Percobaan Kadar Protein

I. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Protein dengan Metode BiuretII. Tanggal Percobaan:III. Tujuan Percobaan : menentukan kadar protein yang ada pada sampel

dengan menggunakan cara BiuretIV. Dasar Teori

Protein adalah komponen utama pada sel makhluk hidup. Protein memiliki

fungsi sebagai pembentuk struktur sel makhluk hidup yang menghasilkan

hormon, enzim, dll. Protein dapat juga digunakan sebagai bahan bakar apabila

keperluan energi tubuh tidak dapat terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak.

Protein juga berperan dalam pengaturan proses dalam tubuh ( secara langsung

maupun tidak langsung ). Dengan cara mengatur zat-zat pengatur proses dalam

tubuh, protein dapat mengatur keseimbangan cairan dalam jarngan dan

pembuluh darah, yaitu dengan cara menimbulkan tekanan osmotik koloid.

Tekanan osmotic tersebut dapat menarik cairan jaringan kedalam pembuluh

darah. Selain itu, sifat amfoter protein yang dapat bereaksi dengan asam dan

basa, dapat mengatur keseimbangan asam basa dalam tubuh.

Protein juga dapat didefinisikan sebagai suatu senyawa polimer dari asam-

asam amino dengan berat molekul yang tinggi (104 sampai dengan 106). Asam

amino yang kita kenal di alam atau yang disebut dengan asam amino essential

berjumlah 20 jenis. Unsur yang menyusun protein terdiri dari unsur-unsur

C,H,O, dan N. Beberapa dari protein mengandung belerang, fosfor, dan

beberapa unsur logam seperti seng, besi, dan tembaga.

Pada umumnya protein memiliki sifat sebagi senyawa amorf, tidak

berwarna, mempunyai titik leleh dan titik didih yang tidak tetap, tak larut

dalam pelarut organik, dan apabila dilarutkan dalam air membentuk suatu

larutan koloid. Protein ini dapat rusak karena pengaruh panas, penambahan

logam, dan pengaruh asam basa.

Protein dapat mengalami perubahan- perubahan yang disebabkan oleh

beberapa hal sebagai berikut:

1. Dapat terdenaturasi yang disebabkan oleh perlakuan pemanasan.

Pada umumnya protein akan terdenaturasi karena adanya kondisi ekstrim.

Penentuan Kadar Protein Dengan Menggunakan Metode Biuret 1

2. Dapat terkoagulasi atau membentuk endapan yang disebabkan oleh

adanya perlakuan pengasaman.

3. Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim- enzim

proteolitik.

4. Dapat bereaksi dengan gula reduksi. Reaksi tersebut akan

menimbulkan terbentuknya warna cokelat.

Untuk menguji protein di dalam suatu sampel dapat dilakukan dengan dua

metode yaitu metode kuantitatif dan metode kualitatif. Salah satu contoh

metode pengujian kuantitatif yaitu uji reaksi Biuret. Uji reaksi Biuret ini

digunakan untuk menentukan kadar protein pada suatu sampel. Reaksi biuret

merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-CO-NH-) dan

protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena

terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida.

Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaruhi warna

reaksi ini. Senyawa dengan molekul dipeptida akan memberikan warna biru,

tripeptida ungu, dan tetrapeptida serta peptida komplek akan memberikan

warna merah.

Pada dasarnya suatu peptida adalah asil-asam amino, karena gugus –

COOH dan –NH2 membentuk ikatan peptida. Peptida didapatkan dari hidrolisis

protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan dihidrolisis lebih

lanjut akan dihasilkan asam-asam amino. (Anna Poedjiadi, 1994).

Sifat peptida ditentukan oleh gugus –COOH, –NH2 dan gugus R. Sifat

asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus –COOH dan –NH2 , namun

pada rantai panjang gugus –COOH dan –NH2 yang terletak diujung rantai

tidak lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti

pada asam amino. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan

protein. (Anna Poedjiadi, 1994).

Selain dengan uji biuret, pengujian juga dilakukan dengan metode

spektrofotometri. Teknik spektroskopi pada daerah ultra violet dan sinar tampak

biasa disebut spektroskopi UV-Via, dari spektrum absorbsi dapat diketahui

panjang gelombang dengan absorbans maksimum dari suatu unsur atau senyawa.


Spektrofotometer merupakan alat ukur yang prinsip kerjanya didasarkan

pada interaksi cahaya/ sinar monokromatis dengan materi, yaitu pada saat

sejumlah cahaya/ sinar monokromatis dilewatkan pada sebuah larutan, ada

seebagian sinar yang diserap, dihamburkan, dipantulkan dan sebagian lagi

diteruskan. Namun karena jumlah sinar yang dihamburkan dan dipantulkan sangat

kecil, maka dianggap tidak ada. Apabila radiasi atau cahaya putih dilewatkan

melalui larutan berwarna, maka radiasi dengan panjang gelombang tertentu akan

diserap (absopsi) secara selektif dan radiasi lainnya akan diteruskan (transmisi).

Absorpsi maksimum dari larutan berwarna terjadi pada daerah warna yang

berlawanan, mislanya larutan warna merah akan menyerap rasiasi maksimum

pada daerah warna hijau. Dengan perkataan lain warna yang diserrap adalah

warna komplementer dari warna yang diamati.

Semua senyawa organik mampu mengabsorbsi/menyerap radiasi sinar,

sebab senyawa organik mengandung elektron valensi yang dapat dieksitasi dari

energi rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Pengabsorbsian sinar ultra violet

dan sinar tampak yang panjang gelombangnya lebih besar, terbatas pada sejumlah

gugus fungsional (chromophore) yang mengandung elektron valensi dengan

energi eksitasi rendah. Untuk protein rentang panjang gelombang yang dapat

digunakan adalah 520nm-580nm, panjang gelombang maksimum yang dapat

digunakan untuk menguji protein dengan spektronik adalah 540nm.

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, absorbansi dari suatu sampel akan

sebanding dengan ketebalan, konsentrasi sampel dan absorbtivitas molar. Bila

ketebalan benda (b) atau konsentrasi materi (c) yang dilewati bertambah, maka

cahaya yang diserap akan lebih banyak. Jadi absorbansi berbanding lurus dengan

ketebalan dan konsentrasi. Selain itu, faktor yang juga berpengaruh terhadapa

besar kecilnya absorbansi adalah absortivitas molar (Ɛ) dari larutan itu sendiri.

Sehingga persamaan di atas dapat dirumuskan sebagai berikut:

A = Ɛ b c


Hukum Dasar Spektroskopi Adsorbsi

Jika suatu berkas sinar melewati suatu medium homogen, sebagian dari

cahaya datang (Po) diadsorbsi sebanyak (Pa), sebagian dapat diabaikan

dipantulkan (Pr), sedangkan sisanya ditransmisikan (Pt) dengan efek intensitas

murnisebesar :

Po = Pa + Pt + Pr,

Dimana : Po = intensitas radiasi yang masuk,

Pa = intensitas cahaya yang diadsorbsi

Pr = intensitas bagian cahaya yang dipantulkan

Pt = intensitas cahaya yang ditransmisikan.

Dalam hal ini berlaku hubungan Hukum Beer-Lambert :

T =

PtPo

=10−abc

b = jarak tempuh optik, c = konsentrasi

log (T) = log ( Pt

Po )=−abc

a = tetapan absortivitas, T = transmitansi

log ( 1

T )= log( PoPt )=abc=A

A = adsorbansi

- log (T) i.e. A = abc

( 1T )=T−1

opasitas (tidak tembus cahaya)


A = abc

A = absorpsivitas (yakni tetap)

Hukum di atas dapat ditinjau sebagai berikut :

1. Jika suatu berkas radiasi monokromatik yang sejajar jatuh pada medium

pengadsorbsi pada sudut tegak lurus setiap lapisan yang sangat kecilnya

akan menurunkan intensitas berkas.

2. Jika suatu cahaya monokromatis mengenai suatu medium yang transparan,

laju pengurangan intensitas dengan ketebalan medium sebanding dengan

intensitas cahaya.

3. Intensitas berkas sinar monokromatis berkurang secara eksponensial bila

Konsentarsi zat pengadsorbsi bertambah.

Hal di atas, adalah persamaan yang mendasar untuk spektroskopi adsorbsi,

dikenal dengan hukum Beer’s Lambert atau Hukum Beer Bougar.

Karena : A = abc, Aα c bila ab konstan

A α b bila ac konstan

Aα bc bila a konstan.

Sampel yang digunakan sebagai sumber protein

Ikan Lele termasuk dalam jenis ikan air tawar dengan ciri – ciri tubuh

yang memanjang, agak bulat, kepala gepeng, tidak memiliki sisik, mulut besar,

warna kelabu sampai hitam. Di sekitar mulut terdapat bagian nasal, maksila,

mandibula luar dan mandibula dalam, masing-masing terdapat sepasang kumis.

Hanya kumis bagian mandibula yang dapat digerakkan untuk meraba

makanannya. Kulit lele dumbo berlendir tidak bersisik, berwarna hitam pada

bagian punggung (dorsal) dan bagian samping (lateral). Sirip punggung, sirip

ekor, dan sirip dubur merupakan sirip tunggal, sedangkan sirip perut dan sirip


dada merupakan sirip ganda. Pada sirip dada terdapat duri yang keras dan

runcing yang disebut patil. Patil lele dumbo tidak beracun (Suyanto 2007).

Klasifikasi ikan lele

Filum : Chordata

Kelas : Pisces

Subkelas : Teleostei

Ordo : Ostariophysi

Subordo : Siluroidae

Famili : Clariidae

Genus : Clarias

Spesies : Clarias sp.

Ikan lele memiliki kandungan protein yang cukup banyak yaitu sekitar

17,77% jika dibadingkan dengan kandugan gizi lainnya. Berikut merupakan

kandungan protein pada ikan lele :


V. Alat dan BahanAlat :- Tabung reaksi 10buah- Mortar dan alu 1set- Gelas ukur 10mL 1buah- Kertas saring secukupnya- Corong 1buah- Labu ukur 1buah- Pipet tetes secukupnya- Spektronik 20 1set

Bahan :

- Sampel protein- Larutan standar protein- Reagen biuret- Aquades- Etil eter


VI. Alur Kerja1. Persiapan sampel


Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5

- Ditambah larutan protein- Ditambah air sampai volume total 1mL- Disentrifuge pada 300 rpm selama 10

menit

Endapan

- Didekantasi

Endapan Supernatant

+ 2mL etil eter dan disentrifuge

Endapan

- Dibiarkan pada suhu kamar - Ditambah 6mL pereaksi biuret

Endapan

Tabung 5

+ 1mL larutan larutan protein standar 5 mg+ 4mL reagen biuret-dikocok-diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit

Warna ungu stabil

-diukur absorbansi pada penjang gel. 540nm dengan alat spektronik 20

absorbansi

Tabung 4

+ 1mL larutan protein standar 4mg+ 4mL reagen Biuret-dikocok-diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit

Warna ungu stabil


absorbansi

Tabung 3

+ 1mL larutan protein standar 3mg+ 4mL reagen Biuret-dikocok-diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit

Warna ungu stabil


absorbansi

Tabung 2

+1mL larutan protein standar 2mg+4mLreagen biuret-dikocok-diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit

Warna ungu stabil


absorbansi

Tabung 1

+ 1mL larutan protein standar 1mg+4mL reagen Biuret-dikocok-diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit

Warna ungu stabil


absorbansi

2. Pembuatan Larutan Standar


1mL aquades

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi+4mL reagen BiuretDikocokDiinkubasi pada suhu 370 selama 10 menitDiukur absorbansi pada panjang gelombang 540nm dengan alat spektronik 20

Absorbansi

1mL sampel

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi +4mL reagen Biuret DikocokDiinkubasi pada suhu 370C selama 10 menitDiukur absorbansi pada panjang gelombang 540nm dengan alat spektronik 20

Absorbansi

3. Penetapan absorbansi larutan blanko

4. Penetapan Absorbansi larutan sampel


Padatan sampelPadatan sampel

Dimaukkan ke dalam waring blenderDitambahkan airDisaring Dimaukkan ke dalam waring blenderDitambahkan airDisaring

FiltratFiltrat ResiduResidu

Soluble proteinSoluble protein

DisentrifugeDidekantasi DisentrifugeDidekantasi

VII. Hasil Pengamatan

No. Prosedur Percobaan Hasil pengamatan Dugaan/reaksi KesimpulanSebelum Sesudah

1. Persiapan sampel -sampel=padatan putih pucat-air= jernih tak berwarna

-filtrat=larutan putih keruh-residu=padatan putih pucat-soluble protein=larutan putih keruh


2. Pembuatan larutan standart -protein standar= jernih tak berwarna-reagen biuret= larutan berwarna biru (++)

-larutan standar+ biuret=lrutan berwarna biru (+)-absorbansi=


-larutan protein standar= jernih tak berwarna-reagen biuret= larutan berwarna biru (++)

-larutan protein standar+ larutan biuret = larutan berwarna biru (++)-absorbansi=











3. Penetapan absorbansi larutan blanko -aquades= jernih tak berwarna-reagen biuret= larutan berwarna biru(++)

-aquades+ larutan biuret= larutan berwarna biru(+)-absorbansi=


4. Penetapan absorbansi larutan sampel -sampel=keruh larutan putih-reagen biuret= larutan berwarna biru(++)

-sampel+ larutan biuret= larutan berwarna biru(+)-absorbansi=



VIII. Analisis Data


Documents

Percobaan Kadar Protein