S K R I P S I

ENY NURYANI

PENUMBUHAN KALUS OlOSCOREA PENTAPHYLLA L. DAN KALUS AGAVE AMANlENStS TREL.& NOWELL PADA MEDIA CAIR

DAN DETEKS1 STEROIQNYA

M IL I KPLRPUS i AKAAN

U N IV ti * u l A S A l K L A N G w v ’

b L K B \ Y A

r f wr/ft

i/ltA

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLAMGGA

S U R A B A Y A

1 9 9 1

PENUMBUHAN KALUS DIOSCOREA PENTAPHYLLA L DAN KALUS AGAVE AMANIENSIS TREL.& NOWELL PADA MEDIA CAIR

DAN DETEKSI STEROIDNYA

SKRIPSI

DIBUAK UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHTH? MENO'APAI GELAR SAltJANA PARMASI

PADA I AKULTAS PARMASI ONIVEESITAS' AIRLANGCT

SURABAYA

1991

oleh ENY NURYANI 058110408

RATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur saya panjatkan pada Allah swt yang telah melimpahkan rahmatHya, sehingga saya da- pat menyelesaikan tugas raenyusun skripsi ini sebagai salah satu syarat mencapai gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Hasil yang diperoleh dari skripsi ini sangat seder- hana dan jauh dari sempuma* Tetapi saya berharap hasil yang sederhana ini dapat bermanfaat bagi penelitian- penelitian selanjutnye. dan bagi pihak-pihak yang membu- tuhkan.

Untuk itu perkenankanlah pada kesempatan ini saya mengucapkan rasa terima kasih yang tulus dan sedalam- dalamnya kepada Almamater Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberi kesempatan belajar dan mendidik saya selama ini*

Terima kasih saya sampaikan pula kepada Bapak DR* G-unawan Xndrayanto, Ibu Dra. Wahyu Utami, MS sebagai pembimbing, yang telah banyak raeluangkan waktu untuk membimbing, memberi saran, pengarahan serta dorongan moral yang sangat berharga selama saya nelakukan pene- litian hingga selesainya penulisan skripsi ini.

Kepada Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengeta- huan Alam Universitas Airlangga, Ketua Jurusan Biologi

ii

FMIPA dan Laboratorium Bio Medis FMIPA, serta Laborato­rium Biofarmasetika Fakultas Farmasi yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk mempergunakan fasilitas laboratorium.

Ketua Jurusan Biologi Farmasi dan Laboratorium Bio­teknologi Fakultaa Farmasi TJniversitas Airlangga yang telah menyediakan fasilitas selama penelitian.

Tidak lupa kepada Bapak dan Ibu Dosen, rekan-rekan mahasiswa dan semua pihak yang telah memberi dorongan moral dan bantuan, saya sampaikan rasa terima kasih yang setulus-tulusnya. Semoga segala amal baik yang telah di berikan mendapat balasan yang melimpah dari ALLAH SWT. Amin.

Surabaya, Agustus 1991 Penyusun

iii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ..............................iiBAFTAR ISI .................... .........ivDAFTAR TABEL ..............................viiiDAFTAR GAMBAR ..............................ixDAFTAR LAMPIRAN ..............................xiBAB I PENDAHULTJAN .........................1BAB II TIKJAUAN PTJSTAKA ................... .6

I.'Kultur jaringan tanaman ......... . 6II. Faktor-faktor yang mempengaruhi

pertumbuhan kultur jaringantanaman ........................ .7

II. 1. Media kultur jaringan ......... .811.1.1. Komposisi media ......... ..... 811.1.2. Sumber karbon 9II. 1.3. Hormon pertumbuhan ...... ..... 9II.1.4. Agar-agar yang dipergunakan .... 1111.2..Kondisi lingkungan ...... . 1111.2.1. pH media ........ . 1111.2.2. Teraperatur dan cahaya 1211.2.3. Kecepatan agitasi untuk

kultur suspensi ..............13

11.2.4. Tek3tur kalus 14

Halaman

iv

III. Tinjauan tentang Diosoorea pentaphylla L dan metabolit sekundernya ............. ....... 14

IV. Tinjauan tentang Agave ama-nienais Trel.& Nowell ....... ... 16

V* Deteksi steroid ........ ........ 17BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............ ... 18

I. Alat yang dipergunakan .... ....... 18II. Bahan ....................... ... 1811.1. Bahan kiraia yang dipergunakan .. 1811.2. Bahan percobaan ........ ....... 19III. Tahapan kerja ........... ...... 20111.1.1. Pembuatan media padat ....... 21111.1.2. Pembuatan media kultur

permukaan ............... ... 21111.1.3. Pembuatan media kultur

"pilter paper Bridge t!Technique 22

111.1.4. Pembuatan media kultursuspensi ............ . 22

III.2* Memperbanyak kalus ..... . 23III.3.1. Peraindahan kalus kedalam

media kultur permukaan .... 23

v

111.3*2. Pemindahan kalus padartkultur Filter Paper BridgeI!Technique ................. 24

III.3.3. Pemindahan kalus padamedia kultur suspensi ...... 24

III.4. pemeriksaan kalus ....... . 25III-4.1. Pemeriksaan kalus secara

visual .................... 25111.4.2. Penghitungan indeks per­

tumbuhan kultur permukaan .... 25111.4.3. Penghitungan indeks per-

ntumbuhan kultur FilterPaper Bridge Technique" ..... 26

111.4.4. Penghitungan indeks per­tumbuhan kultur suspensi ..... 26

III.5. Deteksi steroid dari kalussecara KLT ................ 27

BAB XV HASIL PENELITIAN ................... 281. Pemeriksaan kalus secara visual .... 282. Penghitungan indeks pertumbuhan

kalus ........ .................. 333. Deteksi steroid pada kalus ....... 35

vi

BAB V PEMBAHASAN ....................... ..511. Penumbuhan kalus pada kultur

cair ..........................511.1. Perlakuan pada kultur permukaan .. 51

ti1.2. Perlakuan pada kultur Filterpaper Bridge Technique ....•••• 52

1.3. Perlakuan pada kultur suspensi .. 532. Deteksi steroid dalam kalus .....54

BAB VI KESIMPULAN .........................55BAB VII SARAN - SARAN ..................... .56BAB VIII RINGKASAN ..........................57BAB IX KEPUSTAKAAN ....................... .58

vii

DAFTAR TABEL

1* Pemeriksaan kalus secara visual ...... 282. Data makroskopis kalus Diosoorea

pentaphylla L ................... . 293. Data makroskopis kalus Agave ama-

nlensis Trel.& Nowell ................ 304. Indeks Pertumbuhan kalus Diosoorea

pentaphylla L . •..................... 335* Indeks Pertumbuhan kalus Agave

amaniensis Trel.& Nowell ............. 346. Hasil KLT ekstrak chloroform kalus

Diosoorea pentaphylla L ............... . 447. Hasil KLT ekstrak chloroform kalus Dios

corea pentaphylla L sesudah dihidrolisa •. 468. Hasil KLT ekstrak chloroform kalus

Agave amaniensis .. ................. *. 479# Hasil KLT ekstrak chloroform kalus

Agave amaniensis Trel.& Nowell se­sudah dihidrolisa .................... 49

TABEL Halaman

viii

DAFTAR OAHBAR

1. Kalus Dioscorea pentaphylla Lberumur 8 minggu ................... 31

2. Kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell berumur 4 minggu ........ ........... 32

3* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L* Fase gerakn-heksan : etyl asetat = 4 : 1 ....... 36

4* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L. Fase gerak chloroform : etyl asetat = 9 : 1 ..... 37

5. Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L sesudah dihi- drolisa. Fase gerak n-heksan ; etylasetat = 4 : 1 ............. ....... . 38

6. Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L sesudah dihi- drolisa. Fase gerak chloroform : etylasetat = 9 : 1 ............. ........ 39

7* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell. Fase gerak n-heksan : etyl asetat = 4 : 1 .... 40

GAMBAR Halaman

ix

GAMBAR Halaman

8* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell. Fase gerak chloroform : etyl asetat « 9 : 1 .. 41

9* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell sesudah dihidrolisa. Pase gerak n-heksan: etyl asetat = 4: 1 .............. . 42

10. Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell sesu­dah dihidrolisa. Pase gerak chloroform etyl asetat = 9 : 1 .......... ...... 43

x

DAFTAR LAMPIRAN

1. Koraposisi kimiawi media MS ............. 612* Komposisi penampak noda anisaldehida

sulfat .................... ........... 623* Perbandingan antara IP rata-rata kultur

padat dengan IP rata-rata kultur per­mukaan (agar-agar 0,3 %) dari kalusDioscorea pentaphylla L ................ 63

4- Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata kultur per­mukaan (agar-agar 0,4 %) dari kalus Dioscorea pentaphylla L ................ 66

5. Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata kultur per­mukaan (agar-agar 0,5 %) dari kalus Dioscorea pentaphylla L ................ 69

6. Perbandingan antara IP rata-rata kulturpadat dengan IP rata-rata kultur Filter

ttPaper Bridge Technique dari kalus Dios­corea pentaphylla L ............ ....... 72

LAMPIRAN Halaman

xi

7. Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,3 %) darikalus Agave amaniensis Trel.& Nowell .... 75

8. Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,4 %) darikalus Agave amaniensis Trel.& Nowell .... 78

9. Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,5 %) darikalus Agave amaniensi3 Trel.& Nowell .... 81

10. Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata

ft Mkultur Filter Paper Bridge Technique dari kalus Agave amaniensis Trel.& No­well ......................... ...... 84

11. Tabel nilai t ......................... 87

LAMPIRAH Halaman

xii

iPEUDAHCLUAN 1

1. Latar belakang.Dewasa ini istilah bioteknologi sangat ramai di-

perbincangkan, baik dal am bentuk seminar maupun da- lam bentuk media masa.Secara etimologi, dapat dikatakan bahwa bioteknologi adalah ilmu rekayasa makhluk/jasad hidup. Sehingga secara umum dapat dibedakan atas bioteknologi hewan dan bioteknologi tanaman*Bioteknologi tanaman telah berkembang wawasannya bukan hanya untuk mendapatkan tanaman yang toleran terhadap lingkungan, tanah, iklim serta resisten terhadap hama dan penyakit, tetapi juga bertujuan menaikkan produksi metabolit sekunder*(1)

Berbagai teknik dikembangkan untuk mencapai tujuan tersebut. Satu diantaranya dengan teknik kul­tur jaringan*Kultur jaringan tanaman didasarkan pada konsep yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann (1838) yang menyatakan bahwa organisme terdiri dari sel.Sel sebagai kesatuan biologis terkecil yang mampu mengadakan segala aktifitas yang berhubungan dengan hidup seperti metabolisme, reproduksi dan tumbuh.

BAB I

1

2

Julius Sachs (1865) mengemukakan bahwa proses per­tumbuhan terjadi pada sel-sel maristimatis yang be- lum terdiferensiasi. Didaerah meristem ini pertumbuh an berlangsung karena pembelahan sel, pertambahan plasma, pembesaran atau perpanjangan sel.Diluar daerah meristem baru terjadi diferensiasi. Pada tahap ini akan terjadi berbagai macam bentuk dan ukuran sel yang sesuai dengan fungsinya. Selan- jutnya akan terbentuk individu baru yang sempurna. Kemampuan regenerasi dari tumbuhan ini yang oleh Haberlandt (1902) dan kemudian oleh Sinnott (1950) disebut totipotent.(2)Haberlandt dengan penelitiannya yang berjudul "Expe­riments on the culture of isolated plant cells" te­lah berhasil menanam sel yang diisolasi dari jaring­an tanaman pada medium yang mengandung suatu nutrien (secara in vitro).(3)

Secara umum pertumbuhan kultur jaringan tanaman dipengaruhi oleh 2 faktor, yaitu : (4)

- Kondisi lingkungan kultur jaringan selama inku basi.

- Media kultur jaringan.Kondisi kultur jaringan ini dapat berupa pH media, suhu, cahaya dar; lain-lain, yang secara tunggal atau pun bersama-sama mempengaruhi kecepatan pertumbuhan

3

atau produksi raetabolit sekunder.(4)Sedangkan media kultur jaringan tanaman, pada dasar- nya terdiri dari senyawa kimia yang secara alami di- butuhkan oleh sel untuk kelangsungan hidupnya.Umumnya digunakan media Murashige-Skoog dengan penam- bahan agar-agar untuk membuat media berbentuk gel. Tetapi pemakaian agar-agar dengan konsentrasi yang tinggi dapat mempengaruhi difusi nutrien dan gas yang akhirnya dapat menghambat pertumbuhan kultur jaringan tanaman.(5)Maka perlu dicoba berbagai alternatif penanaman ja­ringan tanaman, baik pada media MS dengan konsentrasi agar-agar yang lebih rendah maupun tanpa penambahan agar-agar, antara lain :

1. Penanaman pada kultur permukaan.2. Penanaman dengan cara filter Paper Bridge

trTechnique .3* Penanaman pada kultur suspensi.Kultur permukaan merupakan cara penanaman pada

media dengan konsentrasi agar-agar 0,2 - 0,5 %•Dengan konsistensi media yang lunak, difusi nutrien oleh sel akan lebih mudah.

Kultur jaringan dapat juga ditumbuhkan pada me­dia cair dengan bantuan kertas saring. Media akan berdifusi melalui kertas saring dan akan diserap

4

oleh sel jaringan tanaman tersebut. Heller memper-kenalkan metode ini. Phillips dan Dodds memperguna-kannya setelah kertas saring diimpregnasi dengan nu-

n fttnsi. Mereka menyebutnya Nurse culture •Goodwin (1966) mempergunakan metode tersebut untuk isolasi kultur meristem pucuk dari Solanum tuberosum dan menamakannya sebagai "Filter Paper Bridge Tech­nique". (3)

Bila kultur jaringan tanaman ditumbuhkan pada media cair, misalnya dalam erlenmeyer dan diagitasi dengan kecepatan pemutaran tertentu maka akan dipe- roleh kultur suspensi.Jika keadaan sesuai dengan yang dibutuhkan, maka agregat dari sel dapat pecah menjadi sel tunggal yang disebut kultur sel.Seperti halnya mikro-organisme maka kultur sel dapat ditumbuhkan pada fermentor/bioreaktor dari liter sampai puluhan liter pada skala industri.Sedangkan untuk skala laboratoris, kultur suspensi dapat dilakukan pada erlenmeyer, dan diagitasi meng- gunakan shaker.(4)

Secara umum penanaman kalus pada media cair mempunyai keuntungan diantaranya : sel tanaman lebih cepat tumbuh pada media cair, pemberian prekursor, substrat maupun bahan berlabel mudah dilakukan.

5

2. Permasalahan.Berubahnya lingkungan dan komposiai media dapat

mempengaruhi kecepatan pertumbuhan dan kandungan me- tabolit kultur jaringan tanaman.Maka dengan mencoba mengubah-ubah konsistensi media diharapkan dapat pula mengubah kecepatan pertumbuhan kalus Dioscorea pentaphylla L dan kalus Agave amani­ensis Trel.& Nowell yang telah dikembangkan pada La- boratorium Bioteknologi Universitas Airlangga yang selama ini lambat pertumbuhannya.Walaupun dalam penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa dalam kultur kalus tersebut mengandung steroid, namun adanya steroid pada kultur cair masih harus di- teliti kembali.

3. Tujuan.penelitian ini bertujuan untuk menumbuhkan kalus

Dioscorea pentaphylla L dan kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell pada media cair dan deteksi steroid- nya.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

I. Kultur jaringan tanaman.Metode kultur jaringan tanaman adalah metode iso

Iasi dan pemeliharaan sel, jaringan atau organ tanam an yang dipisahkan dari lingkungan alamiahnya dan di tanam pada media yang sesuai dal am keadaan steril, sehingga sel-sel tersebut mampu mengadakan pembelah- an dan pertambahan plasma.(6,7)Pembelahan sel ini menghasilkan sekelompok sel yang tidak terdiferensiasi yang disebut kalus.

Bila kalus tersebut dipindahkan kedalam media yang baru dengan komposisi yang cocok dan dengan pe- nambahan hormon pertumbuhan yang sesuai, maka akan terjadi diferensiasi, yang selanjutnya akan terben- tuk individu baru seperti tanaman induknya.

Kultivasi kalus pada media cair menghasilkan kul tur cair, yang dapat dilakukan pada bermacam-raacam metode, diantaranya :

- Kultur permukaan.- Kultur "Filter Paper Bridge Technique".(3)- Kultur suspensi, Yang dapat dibedakan atas ska la pembuatannya, yaitu :(4,5)

- Skala laboratoris pada erlenmeyer.- Skala industri pada fermentor.

6

7

Beberapa peneliti menemukan bahwa pertumbuhan kultur jaringan pada kultur cair, khususnya kultur suspensi lebih baik dari pada pertumbuhan pada media padat* Hal ini disebabkan adanya faktor s

- permukaan sel jaringan yang kontak dengan me­dia cair lebih luas jika dibandingkan pada media padat.

- Adanya pengadukan pada kultur suspensi akan mempermudah transport massa dan oksigen keda­lam sel.

II. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan kultur jaringan tanaman.1. Media kultur jaringan :

1.1. Komposisi media.1.2. Sumber glukosa.1*3* Hormon pertumbuhan.1*4. Agar-agar yang dipergunakan.

2. Kondisi lingkungan kultur jaringan selama inku- basi.2.1. pH media.2.2. Temperatur dan cahaya.2.3. Kecepatan agitasi untuk kultur suspensi.2.4. Tekstur kalus.

8

11.1. Media kultur jaringan.Untuk pertumbuhan kultur jaringan diperlukan

media yang tepat dan harus memenuhi kebutuhan per tumbuhan,proliferasi dan biosintesanya.Untuk itu dalam pembuatannya harus memenuhi unsur unsur hara yang lengkap.

11.1.1. Komposisi media.Komposisl normal media menurut kebutuhan

nutrisi kultur jaringan tanaman adalah sebagai berikut :(6)- Sumber karbon :

- Makro elemen an-organik s

- Mikro elemen an-organik :

- Vitamin

- Fitohormon

sukrosa, glukosa, fruktosa, laktosa.N03 , NH4 , K # Ca Mg , S04.bermacam-macam lo- gam berat, misalnya Co, Cu, Mo dan lain - lain.tiamin, piridoksin, m-inositol, nikoti- namid.sitokinin, auksin.

9

11.1.2. Sumber karbon.Pada tanaman yang autotrop, sumber energi

didapat dari hasil fotosintesis dari karbon.Pada kultur jaringan tanaman selnya tidak menga lami proses autotropi yang dapat menghasilkan karbon, maka dalam kultur jaringan diperlukan sumber karbon pengganti yang sesuai untuk sum- ber energi.

Sumber karbon yang biasa dipakai ialah su- krosa dengan konsentrasi 2-5 %* Glukosa dan fruk tosa juga sering dipakai pada beberapa kultur. Penelitian yang dilakukan oleh Rokem dkk. menun jukkan bahwa pemakaian sukrosa pada berbagai media dan konsentrasi ternyata mempengaruhi tingkat pertumbuhan dan produksi diosgenin pada kultur suspensi Dioscorea deltoidea, dimana di- dapatkan hasil yang maksimum pada media Murashi ge dan Skoog dengan pemakaian sukrosa 30 gram/ liter.(8)

11.1.3. Hormon pertumbuhan.Tanaman yang tumbuh bebas dialam mempunyai

kemampuan mensintesa komponen yang mempunyai peranan sebagai pengendali dalam pertumbuhan tanaman tersebut. Komponen itu adalah auksin,

10

n nsitokinin, giberelin, abscisic acid dan ethy- len. Dari komponen-komponen tersebut, auksin dan sitokinin diketahui mempunyai peranan yang lebih besar pada tanaman,(5)

Sel-sel atau jaringan tertentu pada tanaman mampu memproduksi auksin dan sitokinin, yang ke mudian dibawa ke "site of action” untuk mengon- trol pertumbuhan tanaman* Tetapi tidak semua sel mampu memproduksi komponen tersebut.(5)Hal ini disebabkan walaupun sel tanaman mempu­nyai informasi genetik untuk mensintesa auksin dan sitokinin, tapi tidak semua sel mampu meng- ekspresikan informasi untuk mensintesa komponen tersebut.Oleh sebab itu sebagian besar sel ta­naman yang ditanam pada kultur jaringan tanaman memerlukan penambahan auksin dan sitokinin dari luar untuk mengontrol pertumbuhan dan pembelah- an sel.(5)Kinetin (furfuryl amino purine) merupakan hor- mon golongan sitokinin yang mempunyai peranan menginduksi pembelahan sel. Sedangkan IAA (in­dole 3 acetic acid), NAA (naphtalene acetic a- cid) dan 2,4-D (dichloro-phenoxy acetic acid) merupakan hormon golongan auksin yang banyak menimbulkan aktifitas fisiologis seperti merang sang pembentukan DNA.(5)

11

II*1.4* Agar-agar yang dipergunakan.Agar-agar merupakan substansi koloid yang

bersifat hidrofilik. Diekstraksi dari Gelidium cartilagenum (Gelidiaceae), Gracilaria confer- voides (Phaerococaceae) dan alga lain yang ter- masuk dalam Rhodophyceae.(9)

Pada pembuatan media kultur jaringan tanam­an, agar-agar dipergunakan sebagai bahan pemben tuk gel* Konsentrasi yang sering dipergunakan adalah 1 % b/v.

Naraun pada konsentrasi yang tinggi agar- agar mempengaruhi difusi nitrisi dan gas yang akhimya akan menghambat pertumbuhan kultur ja­ringan itu sendiri.(3,5)

II.2* Kondisi lingkungan.II.2*1. pH media.

pH untuk pertumbuhan kultur jaringan tanam­an umumnya diatur berkisar antara 5,5 - 6,6. Menurut Tullecke dkk* dari penelitian pada em- pat kultur suspensi dengan menggunakan empat macam media, pH optimum pertumbuhan bervariasi antara 5,5 - 6,6.(10)

IV*. A L- 1 PtUi'Uii A.vAAW

"U N IV fc K a l ' iA S A I K l A N G O A -

S U R A B A Y A

Pada beberapa media kultur jaringan tanam­an ditambah dengan dapar phosphat untuk mence- gah adanya perubahan pH, baik selama proses sterilisasi maupun dalam pertumbuhan.

11.2*2. Temperatur dan cahaya.Kultur jaringan tanaman akan tumbuh dengan

baik pada suhu antara 20 - 28°C dengan suhu op­timum 27°C. Sedangkan untuk kultur suspensi su­hu optimalnya berkisar antara 23 - 28°C.(10)

Cahaya dapat memberikan efek yang bermacam- macam pada kultur jaringan. Pada umumnya kultur jaringan tanaman memerlukan pencahayaan yang merata, seperti yang dilaporkan oleh Blakerly dan Stewart pada pertumbuhan kultur suspensi Haplopappus gravlllis yang menghasilkan kultur yang kompak dengan adanya pencahayaan.(10) Keadaan ini justru terbalik untuk kultur sel Contis japonica yang memerlukan tempat yang ge- lap untuk pertumbuhan dan produksi berberinnya, seperti yang dilaporkan oleh Sato dan Yamada.(11)

13

11.2,3. Kecepatan agitasi untuk kultur suspensi.Seperti halnya mikro-organisme, sel tanaman

dapat ditumbuhkan pada media cair yang disertai dengan pengadukan. Namun hal ini tidaklah mudah, karena ada perbedaan antara sel mikro-organisme dengan sel tanaman,

Sifat sel tanaman yang menghambat aplikasi kultur jaringan tanaman untuk kultivasi secara besar-besaran pada skala industri adalah waktu duplikasi yang lama, sel dalam bentuk agregat dan sifat sel tanaman yang sensitif terhadap gaya geser,(4)

Untuk menghindari gaya geser yang besar, para peneliti menganjurkan penggunaan "Air Lift FermentorT. Namun disisi lain kerugian penggu­naan sistem ini adalah sukar untuk mendapatkan pengadukan yang homogen bila jumlah sel sangat besar. Hal ini dapat mengganggu transport masa dan oksigen kedalam sel.(4)

Rokem dkk. melaporkan bahwa kultur suspensi Dioscorea deltoidea memerlukan aerasi yang ren- dah, tidak tumbuh jika digunakan fermentor yang diagitasi dengan stirer.(8)

Disamping karena sifat sensitif dari sel ta­naman terhadap geseran, kecepatan agitasi dan

14

volume juga merapengaruhi besarnya oksigen yang terlarut pada medianya.

II.2.4* Tekstur kalus.Keberhasilan pembuatan kultur suspensi juga

tergantung dari tekstur kalus yang dimasukkan kedalam media, Makin kompak atau keras kalus maka makin sukar untuk mendapatkan kultur sus­pensi. Seperti yang dilaporkan oleh Sato dan Yamada bahwa produksi berberine yang tinggi ter nyata dihasilkan oleh agregat sel yang kecil dari kultur sel Coptis japonica.(11)

Hal ini mungkin ada hubungannya dengan ke- adaan sel tanaman yang berbentuk agregat yang dapat menyebabkan pengadukan menjadi tidak homo gen. Pengadukan yang tidak homogen akan mengham bat transport massa dan oksigen kedalam sel.

III. Tinjauan tentang Diosoorea pentaphylla L dan meta- bolit sekundernya.

Familia Dioscoreaceae dikenal sebagai jenis ubi-ubian. Pada musim kemarau bagian tanaman diatas permukaan tanah akan mati, tetapi urabi yang tinggal didalam tanah masih tetap hidup. pada musim hujan umbi tersebut akan tumbuh kem­bali.

15

Tanaman Dioscorea dibeberapa negara dikenalh ndengan nama Yam . Merupakan sumber yang penting

untuk pembuatan hormon, misalnya hormon corti- son. (12)

Kandungan tanaman Dioscorea sangat bervari- si, tergantung spesiesnya. Umumnya mengandung glikosida saponin, sterol, tanin, trigliserida dan komponen yang lain.

Sedangkan kedudukan sistematis tanaman ini adalah :(1 3,14)

DivisiAnak divisiKelasBangsaSukuMargaJenis

s Spermatophyta.: Angiospermae.: Monocotyledoneae.: Liliales.: Dioscoreaceae.: Dioscorea.: Dioscorea pentaphylla L,

16

IV, Tinjauan tentang Agave amaniensis Trel.& Nowell.Tanaman Agave amaniensis Trel.& Nowell me-

rupakan tanaman yang tahan terhadap kekering- an. Dapat tumbuh dengan baik didaerah tropis maupun subtropis, Mempunyai nilai ekonomi un­tuk diambil seratnya. Sedangkan di Indonesia jenis ini ditanam sebagai tanaman hias.

Agave amaniensis Trel.& Nowell mengandung senyawa sterol, hekogenin, diosgenin dan se- nyawa lain yang belum diketahui.Klasifikasi tanaman Agave amaniensis Trel.fc Nowell adalah sebagai berikut : (13,14)

DivisiAnak divisiKelasBangsaSukuMargaJenis

Spermatophyta.Angiospermae.Monocotyledoneae.Liliales.Amaryllidaceae.

Agave amaniensis Trel.& No­well.

17

V, Deteksi steroid.Sterol yang terdapat pada kultur jaringan

tanaman dikenal sebagai phytosterol (sitoste­rol, stigraasterol dan kampesterol). Tetapi yang terbanyak diketemukan adalah sitosterol dan stigmasterol, Pada tanaman, sterol dapat menga- lami transformasi menjadi saponin steroid,(5)

Adanya sterol bebas dalam kalus dapat dide­teksi secara KLT dari ekstrak chloroform, se- dangkan sterol yang berasal dari hidrolisa gli- kosida steroid dideteksi dari ekstrak chloro­form sesudah dihidrolisa.

FAB III METODOLOC-I PENELITIAN

I. Alat yang dipergunakan :- Laminar air flow cabinet.- Timbangan.- pH meter.- Autoclave.- Shaking incubator.- Erlenmeyer 250 ml.- Botol kultur.- Fermentor buatan sendiri.- Kiselgel 60 F 254.

II. Bahan.II.1. Bahan kiroia yang dipergunakan.

Media yang dipergunakan adalah media Murashige & Skoog (MS) (1974).Semua bahan kimia yang dipergunakan adalah produksi E Merck Damstadt dengan derajatN _ _ . t !Pro Analisa .Hormon pertumbuhan yang dipergunakan ada­lah Kinetin (Fluka) dan hormon 2,4-D (Sig­ma) .

18

19

Konsentrasi hormon kinetin yang dipergunakan untuk pertumbuhan kultur Diosoorea centa- phylla L adalah 2 ppm, sedangkan untuk kul- tur Agave amaniensis Trel.& Nowell adalah5 ppm.Konsentrasi hormon 2,4-D yang dipergunakan untuk pertumbuhan kultur Diosoorea rentaphy- la L adalah 2 ppm, dan untuk kultur Agave amaniensis Trel.& Nowell 1 ppm.Agar yang dipergunakan adalah produk3i E

n ,ttMerck Damstadt dengan derajat Pro Analisa •

IX.2. Bahan percobaan.Kalus berasal dari kalus Dioscorea

pentaphylla L dan kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell yang diperoleh dari Labora­torium Bioteknologi Jurusan Biologi Far- masi Universitas Airlangga.Kalui3 ini diperbanyak pada media yang sama. Untuk perlakuan percobaan diambil stok ka­lus dengan umur yang sama.

20

III. Tahapan kerja.1. Perabuatan media.

1.1. Media padat.1.2. Media kultur permukaan.1.3. Media kultur "Filter Paper Bridge

ttTechnique .1.4. Media kultur suspensi.

2. Memperbanyak kalus untuk stok selama perco­baan.

3- Pemindahan kalus.3.1. Pemindahan kalus ke media kultur per

mukaan.3.2. Pemindahan kalus ke media kultur

n tiFilter Paper Bridge Technique .3.3. Pemindahan kalus kedalam media kultur

suspensi.4.Pemeriksaan kalus.

4.1. Pemeriksaan kalus yang terjadi seca­ra visual.

4.2. Penghitungan Indeks Pertumbuhan kul­tur permukaan.

4.3. Penghitungan Indeks pertumbuhan kul-n ntur Filter Paper Bridge Technique .

4.4. Penghitungan Indeks pertumbuhan kul­tur suspensi.

5. Deteksi steroid.

21

III.1.1* Fembuatan media padat.Media yang dipakai adalah media MS. Masing-

masing komponen dibuat larutan stok. Dengan mencampur larutan stok akan diperoleh media MS. Hormon pertumbuhan ditambahkan menurut komposi- si, selanjutnya ditambah air suling sampai vo­lume mendekati 1 liter.pH diatur 5,7 dengan penambahan HaOH 0,1N atau HC1 0,1N. Ditambah agar-agar dengan konsentra­si 1% b/v. Ditambah air suling sampai volume tepat 1 liter. Dipanaskan dengan api kecil sam­pai diperoleh larutan yang jernih.Dituang kedalam botol kultur lebih kurang 25 ml dan ditutup dengan aluminium foil.Disterilkan dalam autoclave dengan temperatur 121°C selama 20 menit.(3)Selanjutnya disimpan diruang kultur dengan tem­peratur sekitar 27°CT sampai saat untuk dipergu­nakan.

III.1.2. Pembuatan media kultur permukaan.Pada dasamya sama dengan pembuatan media

untuk kultur pada media padat. Tetapi disini dipakai agar-agar dengan konsentrasi 0,2 - 0,5 % b/v.

22

ftIII.1.3* Pembuatan media kultur Filter Paper bridge>tTechnique ,

Setelah larutan stok dicampur, hormon di- tambahkan menurut komposisi, ditambah air su- ling sampai volume hampir mendekati 1 liter, pH diatur 5,7 dengan penambahan NaOH 0,1N atau HC1 0,1N. Ditambah kembali dengan air suling sampai volume 1 liter.media dituang kedalam erlenmeyer sebanyak 150 ml, ditutup rapat dengan aluminium foil, kemu­dian disterilkan dalam autoclave 121°C selama 20 menit.(3)

III.1.4* Pembuatan media kultur suspensi,Pembuatan media untuk kultur suspensi sama

dengan pembuatan media ^Filter Paper Bridge ttTechnique • Setelah diperoleh media dengan vo­

lume 1 liter, media dituang kedalam fermentor atau erlenmeyer sampai volumenya 20 % dari vo­lume fermentor atau erlenmeyer tersebut.(3) Selanjutnya disterilkan dalam autoclave 121°C selama 20 menit.

23

III.2* Memperbanyak kalus*Kalus yang merupakan bibit diambil dari bo-

tolnya menggunakan skalpel steril. Dipindahkan kedalam media padat. Kemudian ditutup rapat de­ngan aluminium foil (dilakukan dalam "laminar air flow cabinet") dan disimpan diruang kultur dengan temperatur sekitar 27°C.

Kalus diperbanyak pada media yang sama dan pada umur yang sama pula. Kalus ini dipergunakan sebagai stok selama penelitian berlangsung. Ka­lus Diosoorea pentaphylla L dipergunakan pada umur 8 minggu, sedangkan kalus Agave amaniensis Trel.& Howell pada umur 4 minggu.

III.3.1. Pemindahan kalus kedalam media kultur permuka­an.

Pemindahan dilakukan secara aseptis dengan alat-alat dan media yang telah disterilkan ter lebih dahulu. Kalus diambil dari botol kalus dengan skalpel steril, dipindahkan kedalam me­dia kultur permukaan yang telah disterilkan. Kemudian ditutup rapat (dilakukan dalam "lami­nar air flow cabinet'). Disimpan dalam ruang kultur selama 8 minggu untuk kalus Dioscorea pentaphylla L dan 4 minggu untuk kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell.

M J'."U N IV E R S E AS A^JuAft •' |

S U R A B A Y A

24

ti111.3.2. Pemindahan kalus kedalam media Filter PapernBridge Technique .

Media untuk lcultur ter3ebut dituang keda- Xam botol kultur yang telah berisi botol kecil yang dilapisi kertas saring dan telah disteril kan lebih dahulu. Media dituang sampai volume hampir mencapai permukaan kertas saring.

Kalus diambil dari botol kalus dan diletak kan diatas kertas saring. Kemudian ditutup ra-pat dengan aluminium foil. Semua ini dilakukan

i t tt dalam laminar air flow cabinet . Disimpan da-lam ruang kultur selama 8 minggu untuk kalus Dioscorea pentaphylla L dan 4 minggu untuk ka­lus Agave amaniensis Tre.& Nowell. Selanjutnya diperiksa kecepatan perturnbuhannya.

111.3.3. Pemindahan kalus kedalam media kultur suspensi.Kalus diambil dari botol kalus, dipilih

tekstur yang lunak/rapuh. Diambil lebih kurang 1 gram kalus dan dimasukkan kedalam fermentor/erlenmeyer, kemudian ditutup rapat. Semua ini

i t t i dilakukan dalam Laminar air Flow cabinet .ii uErlenmeyer diletakkan pada incubator shaker

dengan kecepatan pemutaran 100 - 130 rpm.(3) Kultur diinkubasi selama 8 minggu untuk kalus Dioscorea pentaohylla L dan 4 minggu untuk ka-

25

lua Agave amanienaia Trel.& Nowell. Selanjut- nya diperikaa kecepatan pertumbuhannya.

III.4. Pemeriksaan kalua.III.4.1. Pemerikaaan kalua yang terjadi 3ecara visual.

Meliputi : - Warna.- Tekatur.- Terjadinya diferenaiasi ael.

Pemeriksaan ini dilakukan pada :- Minggu ke 8 untuk Dioacorea pentaphylla L- Minggu ke 4 untuk Agave amanienaia Trel.& Nowell*

III.4.2. Penghitungan Indeks Pertumbuhan kultur permu- kaan.

parameter perturnbuhan dinyatakan denganIndeks Pertumbuhan yang didefinisikan sebagaiberikut :

IP 3 Berat baaah kalua akhir ^Berat baaah kalua awal

Berat baaah kalua ditentukan dengan cara kalua dikeluarkan dari botol kalua, kemudian ditimbang. Sedangkan berat awal kalus dipero- leh dengan cara :

Berat awal = Berat(media+kalU3) - Berat(media)

26

t iIII.4*3. Penghitungan Indeks Pertumbuhan kalus FilteritPaper Bridge Technique .

Sama seperti pada penetapan kecepatan per­tumbuhan pada kultur permukaan, maka penetapan kecepatan pertumbuhan pada media dengan sistem tersebut juga dinyatakan dengan parameter in­deks pertumbuhan.

III.4.4. Penghitungan Indeks Pertumbuhan kultur suspen- si.

Kecepatan pertumbuhan kultur suspensi di­nyatakan dengan parameter PCV (Packed Cell Vo­lume). Mulut fermentor/erlenmeyer dibakar de­ngan pemanas splritus, dikocok dengan hati-ha ti agar homogen dan dibuka tutupnya.Dituang kedalam gelas ukur dengan volume ter- tentu. Didiamkan dan dicatat volume endapan sel. Maka PCV pada waktu tertentu dapat diten tukan dengan : (15)

Volume endapan sel________________________________ %

Volume suspensi yang diambil

27

III.5* Deteksi steroid dari kalus secara KLT.Kalus dipisahkan dari media, dikeringkan da-

lam lemari pengering pada suhu 40 - 60°C» kemu- dian diserbuk dan dihomogenkan.Ditimbang 1 gram serbuk kalus dan dikocok menggu

n ttnakan vorteks 2 X dengan 10 ml chloroform sela 5 menit. Kemudian disaring, filtrat dipisahkan dan diuapkan untuk dianalisa.

Residu ditambah 20 ml HC1 2N, dikocok denganti nvorteks 1X selama 5 menit. Dinetralkan dengan NaOH, kemudian diekstraksi dengan 10 ml Chloro­form. Fase chloroform dipisahkan, diuapkan dan dianalisa dengan KLT.

Ekstrak yang didapat ditotolkan pada lempeng Kieselgel 60 P 254. Dielusi dengan n-heksan : etilasetat = 4 : 1 atau dengan chloroform : etil- asetat = 9 : 1 * Sebagai penampak noda digunakan anisaldehida sulfat.

Lempeng hasil kromatografi dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 100 - 105°C selama 5 menit. Warna noda yang tampak dan harga Rf di- bandingkan dengan steroid pembanding.

BAB IV HASIL PENELITIAN

1, pemeriksaan kalus secara fisual*Setelah kalus ditanam pada berbagai metode kultur

cair, maka keberhasilannya dapat dilihat pada tabel berikut :Tabel 1 * Pemeriksaan kalus yang terjadi.

Metode Dioscorea Agave amanien-pentaphylla L sis Trel & Nowell

- Kultur permukaan s- Agar-agar 0,2 % - -

- Agar-agar 0,3 % + +- Agar-agar 0,4 % + +- Agar-agar 0,5 % + +

- Kultur ” Filter PaperBridge Technique + +

- Kultur suspensi denganfermentor - -

- Kultur suspensi denganIncubator Shaker - -

Keterangan : - : raati+ ; tumbuh.

28

29

Pemeriksaan kalus meliputi warna, tekstur dan adanya diferensiasi.

Tabel 2. Data makroskopis kalus Dioscorea pentaphylla L

Metode Warna Tekstur Diferensiasi

-Kultur permukaan :- agar-agar 0,3% coklat kehi-

taraankompak tak terjadi

- agar-agar 0,4% coklat muda dan coklat ke hitaman

kompak tak terjadi

- agar-agar 0,5% coklat muda dan coklat kehitaman

kompak terjadi

(42 %)

-"Filter Paper coklat muda kompak ter j adiBridge Tech­ setelah umur (43 %)nique” 7 minggu men

jadi kehitam an

30

Tabel 3* Data makroskopis kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell.

Metode Warna Tekstur Diferensiasi

- Kultur perraukaan :Agar-agar 0,3 % Agar-agar 0,4 % Agar-agar 0,5 %ti- Filter Paper Brid

rtge Technique

kuning muda kuning muda kuning muda kuning ke- coklatan

lunaklunaklunakkompak

tak terjadi tak terjadi tak terjadi tak terjadi

31

Gambar 1 • Kalus Dioscorea pentaphylla L berumur 8 ming-gu :

A. Pada media padat (dengan penambahan agar-agar 1%).

B. Pada kultur "Filter Paper Bridge Tech-ftnique ,

32

Gambar 2. Kalus Agave amanienaia Trel.& Nowell berumur4 minggu.A. Pada media padat (dengan penambahan agar-

agar 1 %)B. Pada media kultur "Filter Paper Bridge Tech

nique".

33

2# Penghitungan indeks pertumbuhan kalus.Penetapan kecepatan pertumbuhan kalus Dioscorea

pentaphylla L dilakukan pada minggu ke 8 dengan pa­rameter indeks pertumbuhan yang dapat dilihat pada tabel berikut :

Tabel 4. Indeks pertumbuhan kalus Dioscorea pentaphylla L

Padat (agar-agar 1 %)

Kultur perarukaan "Filter Pa­

agar-agar0,3%

agar-agar0,49*

agar-agar0,5%

rtTechnique

143,5708 144,3548 267,5573 129,1326 106,8122133,7370 125,9669 185,1587 125,9032 109,0252138,4161 158,7730 131,6183 146,2376 137,3146137,8378 184,2795 139,5372 224,8521 ' 144,1974103,6133 164,7959 139,7229 262,5139 102,2958118,0368 173,0012 115,3409 176,0063 158,7474151,3576 140,1620 126,4447 143,7269 100,9812173,6842165,6144

131,2133149,3734173,0255

139,4939120,2096149,5103

132,4590

x=146,2631 154,4946 151,459> 167,6040 122,7677

Keterangan :- X : Indeks pertumbuhan rata-rata.

34

Untuk kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell , pene- tapan kecepatan pertumbuhan dilakukan pada minggu ke 4 dengan parameter indeks pertumbuhan. Hasil- nya dapat dilihat pada tabel berikut :

Tabel 5 . Indeks pertumbuhan kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell.

Padat (agar-

agar 1#)

Kultur permukaan ”pilter Pa­per Bridge Technique

agar-agar0,3 %

agar-agar 0,4 %

agar-agar0,5 %

463,2140 374,5507 842,1995 743,7673 215,6209560,4651 577,5401 521,0409 531,6510 242,0702320,4175 301,2786 256,4619 426,8802 196,2641223,3909 355,4257 244,2829 349,7295 238,6240226,5332 379,2982 421,6876 485,4305 216,3629295,6113 378,6845 349,0859 325,4373 250,9525272,1009 385,0181 363,3607 358,0549 236,7878284,4629 347,5732 333,6987 498,0159233,5967 307,5710 353,2913 325,5648355,1074 240,3735 243,2143204,8270 352,5513 217,9209284,1206 237,9742228,7712

X=304»0476 378,5489 388,9122 395,3034 288,0975

35

Dari tabel diatas dapat dilihat adanya pe- ningkatan kecepatan pertumbuhan dengan bertambah nya konsentrasi agar-agar. Namun karena adanya variasi nllai indeks pertumbuhan yang besar di- antara kultur perlakuan, maka perlu dilakukan uji perbandingan antara nilai IP rata-rata kul­tur padat dengan IP rata-rata kultur perlakuan, Hal ini untuk mengetahui apakah ada perbedaan nilai IP yang bermakna antara kultur padat dengan kultur perlakuan.(17)Perhitungannya dapat dilihat pada lampiran 3-10.

Hasil perhitungan uji perbandingan tersebut menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan antara IP rata-rata kultur padat dengan IP rata-rata kultur perlakuan. Yang berarti bahwa kecepatan pertumbuh an kultur padat sama dengan kecepatan pertumbuhan semua kultur perlakuan.

3. Deteksi steroid pada kalus.Kromatografi lapisan tipis dilakukan pada

ekstrak chloroform kalus dari masing-masing media perlakuan. Dilakukan sebelum dan sesudah dihidro- lisa. Hasil KLT tersebut dapat dilihat pada gam- bar 3-10.

36

Gambar 3* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla LPase gerak n-heksan : etyl asetat » 4 : 1.

Keterangan :D = Pembanding diosgenin.H = Pembanding hekogenin.S = Pembanding sitosterol.P a Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 1#)P « Ekstrak kalus kultur "Filter Paper Bridge Tech-

nnique .A = Ekstrak kalus kultur perraukaan (agar-agar 0,3%)B =* Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4%)C = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5$)

37

Gambar 4* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dlosco-rea pentaphylla L.Fase gerak chloroform ; etyl asetat = 9 : 1 .

Keterangan :D = Pembanding diosgenin.H = Pembanding hekogenin.S « Pembanding sitosterol.p a Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 1$)F a Ekstrak kalus kultur "Filter Paper Bridge Tech-

nnique •A « Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,3/S) B a Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4$) C = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5?$)

Gambar 5* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L sesudah dihidrolisa*Fase gerak n-heksan : etyl asetat a 4 : 1*

Keterangan :D » Pembandlng diosgenin.H » Pembandlng hekogenin.S o Pembandlng sitosterol.P e Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 1?6)F a Ekstrak kalus kultur "Filter Paper Bridge Tech-

nnique .A =* Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,3%)B = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4/0 C » Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5%)

39

Gambar 6. Kromatogram ekstrak chloroform kalus Dloscorea pentaphylla L sesudah dihidrolisa.Pase gerak chloroform : etyl asetat = 9 s 1.

Keterangan :D = Pembanding diosgenin.H = Pembanding hekogenin.S » Pembanding sitosterol.P = Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 1#)P = Ekstrak kalus kultur "Filter Paper Bridge Tech­

nique •A = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,3%)B s Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4%)C » Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5%)

40

• • f • • • • • • •c t 1 * • o

1 1 ( 1 8

ffambar 7* Kromatogram ekstrak chlorofonn kalus Agave

Keterangan :D = Pembanding diosgenin.H * Pembanding hekogenin.S = Pembanding sitosterol.p » Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 1%) p ■ Ekstrak kalus kultur "pilter Paper Bridge Tech­

nique •A * Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,3%) B = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4%) C = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5%)

amaniensis Trel.& Nowell.pase gerak n-heksan : etyl asetat > 4 : 1

n

f t t » •*

i i i 1 1i

Gambar 8. Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agave

Keterangan :D * Pembandlng diosgenin,5 * Pembanding hekogenin,S * Pembanding sitosterol,P = Ekstrak kalus kultur padat (agar-agar 1&)P * Ekstrak kalus kultur "Filter Paper Bridge Tech­

nique •A * Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,396)B « Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4%)C =* Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5#)

araaniensis Trel.& NowellFase gerak chloroform : etyl asetat * 9 : 1 ,

42

A M A *

1 f

t

Gambar 9. Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agaveamaniensis Trel.& Nowell sesudah dihidrolisa. Fase gerak n-heksan : etyl asetat » 4 : 1*

Keterangan :D * Pembanding diosgenin*H » Pembanding hekogenin.S =» Pembanding sitosterol.p » Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 196)F ■ Ekstrak kalus kultur filter paper Bridge Tech-

rtnique .A a Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,396) B = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,496) C = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5#)

43

Gambar 10* Kromatogram ekstrak chloroform kalus Agaveamaniensis Trel.& Nowell sesudah dihidrolisa. Fase gerak chloroform : etyl asetat a 9 : 1.

Keterangan •D = Pembanding diosgenin.H =* Pembanding hekogenin.S = Pembanding sitosterol.P a Ekstrak kalus dari kultur padat (agar-agar 1%)F » Ekstrak kalus kultur Filter Paper Bridge Tech-

nnique .A = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,3%) B = Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,4%)C *» Ekstrak kalus kultur permukaan (agar-agar 0,5%)

44

Tabel 6. Hasil KLT ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L.

Zat Fase gerak 1 Fase gerak 2

Warna noda Rf Warna noda Rf

- Diosgenin kuning hijau 0,16 kuning hijau kuning hijau

0,280,44

- Hekogenin kuningkuning

0,040,16

kuning 0,34

- Sitosterol ungu 0,22 ungu 0,48- Ekstrak kultur ungu muda 0,06 ungu 0,35padat (agar- ungu 0,22 ungu 0,47agar 1 %) kuning 0,31 kuning 0,64

ungu muda 0,70 ungu 0,83- Ekstrak kultur ungu muda 0,06 ungu 0,35

f!Filter Paper ungu 0,22 ungu 0,47Bridge Tech- kuning 0,31 kuning 0,64

nnique ungu muda 0,71 ungu 0,82- Ekstrak kultur ungu muda 0,06 ungu 0,35

permukaan ungu 0,22 ungu 0,47(agar-agar kuning 0,31 kuning 0,64

0,3%) ungu muda 0,71 ungu 0,82- Ekstrak kultur ungu muda 0,07 ungu 0,36

permukaan ungu 0,22 ungu 0,48(agar -agar kuning 0,31 kuning. 0,640,4%) ungu muda 0,71 ungu 0,82

45

- Ekstrak kultur ungu muda 0,05 ungu 0,36permukaan ungu 0,23 ungu 0,48(agar - agar kuning 0,33 kuning 0,64

0,5%) ungu muda 0,73 ungu 0,83

46

Tabel 7. Hasil KLT ekstrak chloroform kalus Dioscorea pentaphylla L sesudah dihidrolisa.

ZatFase gerak 1 Fase gerak 2

tfarna noda Rf tfarna noda Rf

- Diosgenin kuning hijau 0,17 kuning hijau 0,45-Hekogenin kuning

kuning0,040 ,1 6

kuning 0,35

- Sitosterol ungu 0,23 ungu 0,47-Ekstrak kultur ungu 0,23 ungu 0,46padat ungu 0,65 ungu 0,77

- Ekstrak kultur ungu 0,23 ungu 0,46rtFilter Paper ungu 0,64 ungu 0,78Bridge Tech-

trnique - Ekstrak kultur ungu 0,23 ungu 0,46permukaan ungu 0,66 ungu 0,76

(agar-agar 0,3%) - Ekstrak kultur ungu 0,22 ungu 0,46

permukaan ungu 0,64 ungu 0,78

(agar-agarO, 4/6)- Ekstrak kultur ungu 0,22 ungu 0,46

permukaan ungu 0,63 ungu 0,78(agar-agar 0,5%) . ..

47

Tabel 8* Hasil KLT ekstrak chloroform kalus Agave ama- niensis Trel*& Nowell.

Zat Fase gerak 1 Fase gerak 2

Warna noda Rf Warna noda Rf

-Diosgenin kuning hijau 0,16 kuning hijau 0,46-Hekogenin kuning

kuning0,040,16

kuning 0,35

-Sitosterol ungu 0,21 ungu 0,47-Ekstrak kultur biru ungu 0,06 biru ungu 0,03padat (agar- ungu 0,21 ungu muda 0,06agar 1 % ) ungu muda 0,27 ungu muda 0,20

kuning 0,31 ungu 0,38ungu muda 0,34 ungu 0,47ungu muda 0,46 kuning 0,66ungu 0,63 ungu 0,84ungu 0,70

-Ekstrak kultur biru ungu 0,06 biru ungu 0,03itFilter Paper ungu 0,21 ungu muda 0,05Bridge Tech- ungu muda 0,26 ungu muda 0 ,1 9

mque kuning 0,30 ungu 0,36ungu muda 0,34 ungu 0,46ungu muda 0,45 kuning 0,64ungu 0,63 ungu 0,83ungu 0,70

48

-Ekstrak kultur biru ungu 0,06 biru ungu 0,03permukaan ungu 0,21 ungu muda 0,06(agar -agar ungu muda 0,26 ungu muda 0,190,3 % ) kuning 0,31 ungu 0,36

ungu muda 0,34 ungu 0,46ungu muda 0,45 kuning 0,64ungu 0,63 ungu 0,82ungu 0,69

-Ekstrak kultur biru ungu 0,06 biru ungu 0,03permukaan ungu 0,21 ungu muda 0,06(agar -agar ungu muda 0,28 ungu muda 0,19

0,4 % ) kuning 0,31 ungu 0,36

ungu muda 0,34 ungu 0,46

ungu muda 0,46 kuning 0,64ungu 0,62 ungu 0,81ungu 0,70

-Ekstrak kultur biru ungu 0,06 biru ungu 0,03permukaan ungu 0,21 ungu muda 0,05(agar .agar ungu muda 0,28 ungu muda 0,18

0,5 % ) kuning 0,31 ungu 0,36ungu muda 0,34 ungu 0,46ungu muda 0,46 kuning 0,63ungu 0,63 ungu 0,81ungu 0,70

49

Tabel 9* Hasil KLT ekstrak chloroform kalus Agave ama- niensis Trel.& Nowell sesudah dihidrolisa.

Fase gerak ' Fase gerak 2Zat Warna noda Rf Warna noda Rf

-Diosgenin kuning hijau 0,17 kuning hijau 0,48-Hekogenin kuning

kuning0,050,16

kuning 0,39

-Sitosterol ungu 0,22 ungu 0,49•Ekstrak kultur ungu 0,06 ungu 0,05

padat (agar- ungu 0,12 ungu 0,35agar 1 % ) ungu 0,21 ungu 0,44

ungu 0,58 ungu 0,71•Ekstrak kultur ungu 0,06 ungu 0,06

itFilter Paper ungu 0,12 ungu 0,35Bridge Tech- ungu 0,21 ungu 0,43

nnique ungu 0,58 ungu 0,68-Ekstrak kultur ungu 0,06 ungu 0,05

permukaan ungu 0,12 ungu 0,34(agar-agar 0,390 ungu 0,21 ungu 0,42

ungu 0,56 ungu 0,66-Ekstrak kultur ungu 0,06 ungu 0,06

permukaan ungu 0,12 ungu 0,34(agar-agar 0,4%) ungu 0,20 ungu 0,42

ungu 0,56 ungu 0,66

50

-Ekstrak kultur ungu 0,06 ungu 0,05permukaan ungu 0,12 ungu 0,33

(agar-agar 0,5#) ungu 0,20 ungu 0,43ungu 0,56 ungu 0,66

Keterangan •- Fase gerak 1 : n-heksan : etyl asetat = 4 : 1 .- Fase gerak 2 ; chloroform : etyl asetat s 9 * 1

PEMBAHASAN

1. Penumbuhan kalus pada kultur cair.1.1* Perlakuan pada kultur permukaan*

Untuk pertama kali kalus ditanam pada kultur permukaan dengan konsentrasi agar-agar 0,2 %. Sete lah 3-4 hari ternyata kalus tenggelam dan selanjut nya tidak menunjukkan pertumbuhan*

Pada media dengan penambahan 0,3-0,5% agar-agar kalus tumbuh dengan baik. Namun tergantung pada spesies yang ditanam. Kalus Agave amaniensis Trel*& Nowell berubah menjadi lebih kuning dan terang. Sedangkan kalus Dioscorea pentaphylla L sangat dipengaruhi kalus yang ditanam. Ada 2 macam kalus yang terjadi yaitu kalus yang berwarna coklat ke- hitaman dan coklat muda. Jika yang ditanam coklat muda maka indeks pertumbuhan akan tinggi, hal se- baliknya terjadi jika yang ditanam kalus yang ber- waraa coklat kehitaman*

Walaupun harga indeks pertumbuhan rata-rata kedua kalus diatas lebih besar dari pada indeks pertumbuhan rata-rata kalus pada kultur padat, da­ri analisa statistik menunjukkan tidak ada perbeda an diantara keduanya*

BAB V

51

52

Hal ini disebabkan adanya variasi yang besar di- antara harga indeks pertumbuhan raasing-masing kul tur. Dengan deraikian tidak dapat dikatakan bahwa pertumbuhan pada kultur permukaan lebih baik dari pada pertumbuhan pada kultur padat.

1.2. Perlakuan pada kultur "Filter Paper Bridge Techni t»quePertumbuhan kalus pada metode ini menunjukkan

gejala yang hampir sama. Pada 2 minggu pertama se telah penanaman, kalus tidak menunjukkan perubah- an. Pada minggu berikutnya warna kalus perlahan- lahan berubah menjadi lebih tua dan tekstur lebih kompak. Hal ini mungkin disebabkan karena permuka an sel tidak kontak langsung dengan media, atau karena difusi nutrien pada kertas saring yang ku- rang baik, sehingga menyulitkan sel menyerap nu­trien dari medianya.

Seperti pada kultur sebelumnya, indeks pertumn ftbuhan dari kultur Filter Paper Bridge Technique

juga menunjukkan variasi yang besar. Sehingga de­ngan perhitungan statistik tidak ditemukan adanya perbedaan dengan kultur padat.

!M I L I k

P E RPU ST A K A A N BWVHKSITAS AJRLANi i L R A B A Y A

53

1*3* Perlakuan pada kultur suspensi.Penumbuhan kalus pada kultur suspensi dilaku­

kan dengan 2 cara, yaitu pada erlenmeyer dan pada fermentor.

Untuk kultur suspensi pada fermentor, agitasidilakukan dengan meniupkan udara steril kedalammedianya. Tetapi ternyata tidak dihasilkan aerasiyang baik, sehingga kultur suspensi pada fermentortidak dapat ditumbuhksn.

Sedangkan ‘kultur suspensi pada erlenmeyer, agi>itasi dilakukan dengan menggunakan incubator sha­

ftker • Setelah kalus dimasukkan kedalam erlenmeyer diinkubasi pada temperatur 27°C dan kecepatan pe- mutaran 100 - 130 rpm. Kultur diambil, diukur vo­lume endapannya kemudian disaring untuk ditimbang berat basahnya. Ternyata tidak terdapat pertambah an volume endapan maupun berat basahnya, Hal ini menunjukkan bahwa sel-sel dalam media tersebut mati. Mungkin disebabkan karena benturan antara dinding sel dengan erlenmeyer atau benturan sesa- ma sel jaringan tanaman itu sendiri. Hal ini disebabkan adanya gerak resiproc dari incubator sha­

l lker .

54

Dari uraian diatas jelas bahwa pemakaian agar-agar perlu dipertimbangkan. Karena pada konsentrasi yang tinggi agar-agar dapat mempe- ngaruhi difusi nutrien dan gas kedalam sel. Sekret dari metabolisme sel juga akan terakumu- lasi pada matriks agar-agar. Sebagai contoh, ka­lus Dioscorea pentaphylla L mengeluarkan senyawa fenolik kedalam medianya, sehingga media selalu mengalami pencoklatan selama pertumbuhan kalus.

2. Deteksi steroid dalam kalus.Deteksi steroid dalam kalus Dioscorea penta­

phylla L dan kalus Agave amaniensis Trel.& No­well dilakukan terhadap semua kultur perlakuan. Hasil deteksi dengan kromatografi lapisan tipis pada ekstrak chloroform baik sebelum maupun se- sudah dihidrolisa sebagian besar menunjukkan adanya sterol.

BAB VI KESIMPULAN

Dari hasil penelitian dapat disiinpulkan bahwa :1. Kalus Dioscorea pentaphylla L dan kalus Agave

ainaniensis Trel«& Nowell yang ditanara pada kul-rrtur permukaan dan pada kultur Filter Paper Brid

ge Technique" tumbuh dengan baik, walaupun mem- punyai kecepatan pertumbuhan yang sama dengan kultur pada media padat (agar-agar 1%).

2. Dengan analisa yang digunakan, pada kalus Dios­corea pentaphylla L dan kalus Agave amaniensia Trel.& Nowell, steroid yang terdeteksi dengan KLT adalah sterol*

55

SARAN - SAHAITBAB VII

1* Untuk memperoleh pertumbuhan kalus Diosoorea penta­phylla L dan kalus Agave amaniensis Trel*& Nowell yang cepat, perlu dicoba kembali menumbuhkan kalus tersebut pada kultur suspensi yang diagitasi menggu- nakan orbital shaker*

2. Perlu dilakukan penelitian untuk raengetahui jenis sterol yang terdapat dalam kalus Diosoorea pentaphy­lla L.

3. Mempertimbangkan kembali penggunaan agar-agar yang berlebihan pada pembuatan media kultur jaringan ta- naman.

56

BAB VIII RINGKASAN

Berkurangnya viskositas media kultur Jaringan yangdisebabkan karena turunnya konsentrasi agar-agar, seca-ra teoritis dapat merapermudah difusi nutrien kedalamsel, Dengan demikian diharapkan adanya kenaikan kecepatan pertumbuhan bila kultur jaringan ditanam pada mediadengan konsentrasi agar-agar yang rendah.Penanaman sel jaringan tanaman pada kultur permukaanmemberi gambaran yang sama dengan pendapat tersebut*Namun indeks pertumbuhan yang didapat pada percobaanini mempunyai variasi yang besar, aehingga dengan ana-lisa statistik tidak dapat disirapulkan adanya perbedaanantara kecepatan pertumbuhan kultur padat dengan kulturpermukaan* percobaan penanaman sel jaringan tanaman pa­

ir nda kultur Filter paper Bridge Technique memberi kesiapulan yang sama,

Deteksi steroid pada percobaan ini dilakukan baiki tpada kultur padat, kultur permukaan maupun kultur Fil-

itter Paper Bridge Technique . Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui apakah masing-masing kultur perlakuan raengan dung steroid.

57

KEPUSTAKAANBAB XX

1. Umboh, MIJ* 1990. Bioteknologi Tanaman : Aplikasi Dan Pengembangannya. Seminaire du Samedi 16 Juin 19 90 Paculte de Medicine-Veterinaire. L*Universite Airlangga . Surabaya. 1-16.

2. Noerhadi, E. 1974. Kultur Jaringan Tumbuhan Sebagai Bahan penyelidikan Dan Potensinya Didalam Pembangun- an Negara. Pidato pada peneriraaan jabatan Guru Besar Ilmu Botani pada Institut Teknologi Bandung. Pener- bit TJniversitas ITB. Bandung. 1-14.

3. Dodds, JS., Robert, LW. 1982. Experiment in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. London, New York. 1-6, 11-13, 21-28, 50-62.

4. Indrayanto, G. 1987. Produksi Metabolit Sekunder Dengan Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Seminar Nasio nal Hetabolit Sekunder. PAU Bioteknologi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. 1-13.

5. Staba, EJ, Ph.D. 1980. Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 2-17, 22-48.

6. Indrayanto, G. 1986. Prospek Kultur Jaringan Tanaman Pada Bidang Fannaai. Bulletin ISFI Jatim. 17(1). 12- 20.

59

7. Isnaeni. 1986, Optimasi pertumbuhan Kalus Solanum mammosum L dan Identifikasi Senyawa Steroidnya, Tesis. Universitas Airlangga, Surabaya. 1—13-

8. Rokem, JS,, Tal.B., Golberg, I. 1985. Methods for Increasing Diosgenin production by Dioscorea Cell in Suspension Culture, Journal of Natural Products, 48( 2) . 210- 222.

9. Martindale. 1982. The Extra pharmacopoeia. Twenty- eighth Edition. The Pharmaceutical Press, London, 949.

10. Puhan, Z., Martin, SM. 1971. The Industrial Poten- sial of Plant Cell Culture. Nasional Research Coun­cil Canada. 11595. 14-36.

11. Sato, F., Yamada, Y. 1984. Hight Berberine in Pro­ducing Coptis japonica Cell. Phytochemistry. 23 (20), 281-185.

12. Albert, F. Hill. 1952. Economic Botany, a Textbook of Useful Plant Product. Second Edition. Tata Me Graw Hill Publishing Compagny LTD. Bombay-New Delhi. 37.

13. Steenis, CGGI. 1978. Flora. Cetakan kedua. PT Prad- nya Paramita. Jakarata. 154-156, 160—161.

60

14. Backer, CA. 1968. Flora of Java. Vol III. Wolter Noor Choff. NV Groningen - The Nederlands. 154-157.

15. Street, HE. 1972. Plant Tissue And Cell Culture. Cambridge University Press. London. 89-91.

16. Robert G.D.Steel, James H* Torrie, 1989- Prinsip Dan Prosedur Statistika Suatu Pendekatan Biometrik* Edisi kedua. Penerbit PT G-raraedia. Jakarta. 105-123.

61

LampIran 1.

Komposisi kimiawi media MS.

Komponen Jumlah (mg/1)

nh4no5 1650kiio3 1900CaCl2.,2 H20 400MgS04. 7 H20 370kh2po4 170KI 0,83h3bo3 6,2KnSO 4• 4 H20 22,3ZnSO^. 7 H20 8,6Na2Mo04. 2 H20 0,25CuSO^. 5 H20 0,025CoCl2. 6 H20 0,025PeS04. 7 H20 27,8Ka2.EDTA.2 H20 37,3Mio-inositol 100Asam nikotinat 0,50

Piridokain HC1 0,50

Tiamin HCl 0 ,10

Glisin 2Sukrosa 3000C

62

Lampiran 2*

Komposisi penampak noda Anisaldehida sulfat.(7)Anisaldehida 0,5 mlAsara asetat glasial 15,0 mlAsam sulfat pekat 5,0 mlMetanol 85,0 ml

63

Lampiran 3*

Perbandingan antara IPrata-rata kultur padat denganIP rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,390 darikalus Diosoorea pentaphylla L.

(padat)

143,5708183,7370138,4161

137,8378103,6133118,0368

151,8576173,6842165,6144

IT1= 1316,368 IX*- 197853.5989 ?1= 146,2631 n = 9

Y2( agar-agar 0,3%)

144,3548125,9669158,7730184,2795164,7959173,0012

140,1620

131,2133149,3734173,0255

2Y2=e 1544,9455 IY|= 242073,4243 X2= 154,4946 n » 10

Uji hipotesis nol : HQ:Hipotesis tandingan s H1 >

• ”2*

64

Perhitungan :2 (lY.,)* 1732824,711

o (IY2) -*2 - -n!-

197853,5989 -

5317,5199

242073,4243 -

= 3387,7645 2 5317,5199 + 3387,7645

17

2386856,598

5516,8002

‘ SV * 2 n1n2

9 + 1 0 5516,8002 -g— jQ-

104819,203890

34,1271•

= M164,65782

- t **1 - Y2

% - *2

146,2631 -154,4-94634,1271

- 8,231534,1271

a - 0,2412,

- To - *4 ± t1 * *( .025 ) SY1 - Y2

3,2315 + ( 2*110 ) • 3-,1271

65

« 8,2315 + 72,0082 x1 « 80,239681. x2 =. - 63,7767.

Kesimpulan : HQ diterima --► =Ai2-

IP kultur padat (agar-agar 1%) sama dengan IP kultur permukaan (agar-agar 0,396).

66

Y1(padat) Y2(agar-agar 0,4%)

143,5708 267,5573183,7370 185,1587 138,4161 131,6133137,8378 139,5372103,6133 139,7229 113,0368 115,3409151,8576 126,4447173,6842 139,4939165,6144 120,2096

__________ • 149,5103

.aiapiran 4*

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat denganI?- rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,4#) dariDioscorea pentaphylla L.

= 1316,3682Y^ = 197853,5989 2?2 = 1514,5938i1 = 146,2631 IY§ = 247741,16n1 = 9 Y2 » 151,4594

n 2 = 10

Uji hipotesis nol : HQ : /a^- /u . Hipotesis tandingan : H.,: yu., ^

U : .¥.c ./■

"UNIVEaiS U K /, -j

67

9 (Irl5 1732824; 711- Z Y 7 -------- - -197853,5989 ------ — ----

n1 9■ -5317,5199.

9 (IY25 2293994,379- iri - ----:— - 247741,16 --------- —

Perhitungan :

2 n2 10

- 18341,7221.« 5-317,5199 + 18341,7221

- S2 ~8 + 9

23659,24217 .

— d b * 8 + 9**17*

1391,7201.

s2 -'n.1 * n2 1391,7201Sy _y .1 -2 ' nla2 9‘10

26U2',6819293,8076 - 17,1408

- t90

r1:~T2 146,2631 -151,4594s- _ 17,1408ri “ t21 2 = 5,1963

“ ~ 17 ,1405 “ " 0 ,3 0 3 2 .

X2-X ± t(.o25). “ 5,1963 ± (2,110) .17,1408

= 5,1963 t 36,1671.

*1 - 41,3634.Xg * - 30 ,9708 .

53

Xeaisipulan : HQ diterima -- yu = /ig

I? rata-rata kultur padat (agar-agar 1%) sama dengan IPrata-rata kultur perrau- kaan (agar-agar 0,4 90.

69

Lampiran 5.

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat denganIP rata-rata kultur permukaan (agar -agar Q,5%) dariDiosoorea pentaphylla L.

(padat)143,5708183,7370138 ,4161

137,8378103,6133118,0368

151,8576173,6842

165,6144

= 1 3 1 6 , 3 6 8

= 197853,5989 Y1 = 146,2631 n1 = 9

Y2(agar-agar 0,5%) 129,1326

125,9032 146,2376

224,8521 262,5139 176,0063 143,7269 132,4590

iy2 = 1340,8316 IYg = 242565,3205 f2 = 167,6040

n2 55 ®

Uji hipotesis nol : Ho :Hipotesis tandingan : H : < /i2.

70

Perhitungan :

O (2Y,)2 173224,711l Y f ----- -— = 197853,5989 -----------

n1 9 =* 5317,5199.

9 ( 2Y?)2 1797829,38s y; ----- = 242565,3205 --------------6 n2 8

a 17836,6481.

2 5317,5199 + 17836,6481 8 + 723*7,168

= , ----------------- ^ ----------------------

= 1543,6112.- db = 8 + 7 = 15.

- S

« (n1+n2) \ (9+8)SY r = V s — "— “ a V 1543,6112 ----X1 t2 V nin2 V 9x8

23154,168y 72

= 17,9328.

= V 321,5856667

Y1 - Y2 146,2631 - 167,6040Sy s 17,9328*1 2

- 21,3409= -------------------- = - 1, 1900.

17,9328

71

- f2 - 51 + t(.025)'SY1 - Y2 ■ 2 1 »3409 ± 2»131. 17,2148

= 21,3409 + 38,2148

Kesimpulan : HQ diterima --► = /U2 •

IPrata-rata kultur padat ( agar-agar 1%) dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar_agar 0, 596)

Lampiran 6

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat denganrtIP rata-rata kultur sistem Filter Paper Bridge

ttTechnique dari kalus Dioscorea pentaphylla L«

Y2(Filter Paper Bridge Technique )

Y1(padat)

143,5708183,7370138 ,4161

137,8378103,6133118,0368

151,8576173,6842165,6144

2Y1 = 1316,368 = 197853,5989

Y1 = 146,2631 n1 =* 9

106,8122109,0252

137,3146144,1974102,2953158,7474100,9812

IY2 = 859,3738 2y| =* 108805,9003 Y2 = 122,7677 n2 * 7

Uji hipotesis nol j HQ : yu1 =* /u2 Hipotesi3 tendingan : H1 : y / 12

73

Perhitungan :

9 (IT.)2 1732824,711 2 y; = 197853,5989 ---------------

n1 9= 5317,5199

P ( 2Y?)2 738523,3281- I Y p ----- -— = 108805,9003 ------------

n2 7* 3302,56772

7 5317,5199 + 3302,56772- S = --------------------

8 + 6

8620,08762

14= 615,7205.

-db = 3 + 6 = 1 4 .

2 (n1+n2) \ (9+7)Sy . y = / — -— — = / 615,7205 ----*2 V n.no V 9x7'12

9851,52863

12,5049-

V 156,3735

74

Y. - Y- 146,2631 - 122,7677

23,4954* * 1,878912,5049

- Y2 - Y 1 + t(#Q25) ; Sj - f2 s 25»4954 + 2,145 . 12,504<

=* 23,4954 + 26,8230

x1 « 50,3184 x2 * - 3,3276

Keaimpulan : HQ £iteriraa — * /1 1 = yu2

IP rata-rata kultur padat sama dengan Ip rata-rata kultur aiatem "Filter Paper Bridge Technique".

75

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat (agar-agar1%) dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,3%)

i

dari kalus Agave amaniensls Trel.& Nowell.

Y1(padat) Z2(agar-agar 0,3%)

463,2140 374,5507560,4651 577,5401320,4175 301,2786223,3909 355,4257226,5332 379,2982295,6113 378,6845272,1009 385,0181284,4629 347,5732233,5967 307,5710355,1074 _______ „

Lampiran 7.

2Y1 = 3952,6187III = 1330604,14T1 = 304,0476n1 = 13

204,8270 IY2 = 3406,9401284,1206 = 1341852,079228,7712 Y2 = 378,5489

n.2

76

Uji hipotesis nol : Hq : = /ig- Hipotesis tandingan : < /U2-Perhitungan s

o ( 2Y-)2 15623194,59- Z Y T ----- -— = 1330604,14 ------------

. n1 13

= 128819,941.

~ ( 2Y0)2 11607240,84- VL% ----- -— » 1341852,079 ------------

* n2 90

» 52158,6519.

,, 128819,941 + 52158,6519- S = --------------------- « 9048,9296

20

(13+9) 1/199076,4512-Sji_j 9048,9296 13x9 V 117

t

= V 1701,5081 = 41,2493.

f1 - Y2 304,0476 - 378,5489Sy 41,2493X1 2

- 74,5013= -------- = -1,806141,2493

77

- ^2 - + t(>025). _ 22

= 74,5013 + 2 ,086 . 41,2493

= 74,5013 + 86,0460

x 1 = 160,5473

x2 = - 11,5447

Kesirapulan : H0 diterima --► /U2

IP rata-rata kultur padat sama de­ngan IP rata-rata kultur permukaan ( a g a r - a g a r 0,3%)

78

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat (agar-agar 1%) dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar-agar 0,4%) dari kalus Agave amaniensis Trel.fi: Nowell.

Lampiran 8.

(padat)

463,2140560,4651320,4175223,3909226,5332295,6113272,1009284,4629233,5967355,1074204,8270284,1206228,7712

2Y1 = 3952,6187 = 1330604,14

51 = 304,0476

Y2(agar-agar 0,4%)

842,1995521,0409256,4619244,2829421,6876349,0859363,3607333,6987353,2913240,3735352,5513

IY2 = 4278,0342 ll\ = 1956184,258 Y2 = 388,9122 n2 = 11

79

Uji hipotesis nol : HQ : = yu2*Hipoteais tandingan : : /U ^ ^ 2*Perhitungan :

p ( I Y J 2 15623194,59- 2 Y f --------- -— « 1330604,14 -------------------

n 1 13

- 128819,941.

o ( ZY9)2 18301576,62- 1 X % --------- -— a 1 9 5 6 1 8 4 ,2 5 8 ---------------------

n2 11

= 292404,565.

2 128819,941 + 292404,565- S * --------------------- = 19146,56845

22

- db = 12 + 10 = 22.

Sy y*1 Y2(13+11)

19146,5684513x11

459517,642841009

t

143

= 56,6869.

Y1 - Y2 304,0476 - 388,9122'■ ■ ■! 3 ■■■ — ■■ ■ —

Sy y 56,68691 ■ 2

80

- 84,8646 = = - 1 ,4971.

56,6869

■ V M *(.025) * SY1 - Y2= 84,8646 + 2 ,074 . 56,6869

= 84,8646 + 117,5686

x 1 - 202,4332.

x2 = - 32 ,704 .

Kesimpulan : HQ diterima — ► 3 /u -

IP rata-rata kultur padat sama de­ngan IP rata-rata kultur permukaan(agar-agar 0,4#)

81

Lampiran 9.

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat (agar-agar1#) dengan IP rata-rata kultur permukaan (agar-agar o,5#) dari kalus Agave amanlensis Trel.& Nowell.

ri(padat)

463,2140 560,4651

320,4175

223,3909

226,5332

295,6113

272,1009

284,4629

233,5967

355,1074

204,8270

284,1206 228,7712

= 3952,6187

ZYj = 1330604,14

Y1 = 304,0476

n 1 = 13

Y2(agar-agar 0,5#)

743,7673

531,6510

4 26 ,8802

349,7295

485,4305

325,4373

358,0549

498,0159

325,5648

243,2143

217,9209

237,9742

2Y2 = 4743,6408

2Y2 * 2 1 2 7 4 2 2 ,2 3 8

r 2 = 395,3034

n2 = 12

82

Uji hipotesis nol : H : = AS Hipotesia tandingan : S1 ; ax < -**2.Perhitungan *

P ( Z Y O 2 15623194,59- s y * --------- 1— » 1330604# 1 4 -------------------

n1 13

» 128819,941.

~ ( 2YP)2 22502128,04- Z Y i ----- -— » 2127422,238 ------------n2 12

= 252244,901.

9 128819,941 + 252244,901- S * --------------------- » 16568,03661.

12 + 11

- db * 12 + 11 a 23.

(13+1 2) 16568,03661 -----------

13x12

414200,9153156

51,5280.

If2655,134072

Y1 - i2 304,0476 - 395,3034~ % " *2 51,5280

- 91,2558= -------- = - 1,7710.

51,5280

83

“ *2 “ *1 ± t (.025)# Sr 1 - T2

= 91,2558 + 2 ,069 . 51,5280

= 91,2558 + 106,6114

Xl = 197,8672

x2 = - 15,3556

Kesimpulan : HQ diterima — ► /U * /u2.

IP rata-rata kultur padat sama dengan IP rata-rata kultur permu­kaan (agar-agar 0,5%)

84

Perbandingan antara IP rata-rata kultur padat (agar-agart*1%) dengan IF rata-rata kultur Filter Paper Bridge

Technique " dari kalus Agave amaniensis Trel.& Nowell.

Lampiran 10*

Y1(padat) Ygf Filter PaperBridge Technique)

463,2140 215,6209■V?0...;651 242,0702

>0,4175 196,2641238,6?40

226,5332 216,3629295,6113 250,9525272,1009 236,7878284,4629 233,5967 2Y2 = 1596,6824355,1074 = 366409,8886

204,8270 Y2 = 228,0975284,1206 n2 = 7 228,7712

2Y1 = 3952,6187ZYlj - 1330604,14Y.j = 304,0476n1 = 13

85

Uji hipotesis nol : HQ : = >u2 Hipotesis tandingan : > /*2perhitungan •

2 ( *Y1)2 - 2 * 1 «= 1330604,14n 1

= 1?8819,941.

( 2 Y ) 2- Z Y ? ----- ~— « 366409,8886

n2

« 2210,6477.

„ 128819,941 + 2210,6477- S ~ -------------------- s

18

- db = 12 + 6 = 18.

\ (13+7)• % - f2 - V 7279,4772 13x7

145589,544 I/

t

91

= 39,9986

Y1 - Y2 304,0476 - 228,a

Sy y 39,9986*1 12

15623194,5913

2549394,6867

7279,4772

1599,8851

0975

86

75,9501=> ------ - 1,8988.

39,9986

" V M t ( .025 ) • SY1 - Y2

« 75,9501 + 2,101 . 39,9986

= 75,9501 + 84,0571

x 1 « 159,9872

x2 * - 8 ,087

Kesimpulan : HQ diterima — ► =* .

IP rata-rata kultur padat sama denganIP rata-rata kultur " Filter Paper

ftBridge Technique

87

:Tabel nilai ,t. (16)

Peiuiag oilai mutLak t yang lebih boardb

<LS 0.4 03 0.2 0.1 0.05 0.02 0.01 0.001

I 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657 636.6192 .816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925 31.5983 .765 .978 1.2S0 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841 12.9414 .741 .941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604 8.6105 .727 .920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032 6.859

6 .718 .906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707 5.9597 . .711 .896 t.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499 5.4058 .706 .889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355 5.0419 .703 .883 1.100 1.383 1.833 2.262- 2.821 3.250 4.781l9 .700 .879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169 4.587

n .697 .876 1.088 1.363 1.79* 2.201 2.718 3.106 4.43712 .695 .873 1.083 1.356 1.782 2.179 2.681 ‘ 3.055 4.31813 .694 .870 1.079 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012 4.22114 .692 .868 1.076 1.345 1.761 2.14S 2.624 2.977 4.140IS .691 .866 1.074 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947 4.073

16 .690 .865 1.071 1.337 1.746 2.120 2.S83 2.921 4.01517 .689 .863 1.069 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898 3.96518 .688 .862 1.067 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878 3.92219 .688 .861 1.066 1.323 1.729 2.093 2.539 2.861 3.88320 .687 .860 1.064 1.325 1.725 2.086 2.528 £.o45 3.850

2! .686 .859 1.063 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831 3.81922 ..686 .858 1.061 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819 3.7922S .685 .858 1.060 1.319 1.714 2.069 2.500 2.S07 3.76724 .685 .857 t .059 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797 3.74525 .684 .856 1.058 1.316 1.70S 2.060 2.485 •2.787 3.725

26 .684 .856 1.058 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779 3.70727 .684 .855 1.057 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771 3.69028 .683 .855 1.056 1.313 1.701 2 048 2.467 2.763 3.67429 .683 .854 1.055 1.311 1 .69;* 2 045 2.462 2.756 3.65930 .683 .854 1.055 1.310 1.697 2 042 2.457 2.750 3.646

40 .681 .851 1.050 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704 3.55160 .679 .848 1.046 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660 3.460

120 .677 .845 1.041 1.289 1.655 1.980 2.35S 2.617 3.373.674 .842 1.036 1.282

'1.645 1.900 2.326 2.576 3.291

0.25 02 0.15 0.1 0.05 | 0.025 0.01 0.005 0.0005

P e lu a n g ttila i t p o s u i: y an g le b ih b e sa r