dan indeks polidispersitas yang lebih

kecil daripada ekstrusi 5 siklus dengan membran 0,45 µm. Ekstrusi steril 1 siklus dengan

membran 0,22 µm meningkatkan rata-rata ukuran partikel dan keseragaman (menurunnya


indeks polidispersitas) liposom hasil ekstrusi, tetapi tidak berpengaruh terhadap rata-rata dan

distribusi ukuran partikel liposom tersonikasi. Uji sterilitas terhadap liposom ekstrusi dan

sonikasi steril menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri.

Saran Sebagai penutup dari jurnal ini, penulis menyampaikan sejumlah saran yang kiranya

berguna untuk diperhatikan dalam penelitian selanjutnya. Dalam proses sonikasi, perlu

dilakukan optimasi waktu dan siklus sonikasi serta frekuensi sonikator dalam rangka produksi

liposom dengan karakteristik yang optimal. Terkait proses ekstrusi, perlu dilakukan

penambahan siklus ekstrusi dan penggunaan membran dengan ukuran pori lebih kecil untuk

menghasilkan liposom dengan rata-rata dan distribusi ukuran yang lebih baik. Untuk

menjamin sterilitas sediaan liposom yang dihasilkan, perlu dilakukan optimasi prosedur kerja

dan pemurnian liposom secara aseptik.

Daftar Referensi

Almgren, M., Edwards, K., & Karlsson, G. (2000). Cryo transmission electron microscopy of liposomes and related structures. Colloids and Surfaces A: Psychochemical and Engineering Aspects , 174, 3-21.

Bangham, A. H. (1964). Negative staining of phospholipids and their structural modification by surface-active agents as observed in the electron microscope. J . Mol. Biol. , 8, 660–668.

Berger, N., Sachse, A., Bender, J., Schubert, R., & Brandl, M. (2001). Filter extrusion of liposomes using different devices: comparison of liposome size, encapsulation efficiency, and process characteristics. International Journal of Pharmaceutics, 223 , 55-68.

Bergstrand, N. (2003). Liposome for Drug Delivery: from physicochemical studies to applications. Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations .

Ishida, T., Harashima, H., & Kiwada, H. (2002). Liposome clearance. Bioscience Reports , 22 (2), 197-224.

Jufri, M. (2004). Arah dan Perkembangan Liposome Drugs Delivery Systems. Majalah Ilmu Kefarmasian , 1 (2), 59-68.

Jufri, M., Anwar, E., & Djajadisastra, J. (2004). Pembuatan niosom berbasis maltodekstrin DE 5-10 dari pati singkong (Manihot Utilissima). Majalah Ilmu Kefarmasian , 1 (1), 10-20.


Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., & Blanchard, G. J. (2007). Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore. Langmuir , 23 (23), 11677-11683.

Lasic, D. D. (1998). Novel Applications of Liposomes. Tibtech , 16, 307-321.

New, R. (1990). Liposomes: A Practical Approach. Oxford: IRL Press.

Rolanda, E. (2012). Pengaruh enkapsulasi liposom terhadap aktivitas anibakteri gentamisin sulfat. Skripsi Sarjana Farmasi UI .

Sharma, A., & Sharma, U. S. (1997). Liposomes in drug delivery: progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics, 154 , 123-140.

Swarbrick, J. B. (1994). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (3rd ed.). New York: Dekker.

Torchillin, V. P., Lukyanov, A. N., & Klibanov, A. L. (1992). Interaction Between Oleic Acid-Containig pH-Sensitive and Plain Liposome. Federation of European Biochemical Societies , 305, 185-188.

Torchillin, V., & Weissig, V. (2003). Liposomes: A Practical Approach (2nd ed.). New York: Oxforf University Press USA.

Varun, T., Sonia, A., & Bharat, P. (2012). Niosomes and Liposomes - Vesicular Approach Towards Transdermal Drug Delivery. International Journal of Pharmaceutical and Chemical Sciences , 632-644.

Venuganti, V., & Perumal, O. (2009). Nanosystem for Dermal and Transdermal Drug Delivery. In Y. Pathak, & D. Thassu, Drug Delivery Nanoparticles Formulation and Characterization. New York: Informa Healthcare.

Walde, P., Namani, T., Morigaki, K., & Hauser, H. (2007). Formation and Properties of Fatty Acid Vesicles (Liposomes). In G. Gregoriadis, Liposome Technology: Liposome Preparation and Related Techniques (pp. 1-17). New York: Informa Healthcare USA, Inc.

Windholz, M. (1976). The Merck Indek an Encyclopedia of Chemicals and Drugs (9th ed.). New Jersey: Merck and Co. Int. Rahway.

Zasadzinski, J. A. (1986). Transmission Electron Microscopy observations of sonication-induced changes in liposome structure. Biophys Journal , 1119-1130.

Zuidam, N., van Winden, E., de Vrueh, R., & Crommelin, D. (2003). Stability, storage, and sterilization of liposomes. In V. W. Torchillin, Liposomes, A Practical Approach (2nd ed.). Oxford University Press.


Documents

Pengaruh Metode Ekstrusi dan Sonikasi terhadap