1 BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang AnnonamuricatamerupakangenusdariAnnonaceaeyangmemiliki129 spesiestersebardidaerahtropisdansubtropissepertisebagiandarikepulauan Karibia,AmerikaTengahdanAmerikaSelatan,Afrika,AsiadanAustralia.Annona muricatamerupakanpohondengantinggi8hingga10meter,dengankarakteristik daun berwarna hijau tua, bunga serta buahnya dapat muncul di bagian manapun dari dahannya (Owolabi et al.,2013). Secaratradisional,didaerahAmerikaTengahdanKepulauanKaribiadaun daripohonsirsakiniseringdigunakansebagaiobatdaribeberapapenyakit,antara lainadalahsakitkepala(headaches),insomnia,sistitis,penyakitliver,diabetes meilitus,hipertensidansebagaiantiinflamasi,antispasmodic,sertaantidisentri. PendudukasliGuyanamenggunakandaunataukayusirsaksebagaiobatpenenang dantonikjantung.PendudukBrazilAmazonmenggunakanminyakdaridaunserta buahsirsakyangbelummasakdicampurdenganminyakzaitundigunakansebagai obat luar untuk penyakit neuralgia, reumatik, serta nyeri artritis (Suranto, 2012). Beberapapenelitianterkinimengatakanbahwatumbuhansirsakiniternyata mampu menghilangkan sel-sel kanker berkat suatu kumpulan senyawa yang ada pada tumbuhantersebutyaituAcetogenin.Annonaceousacetogeninssendirisebenarnya hanyadapatditemukanpadafamiliAnnonaceae(yangmanasirsaktermasuk didalamnya).SecaraumumAnnonaceousacetogeninsdalamsirsaktelahdilaporkan dapatberfungsisebagaiantitumor,antiparasit,pestisida,antiprotozoa,antihelmintes dan antimikroba (Keinan et al., 1998). Riset yang meneliti tentang fenomenaini sudah dimulai pada tahun 1976 oleh The National Cancer Institute di Amerika Serikat, tetapi hasil dari penelitian ini tidak dipublikasikan. Barulahseiktar 7 tahun berikutnya,mereka menyatakan bahwa sirsak mengandungAcetogeninyangternyatamampumengatasi12jenisselkanker. 2 Kemudianpadasekitartahun1995hingga1996,Prof.SoelaksonoSastrodihardjo, yaituseorangentomologidariDepartemenBiologiITBbersamaDr.JerryMc. Laughlin seorang farmakolog dari Universitas Purdue, Amerika Serikat serta dibantu olehFengEWu,yaituseorangmahasiswaKoreaSelatan,melakukanpenelitian terhadap sirsak. Sampelyang diambil adalah daun, kayu, dan biji sirsakyang ada di daerah Garut, Jawa Barat. Kemudian penelitian dilanjutkan oleh Dr. Mc. Laughlin di Amerika.Akhirnyapadatahun1996hingga1998,Dr,Mc.Laughlin mempublikasikanbahwasirsakternyatamemangmengandungAcetogeninyang terkandung dalam daun, tunas, kulit kayu, dan biji salak (Suranto, 2012). Meskipuntidakdapatdipungkiribahwasirsakmemilikimanfaatyangsangat banyakbagikesehatan,ternyatabeberapapenelitiantelahmenemukanefeksamping yangtidaksedikit.Padatahun2011,Arthuretal.,melakukansebuahpenelitian tentangefektoksikekstrakairdaunsirsak(Annonamuricata)padatubuh.Pada penelitiantersebutdidapatkanhasilberupakerusakanginjalpadapenggunaandosis besar atau pemberian ekstrak air tersebut. (Arthur et al,. 2011) TidakhanyaArthuret.al.,sajayangmenemukanefeksampingdariAcetogenin ini,padatahun2005,Champyet.al.,telahmenemukanbahwapemberianekstrak metanolakarsirsakdapatmembuatdegenerasiselneurondopaminergik,sehingga berpotensimenyebabkanpenyakitneuronaldangejalasepertiParkinsonyang diakibatkanolehadanyazatneurotoksikyangadapadaAcetogeninyaitu Annonacin(Champy et.al.,2005). Substantianigrasendirikitaketahuisebuahbagiandariotakyangsangat berperanpentingdalampengaturangeraksehinggakitamampumengontrolgerakan padatangandankaki.Kerusakanyangterjadipadaselneurondisubstantianigra dapatmengakibatkangangguanpadapengaturangerak.Kerusakanyangdapat diamati adalah adanya degenerasi sel neuron pada substantia nigra, yang ditandai oleh adanyapembengkakanselataudapatpulapembengkakannukleus(Champy et.al.,2005) 3 1.2 Rumusan Masalah Denganmelihatlatarbelakang,makatimbullahbeberapapertanyaan penelitian mengenai hal tersebut : 1.Apakahterdapatpengaruhpemberianekstrakairdaunsirsak(Annona muricata)secarakronikterhadaprasionukleusneuronpadasubsanstianigra tikus (Rattus novegicus) ? 2.Apakah terdapat perbedaan rasio nukleus neuron substantia nigra tikus (rattus norvegicus) antara kelompok kontrol dan perlakuan? 1.3 Tujuan Penelitian Daripertanyaan-pertanyaanpenelitianyangmunculmakadidapatkantujuan penelitan, yaitu : 1.Mengetahuipengaruhpemberianekstrakairdaunsirsak(Annonamuricata) secarakronikterhadaprasionukleuspadasubtantianigratikus(Rattus norvegicus) 2.Mengetahuiadanyaperbedaanrasionukleusneuronsubstantianigratikus (Rattus norvegicus) antara kelompok kontrol dan perlakuan 1.4 Keaslian Penelitian Daripengetahuanpenulis,penelitiandenganjudul"Gambaran Histopatologissubtantianigratikus(Rattusnorvegicus)denganpemberiankronis ekstrak air daun sirsak (Annona muricata)" adalah benar-benar baru, dan belum ada yangmenelitisebelumnya.Tetapiadapenelitianyangmenyerupaiyaitupenelitian denganjudul"Annonacin,alipophilicinhibitorofmitochondrialcomplexI,induces nigralandstriatalneurodegenerationinrats:possiblerelevanceforatypical parkinsonism in Guadeloupe" yang ditulis oleh Champy et al., (2004). Penelitian ini menunjukkanadanyagambarandegeneratifpadabeberapabagianotakdengan pemberianjangkapanjangAnnonaceousacetogenin.Perbedaandenganpenelitian yang penulis lakukan adalah, pada penelitian tersebut, yang digunakan adalah ekstrak 4 metanolakarsirsak(Annonamuricata),sedangkanpenelitianyangpenulislakukan menggunakan ekstrak air daun sirsak. PenelitianlainyangmenyerupaiadalahpenelitiandenganjudulPengaruh PemberianEkstrakMetanolDaunSirsak(Annonamuricata)TerhadapPerubahan Ukuran Nukleus Dan Jumlah Vakuolisasi Neuron di Substantia Nigra Pars Retikulata Tikus(Rattusnorvegicus)yangditulisolehAndaDamayanti(2009).Perbedaan denganpenelitanyangpenulislakukanadalah,padapenelitiantersebutdigunakan ekstrakmethanoldaunsirsak(Annonamuricata)sedangkanpenelitimenggunakan ekstrak air daun sirsak (Annona muricata). Penelitianyang menyerupai lainnya berjudul Pengaruh Pemberian Ekstrak Air Daun Sirsak (Annona muricata) Terhadap Jumlah Neuron di Substantia Nigra Tikus Putih(Rattusnorvegicus)yangditulisolehAryunDesaArthon.Perbedaandengan penelitianyangdilakukanpenulisadalahlamapenelitianberlangsung,penelitian tersebutberlangsungselama30hari,sedangkanpenelitianyangpenulislakukan berlangsung selama 90 hari. 1.5 Manfaat Penelitian 1.5.1 Manfaat Teoritis Mengetahuiefekyangakanterjadipadabagiansubstantianigratikus(Rattus norvegicus)denganpemberiankronisekstrakdaunsirsak(Annonamuricata),yang padaakhirnyamampumemberikaninformasiilmiahberdasarkanhasilpenelitian yang dilakukan 1.5.2 Manfaat Klinis Dengandilakukannyapenelitiannini,semogamasyarakatmendapatkan informasisertalebihwaspadaterhadappenggunaanobat-obatanherbal,karena kemungkinan masih ada efek samping yang berbahaya. 5 1.5.3 Manfaat Bagi Penelitian Selanjutnya Denganadanyapenelitianini,diharapkandapatmemberikaninformasidan manfaatbagipenelitianselanjutnyasehinggadapatdigunakansebagaitambahan referensi. 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Pustaka 2.1.1 Annona muricata Annonamuricataatauyangkitakenaldengansebutansirsakmerupakan tanamanyangtumbuhsuburdidaerahberiklimtropisberair.Tumbuhaniniberasal dari Amerika Tengah dan Kepulauan Karibia. Annona muricata juga dapat ditemukan didaerahlainnyasepertiBrazil,Peru,sertaNegara-negaradiAmerikaSelatan. TerdapatbanyaksebutanuntuktanamaninidiberbagaiNegara,sepertisoursoup (InggrisdanAmerika),thurian-thet(Thailand),graviolatree(Portugis),guanabana (El-Savador),dancorossel(Vietnam).DiIndonesiasendirisirsakmempunyai julukan yang berbeda-beda, antara lain adalah nangka londa, nangka manila, nangka sabrang,mulwalonda,sirsat,danmasihbanyaksebutanlainnya(Suranto,2012; Owolabi et al., 2013). Annonamuricatatermasuktanamantahunandengansistematikasebagai berikut: Kingdom: Plantae Divisi: Spermatophyta Subdivisi: Angiospermae Kelas: Dicotyledonae Famili: Annonaceae Genus: Annona Spesies: Annona muricata L. Annona muricata mempunyai karakteristik batang keras dengan tinggi mencapai 10 meter. Tanaman ini dapat tumbuh di sembarang tempat, tetapi akan tumbuh subur di ketinggian kurang dari 1.000 meter diatas permukaan laut dan dengan tanahyang mempunyai kadar air cukup(Suranto, 2012). 7 Dauntumbuhaninisangatrimbunsehinggamenyerupaitumbuhanperdu. Ukurandaunlebardanagaktebaldenganbentuklonjongsertaberwarnahijautua. Sedangkan bentuk buahnya menyerupai jantung, disertai duri duri kecil dengan warna hijau kekuningan, daging buahnya berwarna putih(Suranto, 2012). Padabeberapapenelitian,ditemukanAcetogeninpadasetiapbagianAnnona muricata.Mulaidaridaun,akar,batang,buahhinggabiji.Acetogeninsendiri merupakankumpulansenyawa.Didalamnyaterdapatbeberapasenyawayangsangat banyak, namun sampai saat ini penelitian yang telah dilakukan menemukan senyawa antaralainadalahannocatalin,annohexocin,annomonicin,annomontacin, annomuricatinAdanB,annomuricinA-E,annomutacin,annonacin,annonacinone, annopentocinA-C,cis-annonacin,ciscorossolone,cohibinA-D,corepoxylone, coronin, corossolin, corossolone, donhexocin, epomuricenin A dan B, gigantetrocin, gigantetrocinAdanB,gigantetrocinone,gigantetronenin,goniothalamicin,iso-annonacin,javoricin,montanacin,montecristin,muracinA-G,muricapentocin, muricatalicin,muricatalin,muri-catenol,muricatetrocinAdanB,muricatinD, muricatocinA-C,muricinH,muricinI,muricoreacin,murihexocin3,murihexocin A-C,murihexol,murisolin,robustocin,rolliniastatin1dan2,saba-delin,solamin, uvariamicinIdanIV,danxylomaticin.Acetogenininisendirimempunyaiefekyang sangatbaikbagiterapikankerdengancaramenginhibisikompleksImitokondrial (NADH-ubiquinoneoxido-reductase)yangkemudianakanmenghambatproduksi dari ATP dan selanjutnya akan memicu terjadinya apoptosis sel kanker(Taylor, 2005; Alvarez et al., 2009; Liaw et al., 2010). 2.1.2. Morfologi Sel Seladalahunitkehidupanterkecilpadatubuhmanusia.Setiaporganisme tersusundarisalahsatudariduajenisselyangsecarastrukturalberbeda,yaitusel prokariotikatauseleukariotik.Hanyabakteridanarkeayangmemilikisel prokariotik,sedangkanprotista,tumbuhan,jamur,danhewansemuanyamempunyai 8 seleukariotik.Padaorganismehidupberselbanyak,sepertimamalia,sel-sel berkontak erat satu sama lain dan dikelilingi oleh cairan tubuh serta matriks ekstrasel yang membentuk internal milieu yang penting untuk mempertahankan fungsi sel. Sel-sel secara normal berada dalam homeostasis,yaitu, keseimbangan metabolik dengan sellaindancairanekstraselyangmembentuklingkunganmikro(Damjanov& McCue, 1999., Junqueira et al., 2007; Campbell et al., 2002). Yangpalingmembedakanantaraselprokariotikdanseleukariotikadalah nukleusdalamseltersebut.Halinidapatdilihatdarinamanya.Prokariotaatau prokaryotediambildaribahasaYunani,promempunyaiarti"sebelum"dankaryon artinyakernel",ataudisebutnukleus,sehinggamemilikimaknabahwasel prokariotikmerupakanselyangtidakmemilikinukleus.Sedangkankataeukariotik diambildarikataeuyangberarti"sebenarnya"dankaryonyangartinyanukleus sehinggadapatdidefinisikanmenjadiselyangmemilikinukleus(Campbelletal., 2002). Apabiladilihatdariukuransel,makaselprokariotikmemilikiukuranlebih kecilyaitupanjangnya1-5m,sedangkanseleukariotikmemilikiukuranselyang lebihbesar.Padaselprokariotikjugatidakmemilikihiston(proteinbasaspesifik) yangterikatpadaDNA,danjugatidakmemilikiorganelbermembran.Sebaliknya, padaseleukariotik,histonberhubunganeratdenganmaterigenetik(DNA),serta memiliki banyak organel berlapis membran yang berada di sitoplasma. Pada tinjauan pustakaini,akandibahaskhususpadaseleukariotikyangmemilikisitoplasmadan inti sel (nukleus) (Junqueira et al., 2007). Masing-masing komponen sel memiliki penjelasan sebagai berikut : 1. Membran Plasma Membranplasmamerupakanbagianterluardarisel,berbentukbarrieryang membatasibagianintraseldanekstrasel,lapisaninimembantumenstabilkan keadaanyangkonstanuntukaktifitasselnormal.Membranplasmasendiri merupakansawarselektifyangmengaturkeluarmasuknyamateripadasel. 9 Membranplasmajugaberperanpentingpadakomunikasiantarselmaupun dengan lingkungan luar sel (Tortora et.al., 2009). 2. Sitoplasma Sitoplasmaadalahseluruhdaerahantaranukleusdanmembranyang membatasisel.Sitoplasmasendirimemilikimediumsemicairyangdapat disebutdengansitosol,dimanadidalamsitosoltersebutterdapatorganel-organelyangmemilikibentukdanfungsiterspesialisasi,sitoskeleton,serta deposit karbohidrat,pigmen, dan lipid(Junqueira et al., 2007; Campbellet al., 2002). 3.Nukleus Nukleus atauyang dapat disebut sebagai inti sel, merupakan organel paling mencolokpadaseleukariotik,denganrata-ratamemilikidiameter5m. Nukleussendirimemilikisebagianbesargenyangberfungsimengontrolsel eukariotik,dimanasebagiangenlainnyaterdapatpadamitokondriadan kloroplas.DidalamnukleusterdapatkromatinyangterdiridariDNAdan protein. Kromatin akan memadat serta tiap-tiap kromosom akan terlihat ketika selbersiapuntukmembelah.Dalamnukleusterdapatpulanukleolusyang merupakan tempat komponen ribosom di sintetis. Nukleus sendiri mempunyai selubung yang terdiri dari dua membran yang dipisahkan ruang sempit berpori banyak (Campbell et al., 2002). 4. Ribosom Ribosomadalahtempatdimanaselmensintesisprotein.Ribosomterletak pada dua tempat, yaitu ribosom bebas yang terletak dalam sitosol dan ribosom terikatyangmelekatdibagianluarretikulumendoplasma(Campbelletal., 2002). 10 5. Sistem endomembran Sistem endomembran mencakup selubung nukleus, aparatus golgi, retikulum endoplasma, lisosom, berbagai jenis vakuola, serta membran plasma. Retikulumendoplasmamerupakanjalinandarikantungdansaluranyang saling beranastomosis serta berhubungan,yang dibentuk oleh membran utuh. Retikulum endoplasma terdiri atas jaringan tubulaserta gelembung membran yang disebut juga sisterna. Retikulum endoplasma sendiri terbagi menjadi dua daerahyangmemilikifungsidanstrukturyangberbeda.Padaretikulum endoplasmahalustidakmemilikiribosomdipermukaannyatetapimemiliki sisterna yang berbentuk tubular. Sedangkan pada retikulum endoplasma kasar memilikiribosompadapermukaan,sertamemilikisisternayangmembentuk kantungpipih.Retikulumendoplasmakasariniseringditemukanpadasel yangberfungsikhususuntukmensekresiproteinsepertifibroblasdansel plasma (Campbell et al., 2002 ;Junqueira et al., 2007). AparatusGolgiterdiridarikantungmembranpipihatausisteranayang tampaksebagaitumpukanrotiyangberbentukbulatdandatar.Aparatusini dapatmenerimasertamengirimkanvesikulatranspordanprodukyang dikandungnya.Makadaripadaitu,materiyangditerimadariretikulum endoplasma,dimodifikasilaludisimpandalamaparatusgolgi,danakhirnya dikirimmenujupermukaanselatautempatyanglainnya(Campbelletal., 2002). Lisosommerupakantempatterjadinyaprosespencernaanintraselserta penggantiankomponen-komponensel.Lisosomterdiridarivesikelyang bermembrandanmengandungberbagaimacamenzimhidrolitik.Lisosom memilikibentukbulat,dengandiameter0,05-0,5msertamemperlihatkan granulyangmerata.Lisosominiakanbanyakterdapatpadaselyang mempunyai fungsi fagositik(Junqueira et al., 2007). Vakuola merupakan kantung terikat membranyang berada dalam selyang memilikifungsibermacam-macam,sepertivakuolakontraktil,vakuola 11 makanandansebagainya.Padaintinyavakuolaadalahkomponensebuahsel yang memiliki fungsi sebagai tempat penyimpanan (Campbell et al., 2002). 6. Organel membran lain Adaorganelmembranlainyangbelumdijelaskan,yaitumitokondriadan peroksisom.Mitokondriaadalahorganelberbentukbulatyangmempunyai lebar0,5-1m,sertapanjangdapatmencapai10m.Mitokondriaini memilikifungsiuntukmengubahenergikimiawimetabolityangadapada sitoplasmamenjadienergiyangmudahdimanfaatkanolehsel(Junqueiraet al., 2007). Peroksisomadalahruanguntukmetabolismekhususyangdilingkupioleh membran tunggal,yang mengandung enzim yang dapat mentransfer hidrogen dariberbagaisubstratkeoksigen,sehinggadapatdihasilkanhidrogen peroksida(H2O2)yangmenjadiproduksamping.Contohnyaadalah peroksisomyangterdapatdalamhatiyangberfungsimenawarkanracun alkoholdanberbagaisenyawayangberbahayalainnyadengancara mentransfer hidrogen dari racun menuju ke oksigen (Campbell et al., 2002). 7. Sitoskeleton Sitoskeletonmerupakanjaringanyangkomplek,terdiridarimikrotubulus, filamen aktin, serta filamen intermediat. Protein struktural ini memberi bentuk padaseldanjugaberperanpentingbagipergerakanorganelsertavesikel intrasitoplasmanya.Sitoskeletonjugaikutsertadalammengaturpergerakan sel (Junqueira et al., 2007; Campbell et al., 2002). 2.1.3. Morfologi Neuron Manusiapadadasarnyamemilikikuranglebih100miliarneuron.Neuronini berkejapadasarafpusatsebagaipenghantarimpulskesellainnya.Peranneuron sangatbesarpadasistemkerjaotakdikarenakanneuronmemilikibagianyang 12 membantukerjaneuron.Bagiantersebutadalahdendrit,badansel(somaatau perikarion) dan akson (Junqueira et al., 2007 ; Bloom et.al.,2012). Berikut ini adalah penjelasan dari bagian-bagian neuron tersebut : 1.Dendrit Padadasarnya,dendritmempunyaicabangdanmeluas,sertapercabangan daridendritiniakandiikutiolehberkasmikrotubulidanneurofilamenyang secarabersamaanakanikutmeluasdalamcabang-cabang.Dendritsecara khususmempunyaifungsiyaituuntukmenerimastimulusdarilingkungansel-selepitelsensorikataudarineuronlain(Junqueiraetal.,2007;Leeson et.al.,2012). 2.Badan sel (perikarion) Badanselmerupakanbagiandarineuronyangmengandungintidan sitoplasmanamuntidakmencakupcabang-cabangsel,yangmerupakanpusat trofik bagi keseluruhan sel saraf serta berfungsi untuk menerima stimulus. Pada sitoplasmabadanseliniterdapatbadanNissl,keompleksGolgi,mitokondria, danneurofilamen.BadanNissladalahgambarandariretikulumendoplasma kasar dan ribosom bebas yang apabila dilihat di bawah mikroskop cahaya akan tampak sebagai daerah yang bergranul basofilik, dimana badan Nissl merupakan organel yang hanya terdapat pada sel-sel saraf. 13 Gambar 1. badan Nissl dengan pewarnaan toluidin blue (Junqueira et al., 2007) 3.Akson Aksonadalahsuatucabangtunggal,berbentuksilindris,timbuldaribadansel saraf pada suatu daerah yang dapat disebut akson hilok. Akson mempunyai fungsi khususyaitu menghantarkan impuls saraf ke sel-sel lain seperti sel saraf, sel otot, dan sel kelenjar 2.1.4. Respon Sel Terhadap Stres Apabilaadaperubahanpadalingkungan,yangberupastressfisiologis maupunpatologis,makaseldituntutuntukmempertahankankelangsunganhidupnya dengan melakukan mekanisme adaptasi, yang dimana pada mekanisme tersebut dapat diikuti oleh perubahan struktur maupun fungsi dari sel tersebut. Apabila adaptasi sel terhadapsuatustresberhasil,makaseltersebutakantetapnormal,inidisebutjuga denganhomeostasis,dimanakeadaanselyangmampumempertahankanfungsinya dariberbagaiketidakseimbangan.Namunapabilaprosesadaptasitersebuttidak 14 berhasil, sel akan mengalami cedera atau kematian (Kumaret al., 2007 ;Damjanov, 1999). Perubahan struktural atau cederayang terjadi pada sel dapat bersifatreversible dan irreversible. Dikatakan reversibel apabila sel dapat kembali normal bila paparan streshilang.Namunapabilapaparanstrestersebutberlangsungkronisatausel tersebuttidakmampuuntukmelakukanmekanismeadaptasipadapaparanstres tersebut, maka sel akan mengalami perubahan ireversibel, yaitu dapat berupa nekrosis hingga kematian sel. Apabila cedera atau kerusakan terjadi pada membran sel, DNA, ataumitokondria,mekanismekematianselyangterprogramakanterjadi,ataudapat disebut apoptosis (Stevens et.al.,202 ; Damjanov, 1999 ; Kumar et.al.,2007) Padaumumnyasemuajaringantubuhrentanterhadapperubahanyang berlangsung terus-menerus, begitu pula dengan jaringan saraf. Neuronyang terpapar stresdalamjangkawaktuyangpanjangakanmenimbulkansuatuperubahanatau mengalamidegenerasi.Degenerasineuronmenunjukkanadanyagambaranberupa pembesarandandistrofipadaserabutsaraf,pembengkakannukleus,sertahilangnya nukleusapabiliadilihatmenggunakanpengecatanbodiansilver.Namunpada pengecatancresylvioletdapatterlihatgambaranvakuolisasisitoplasmaserta pembengkakan nukleus (Champy et al., 2004). Gambar 2. Gambaran degenerasi neuron di substansia nigra pada pengecatan bodian silver(ditunjukkanolehhurufcdane)danpengecatancresylviolet (ditunjukkanolehhurufddanf),yangditunjukkandenganvakuolisasi sitoplasma(f),pembesarandandistrofinukleus(e,tandapanahkecil), distrofi serabut saraf (e, tanda panah besar) (Champy et al., 2004). 15 2.1.5 Histopatologi Neuron Otak Beberapagambaranhistopatologidapatterlihatakibatpaparanzatasingpada tubuh,diantaranyaadalahakumulasilipofuscin,kromatolisis,dannekrosis (McMartin et al., 1997). Granulalipofuscinmunculdidalamsitoplasmaselneuronatauselglia. Munculnyagranulalipofuscininieratkaitannyadenganprosespenuaanpadatikus ataudapatpulaakibatadanyapaparanzatkimiasepertiachetylethyltetramethyl tetralin( McMartinet al., 1997).Kromatolisisterjadiapabilaadakerusakanaxonalyangparahdanmendekati bagian ujung proksimaldariaxon tersebut. Sel neuronyang mengalami kromatolisis akantampakmembesardannukleusterdorongkebagianpinggirsel,sedangkan badan Nissl nya tampak pucat (McMartin et al., 1997). Gambar 3Gambar 4 16 Lipofuscin (McMartin et al., 1997) Kromatolisis ( McMartinet al., 1997) Nekrosisselneuronakanterjadisetelahadanyapaparanzatneurotoksikatau apabilaselmengalamiiskemia.Somapadaselneuronakantampakmengecil, kemudianpadatahapselanjutnya,ketikakaryorrhexisataukaryolysismuncul, nekrosis pada sel neuron akan tidak dapat dibedakan dari sel lainnya pada mikroskop (McMartin et al., 1997). Selanjutnyaadalahadanyavakuolisasiyaitubentukreaksiselyang menyebabkanadanyaruanginterselulerdanekstraseluleryangditandaidenganinti mendesakkebagiantepiataudapattampakmembesardanmenggelembung (McMartin et.al., 1997). Gambar 5. Gambar 6. Neuronal necrosis ( McMartinet al., 1997)Vakuolisasi (McMartin et.al 1997) 17 2.1.6 Substansia NigraSubstantiaNigramerupakannukleusmotorikyangberukuranbesar,terletak padaotaktengahbagianventraldiantararednucleusdancerebralpeduncle,serta ditemukan di mesencephalon. Substantia nigra adalah bagian dari ganglia basal yang mengandungneurondopaminergiksertanon-dopaminergik,yangterbagimenjadi2 bagian,yaitusubstantianigraparskompaktadansubstantianigraparsretikulata. Substantianigraparskompaktaterbagiatasbagiandorsaldanventral,yangdimana neuronparaparskompaktaadalahneurondopaminergikyangmengandung neuromelaminpigmen.Sedangkansubstantianigraparsretikulatamengandung neuron non dopaminergik yang tidak memiliki pigmen (Halliday, 2004). Gambar 7. Gambaran potongan substansia nigra secara coronal (Tortora.2009). Substantia nigra berfungsi mengatur tonus otot yang terhubung dengan korteks serebri,medullaspinalis,hipotalamus,sertagangliabasal.Neuron-neurondi substantianigratersebutakanmengirimkanakson-aksonnyakestriatum(neuron SNC)sertamelepaskandopamindiujung-ujungnyasebagaineurotransmitter,dan 18 neuron-neurondisubstansianigratersebutakanmengirimkanakson-aksonnyake striatum(neuronSNC)sertamelepaskandopamindiujung-ujungnyasebagai neurotransmitter,danketalamus(neuronSNR)denganmelepaskanGABAsebagai neurotransmitter.Adanyadegenerasipadaneurondisubstansianigraakan menyebabkan terjadinya penyakit parkinson (Snell, 2006; Halliday, 2004). 2.2. Kerangka Teori Daun sirsak (Annona muricata) Senyawa acetogenins Menembus sawar darah otak (blood brain barrier) Penghambatan kompleks I mitokondrial Penurunan produksi ATP Degenerasi sel 19 Pembengkakan Sel 2.3. Kerangka Konsep Ekstrak air daun sirsak(Annona muricata)Degenerasi sel 2.4. Hipotesis 1.Ada pengaruh pemberian ekstrak air daun sirsak (Annona muricata) secara kronik terhadap rasio nukleus neuron pada substantia nigra tikus (Rattus norvegicus). 2.Adaperbedaanrasionukleusneuronsubstantianigratikus(Rattusnorvegicus) antara kelompok kontrol dan perlakuan. Perubahan rasio nukleus Substantia Nigra Perubahan rasio nukleusSubstantia Nigra 20 BAB III. METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitianyangdilakukanolehpenulisadalahpenelitianeksperimental dengan berbasis rancangan posttest only group design. 3.2 Populasi dan Sampel 3.2.1. Populasi Penelitian Populasidalampenelitianiniadalahtikus(Rattusnorvegicus)betinayang diperoleh dari Laboratorium Farmasi Universitas Islam Indonesia 3.2.2. Sampel Penelitian `Sampelyangdigunakandalampenelitianiniadalahtikus(Rattusnorvegicus) betina dewasa galur Sprague-Dawley yang dikembangkan oleh Laboratorium Farmasi Universitas Islam Indonesia yang telah memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi. Kriteriainklusiantaralainadalahtikusyangsehat,tidakcacat,berumur3 bulan,denganberat180-300gram.Sedangkankriteriaekslusipadapenelitianini adalah tikus yang mati pada saat, atau tikus yang sakit pada saat penelitian. Jumlahsampelyangdigunakansebanyak10ekortikus,kemudiandibagi menjadiduakelompokyaitukelompokkontroldankelompokperlakuanyang masing-masing berjumlah 5 ekor tikus. 3.3 Variabel Penelitian 3.3.1. Variabel Terikat Variabelterikatpadapenelitianadalahgambaranhistopatologiyangberupa perubahan rasionucleus neuron atau Substantia Nigra tikus(Rattus norvegicus).3.3.2. Variabel Bebas Variabelbebaspadapenelitianiniadalahekstrakairdaunsirsak(Annona muricata) dengan dosis 1000mg/KgBB/Hari yang diberikan selama 90 hari 21 3.4 Definisi Operasional 1.Ekstrakairdaunsirsak(Annonamuricata)merupakanekstrakyangdibuatdari hasilpengeringandanpenyerbukandaunsirsakyangdiambildaridaunke-4 hinggake-6dalamsaturanting.Dosisyangdigunakanadalah 1000mg/KgBB/Hari selama 90 hari. 2.Rasionukleusneuronsubstantianigratikus(Rattusnorvegicus)merupakan perbandinganantaradiameternukleusdengandiametersomaneuronsubstantia nigratikus(Rattusnorvegicus).Diameternukleusdansomaadalahbesarnya rata-ratadaripenjumlahanantaradiameterterpanjangdanterpendekbaik nukleusmaupunsomayangkemudiandinyatakandalamukuranmikrometer. rumusannya sebagai berikut :Pengukuran diameter nukleus. ( diameter nukleus terpanjang+ diameter nukleus terpendek )2 Pengukuran diameter soma ( diameter soma terpanjang + diameter soma terpendek )2 3.Masing-masingsampeldiberipewarnaanmenggunakanHematocylineosin yangkemudiandiambil5lapanganpandangdenganperbesaran400x. pengamatan diameter nukleus dan soma neuron menggunakan mikroskop CX 21 yangterhubungdengankameraOptilabviewerdenganpencitraan640x480dan komputer yang memiliki software image raster 3.5. Instrumen Penelitian 1. Alat penelitian a.kandang untuk pengelompokan tikus b. spuit sonde c.alat pemotong jaringan d.kaca objek 22 e. deck glas f.mikroskop cahaya g. pencetak blok jaringan 2. Bahan penelitian a. Tikusbetina(rattusnorvegicus)galurSprague-Dawleyberumur3 bulan dengan berat 175 - 300 gram. b.Bahan uji daun sirsak (Annona muricata) diperoleh dan diekstraksi di LaboratoriumPenelitiandanPengujianTerpadu(LPPT)Universitas Gajah Mada. c.Zat pewarna HE d.Etanol e.Parafin d.cloral hydrat 3,5% f.Aquades 3.6 Tahap Penelitian 3.6.1. Koleksi Daun Sirsak (Annona muricata) Daunsirsakyangdigunakandalampenelitianiniadalahdaunsirsakyang diambil pada daun ke-4 sampai ke-6 tiap rantingnya 3.6.2 Pembuatan Ekstrak Air Daun Sirsak (Annona muricata) ProsesekstraksidilakukandiLaboratoriumPengujianLPPT-UGM.Daun sirsakyangtelahdiambiltadidicucuibersih,kemudiandikeringkandalamalmari pengeringdengansuhu45OCselama48jam.Kemudiandilakukanproses penyerbukan,daunsirsakdiserbukmenggunakanmesinpenyerbukdengansaringan yang lubangnya berdiameter 1mm. 23 Air ditambahkan pada serbukan daun sirsak, kemudian diaduk selama 30 menit dan didiamkan selama 24 jam, kemudian hasilnya disaring. Proses tersebut diulang 3 kali. Hasil dari penyaringan akhir didapatkan ampas dan filtrat. Filtratkemudiandiuapkandenganvacuumrotaryevaporatorpemanaswater bath pada suhu 60OC. hasil dari penguapan terbentuk ekstrakyang kental, kemudian dituangkan dalam cawan porselin dan dikeringkan pada suhu 50O. 3.6.3. Persiapan Hewan Coba Hewancobamenggunakantikus(Rattusnorvegicus)betinadewasayang berjumlah10ekor,kemudiandibagimenjadikelompokkontrolyangberjumlah5 ekordankelompokperlakuandenganjumlah5ekor.Pembagiantikuskedalam kelompok dilakukan secara random. Pemeliharaan hewan coba dilakukan dalam kandang dengan ukuran 40x20x20 cm3.Suhudalamkandangdiatursesuaisuhukamar.Pencahayaandalamkandang diaturmenggunakansiklusgelapterang,denganmasing-masingsiklusselama12 jam. Siklus terang dimulai dari pukul 07.00 WIB dan siklus gelap dimulai pada pukul 19.00WIB.Pemberianmakanhewancobadilakukanpadapukul06.00WIB sedangkan pemberian air minum diberikan dengan caraad libitum. 3.6.4. Pemberian Ekstrak Air Daun Sirsak Hewancobadiberiekstrakairdaunsirsakdengandosis1000mg/KgBB/Hari dengan menggunakan sonde oral. Sondase dilakukan selama 90 hari. 3.6.5. Pengambilan Jaringan Otak Pengambilanjaringanotakdilakukanpadaharike-91.Tikusdibiusterlebih dahulu menggunakan chloral hydrat 3,5% dalam aquadest dengan dosis 1cc/100gram BBtikussecaraintraperitoneal.Setelahitudilakukanperfusitranskardial menggunakan0,2%paraformaldehiddalamlarutanphospatebuffer(PB)0,1M,pH 7,4padasuhu37OC,dengankecepatanantara15-20ml/menitsebagaipre-rinse, 24 dilanjutkandenganlarutanfiskatif2%paraformaldehiddalamPB0,1M.PH7,4 dengan suhu 40C selama 20 menit dengan kecepatan yang sama. Pembukaanronggathoraxdilakukandenganinsisimedianapadadinding abdomenbawahkemudianditeruskandenganinsisisepanjanglineaaxillarissampai ronggathoraxterbuka.Kanuladimasukkanhinggamencapaiaortaascendendan difiksasimemakaiklemarterimelaluiventrikelkiriyangsebelumnyatelahdiinsisi. Insisipadaatriumkanandilakukandengantujuanmengeluarkandarahagartidak kembalikejantung.CairanperfusiPBSdialirkanmelaluikanulaselama5menit. Perubahanwarnadarahyangkeluarmelaluiatriumkananmenjadijernihdanarteri mamariainternatampakputihkarenaterisicairanmerupakantandabahwaperfusi telah masuk ke otak dan jaringan lainnya. Setelah berlangsung selama 5 menit, cairan perfusiPBSdigantidengancairanfiksatifmelaluikanulayangsamaselama20 menit.Tandakeberhasilanprosesfiksatifdapatdiketahuimelaluiperubahan ekstremitas yang menjadi kaku, arteria mamaria interna berwarna putih. Setelahprosesperfusitranskardialtelahsempurnadilakukan,dilanjutkan dengan dekapitasi dan lalu pengambilan jaringan otak tikus. Jaringan otak yang telah diambil kemudian difiksasi dengan larutan 2% paraformaldehid dalam PB 0,1 M, pH 7,4 pada suhu 4OC selama 24 jam. 3.6.6 Proses Blok Parafin dan Sayatan Preparat Sayatankoronalotakdenganketebalan5mmdidehidrasidenganetanol bertingkatberturut-turut50%,70%,80%dan95%,diakhiridengantigakalilarutan etanol100%.Semuaprosesdehidrasidilakukanpadasuhukamar.Setelahdehidrasi dilakukanprosespenjernihan(clearing)dalamlarutancampuransiloldanetanol 100%,danduakalisilolmasing-masingselama45menitpadasuhukamar.Setelah prosesclearing,dilakukanprosesinfiltrasidalamlarutancampuransiloldanparafin kemudiandilanjutkandengantigakalilarutanparafin,masing-masing45menit, dengansuhu64C.Terakhirjaringandiletakkandalamcetakanblokkemudiandi 25 siramparafincairdandidinginkanpadasuhukamarsampaiparafinmembeku menjadi blok. Blokparafinjaringanotakdisayatsecaraserialsetebal12mmmenggunakan rotarymicrotome.Setiapserialdiambiltigasayatandandiwarnaimenggunakan Hemaktosilineosinuntukmengetahuimelihatneuronsubstansianigradengan mencocokkanposisidengangambarpotonganotakpadaTemplateAtlasofthe Primate Brain (Martin dan Bowden, 1996). 3.7 Cara Pengumpulan Data Efekpemberianekstrakairdaunsirsak(Annonamuricata)diamatidari banyaknyaselyangmengalamivakuolisasidanperubahanrasioselneuron Substantia nigra pada pengecatan hemaktosilin eosin. Pengamatandilakukanoleh1orangpembacauntukmasing-masingpreparat denganmenggunakanmikroskopcahayaOlympusCX21yangdilakukandi Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. 3.8 Rencana Analisis Data Perbandingan rasio nukleus dan soma padaSubstantia nigraantara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol akan dianalisa menggunakan uji t-test. 3.9 Etika Penelitian 1.PenelitiandilakukandenganmengajukanpermohonanizinkepadaFakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. 2.Penelitiandilakukandenganmengajukanpermohonanizinkepadalaboratorium yang terkait. 3.Penelitian dilakukan pada tikus yang sehat. 4.Dilakukan pembiusan sebelum dilakukan dekapitasi 26 BAB IV. HASIL PENGAMATAN 4.1. Hasil Penelitian 4.1.1. Deskripsi Subjek Penelitian Subjekpenelitiandibagimenjadi2kelompok,yaitukelompokkontroldan kelompokperlakuandengansetiapkelompokterdiridari5tikus.Tikusyang digunakan dalam penelitian adalahtikus betina yang sehat dan tidak cacat, berumur 3 bulan dengan berat badan175 sampai 250 gram. Penentuan tikus sehat berdasarkan hasil laboratorium darah tikus berupa Hb. Nilai normal Hb tikus (Rattus norvegicus) adalah 10-16,8 g/dl (Mitruka, 1987). Berikut adalahtabel berat badan dan Hb pada tikus kontrol dan perlakuan. Tabel 1. Berat badan subjek penelitian KelompokSubjekBerat Badan (gram) Kontrol K1200 K2188 K3178 K4207 K5218 Perlakuan P1225 P2208 P3200 P4228 P5225 27 Tabel 2. Kadar Hemoglobin (Hb) Subjek Penelitian KelompokSubjekKadar Hb (gram/dl) Kontrol K114.9 K212.5 K312.8 K412.8 K514.9 Perlakuan P113.0 P214.5 P312.5 P411.2 P513.6 Berdasarkanhasilpemeriksaanpadatabel1didapatkanhasilberatbadanpada kelompok kontrol terendah 178, tertinggi 218 dan kelompok perlakuan terendah 200, tertinggi228.DanhasilpemeriksaanHbyangterdapatpadatabel2,kadarHb kelompokkontrolterendah12,5,tertinggi14,9sedangkanpadakelompokperlakuan terendah 12,5, dan tertinggi 14,5 dengan rata-rata 12,92. Berdasarkan hasil pemeriksaan berat badan padatabel 1 dan Hb pada tabel 2 menunjukkanbahwaberatbadantikussesuaidengankriteriadalampenelitiandan hasil pemeriksaan Hb dalam batas normal. 4.1.2. Hasil Pengamatan Rasio Nukleus Substantia Nigra Rasionukleusmerupakanperbandingandiameternukleusdansomapada substantianigrayangdiukurmenggunakanSoftwareImageRaster.Padapengukuran tersebutdiukurdiameterterbesardarinukleus,kemudiandiukurdiameterterbesar padasoma.Hasilyangdidapatkemudiandibandingkan,sehinggadapatdiketahui rasio nukleus. 28 Gambar 8. Cara Pengukuran Rasio Menggunakan Image RasterPerbesaran 100x Rasionukleuskemudiandimasukkanpadatabel.Hasilpengukuranrasionukleus pada penelitian ini dapat dilihat pada tabel dibawah berikut: Tabel 3. Hasil Pengukuran Rasio Nukleus KelompokSubjekRasio Nukleus Kontrol K10.58 K20.61 K30.63 K40.58 29 K50.44 Perlakuan P10.63 P20.66 P30.67 P40.66 P50.68 Daridatapadatabel3tersebut,kemudiandilakukanujinormalitasmenggunakan SoftwareIBMSPSSver.21untukmenilainormalitasdistribusidatayangakan dianalisis,sebelumselanjutnyadianalisismenggunakanUjiT-Test.Darihasiluji normalitas didapatkan hasil sebagai berikut : Tabel 4. Hasil Uji Normalitas. Tests of Normality KELOMPOKKolmogorov-SmirnovaShapiro-Wilk StatisticdfSig.StatisticdfSig. Perbandingan Kontrol.3645.029.8005.081 Perlakuan.3005.161.9085.453 a. Lilliefors Significance Correction Data pada tabel 4 tersebut, yang digunakan adalah bagian Shapiro-Wilk karena datayangdigunakandalampenelitianadalah 50 (Sopiyudin, 2011). Pada kolom Sig,menunjukkanangka0.081padakontroldan0.453padaperlakuanyangberarti data yang digunakan memiliki distribusi yang normal ( P> 0.05). SelanjutnyadilakukananalisismenggunakanmetodeIndependentSampleT-Testdengantujuanuntukmengetahuiadakahperbedaanmeanataureratayang bermakna antara 2 kelompok bebas yang berskala rasio (Sopiyudin, 2011). Hasil dari analisis Independent-Sample T-Test rasio nukleus substantia nigra sebagai berikut : 30 Tabel 5. Hasil Independent-Sample T-Test Darihasilanalisisdiatas,dapatdilihatpadabagianSig.(2-tailed)didapatkanangka 0.028dimanaangkatersebut