UNIVERSIDADE PARA O DESENVOLVIMENTO DO ESTADO E DA REGIÃODO PANTANAL (UNIDERP)

FABIANO DE OLIVEIRA FRAZILIO

PERFIL DAS PROTEÍNAS SÉRICAS E DA CONTAGEMLEUCOCITÁRIA EM OVINOS COM INFECÇÃO HELMÍNTICA

NATURALMENTE ADQUIRIDA.

CAMPO GRANDE-MS2005

FABIANO DE OLIVEIRA FRAZILIO

PERFIL DAS PROTEÍNAS SÉRICAS E DA CONTAGEMLEUCOCITÁRIA EM OVINOS COM INFECÇÃO HELMÍNTICA

NATURALMENTE ADQUIRIDA.

Dissertação apresentada ao Programa dePós-graduação em nível de MestradoProfissionalizante em Produção e GestãoAgroindustrial da Universidade para oDesenvolvimento do Estado e da Região doPantanal, como parte dos requisitos para aobtenção do título de Mestre em Produção eGestão Agroindustrial.

Comitê de Orientação:

Prof. Dr. Cláudio Roberto Madruga.

Prof. Drª. Iandara Schettert Silva.

Prof. Dr. Olímpio Crisóstomo Ribeiro.

CAMPO GRANDE-MS2005

FOLHA DE APROVAÇÃO

Candidato: Fabiano de Oliveira Frazílio

Dissertação defendida e aprovada em 29 de junho de 2005 pela BancaExaminadora:

__________________________________________________________Prof. Doutor Cláudio Roberto Madruga (Orientador)

__________________________________________________________Prof. Doutor Fernando Paiva (UFMS)

__________________________________________________________Prof. Doutor Edison Rubens Arrabal Arias (UNIDERP)

_________________________________________________Prof. Doutor Francisco de Assis Rolim Pereira

Coordenador do Programa de Pós-Graduaçãoem Produção e Gestão Agroindustrial

________________________________________________Profa. Doutora Lúcia Salsa Corrêa

Pró-Reitora de Pesquisa e Pós-Graduação da UNIDERP

ii

Dedico o presente trabalho aos meus pais,irmão, esposa e amigos, como também aomeu orientador Prof. Dr. Cláudio RobertoMadruga que se propôs em me ajudar desdeo primeiro instante.

iii

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por ter transmitido-me saúde e sabedoria paravencer os obstáculos.

A meus pais exemplos de minha vida.

As minhas esposa e filha, pela preocupação, cuidado e carinho.

Ao professor Cláudio Roberto Madruga, pela paciência, atenção dedicada eensinamentos transmitidos.

iv

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................ v

ABSTRACT ........................................................................................................... vi

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................7

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................11

2.1 PRINCIPAIS HELMINTOS PARASITAS DE OVINOS..........................................11

2.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS INFESTAÇÕES PARASITÁRIAS ........13

2.3. IMUNIDADE MEDIADA POR CÉLULAS ......................................................16

2.3.1. Macrófagos.................................................................................................16

2.3.2. Eosinófilos ..................................................................................................17

2.3.3. Linfócitos ....................................................................................................18

2.4. IMUNIDADE HUMORAL CONTRA HELMINTOS.........................................21

2.5. PROTEÍNAS SÉRICAS ................................................................................22

2.5.1. As principais proteínas ...............................................................................25

2.5.2. Fatores que influenciam a concentração das proteínas séricas .................29

3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................30

4. RESULTADOS .................................................................................................33

5. DISCUSSÃO.....................................................................................................37

6. CONCLUSÕES.................................................................................................40

REFERÊNCIAS ....................................................................................................41

v

RESUMO

Quarenta ovinos adultos de diversas raças criadas em um sistema decriação de baixa tecnologia no município de Campo Grandes, Mato Grossodo Sul, foram divididos em quatro grupos. No grupo I (até 100 ovos porgrama de fezes, OPG), grupo II (200 a 700 OPG), grupo III (700 a 1.700OPG) e grupo IV (mais de 1.700 OPG). Por meio de eletroforese foiverificada redução significativa de proteínas séricas totais, albumina,gamaglobulinas no grupo IV. Entre as células do sangue, os linfócitostambém apresentaram uma diminuição significativa no grupo IV. Essesresultados indicam que os ovinos com infestações acima de 1.700 OPGapresentaram alteração significativa nos parâmetros observados. Entretanto,a determinação de grupos de ovinos com infestações de helmintos que nãoalteram os parâmetros estudados, sugere a possibilidade de seleção deanimais resistentes nesse sistema de criação, o que poderia resultar em umimportante retorno econômico.

Palavras-chave: ovinos; helmintos, eletroforese: proteínas séricas,leucócitos.

vi

ABSTRACT

Forty adult ovine from different breeds raised in a system of low technologyin Campo Grande municipality, Mato Grosso do Sul state, were divided infour groups. The group I (until 100 eggs per gram of faeces), group II (200until 700 EPG), (group III 700 to 1700 EPG) and group IV (over 1700 EPG).Using electrophoresis was verified a significant reduction of total proteins,albumin and gamma globulins in the group IV. The blood lymphocytes alsoshowed a significant decrease in this group. These results suggested thathelmintic infestations with more than 1700 OPG cause imunodepression.However, the groups with lower infestations did not showed alterations in thestudied parameters. There fore that there is possibility to select resistantanimals for helmintic infestations in this husbandry system, which could resultin important economical income.

Key-words: ovine; helminths; electrophoresis; seric proteins; leukocytes.

1. INTRODUÇÃO

Não se sabe ao certo como e onde surgiram as primeiras civilizações,

contudo, a domesticação de animais foi fundamental para a sua prosperidade.

Dentre estes animais, os ovinos merecem destaque por figurarem entre os

primeiros a serem domesticados pelo homem, vindo talvez somente depois do

cão. Acredita-se que a domesticação dos ovinos tenha tido seu início na Ásia

Central, pois existem indícios históricos de sua criação por pastores hebreus que

antecedem a história escrita (VIEIRA, 1967).

Os estudos já realizados sugerem que os ovinos domésticos tenham tido

sua origem a partir do Muflon, originário da Europa e Ásia, ou do Urial Asiático.

Ambos se tratam de ovinos selvagens que têm chifres, cauda curta e corpo

coberto mais por pêlos do que por lã, o que sugere um processo de seleção

antigo até se chegar no ovino doméstico (Ovis Áries) (VIEIRA, 1967).

Despertando o interesse de muitos produtores, a ovinocultura vem

crescendo muito e conquistando muitos mercados. Entretanto, um dos problemas

verificados na maior parte das criações é a falta de atenção dos criadores quanto

aos cuidados específicos com a espécie criada. Os ovinos apresentam

características reprodutivas, alimentares e de manejo, diferentes de outras

espécies, e por isso o criador deve estar ciente de todos os cuidados e as

características da criação antes de inicia-la (SANTOS, 1985).

A ovinocultura só recentemente começou a se desenvolver como atividade

profissional. Em Mato Grosso do Sul, ela está em plena expansão, melhorando a

qualidade do rebanho, principalmente, com adoção de práticas como

8

cruzamentos de animais de pura origem (PO) e inseminação artificial (IA). O

Estado conta, hoje, com um rebanho de quase 600 mil animais, que são

comercializados, sobretudo, com São Paulo, Paraná, Minas Gerais e Goiás

(OZAKI, 2005).

A criação de ovinos tem se revelado uma segunda alternativa econômica

para os pecuaristas, pois a atividade em forma de consórcio boi/ovelha não é

somente viável, como indicada para diminuir custos. Esse sistema evita também

as helmintoses, que são a maior causa de mortalidade entre os ovinos, pois o boi

alimenta-se da pastagem contaminada com ovos de helmintos que são

patogênicos para os ovinos, sem que isso afete a sua saúde, diminuindo assim o

custo com profilaxia e tratamento. Nas grandes fazendas de fronteira, do Rio

Grande do Sul, já existem cerca de 20 mil a 30 mil ovelhas consorciadas, essa

possibilidade tem despertado o interesse de pecuaristas (AMARANTE, 1995).

Outro atrativo é o tempo entre o nascimento e o abate do cordeiro, em

torno de 80 dias, cujo peso pode variar de 9 kg a 12 kg (cordeiro mamão), há 120

dias, para um animal mais pesado, que ficou confinado, comparando-se à idade

de abate de bovinos, que fica em torno de dois anos (OZAKI, 2005).

Dos produtos oriundos da ovinocultura a carne vem se destacando por ser

hoje muito explorada e apreciada por grande parte da população, atingindo altos

preços nos mercados nacionais e internacionais. A lã, que passou por momentos

difíceis com a entrada dos produtos sintéticos, já mostra sinais de recuperação e

aumento de produção. Contudo, o leite de ovelha ainda não tem uma produção

muito expressiva no Brasil, mas em outros países, como a Itália, se mostra como

um excelente produto para a confecção de queijos finos, como o queijo

Gorgonzola Italiano. Além destes produtos derivados da ovinocultura aproveita-se

ainda o couro, o pêlo, os chifres, os intestinos e praticamente todo o animal

(SANTOS, 1985).

Além das vantagens advindas da qualidade dos produtos dos ovinos, a

ovinocultura ainda se apresenta como uma alternativa viável para o homem do

campo, principalmente para o pequeno produtor, uma vez que os animais, devido

a sua docilidade, porte pequeno e excelente conversão alimentar, não demandam

muita mão-de-obra para sua manutenção. Apresentando-se, desta forma, como

9

uma opção viável e barata para o produtor (AMARANTE, 1995).

O rápido crescimento populacional no planeta vem exigindo uma demanda

cada vez maior de proteína animal. Portanto, há uma necessidade constante de

inserção de novas tecnologias para inovação dos meios de produção, de maneira

a não permitir uma defasagem entre produção e consumo de alimentos. As

tecnologias introduzidas nos sistemas de produção animal, que incrementam o

potencial genético, que melhoram as condições nutricionais e de controle

sanitário, aumentam a produtividade de maneira significativa (BARRAGRY, 1994).

No Brasil, tem ocorrido um crescimento na exploração intensiva de ovinos,

e devido a este fato, tornaram-se relevantes para a produtividade dos rebanhos,

os aspectos sanitários. Na ovinocultura um dos maiores problemas sanitários é as

helmintoses gastrintestinais, já que são muito freqüentes e influenciam

diretamente na capacidade produtiva dos rebanhos (AMARANTE, 1995).

Os helmintos gastrintestinais Haemonchus contortus, Ostertagia sp e

Trichostrongylus sp são os de maior relevância para ovinos. O ciclo de vida

destes parasitas é direto, os ovos são liberados com as fezes e desenvolve-se

rapidamente em larvas infectantes (PINHEIRO 1983; VANIMISETTI et al., 2004).

Os sintomas clínicos relacionados ao parasitismo intestinal por helmintos

são anorexia, anemia, baixo ganho de peso, desenvolvimento deficiente e

eficiência reprodutiva baixa. A soma desses fatores acarreta inúmeras perdas

produtivas e econômicas, que estão relacionadas à baixa produtividade, devido

aos custos com tratamento, profilaxia e morte dos animais (HARRISON et al.,

2002; PINHEIRO, 1983).

As infestações por helmintos comprometem o sistema imune e inúmeros

fatores foram propostos como causas de imunodepressão. Entre esses a

competição antigênica, estimulação de células supressoras não específicas,

competição com superfície de macrófagos, modificação do tráfego de linfócitos

através dos tecidos parasitados, produção de fatores inibidores da resposta

imunológica pelos parasitas e ativação de linfócitos policlonais (MEEUSEN,

2003).

10

Aparentemente, os parasitas induziriam uma imunossupressão em seu

hospedeiro para poder permanecer livre dos ataques do sistema imune. As

conseqüências da imunodepressão associada a parasitas incluem aumento da

susceptibilidade a outros organismos, eficácia de vacinação reduzida, assim como

diminuição da resposta imunológica contra parasitas homólogos (SILVA et al.,

2002).

Portanto, o presente estudo se propõe a investigar as alterações das

proteínas séricas e os valores absolutos da contagem de leucócitos e linfócitos,

de ovinos criados sob sistemas de produção característicos do Estado de Mato

Grosso do Sul.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. PRINCIPAIS HELMINTOS PARASITAS DE OVINOS

A elevada prevalência, associada à grande patogenicidade, faz do

Haemonchus contortus, a principal espécie de endoparasita de ovinos no Brasil.

Este nematóide do abomaso, hematófago pode ser responsável por enormes

perdas em ovinos, especialmente em regiões tropicais (AMARANTE, 1995

BARBOSA; OLIVEIRA e SIQUEIRA, 1989).

O ciclo evolutivo é direto. A eclosão larval ocorre no pasto, o

desenvolvimento da larva infectante (L3) ocorre em um período curto, de até cinco

dias. Após a ingestão, a larva no rúmen perde sua cápsula para sofrerem mudas.

Quando adultos, move-se livremente na superfície da mucosa. O período pré-

patente é de duas a três semanas (AMARANTE et al., 1997; VANIMISETTI et al.,

2004).

A patogenia da hemoncose é essencialmente uma anemia hemorrágica

aguda, caracterizada por uma diminuição do volume globular e perda contínua de

ferro e proteína através do trato gastrintestinal. Os animais apresentam graus

variáveis de edema, dos quais a forma submandibular e a ascite são as mais

comuns. Letargia, fezes de coloração escura e queda de lã são também

observadas. Em casos hiperagudos os animais morrem subitamente de gastrite

hemorrágica (AMARANTE et al., 1997).

12

Como o desenvolvimento da larva de H.contortus é ótimo em temperaturas

relativamente altas, a hemoncose é basicamente uma doença de ovinos de clima

tropical. A umidade alta, também é um fator importante, pelo menos no microclima

das fezes e do capim, para o desenvolvimento e a sobrevivência da larva. A

freqüência e a gravidade dos surtos dependem do regime de chuvas que ocorre

numa determinada região (MACEDO et al., 1986; VANIMISETTI et al., 2004).

Em seguida, em ordem de importância, tem-se o Trichostrongylus

colubriformis. Os adultos são pequenos e capiliformes, em geral com menos de 7

mm de comprimento. O ciclo evolutivo é direto e, em condições ótimas, o

desenvolvimento larval até o estágio infectante ocorre em uma a duas semanas,

sendo que este possui alta capacidade para sobreviver em condições adversas,

sejam de frio extremo ou de dessecação (AMARANTE et al., 1992; LARSEN et

al., 1994).

Após a ingestão, as larvas infectantes de terceiro estágio penetram entre

as glândulas epiteliais da mucosa, com formação de túneis sob o epitélio, mas

acima da lâmina própria. Quando os túneis subepiteliais contendo os parasitas em

desenvolvimento se rompem, há liberação dos mesmos por cerca de 5 dias. Essa

espécie de parasito provoca hemorragias e edemas consideráveis, que resulta em

perdas de proteínas plasmáticas na luz intestinal (YACOB et al., 2004).

Em infestações maciças ocorre diarréia, o que, juntamente com a perda de

proteínas plasmáticas na luz intestinal, leva à perda de peso. Em níveis mais

baixos de infecção, a inapetência e baixos índices de crescimento,

acompanhados às vezes por fezes amolecidas constituem a sintomatologia mais

evidente, sendo esta, difícil de diferenciar de má nutrição (YACOB et al., 2004).

O Oesophagostomum columbianum é outra espécie merecedora de

destaque devido a sua grande patogenicidade. A enfermidade aguda é causada

pelas larvas histotróficas do parasita que se localizam no intestino delgado e

grosso onde causam a formação de nódulos (AMARANTE et al., 1997).

As infestações, na maioria das vezes, são mistas sendo ainda comum o

parasitismo dos ovinos por espécies de Cooperia spp. e Strongyloides papillosus

13

(AMARANTE, 1995; BARBOSA; OLIVEIRA e SIQUEIRA, 1989).

A maioria dos nematódeos apresentam duas fases distintas no seu

desenvolvimento: (1) uma fase de vida parasitaria que ocorre no hospedeiro e que

se inicia com a ingestão da larva infectante e se completa com o parasita adulto

eliminando ovos nas fezes e (2) uma fase de vida livre que ocorre na pastagem e

vai de ovo ate a larva infectante (AMARANTE et al., 1992; LARSEN et al., 1994).

2.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS INFESTAÇÕES

PARASITÁRIAS

O sistema imune emprega diferentes estratégias de defesa. Algumas são

de amplo espectro. Geralmente a imunidade inata e outras específicas estão

freqüentemente associadas à imunidade adquirida. A primeira constitui uma

barreira inicial às infestações parasitárias, enquanto que a segunda é uma

barreira para controlar agentes patogênicos que superaram a primeira. O sistema

imune também adapta a resposta às características do agente infeccioso, pois

alguns se localizam intracelularmente e outros extracelularmente (KAHN et al.,

2000; TIZARD, 2000).

Os parasitas multicelulares, como os helmintos, em virtude de sua estrutura

mais complexa, e de seu metabolismo, induzem o hospedeiro a produzir uma

resposta imunológica complexa. Essa complexidade ainda é maior quando

ocorrem infestações parasitárias múltiplas por distintos parasitos cujo controle

requer uma resposta imune específica (TIZARD, 2000).

A maioria dos antígenos relevantes dos helmintos consiste em subprodutos

metabólicos, enzimas ou outros produtos secretórios que são variáveis de acordo

com o estágio de desenvolvimento do parasito e requerem uma resposta imune

com especificidade distinta (ORTONA et al., 2002).

A resposta imune a esses organismos patogênicos é expressa por uma

eosinofilia e a produção do anticorpo reagínico (IgE). Ambas dependem dos

linfócitos T. Além disto, foi constatado que certos helmintos potencializam a

14

resposta imunológica a outros antígenos, talvez através de subprodutos

metabólicos comuns que atuam como adjuvantes inespecíficos (PREMIER et al.,

2004; HOUDIJK et al., 2001).

Os helmintos causam infestações que podem causar sintomatologia aguda

com mortalidade ou uma doença suave ou subclínica, que provoca morbidade.

Isso está relacionado a fatores genéticos, de manejos, nutricionais ou ambientais.

Além disso, a imunidade pode ser influenciada pela própria infestação parasitaria

de outros helmintos. Por exemplo, a presença de parasitas adultos no intestino

pode retardar o desenvolvimento posterior dos estágios larvais da mesma espécie

dentro dos tecidos. Exemplos disso, cordeiros podem adquirir uma resistência ao

Echinococcus granulosus de forma que uma infestação com um grande número

de ovos, não resulta no desenvolvimento de uma carga maciça de parasitas. A

dose original de ovos pode estimular uma rejeição das doses subseqüentes

(TIZARD, 2000; KAHN et al., 2000).

A competição entre os helmintos por habitats mútuos e nutrientes no trato

intestinal determinará a quantidade, localização e composição da população de

helmintos de um animal (HARRISON et al., 2002).

Os fatores relacionados ao hospedeiro que influenciam as cargas de

helmintos incluem idade, sexo e base genética do hospedeiro. A relação da idade

e sexo com a carga parasitária de helmintos parece ser determinada por

hormônios. Nos animais cujo ciclo sexual é sazonal, os parasitas tendem a

sincronizar o seu ciclo reprodutivo com os dos seus hospedeiros. Por exemplo, as

ovelhas mostram uma elevação primaveril nos ovos de nematóides fecais que

coincide com o parto e início da lactação. Este fenômeno está associado a um

aumento nos níveis circulantes de prolactina, ocasionando uma queda temporária

da imunidade (GRUNER; BOUIX E BRUNEL, 2004; HOODA et al., 1999).

Os mecanismos imunes resultantes da resistência genética, seriam a maior

produção de imunoglobulinas de superfície das mucosas (IgA), que interferiria na

fecundidade do nematódeo, e a maior intensidade das reações de

hipersensibilidade do tipo I (GRUNER; BOUIX e BRUNEL, 2004; CARTA e

SCALA, 2004; SRÉTER; KASSAI E TAKÁCS, 1994; WINDON, 1996).

15

O sucesso de qualquer parasita é medido não somente pelos distúrbios

que ele impõe no hospedeiro, mas sim pela sua capacidade de se adaptar e se

integrar ao hospedeiro. Imunológicamente pode-se considerar um parasita de

sucesso se ele se integrar em um hospedeiro de uma forma tal que não seja

considerado estranho. Ao contrário das infecções por bactérias e vírus que são de

curta duração e agudas. As infestações por helmintos são geralmente crônicas, e

determinados parasitas podem persistir em um hospedeiro por um longo período

de tempo (AMARANTE et al., 2004).

O sistema imune é relativamente insuficiente no controle dos helmintos

parasitas, pois afinal esses parasitos se adaptaram a uma existência parasitaria

obrigatória, que envolve necessariamente uma superação ou um escape da

resposta imune. Os helmintos, portanto, não são organismos patogênicos mal

adaptados, mas parasitas obrigatórios completamente adaptados, cuja

sobrevivência depende de certa forma de acomodação com o hospedeiro. Por

isso, estes parasitas geralmente provocam uma doença suave ou subclínica, ou

seja, provoca morbidade e não mortalidade (AMARANTE et al., 2004; TIZARD,

2000).

A doença somente ocorre, quando os helmintos invadem o hospedeiro ao

qual não estão completamente adaptados, ou em um número incomumente

grande. Existem animais, a minoria, que podem albergar apenas uma pequena

quantidade de parasitas, mas alguns animais albergam muitos. Isto ocorre porque

há variação quanto à resistência, devido a fatores genéticos, comportamentais,

nutricionais ou ambientais (KASSAI et al., 1990; MEEUSEN e PIEDIAFRA; 2003).

A fase parasitária pode manifestar-se de forma aguda, onde as perdas são

apreciáveis. Nas formas subagudas e crônicas ocorre diminuição da produção

animal devido há uma menor digestibilidade e absorção do alimento. Porém, são

as parasitoses subclínicas, de animais aparentemente sadios, que geralmente

produzem maiores contaminações das áreas de pastoreio com ovos dos parasitos

(SIEVERS et al., 2002).

A ovoposição causa contaminação das pastagens. O grau de

contaminação das mesmas depende da susceptibilidade do animal. Vários fatores

16

contribuem para isso, tais como: a idade dos animais, a imunidade adquirida, o

estado fisiológico, o nível nutricional, a época do ano, as condições geoclimáticas,

a espécie do parasita e o número de parasitos presentes (SIEVERS et al., 2002).

As infestações por helmintos, raras vezes provocam mortalidade, porém os

animais parasitados apresentam baixo ganho de peso e eficiência reprodutiva, o

que resulta numa reduzida produtividade (SIEVERS et al., 2002).

As enteropatias que ocorrem nos animais parasitados provocam perdas

protéicas por perda de sangue em decorrência do parasitismo intestinal. Isso

provocaria no animal, hipoproteinemia com hipogamaglobulinemia. Como

conseqüência, haveria baixa conversão alimentar e reduzida resistência do animal

frente às outras patologias (LLOYD et al., 2002).

O hospedeiro poderá adquirir resistência por intermédio da chamada co-

imunidade, processo em que o animal infestado adquire resistência a outros

parasitas quando uma infestação inicial por um parasito não é eliminada. Vários

mecanismos imunológicos e geralmente em associação determinam a resistência

contra os helmintos (WINDON, 1996).

2.3 IMUNIDADE MEDIADA POR CÉLULAS

2.3.1 Macrófagos

Essas células originadas da medula óssea, no sangue, são os monócitos

que totalizam cerca de 5% da população de leucócitos sanguíneos totais. Essas,

são células que pertencem ao sistema mononuclear-fagocítico. Ao contrário dos

neutrófilos, tem uma atividade fagocítica prolongada. Além da fagocitose, os

monócitos secretam moléculas capazes de amplificar a resposta imune, controlam

a inflamação e contribuem para o reparo de danos teciduais. Isso é realizado por

meio da remoção dos tecidos lesados e auxiliam no processo de cicatrização

(FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000).

Durante a infestação parasitária os macrófagos são ativados nos estágios

17

iniciais da infestação, exercendo uma importante linha de defesa contra os

parasitas, através da fagocitose e bem como de sua remoção. Os macrófagos

possuem dois mecanismos principais de eliminação do parasito; uma a

citotoxicidade dependente de anticorpos, e a outra pelo mecanismo de explosão

oxidativa (STITES et al., 2000). Esse último mecanismo ocorre quando os

macrófagos são ativados pela exposição a agentes patogênicos ou quimiotáticos.

Nestas condições sintetizam a enzima óxido nítrico sintetase, que usa o oxigênio

para agir na L-arginina, produzindo o óxido nítrico, que ao reagir com o ânion

superóxido produz derivado tóxico, tais como o NO2, N2O3 e NO3. Essas células

são capazes de sintetizar várias substâncias que atuam na ação imunológica, tais

como a enzima lisozima e os componentes do complemento como C2, C3, C4 e C5

(STITES et al., 2000; FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000).

Além destas, existem quatro outras importantes proteínas secretadas pelos

macrófagos, que exercem um papel-chave na regulação de imunidade:

interleucina-1, interleucina-2, a interleucina-12 e o fator de necrose tumoral, sendo

estas classificadas como citocinas (BIRO et al., 1998; TIZARD, 2000).

2.3.2 Eosinófilos

Estas células são extremamente importantes no controle das infestações

parasitárias e na regulação dos processos alérgicos, bem como no controle das

reações inflamatórias. Os eosinófilos também possuem a propriedade de

fagocitar, entretanto com menor eficiência quando comparada aos neutrófilos e

macrófagos. Contudo, os eosinófilos participam de mecanismos importantes da

imunidade protetora antiparasitária. Os eosinófilos participariam no processo de

destruição do parasito quando este estivesse revestido de anticorpos e

complemento. Isso resultaria na liberação de seu conteúdo granular, provocando

a destruição do mesmo. Os grânulos dos eosinófilos contêm proteínas catiônicas

e diversas enzimas lisossômicas (BAO et al., 1996; FELDMAN; ZINKIL e JAIN,

2000).

Os eosinófilos regulam as respostas de hipersensibilidade imediata (tipo I)

18

e inflamatórias, pela inativação da histamina e de outros mediadores químicos

envolvidos nesses processos. Quando há um aumento na concentração de

histamina, os eosinófilos são rapidamente atraídos para os tecidos, estas células

secretam histaminase e fatores que inibem liberação de histamina. (BAO et al.,

1996; FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000.

Os eosinófilos são produzidos na medula óssea e possuem a mesma

seqüência de maturação dos neutrófilos, exceto que a célula-tronco é diferente,

sendo denominada eosinófilo-unidade formadora de colônia. A meia-vida

circulatória varia de 30 minutos a 10 horas, dependendo da espécie. Na medula

óssea existe uma grande reserva de eosinófilos (FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000;

SHAW; GATEHOUSE e MCNEILL, 1998).

Os eosinófilos deixam a circulação aleatoriamente. Sendo encontrados em

muitos tecidos, principalmente no tecido conjuntivo frouxo subepitelial do intestino,

do subcutâneo, útero e trato respiratório. Uma vez que esteja no tecido, a meia-

vida dos eosinófilos aumenta para 12 dias (FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000;

SHAW; GATEHOUSE e MCNEILL, 1998).

O eosinófilos atuam numa reação IgE-dependente, promovendo a limitação

da migração do parasita pelos tecidos. A destruição do parasita ocorre quando os

eosinófilos se conjugam com o parasita que estão previamente recobertos por

anticorpos, e então ocorre a degranulação celular liberando o conteúdo sobre a

cutícula do helminto. Esse conteúdo granular inclui o superóxido, peróxido de

hidrogênio e outros radicais livres gerados pelas peroxidases e pelas enzimas

líticas eosinofilicas, tais como a lisofosfolipase e fosfolipase D (BUDDLE et al.,

1992; STEAR et al., 2002; SPRY, 1996; STEVENSON; COLDITZ e LEJAMBRE,

2001).

2.3.3 Linfócitos

Os linfócitos são as células que reconhecem os antígenos estranhos por

meio das células apresentadoras de antígenos e montam a resposta imune

adquirida. Existem diferentes populações e subpopulações de linfócitos que

19

possuem características fenotípicas e funções diferentes (STITES et al., 2000).

Os linfócitos são encontrados principalmente na medula óssea, linfonodos

e baço. São divididos em dois grupos: linfócitos T ou linfócitos derivados do timo,

e linfócitos B ou linfócitos derivados da medula óssea. Células “nulas” foram

identificadas no homem e em alguns animais; lhes faltam os marcadores que

caracterizam os linfócitos T ou B (FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000; JAIN, 1986).

O timo e medula óssea são órgãos linfóides primários, que propiciam

precursores linfóides para os órgãos linfóides secundários (linfonodos, baço, e

placas de Peyer), nos quais os linfócitos T e B desenvolvem a capacidade de

responder aos antígenos. Tanto a população de linfócitos T, quanto à de linfócitos

B estão presentes no sangue periférico das espécies animais, sendo que os

primeiros constituem a maioria. O número de linfócitos T e B, no sangue periférico

varia com a idade e saúde do indivíduo. Os linfócitos B são poucos durante a vida

fetal, mas aumentam continuamente, para constituir cerca de 20% dos linfócitos

circulantes na maior parte dos animais domésticos adultos (FELDMAN; ZINKIL e

JAIN, 2000; JAIN, 1986).

O período de vida dos linfócitos é de difícil mensuração, visto que tais

células podem recircular e passar por mitoses. Não há informações para os

animais domésticos, mas a maior parte dos linfócitos humanos tem longa vida,

com média de existência de 4,3 anos (FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000; SMITH et

al., 1994).

Os linfócitos T tem participação fundamental na resposta imunológica, pois

reconhecem o antígeno apresentado pelas células apresentadoras de antígeno

(macrófagos, células dentríticas, células B), produzindo uma resposta imune

específica com produção de linfocinas que ativam outras células do sistema

imune (STITES et al., 2000). Três populações de linfócitos têm suas funções

melhor estabelecidas: às células T auxiliadoras que se subdividem em

subpopulações, e que são responsáveis pela regulação das respostas imunes; as

células T citotóxicas que destroem os antígenos endógenos, e as células B, que

fagocitam os antígenos atuam como apresentadoras de antígenos e produzem

imunoglobulinas além de linfocinas (BALIC; BOWLES e MEENSEN, 2000).

20

As células T auxiliares emitem sinais que aumentam as respostas

imunológicas mediadas por células, e que são necessários para a diferenciação

das células B em células produtoras de anticorpos. Quando ativadas, as células T

auxiliares produzem linfocinas solúveis, que têm a capacidade de regular as

atividades das células T, células B, monócitos-macrófagos e outras células do

sistema imunológico. O auxílio das células T, para diferenciação das células B,

também ocorre por meio de contato direto entre os dois tipos celulares, resultando

em estimulação direta dos receptores das células B, e expondo também a célula

B às altas concentrações locais de linfocinas derivadas de células T (FELDMAN;

ZINKIL e JAIN, 2000).

Estas células efetoras T maduras pertencem, em sua maioria, a dois

subgrupos distintos, denominados células Th1 e Th2, que são distinguidos pelas

linfocinas que produzem. Por sua vez, os padrões divergentes de expressão de

linfocinas, permitem que cada um destes subgrupos de células Th promova tipos

distintos de reações imunológicas que se caracterizam como resposta mediada

por anticorpos ou por células (BALIC; BOWLES e MEENSEN, 2000).

As células Th1 produzem IL-2, interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα), também denominado linfotoxina. De modo geral, estas

linfocinas promovem reações de defesa que são mediadas por macrófagos e

outros fagócitos, envolvendo, portanto, a morte intracelular dos patógenos. Por

exemplo, o IFN-γ ativa de forma potente os macrófagos ao induzir a óxido nítrico-

sintetase e outras enzimas metabólicas que aumentam a atividade microbicida

(BALIC; BOWLES; MEENSEN, 2000).

Em contraste, as células Th2, suas citocinas atuam em conjunto para a

quimioatração de células B, mastócitos, basófilos e eosinófilos, promovendo o

crescimento e a diferenciação destes tipos celulares no local da resposta

imunológica. Além disso, a IL-4 promove a troca de isotipo de imunoglobulinas,

atuando na produção de IgE pelos plasmócitos. Esse isotipo, ligado aos

receptores dos mastócitos e eosinófilos, permite que estas células reconheçam e

respondam aos antígenos. Através destes processos, as células Th2 produzem

um influxo de mastócitos e eosinófilos, e ajudam a direcionar o ataque contra do

antígeno parasitário. Esse tipo de reação de defesa é particularmente eficaz

21

contra grandes parasitas multicelulares, como helmintos, que muitas vezes

podem ser destruídos extracelularmente por eosinófilos, mas que são muito

grandes para serem fagocitados por macrófagos (BALIC; BOWLES e MEENSEN,

2000).

2.4 IMUNIDADE HUMORAL CONTRA HELMINTOS

Numerosas interações entre as células do sistema imunológico são

controladas por mediadores solúveis, denominadas de citocinas. Elas formam um

grupo diversificado de proteínas de sinalização intercelular, que regulam não

apenas as respostas inflamatórias e imunológicas locais e sistêmicas, como

também a cicatrização de feridas, a hematopoiese e muitos outros processos

biológicos. As citocinas produzidas pelos linfócitos são conhecidas como

linfocinas, enquanto aquelas produzidas por monócitos e macrófagos são

denominadas monocinas (FUST e CSASZAR, 1998; ROITT et al., 1999).

A interleucina-4 é uma glicoproteína secretada por células T CD4, ativadas

através do subgrupo Th2 e por mastócitos. Estimula a produção de IgE e promove

a indução das células Th2 que controlam, entre outras funções, a proliferação e

as atividades dos eosinófilos e mastócitos (BALIC e BOWLES; MEENSEN, 2000).

O efeito indireto da IL-4 sobre essas células, juntamente com seu efeito

direto sobre a produção de IgE, sugere um papel central nas doenças alérgicas e

parasitárias. Contrariamente, a IL-4 suprime a indução e função Th1, que

controlam muitos aspectos da imunidade celular. Além dos efeitos anteriormente

descritos, a IL-4 promove a atividade das células T citotóxicas, aumenta o

crescimento dos mastócitos mediados pela IL-3, atua de modo sinérgico com o

fatores estimuladores de colônias para aumentar o desenvolvimento de várias

células hematopoéticas e induz a molécula de adesão da célula vascular (VCAM-

l) nas células endoteliais, fazendo o recrutamento dos eosinófilos, linfócitos e

monócitos (STITES et al.,, 2000).

A interleucina-5 (IL-5) foi originalmente descrita como fator de crescimento

de células B e eosinófilos, porém não possui a atividade estimuladora significativa

22

sobre as células B. As células Th2 CD4+ constituem a principal fonte desta

citocina. A IL-5 não apenas aumenta o número de eosinófilos como também

incrementa a sua função. Estudos in vivo demonstraram claramente ser a IL-5 a

principal citocina reguladora da eosinofilia durante infestações por helmintos e

doenças alérgicas (BAO et al., 1996).

Nas infestações provocadas por helmintos, embora haja produção de

anticorpos das classes IgM, IgG e IgA em resposta aos antígenos dos helmintos,

a classe mais significativamente envolvida na resistência aos helmintos é a IgE.

Os antígenos dos helmintos parecem promover preferencialmente a ativação das

células Th2 e, como resultado disto, os indivíduos parasitados apresentam níveis

elevados de IgE circulante (TIZARD, 2000). Os linfócitos B, após terem sido

estimulados pela IL-4, diferenciam-se em plasmócitos e produzem IgE. Essas

imunoglobulinas ligam-se à membrana de mastócitos e basófilos, e quando

entram em contato com o antígeno, liberam substâncias mediadoras da

inflamação. Portanto, estas são responsáveis pelas manifestações agudas das

doenças alérgicas ou indicam infestação por helmintos (BAO et al., 1996;

BENDIXSEN et al., 2004).

2.5 PROTEÍNAS SÉRICAS

As proteínas são elementos indispensáveis à vida, representando a base

da estrutura de células, tecidos e órgãos. Funcionam como catalisadores

enzimáticos nas reações bioquímicas, como hormônios na regulação endócrina,

como nutrientes, como carreadores de muitos constituintes do plasma e na defesa

imunológica, com anticorpos, citocinas, complemento e outras moléculas do

sistema imune (LEAL et al., 2003).

Pelo significado biológico e múltiplas funções exercidas no sistema

orgânico, a avaliação dos níveis séricos das proteínas totais e de suas frações

(albumina, alfaglobulinas, betaglobulinas e gamaglobulinas) obtidas por

eletroforese, representa um importante auxílio ao diagnóstico clínico (LEAL et al.,

2003).

23

A análise do quadro de proteínas séricas é de particular interesse na

bioquímica clínica, devido aos importantes progressos acumulados nos últimos

anos sobre as características físico-químicas e estruturais das proteínas. Soma-

se a esses aspectos, as propriedades fisiológicas e o significado clínico de

numerosas proteínas séricas que, devido a continua evolução nas metodologias

de suas caracterizações e quantificações, têm permitido auxiliar no diagnóstico de

várias patologias que refletem no conteúdo dessas (NAOUM, 1999).

Entre os métodos de qualificação e quantificação dessas proteínas

destaca-se a eletroforese, que permite uma avaliação aproximada das

concentrações de várias proteínas importantes, cujas alterações estruturais, seja

de regulação de suas sínteses, ou de seu maior consumo, podem refletir nas suas

mobilidades eletroforéticas ou nas suas concentrações (NAOUM, 1999).

A eletroforese continua sendo a prova de triagem mais comumente

utilizada para anormalidades das proteínas séricas, à exceção da determinação

da albumina. Antes da eletroforese se tomar facilmente disponível, utilizava-se

amplamente a relação albumina/globulinas, que era determinada por um método

químico. A relação albumina/globulinas não deve ser mais solicitada, uma vez que

a eletroforese não apenas fornece a mesma informação, como também

demonstra com precisão frações em que podem ocorrer anormalidades das

globulinas. Os vários métodos eletroforéticos produzem resultados variáveis,

devido a fatores técnicos, e aos diferentes tipos de materiais utilizados na

migração eletroforética. Alguns dos materiais padrões incluem papel de filtro,

acetato de celulose, gel de agarose e gel de poliacrilamida. Cada método possui

suas vantagens e desvantagens quanto à facilidade de execução, custo ou

sensibilidade a certas frações protéicas (LEAL et al., 2003; NAOUM, 1999).

A utilização da eletroforese tem sido ampliada nos últimos anos, devido o

surgimento de aparelhos modernos e de simples utilização, e também da

disponibilidade de meios de suporte industrializados. Conseqüentemente, os

testes são efetuados com rapidez e uniformidade. A evidenciação de proteínas

pela eletroforese é precisa e valiosa para estudos fisiopatológicos e

imunopatológicos em animais (BRUNE e ALFENAS; 1998).

24

Até hoje foram identificados cerca de 200 tipos de proteínas plasmáticas,

mas estas somente são identificadas por aparelhos de alta sensibilidade e por

técnicas sofisticadas de diagnósticos bioquímicos. Entretanto, na rotina somente

de dez a doze tipos podem ser detectados pelas técnicas comumente utilizadas,

sendo que estas constituem mais de 90% do conteúdo protéico do soro, por isto,

são componentes determinantes das zonas de traçado eletroforético. Para se

obter uma nítida separação das proteínas plasmáticas deve-se utilizar o soro, pois

a análise direta do plasma sofre interferência do fibrinogênio (KANEKO, 1997).

No exame de eletroforese do soro, as proteínas séricas são separadas em

quatro frações principais: albumina, alfa, beta e gama globulinas. Entretanto

dependendo da técnica e da espécie animal em questão, pode-se obter mais uma

fração, a pré-albumina (FELDMAN; ZINKIL e JAIN, 2000; JAIN, 1986).

O principal local de produção das proteínas séricas é o fígado, onde são

sintetizados a albumina, muitos fatores de coagulação e a maior parte das alfas e

beta globulinas (JAIN, 1986). Outras fontes dessas proteínas são as células do

sistema fagocítico mononuclear, linfócitos e plasmócitos (KANEKO, 1997).

As proteínas séricas consistem em albumina e globulinas, tanto na forma

livre ou como proteínas transportadoras. A palavra “globulina” é um antigo termo

químico de fracionamento que se refere à porção não-albumínica das proteínas

séricas. Subseqüentemente, foi constatado que esta porção inclui um grupo

heterólogo de proteínas, como glicoproteínas, lipoproteínas e imunoglobulinas

(EK, 1970; LEAL et al., 2003).

Em geral, as moléculas de globulina são maiores do que as de albumina,

apesar da concentração total de albumina, em condições normais, ser duas a três

vezes ao da globulina. A albumina parece ser mais ativa na manutenção da

pressão oncótica do soro, onde normalmente é cerca de quatro vezes mais

importante do que a globulina. Sendo responsável por cerca de 80% da pressão

oncótica do plasma. A albumina também atua como proteína de transporte para

alguns medicamentos e outras substâncias (ENGLER, 1995).

As globulinas exercem funções mais variadas do que a albumina e formam

25

o principal sistema de transporte de várias substâncias, além de constituir o

sistema de anticorpos, as proteínas da coagulação, o complemento e certas

substâncias de função especial, como as proteínas de “reação aguda” (NAOUM,

1999; KANEKO, 1997; LEAL et al., 2003).

2.5.1 As principais proteínas

Pré-albumina:

Esta proteína é facilmente identificada nas aves, porém em outras espécies

animais, há dificuldade em visualizar esta proteína por meio da eletroforese, ou

porque está ausente em alguns animais domésticos (JAIN, 1986). Sendo esta

sintetizada no fígado e com peso molecular de 50 a 60 kDa, a pré-albumina é

considerada uma proteína de fase aguda negativa. Nos processos inflamatórios

agudos é observada sua diminuição de concentração. A sua redução precoce e

marcante está associada à insuficiência funcional das células hepáticas (NAOUM,

1999).

Albumina sérica:

As principais funções da albumina são o controle da pressão osmótica

plasmática e transporte especifico do material resultante de várias substâncias

endógenas e exógenas, como a bilirrubina, ácidos graxos, ácidos biliares,

histamina, IL-6, cálcio, cobre, zinco, corantes e fármacos. Observa-se a redução

da albumina em processos inflamatórios agudos, por aumento da permeabilidade

capilar, e em situações como a caquexia do câncer, subnutrição e diversas

patologias no sistema digestivo que provocam má absorção. O decréscimo do

nível de albumina também pode ocorrer por hepatopatias, onde a sua síntese

encontra-se prejudicada. A perda da albumina também ocorre por nefropatias e

por queimaduras cutâneas extensas (BIRGEL, 1982; ATHANASIADOU, 2000). A

hiperalbuminemia é resultado de uma hemoconcentração, já que um acréscimo

verdadeiro na concentração de albumina sérica não ocorre (JAIN, 1986).

26

Alfaglobulina:

No fracionamento da alfa-globulina, encontram-se outros subgrupos de

proteínas, a alfa-1 antitripsina, alfa-2 antiquimiotripsina e da alfa-2

macroglobulina. Essas globulinas possuem uma função importante no controle da

resposta inflamatória aguda, bloqueando as proteases liberadas a partir dos

grânulos dos neutrófilos, bem como a trombina e a plasmina (TIZARD, 2000).

A alfa-1 antitripsina é um dos componentes mais importantes entre os

inibidores de proteases. Esse grupo de proteínas possue a função de neutralizar

as atividades das enzimas proteolíticas, seja de natureza bacteriana ou

leucocitária, durante um processo inflamatório (TIZARD, 2000). Observa-se o

aumento da alfa-1 antitripsina em casos de hepatopatias agudas e crônicas em

fases não muito avançadas, e na fase terminal da cirrose, observa-se um

decréscimo (ESTOMBA et al., 1993).

A fração alfa-2 globulina é composta pelas proteínas alfa-2 macroglobulina

e a haptoglobina (GREEN; JENKINS e CLARK, 1982). A primeira possui pouca

importância clínica, pois a diminuição ocorre em casos de hepatopatias crônicas

na fase avançada, pois sua síntese ocorre no fígado (NAOUM, 1999). A

haptoglobina forma um complexo protéico com a hemoglobina livre plasmática,

que é removido posteriormente por fagocitose, realizada pelas células reticulo-

endoteliais (LASTRAS et al., 2001). Durante uma infecção bacteriana os

macrófagos liberam IL-1, estimulando os hepatócitos a secretarem a

haptoglobina, sendo que esta molécula se conjuga ao ferro diminuindo sua

disponibilidade para as bactérias (CHOI et al., 2004). A haptoglobina está

associada a anemia observada em algumas infecções severas ou crônicas,

porque a haptoglobina reduz a disponibilidade de ferro para a produção de

hemácias (TIZARD, 2000).

Betaglobulina:

As zonas das Betaglobulinas contem a transferrina, beta-lipoproteína e

vários componentes do complemento (GREEN; JENKINS e CLARK, 1982;

NUVOLE et al., 1984), sendo que a redução no nível de betaglobulinas não é

27

muito comum.

A função da transferrina que é sintetizada no fígado é o transporte do ferro

plasmático. Sua concentração e peso molecular variam conforme a espécie

animal, de 76 a 90 kDa (JAIN, 1986). Quando ocorre um estado de carência de

ferro, e há hemoglobina livre no soro ou fibrinogênio do sangue não coagulado,

ocorre um aumento da transferrina. Entretanto, na prática clínica, o fator mais

comum de aumento seja o jejum. As betaglobulinas também podem estar

aumentadas quando os níveis séricos de colesterol estão elevados. Esse distúrbio

pode ser resultante de hipertireoidismo, nefrose ou de alguns casos de diabetes,

enquanto a sua diminuição é observada nas hepatopatias crônicas (CHOI et al.,

2004).

O C3 é o componente mais abundante do sistema complemento, sendo o

mesmo sintetizado pelos hepatócitos e macrófagos (CHOI et al., 2004). O

aumento desse componente está relacionado à fase tardia da reação inflamatória

aguda, por isso é considerada uma proteína de fase aguda positiva. Sua

diminuição ocorre quando há um consumo excessivo, devido à ativação da

complexa seqüência de reações em cascata do complemento (NAOUM, 1999);

Gamaglobulina:

As imunoglobulinas (Ig) também chamadas anticorpos são glicoproteínas.

Estas são divididas em cinco classes, sendo a IgG a que possui maior

concentração sérica nos mamíferos, seguida pela IgM e IgA. A IgE é encontrada

em baixas concentrações no soro (JAIN, 1986; ORTONA et al., 2002). As

subclasses de imunoglobulinas dos ovinos são as IgG1, IgG2 e IgG3. Descreveu-

se que alguns ovinos possuem uma IgG1a, mas esta molécula é provavelmente

um alótipo (TIZARD, 2000).

A IgG, com peso molecular de 180 kDa e com concentração variável entre

1.700 a 2.000 mg/dl em ovinos, é produzida e secretada pelos plasmócitos, que

são encontrados no fígado, medula óssea, baço e outros órgãos linfóides

secundários. Essa é a imunoglobulina de maior concentração no sangue, e tem

meia vida média de 20 dias. O aumento da IgG está relacionado aos casos de

28

doenças infecciosas, parasitárias, doenças do tecido conectivo, hepatopatias,

mielomas e outros tumores (FERRE; ORTEGA e MORA; ROJO-VASQUEZ,

1997), enquanto a sua diminuição é observada em fetos, animais recém-nascidos

que não ingeriram o colostro, em animais com imunodeficiências e em casos de

agamaglobulinemia (VERVELDE et al., 2003).

A IgM, apresenta uma concentração sérica de 150 a 250 mg/dl e peso

molecular de aproximadamente 900 kDa. É a segunda imunoglobulina em

concentração plasmática, mas a principal classe de imunoglobulina produzida

durante uma resposta imune primária. A sua produção ocorre nos plasmócitos,

baço, linfonodos e medula óssea. Esta imunoglobulina é mais eficiente que a IgG

na ativação do complemento, opsonização, neutralização de vírus e aglutinação,

e esta se encontra confinada na corrente sanguínea, por ser uma molécula de

elevado peso molecular (JAIN, 1986; LASTRAS et al., 2001).

A IgA é secretada pelos plasmócitos predominantemente localizados nas

paredes dos tratos intestinal e respiratório, sistema urinário, pele e glândula

mamária. Esta, quando produzida nas superfícies corpóreas, pode atravessar

pelas células epiteliais para as secreções externas ou se difundir na corrente

sangüínea, conseqüentemente, a maior parte da IgA produzida no intestino é

transportada no fluido intestinal. Esta é transportada através das células epiteliais

intestinais conjugadas a um receptor conhecido como receptor de imunoglobulina

polimérica (RIgp) ou componente secretor. A molécula complexa formada,

chamada de IgA secretora, torna-se resistente à digestão por parte das proteases

intestinais. O principal modo de ação da IgA é o impedimento da aderência de

microrganismos às superfícies corpóreas (BENDIXSEN et al., 2004). Sua

concentração sérica em ovinos varia de 10 a 50 mg/dl, e possui peso molecular

de 360 kDa. Devido a sua presença nas membranas externas, os constituintes

secretores da IgA formam uma primeira linha de defesa contra agressões do

ambiente externo (STEAR et al., 2004). Aparentemente, não conseguem ativar o

complemento pela via clássica, fazendo-o pela via alternativa (JAIN, 1986;

LASTRAS et al., 2001).

A IgE, como a IgA, é produzida predominantemente pelos plasmócitos

localizados nas paredes dos tratos intestinal e respiratório, sistema urinário, pele

29

e glândula mamárias. Possui peso molecular de 190 kDa e é encontrada em

concentração extremamente baixa no soro. Devido a essa concentração ela não

pode agir simplesmente atravez da conjugação e do recobrimento de antígenos,

semelhante ao que as outras imunoglobulinas fazem (BENDIXSEN et al., 2004).

As moléculas de IgE são encontradas conjugadas a receptores de

mastócitos e basófilos e quando o antígeno se conjuga com essas moléculas, há

liberação dos agentes inflamatórios a partir dessas células. Tem um papel

importante na imunidade ativa contra parasitos, especialmente os helmintos, e

nas doenças alérgicas. Possui uma meia vida de dois a três dias, sendo

razoavelmente instável (BENDIXSEN et al., 2004).

2.5.2 Fatores que influenciam a concentração das proteínas séricas

Fatores como a idade, dieta alimentar, estresse, hemoconcentração,

gestação e lactação, são fatores biológicos que podem influenciar as

concentrações das proteínas séricas (ABBOTT; PARKINS e HOLMES, 1986;

KATARIA et al., 1992; KANEKO, 1997).

Após o nascimento, observamos baixos valores de proteínas séricas,

devido ao baixo nível de imunoglobulinas (LEAL et al., 2003). Este quadro é

rapidamente revertido a partir da ingestão do colostro. Os níveis normais de

albumina e globulinas são alcançados na fase adulta, porém com o avanço da

idade, os níveis de albumina decrescem ligeiramente, enquanto há um

progressivo incremento nos níveis de globulinas (JAIN, 1986; LEAL et al., 2003).

Os indivíduos idosos apresentam um declíneo das proteínas totais (LOPES et al.,

1996).

Existem várias condições patológicas que podem influenciar as

concentrações das proteínas séricas, tais como as doenças que provocam febre,

qualquer forma de injúrias nos tecidos e casos de hemorragias. Animais que

apresentam desidratação, devido à redução do volume sanguíneo, apresentam

valores aumentados das proteínas séricas (JAIN, 1986; KESSABI e

LAMNAOUER, 1981).

3 MATERIAIS E MÉTODOS

No presente estudo foram utilizados 40 animais da espécie ovina, sem raça

definida e com mais de um ano de idade. Os animais que apresentavam sintomas

clínicos evidenciavam secreção ocular, nasal e fezes de consistência pastosa o

que caracterizava um quadro de diarréia. Ao exame das mucosas (palpebral e

oral), alguns animais estavam com as mesmas hipocoradas.

As amostras foram coletadas na Cabanha Santa Suzana, localizada no

macroanel rodoviário (Km 8,5), porção central do Estado de Mato Grosso do Sul.

A região está a uma altitude média de 532 m acima do nível do mar e situa-se nas

seguintes coordenadas geográficas: Latitude - 20º 26’ 34 “Sul e Longitude - 54º

38‘ 47” Oeste. Os animais eram expostos à infestação natural por helmintos

gastrintestinais. O manejo sanitário da propriedade era deficiente, sem programa

estabelecido de desvermifugação.

Os animais foram divididos em quatro grupos, segundo a contagem de

ovos de helmintos por grama de fezes (OPG). Portanto, os grupos contendo 10

animais cada, foram agrupados da seguinte maneira: grupo I (até 100 OPG) com

o mínimo de zero e um máximo 100 OPG, grupo II (200 a 700 OPG)

apresentando um número mínimo de 200 OPG e um máximo 700 OPG, grupo III

(700 a 1.700 OPG) com um número mínimo de 900 OPG e um máximo 1700

OPG e grupo IV (mais de 1.700 OPG) com um número mínimo de 1800 OPG e

um máximo 13200 OPG.

Dos animais experimentais foram coletadas fezes em frascos coletores

universais, transportados para o laboratório sob refrigeração e processadas no

31

mesmo dia. As fezes no laboratório foram pesadas (2 gramas), e adicionadas a

58 ml de solução salina hipersaturada. Após homogeneização as amostras foram

peneiradas no mínimo duas vezes e em seguida colocadas na câmara MacMaster

para contagem (REINECK, 1983). Essa técnica foi realizada no microscópio

Zeiss, modelo ICS Standard 25 utilizando a objetiva de 10 X. Também foram

coletadas amostras de sangue por punção da veia jugular com seringas de 10

mL. Deste volume total 7 mL de sangue foram transferidos para tubos de ensaio

sem anticoagulante, enquanto que 3 mL foram colocados em tubos de ensaio

com anticoagulante (ácido etilenodiamino tetracético – EDTA). As amostras foram

transportadas sob refrigeração para o laboratório. Foram utilizados 3 mL de

sangue total, dispostos em tubos de ensaio com EDTA, para a realização do

leucograma. As amostras com anticoagulante foram utilizadas para contagem

global de leucócitos que foi realizada em câmara de Neubauer pelo método do

hemocitômetro. Estas amostras foram preparadas por diluição do sangue total no

reativo de Türk. O exame foi feito numa câmara de Neubauer em microscópio

com a objetiva de 10x.

A contagem diferencial foi feita através de extensão sangüínea corada pelo

corante panótico (Newprov), usado para coloração rápida na hematologia clínica,

e após a obtenção da contagem relativa dos neutrófilos, eosinófilos, basófilos,

monócitos e linfócitos, os números foram transformados em contagem absoluta

de linfócitos (HEWITT, 1984).

O tubo com sangue sem anticoagulante foi centrifugado a 3.000 rpm

durante 10 minutos (Fanem, modelo 211), para obtenção do soro. O soro obtido

foi congelado – 20º C, até ser analisada.

A separação das frações das proteínas foi realizada através da

eletroforese. O suporte utilizado foi o gel de agarose. Para isto utilizou-se uma

cuba com dois compartimentos separados por 5 a 10 cm, o primeiro contendo o

eletrodo com fio preto, que determina o pólo negativo, e o segundo, o eletrodo

com fio vermelho, que é o pólo positivo. Nos compartimentos foi colocada a

solução tampão, e entre os compartimentos o suporte de eletroforese (agarose).

As amostras foram colocadas no suporte, e então aplicada uma corrente elétrica

para o posterior fracionamento das proteínas.

32

Na análise estatística foram consideradas as seguintes variáveis: proteínas

totais (em g/dl), globulinas totais (em g/dl), gamaglobulinas, alfaglobulinas e

betaglobulinas avaliadas pela eletroforese (em g/dl), linfócitos totais (em

células/ml). Tais variáveis foram submetidas à análise de variância, de acordo

com os quatro grupos experimentais. Nos casos em que houve significância no

resultado, foi realizada a comparação entre médias dos grupos pelo método de

Tükey. Foi realizado, também, o teste de correlação entre as variáveis citadas e

os valores de OPG. Os testes foram realizados com níveis de significância igual a

5% (p < 0,05), conforme recomendam Berquó, Souza e Gotlieb (1981).

4 RESULTADOS

Os animais, dos quatro grupos experimentais apresentaram as médias dos

leucócitos dentro dos valores referência para a espécie (4.000 a 12.000 céls. /µL).

Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. Os linfócitos

dos animais pertencentes aos grupos I, II e III não apresentaram diferença

estatisticamente significante, enquanto que os animais do grupo IV apresentaram

diferença significativa entre as medias conforme indicado na Tabela 1.

TABELA 1- Valores médios (e desvio padrão) de parâmetros imunológicos de ovinosnaturalmente infectados por helmintos gastrintestinais

GruposParâmetros I

(até 100 OPG)II

(200 a 700 OPG)III

(900 a 1.700 OPG)IV

(mais 1.700 OPG)

Leucócitos

(céls. /µL).

6,97 a(1,90)

8,56 a(3,47)

9,0 a(2,89)

9,03 a(2,35)

Linfócitos

(céls. /µL).

3,71 a(1,56)

3,02 a(1,11)

3,04 a(1,38)

2,91 b(1,09)

Obs.: Por meio das letras (a e b) indica-se as diferenças estatisticamente significantes a nível de5% (p < 0,05), pelo método de Tükey.

A concentração média das proteínas séricas totais dos animais dos grupos

I, II e III, apresentaram valores normais para a espécie, não havendo diferença

estatística significante. Porém os animais do grupo IV tiveram uma concentração

média, abaixo do valor normal para a espécie. As frações albumina e

34

gamaglobulina nos grupos I, II, III não diferiram, segundo o teste de Tükey,

porém, o grupo IV, evidenciou diferença.

GRAFICO 1- Valores médios de leucócitos e linfócitos de ovinos infestados por

helmintos gastrintestinais.

TABELA 2 - Valores médios (desvio padrão) de proteínas séricas totais, albumina,gamaglobulina e frações globulínicas determinados por eletroforese no soro de ovinosdos quatro grupos experimentais.

GruposParâmetros I

(até 100 OPG)

II(200 a 700 OPG)

III(900 a 1.700 OPG)

IV(mais 1.700 OPG)

Proteínas totais

(g/dl)7,24 a(1,02)

7,18 a(0,51)

7,18 a(0,71)

5,88 b(0,96)

Gamaglobulina

(g/dl)2,88 a(0,89)

2,34 a(0,94)

2,03 a(1,03)

1,98 b(1,39)

Alfa 1 globulina

(g/dl)0,61 a(0,07)

0,63 a(0,15)

0,58 a(0,08)

0,55 a(0,10)

Alfa 2 globulina

(g/dl)0,69 a(0,22)

0,82 a(0,12)

0,72 a(0,15)

0,72 a(0,10)

Betaglobulina

(g/dl)1,02 a(0,23)

0,92 a(0,23)

0,96 a(0,25)

1,06 a(0,44)

Albumina

(g/dl)3,57 a(0,18)

3,24 a(0,27)

2,93 a(0,14)

2,14 b(0,17)

Obs.: Por meio das letras (a e b) indica-se as diferenças estatisticamente significantes a nível de5% (p < 0,05), pelo método de Tükey.

0123456789

10

Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV

Leucócitos (céls./uL)linfócitos (céls./uL)

35

As frações alfa-1 globulina, alfa-2 globulina e betaglobulina os resultados

destas mostraram-se estatisticamente semelhantes conforme demonstrado na

Tabela 2.

GRAFICO 2 – Valores médios das proteínas séricas, gamaglobulinas e albumina deovinos infestados por helmintos gastrintestinais.

GRAFICO 3 - VVaalloorreess mmééddiiooss ddaass aallffaa 11 gglloobbuulliinnaass,, aallffaa 22 gglloobbuulliinnaass ee bbeettaagglloobbuulliinnaass ddeeoovviinnooss iinnffeessttaaddooss ppoorr hheellmmiinnttooss ggaassttrriinntteessttiinnaaiiss

012345678

Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV

Proteina totais (g/dl)Gamaglobulinas (g/dl)Albumina (g/dl)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV

Alfa 1 globulina (g/dl)Alfa 2 globulina (g/dl)Betaglobulina (g/dl)

36

TABELA 3 - Correlação (r) entre parâmetros imunológicos celulares e humorais econtagem de ovos nas fezes dos ovinos dos quatro grupos experimentais

Correlação Valor de r

Leucócitos x OPG 0,229

Linfócitos x OPG - 0,03

Proteínas totais x OPG - 0,14

Gamaglobulina x OPG - 0,061

Alfa 1 globulina x OPG - 0,10

Alfa 2 globulina x OPG 0,02

Betaglobulina x OPG 0,14

Albumina x OPG - 0,25

Ao realizar o teste de correlação com a contagem de ovos (OPG),

encontrou-se uma correlação negativa com as variáveis (proteínas totais,

gamaglobulinas, linfócitos, alfa 1 globulina e albumina), ou seja, quanto maior a

contagem do OPG, menor o valor das variáveis citadas e estudas acima. E para

os leucócitos, a alfa 2 globulina e Betaglobulina, quanto maior o valor do OPG,

maior foi número de leucócitos, alfa 2 globulina e Betaglobulina, ou seja,

correlação positiva, conforme descrito na Tabela 3.

5 DISCUSSÃO

Conforme observado no OPG das fezes, alguns animais chegaram a níveis

próximos de 2.000 OPG, que reflete o nível alto de contaminação das pastagens

e o número de parasitas no animal. Segundo Amarante (1995), a criação de

ovinos está estabelecendo-se em áreas pequenas e com superlotação, fazendo

com que o alto índice de larvas nas pastagens seja uma fonte de contaminação

constante.

Possivelmente o principal parasita responsável pelas alterações

encontradas seja o Haemonchus contortus, pois segundo Baker et al. (1982)

citado por Silva et al., (2002), descreveram hipoproteinemia com

hipogamaglobulinemia em animais com hemoncose. Ressalta-se que neste

trabalho os animais do grupo IV, apresentaram tais alterações. As infecções, na

maioria das vezes, são mistas (AMARANTE, 1995). Assim é razoável supor que

havia parasitismo por espécies de Trichostrongylus colubriformis e que também

podem ter sido responsáveis pelas alterações encontradas.

Ao avaliar as alterações das proteínas séricas, leucócitos e linfócitos,

verificamos os efeitos do parasitismo e como o animal está reagindo frente a

estes parasitas. Isto foi possível porque, ao serem analisados os valores

individuais dos animais estudados, observou-se uma grande variabilidade de

resposta, também encontrada por outros autores (WINDON; DINEEN e KELLY,

1980; ALBERS et al., 1987; PADILHA, 2000).

Os resultados também demonstram que é possível selecionar animais

resistentes aos helmintos gastrintestinais conforme descrito por Woolaston,

38

Barger e Piper (1990). Essa avaliação pode ser um instrumento valioso para

estabelecer um de programa de controle parasitário, pois através dos exames

realizados, verificou-se que animais que tiveram a contagem acima de 1.700 ovos

por grama de fezes apresentaram alterações significativas das proteínas séricas

totais, das frações albumina e gamaglobulina e diminuição da contagem absoluta

de linfócitos.

Os animais do grupo IV apresentaram redução dos valores das proteínas

totais e albumina, conforme descrito por Baker et al. (1982) citado por Silva et al.,

(2002) e Vervelde et al. (2003), que descreveram hipoproteinemia em animais

com intensa infestação parasitaria. Houdijk et al. (2001), Johnston e Morris (1996)

demonstraram que o parasitismo intestinal por helmintos pode provocar estado

nutricional precário, devido à diminuição da absorção de nutrientes, anorexia e

anemia, causando hipoproteinemia nestes animais.

A grande perda de proteínas (parasitismo intestinal) leva a diminuição em

todas as frações, mas a redução mais dramática é observada na albumina.

Houdijk et al. (2001), descreve que distúrbios gastrintestinais crônicos interferem

com a digestão e absorção, podem levar a inadequada provisão de substratos

aminoácidos para a produção de proteínas.

Observou-se uma gradativa redução nos valores das gamaglobulinas,

sendo esta mais intensa no grupo IV, resultados que estão de acordo com Silva et

al. (2002) e Baker et al. (1982) citado por Silva et al., (2002), que observaram

hipogamaglobulinemia em animais com helmintose. O sistema imune é

fortemente afetado pela privação severa de proteínas com diminuição da síntese

de imunoglobulinas resultando em hipogamaglobulinemia e diminuição da

resistência a infecções (VERVELDE et al., 2003).

No presente estudo foi verificado alterações apenas na fração alfa 2

globulina, onde fora observado aumento desta, conforme houve um acréscimo do

OPG. Possivelmente o aumento dessa fração deve-se ao fato da mesma ser

considerada uma proteína de fase aguda positiva, que compartilham propriedades

de apresentarem elevações nas concentrações em respostas a situações de

estresse ou condições inflamatórias (LASTRAS et al., 2001).

39

Em face aos resultados encontrados no grupo IV, podemos inferir que a

maior infestação fez com que os animais apresentassem hipoproteinemia, logo

estes animais poderão apresentar baixo ganho de peso, diminuição da

quantidade e qualidade de lã, eficiência reprodutiva baixa e diminuição da

qualidade do produto enviado ao mercado consumidor. A soma desses fatores

acarreta inúmeras perdas produtivas e econômicas. As perdas causadas por

helmintos, estão relacionadas à baixa produtividade, devido aos custos com

tratamento, profilaxia e morte dos animais (EMPRESA BRASILEIRA DE

PESQUISA AGROPECUÁRIA, 1987; HARRISON et al., 2002).

6 CONCLUSÕES

O presente trabalho permite inferir que animais com intensa parasitose

intestinal, apresentam redução das proteínas séricas totais, e das frações

albumina e globulina, e que a hipoproteinemia resultante pode afetar a resposta

imune dos animais.

Os resultados do OPG nas fezes associados à eletroforese das proteínas

séricas constituem indicadores para controle parasitário de ovinos e seleção de

animais resistentes a helmintos.

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