MK: MIKROBIOLOGI TEKNIKDOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.PERSIAPAN UNTUK PEMERIKSAAN BAKTERI

1. PENDAHULUAN Bakteri dapat diperoleh dari mana-mana, misal dari rongga mulut, dari sela-sela gigi, dari sisa-sisa makanan yang sudah basi. Biasanya kita mengadakan pemiaraan dulu didalam cawan petri yang berisi zat-makanan atau medium. Asalkan medium itu dibiarkan begitu saja terbuka, maka sehabis 24 jam akan kita dapati berpuluh-puluh koloni bakteri dan jamur (cendawan) menutup permukaan medium tersebut. Rebusan kentang yang sudah dikuliti ataupun jenang-dodol dapat kita pergunakan sebagai medium yang sederhana. Di belakang akan diuraikan tentang pembuatan medium untuk keperluan penelitian. Koloni cendawan dapat segera dibedakan dari koloni bakteri; koloni cendawan itu memperlihatkan benang-benang miselium. Koloni bakteri nampak seperti sekelumit mentega, air susu atau percikan sari-buah yang kental. Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa didalam keadaan hidup ataupun didaklam keadaan mati. Pemeriksaan morfologi ini perlu untuk mengenal nama bakteri disamping itu diperlukan juga sifat-sifat fisiologinya, bahkan sifat-sifat fisiologi itu kebanyakan merupakan factor penentu dalam mengenal nama spesiesnya.

2. PEMERIKSAAN BAKTERI HIDUPPemeriksaan bakteri hidup harus dikerjakan dengan berhai-hati, lebih-lebih jika yang akan diperiksa itu bakteri pathogen.di sini akan dibicarakan cara-cara pemeriksaan itu secara garis besar saja; hal-hal yang lebih khusus dapat dipelajari dari kitab-kitab penuntun praktikum mikrobiologi. Untuk mengetahui tingkah-laku (gerak-gerik) bakteri, lazimnya kita adakan penyelidikan bakteri di dalam teesan berganung. Alat-alat yang kita perlukan untuk ini ialah:a. sehelai kaca-penutup (cover glass)yang bersih.b. sehelai kaca-benda yang mempunyai cekungan di tengah-tengah.c. kawat inokulasi, yaitu kawat lurus sepanjang 10 cm, berdiameter kurang dari pada suatu pegangan. Guna kawat inokulasi ialah untuk memindahkan mikroorganisme dari tempat yang satu ke tempat yang lain.Baik sekali jika kawat itu dibuat dari platina atau logam lain yang tidak mudah berkarat.d. Sebuah mikroskop biasa.e. Nyala api, misalnya dari lampu Bunsen, yaitu sentir yang diisi dengan spritus. Api ini perlu sekali untuk memijarkan kawat inokulasi. Tiap kali kawat itu akan dipakai untuk memindahkan bakteri, haruslah sebelum dan sesudahnya dipijarkan supaya benar-benar steril.

3. PROSEDUR MENYIAPKAN SEDIAAN (PREPARAT)Jika bakteri dipiara didalam cairan, ujung kawat inokulasi setelah dipijarkan dan dingin kembali, kemudian dicelupkan sedikit didalam pemiaraan tersebut. Sentuhkanlah ujung kawat yang mengandung piaraan itu kepada tengah-tengah kaca penutup, kemudian baliklah kaca penutup itu dan letakkanlah ia diatas benda kaca demikian rupa, sehingga tetesan yang berisi bakteri itu masuk tepat didalam cekungan kaca benda. Setelah ujung kawat selesai dipakai tadi perlulah dipijarkan dalam nyala api.Kaca benda yang membawakan tetesan bergantung tersebut dapat dipindahkan ke piringan mikroskop untuk diperiksa. Supaya cairan yang mengandung bakteri itu tidak menguap, dapatlah tepi kaca penutup ditetesi dengan gliserin.Perlu diperingtkan disini, bahwa tepi mulut tabung reaksi tempat piaraan bakteri itu harus dipanasi dengan nyala api setelah kapas penumbatnya diambil. Demikian pula, setelah pengambilan bakteri selesai dan kapas akan disumbatkan kembali, maka mulut tabung piaraan itu harus dipanasi lagi. Memijarkan kawat inokulasi sebelum dan sesudah dipakai serta memanasi mulut tabung sebelum dan sesudah dipakai harus dipakai harus merupakan kebiasaan yang tidak boleh dilupakan. Hal ini merupakan apa yang disebut teknik aseptik.Keuntungan penggunakan metoda tetesan bergantung ialah:a. Bakteri ada terkurung didalam lubang kaca benda, sehingga bahaya terhamburnya kemana-mana itu hampir tidak ada.b. Bakteri dapat bergerak dengan leluasa, jika bakteri memang suka bergerak. Tidak semua sepsis dapat bergerak. Cara lain untuk memeriksa bakteri hidup ialah dengan tetesan medium yang tidak bergantung. Prosedurnya lebih mudah, dan untuk itu tidak diperlukan kaca benda yang mempunyai cekungan ditengah, akan tetapi cukuplah dengan menggunakan kaca benda yang datar biasa. Ujung kawat yang membawa bakteri disentuhkan ditengah-tengah kaca benda, kemudian tetesan itu ditutup dengan kaca penutup biasa, maka jadilah suatu preparat yang siap untuk diperiksa. Preparat yang disediakan demikian ini kurang aman, lagi pula gerakan bakteri tidak dapat sebebas-bebasnya.

4. MEMBUAT PREPARAT BAKTERI YANG SUDAH DIMATIKAN LEBIH DAHULUSediakan sehelai kaca yang bersih. Ambillah sedikit sample dari bakteri yang dipiara dalam medium cair atau dari suatu koloni yang terdapat pada suatu medium padat. Pengambilan itu dengan menggunakan ujung kawat inokulasi. Gesekkan ujung kawatyang membawakan bakteri itu ditengah-tengah kaca benda sehingga terjadi suatu pembidangan seluas kira-kira 1 cm2. Jika sikap ujung kawat itu diusahakan agak sejajar dengan permukaan kaca benda, maka penggesekan akan lebih mudah dan lebih merata, bakteri tidak akan bertimbun-timbun pada suatu tempat tertentu. Jika sample tadi diambil dari suatu koloni pada medium padat, maka tengah-tengah kaca benda harus diberi sedikit air murni dulu sebelum penggesekan dilakukan. Air itu tidak perlu diberikan, jika sample bakteri diambil dari piaraan yang berada pada medium cair.Tunggulah sampai gesekan agak kering, kemudian lewatkan kaca benda itu melalui suatu nyala api, perlahan-lahan sampai gesekan itu kering. Dalam hal ini haruslah dijaga supaya tempat gesekan bakteri tersebut tidak langsung kena nyala api, jadi permukaan yang mengandung gesekan harslah diatas pada waktu kaca benda itu dilewatkan nyala api.Jika gesekan bakteri itu sudah kering benar, dapatlah dimulai dengan pewarnaan bakteri. Metode mewarnai preparat itu banyak sekali, akan tetapi hanya kira-kira 12 cara sajalah yang lazim digunakan. Bakteri hidup itu tidak nampak jelas bentuk maupun sifat-sifat morfologi lainnya. Bakteri tunggal yaitu berupa satu sel saja nampaknya hanya bening belaka, walaupun bakteri itu berasal dari suatu koloni yang mempunyai warna tertentu. Maka untuk memperlihatkan bagian-bagian sel itu diperlukan pewarnaan. Untuk memperlihatkan inti atau bahan inti ada pewarnaan tersendiri, untuk memperlihatkan flagel ada cara lain lagi, demikian pula untuk memperlihatkan spora ada cara yang khusus untuk itu saja. Cara-cara mewarnai itu ditemukan oleh sarjana-sarjana, sehingga metode pewarnaan itu disebut menurut nama sarjana yang menemukan cara itu, misalnya pewarnaan inti disebut pewarnaan secara Feulgen, kemudian ada pewarnaan secara Giemsa, pewarnaan secara Gram, secara Neisser, dan masih banyak lagi. Zat warna yang digunakan bias biru metilen, merah safranin, ungu, hijau berlian dan lain-lainnya lagi. Disamping itu zat warna bias bersifat asam, netral atau basa.

5. PETUNJUK-PETUNJUK UMUM UNTUK MEWARNAI BAKTERISecara umum, petunjuk-petunjuk untuk mewarnai bakteri yaitu:a. Bakteri haruslah diambil dari suatu piaraan yang masih muda, kira-kira umur 24 jam, ini usia yang baik untuk memperlihatkan bentuk morfologinya. Jika ingin melihat bakteri yang sudah membentuk spora, maka perlulah diambil bakteri yang sudah tua, yaitu dari suatu piaraan yang berumur 2 sampai 3 kali 24 jam.b. Bakteri diratakan diatas kaca benda yang bersih, seluas kira-kira 1 cm2. Hindarilah pengambilan bakteri yang terlalu banyak. Jika tidak diratakan tipis-tipis, maka bakteri akan bertimbun-timbun sehingga pemeriksaan bentuknya satu persatu tidak akan jelas.c. Jika sudah kering, sediaan perlu dilewatkan nyala api perlahan-lahan supaya bakteri itu benar-benar melekat pada kaca benda, sehingga dengan demikian tidak akan terhapus apabila sediaan dicuci. Jangan sampai bidang yang mengandung bakteri itu kena nyala api.d. Zat warna ditetesi pada bidang yang mengandung bakteri. Juga mungkin seluruh kaca benda tersebut terendam miring didalam zat warna, hal ini bergantung sifat khusus pewarnaan, dan kadang-kadang juga bergantung pada banyak sedikitnya kaca benda (preparat) yang harus dibuat. Zat warna diberi waktu beberapa lama supaya diserap oleh bakteri yang sudah kering itu, waktu inipun bergantung sifat khas dari zat warna yang digunakan.e. Kemudian sediaan dicuci dengan alcohol atau asam encer guna menghilangkan zat warna yang berlebihan. Alkohol yang digunakan untuk mencuci itu dapat berupa larutan 15% sampai 95%, kadang-kadang diperlukan juga alcohol 100%. Caranya mencuci itu cukup dengan mencelupkan sediaan ke dalam alcohol atau ke dalam asam encer dengan tidak usah disinggung-singgung ataupun digesek-gesek. Ada pula zat warna yang cukup dicuci dengan air murni ataupun air biasa dari kran.f. Sediaan ditunggu keringnya, jangan dipanasi. Jika sudah kering, sediaan dapat diperiksa dengan mikroskop, kalau perlu dengan menggunakan minyak cedar (minyak imersi atau minyak celup). Jika dikehendaki, sediaan dapat ditutup dengan kaca penutup sebelum di tempatkan diatas piringan mikroskop. Sediaan yang diinginkan untuk disimpan lama perlu perlakuan sebagai berikut. Permukaan yang mengandung bakteri ditetesi balsam kanada, kemudian dituutp dengan kaca penutup yang bersih. Sebelum kering betul, sediaan tidak boleh diletakkan miring. Sesudah balsam kanada kering betul, barulah sediaan dapat dimasukkan kotak penyimpan sediaan, dalam posisi miring. Selanjutnya preparat disimpan di dalam gelap lagi pula sejuk, agar supaya zat warna tidak lekas luntur.

6. TAHAN ASAM, GRAM POSITIF, GRAM NEGATIFAda kalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Ditinjau dari tujuan pewarnaan sudah barang tentu pewarnaan tersebut merupakan kegagalan. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya basil-basil TBC dan basil-basil yang berspora. Maka kita katakana, bahwa bakteri itu adalah bakteri tahan asam, ini merupakan cirri yang khas bagi suatu species. Ada kalanya suatu sediaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alcohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah.Jika sediaan itu kemudiaan kita cuci dengan air, lalu dengan alcohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang nampak ialah zat warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut Gram Positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita katakan Gram Negatif. Ada pula bakteri yang usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negative atau sebaliknya. Bakteri yang demikian ini disebut gram variable. Jumlah bakteri yang gram variable tidaklah banyak. Bakteri gram positif lebih peka terhadap fenol, penisilin, dan resisten terhadap streptomisin. Cirri yang khas ini dipergunakan dalam penggolongan bakteri.

GUNA KULTUR BAKTERI

Untuk menggampangkan pemeriksaan perlulah diadakan kultur atau pembiakan bakteri, sehingga sewaktu-waktu perlu, bakteri itu selalu tersedia. Kultur dapat disimpan didalam lemari es untuk waktu yang lama.

1. KULTUR CAMPURAN, KULTUR MURNISupaya kita mendapatkan satu spesies saja dalam satu kultur, maka perlulah diadakan suatu kultur murni (pure culture). Kultur murni dapat diperoleh dari kultur campuran (mixed culture) dengan cara sebagai berikut.Kalau kita pertama kali mengadakan pengkulturan, biasanya yang kita peroleh itu suatu kultur campuran. Misal, kita ambil bahan (sampel) dari udara, dari tanah, dari kotoran; kalau bahan kita sebarkan pada medium steril, akan tumbuhlah beraneka koloni yang masing-masing mempunyai sifat-sifat yang khas. Jika kita mengambil bahan dari salah satu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita tanam pada medium baru yang steril, maka bahan itu tumbuh menjadi koloni yang murni, asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptik, yaitu menggunakan alat-alat yang steril dan aturan-aturan laboratorium tertentu. Kultur yang kita peroleh dengan jalan demikian kita sebut kultur pertama (primary culture), dan sifatnya murni. Kultur semacam ini dapat disimpan, tetapi tiap-tiap waktu tertentu harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru. Kultur-kultur yang diperoleh dari kultur pertama disebut kultur turunan (sub-culture).Tiap-tiap laboratorium perlu menyimpan beberapa jenis kultur murni. Negara-negara yang sudah maju mesti mempunyai koleksi pelbagi kultur murni; kultur simpanan itu disebut juga stock culture.Ada kultur spesies bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu tiap 2 atau 3 bulan sekali, perlu diremajakan, meskipun kultur itu selalu disimpan dalam lemari es. Untuk meremajakan kultur itu caranya sama dengan yang telah diceritakan diatas dengan memindahkan bibit dari koloni yang lama kepada medium yang baru. Setelah tanaman baru itu dibiarkan tumbuh beberapa jam dalam temperature biasa (250-270C), koloni baru ini dimasukkan dalam lemari es, untuk diperbaharui 2 atau 3 bulan lagi.Cara lain untuk menyimpan kultur murni adalah dengan jalan liofilisasi yang prosedurnya sebagai berikut:Bakteri ditanam di dalam air susu yang tidak mengandung lemak atau didalam serum yang steril. Setelah tumbuh diambillah 0,1 ml dari medium tersebut untuk dimasukkan kedalam botol-botol kecil yang dari dalam telah dilapisi dengan alkohol yang mengandung CO2 yang kental (temperatur -780C). Kemudian leher botol itu dipijarkan sehingga tertutuplah botol berisi bakteri itu. Dalam keadaan demikian ini bakteri dapat disimpan sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 40C.

2. DASAR MAKANAN (MEDIUM ATAU SUBSTRAT)Dasar makanan yang paling baik bagi kultur bakteri adalah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan, atau ramu-ramuan yang dibuat oleh menusia. Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium ialah kaldu cair dan kaldu agar. Medium ini tersusun dari pada: Kaldu bubuk3 g Peptone5 g Air suling 1000 gJika diperlukan medium padat, maka kepadanya ditambahkan 15 g agar-agar. Medium ini disebut medium baku. Untuk keperluan penelitian yang berhubungan dengan serologi perlu ditambahkan 5 g NaCl.Jika tidak ada kaldu bubuk, bahan itu dapat diganti dengan rebusan daging yang diperoleh sebagai berikut: ambil barang 0,5 kg daging yang tidak berlemak, rendam dalam 1000 ml air suling semalam-malaman dalam lemari es. Paginya buanglah lemak yang mungkin terdapat mengapung di permukaan air. Kemudian peraslah suspensi lewat kain mori yang halus. Tambahkan air suling kepada filtrat sehingga volume menjadi 1 liter lagi. Kepada medium ini ditambahkan 5 g peptone dan lain-lainnya yang diperlukan, lalu panasi suspensi lewat kertas saring, dan tambahkan air suling lagi sehingga volume tetap 1 liter. Medium ini perlu disterilkan dahulu sebelum digunakan untuk mengkultur bakteri. Juga keasaman medium perlu diatur, biasanya pH 7.Untuk mengetahui jenis-jenis medium yang lain, yang berkepentingan dipersilahkan membaca buku-buku praktikum mikrobiologi atau bakteriologi.Selanjutnya medium buatan manusia itu dapat berupa :A. Medium Cair Medium cair yang biasa dipakai adalah kaldu yang disiapkan sebagai berikut. Kepada 1 liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g peptone. Peptone adalah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai, dan pada putih telur. Peptone mengandung banyak N2, sedangkan kaldu berisi garam-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukan pHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut diatas masih perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi atau botol-botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelah tabung atau botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas, dapatlah mereka dimasukkan kedalam alat pensteril (autoklaf).

B. Medium Kental (Padat) Dahulu kala orang lazim menggunakan kentang yang dipotong-potong serupa silinder untuk medium. Silinder kentang mentah dibuat dengan pipa besi, lalu potongan-potongan itu dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian tabung disumbat dengan kapas, dan setelah itu disterilkan di dalam autoklaf. Setelah kentang dingin kembali, permukaan atas dari silinder kentang dapat ditanami bakteri.Suatu penemuan yang baik sekali adalah medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium itu disterilkan, dan kemudian dibiarkan mendingin, maka kita perolehlah medium padat. Gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental dan memang dahulu orang biasa memakainya, tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-agar baru mencair pada suhu 950C, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 230C. Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam tempat yang lebih dingin daripada temperatur kamar, jika dikehendaki medium tersebut tetap dalam keadaan padat.Agar-agar merupakan zat pengental, dan bukan zat makanan bagi bakteri. Gelatin sebaliknya dapat diencerkan oleh enzim-enzim bakteri. Gelatin diperoleh dari rebusan tulang-tulang, jadi gelatin itu zat serupa perekat.

C. Medium Yang Diperkaya Kebanyakan bakteri suka tumbuh pada dasar makanan seperti disebut diatas. Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis, Diplococcus pneumoniae, dan Neisseria gonorrhoeae memerlukan zat makanan tambahan berupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen lagi. Fibrinogen adalah zat yang menyebabkan darah menjadi kental, apabila keluar diluka. Serum atau darah itu dicampurkan ini dilakukan sebelum disterilkan. Jika pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serum atau darah tersebut akan mengental akibat pemanasan. Pada medium buatan Loeffler, serum dicampurkan didalam dasar makanan sebelum sterilisasi. Medium ini baik sekali untuk memiara basil-basil dipteri. Juga medium yang memerlukan tambahan putih telur dibuat dengan cara demikian. Sering kali orang menambahkan susu atau air tomat kepada dasar makanan untuk menambahkan Lactobacillus dan beberapa spesies lainnya.D. Medium Yang Kering Pekerjaan laboratorium sekarang ini banyak dipermudah dengan telah adanya bermacam-macam medium yang tersedia dalam bentuk serbuk kering. Untuk menyiapkan medium tersebut, cukuplah orang mengambil sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian liter air dan kemudian larutan itu disterilkan. Penentuan pH tidak perlu lagi, karena hal itu sudah dilakukan lebih dahulu pada pembuatan serbuk. Periksalah Difco Manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and dimical laboratory producers.

E. Medium Yang Sitentik Medium sitentik berupa ramuan-ramuan zat anorganik yang tertentu yang mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam medium ini. Bakteri saprofit (istilah lain untuk ini adalah saprobakteri) dapat juga di kultur di dalam medium ini asalkan kepada medium ini ditambahkan natrium sitrat dan natrium ammonium fosfat; yang pertama merupakan sumber karbon, sedang yang kedua merupakan sumber nitrogen. Medium ini buatan koser, dan medium ini berguna untuk membedakan Aerobacter aerogenes dari Escherichia coli; yang pertama dapat hidup dalam medium ini, sedang yang kedua tidak. Medium yang hanya cocok untuk spesies-spesies tertentu, dan tidak cocok untuk spesies-spesies yang lain, itu disebut medium selektif.Medium sintetik itu umumnya dibuat secara eksperimental. Medium ini tidak menimbulkan zat-zat penolak, apabila masuk tubuh hewan atau manusia. Selanjutnya medium sintetik itu berguna sekali sebagai medium dasar dalam penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan tentang ada tidaknya zat-zat tertentu dengan menggunakan mikroorganisme itu disebut analisis zat jadi atau bio-assay.

3 STERILISASI MEDIUM DAN PERALATANKita semua dapat memaklumi, andaikata medium dan alat-alat yang kita pergunakan dalam inokulasi itu tidak steril, niscahayalah kita tidak akan mungkin memperoleh kultur bakteri yang kita inginkan. Maka langkah-langkah pertama yang harus kita ambil sebelum kita mengadakan inokulasi adalah mengusahakan sterilnya medium serta alat-alat perlengkapannya. Lagi pula, kita harus menguasai teknik inokulasi.Beberapa cara untuk mensterilkan medium, adalah:1. Dalam abad 18 orang mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut selama beberapa jam. Dengan jalan ini maka matilah semua benih kehidupan. Cara yang demikian ini dilakukan oleh Spallanzani (1729-1799) untuk membuktikan tidak mungkinnya abiogenesis.2. Tyndallisasi, medium ini berupa mendidihkan medium dengan uap untuk beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif, maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan sekali lagi. Dengan jalan demikian ini diperolehlah medium yang steril, dan lagi pula, zat-zat organik yang terkandung didalamnya tidak mengalami banyak perubahan.3. Dengan autoklaf, yaitu alat berupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan didalam autoklaf selama 15 sampai 20 menit, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya barang yang perlu disterilkan. Medium yang akan disterilkan itu lebih baik ditempatkan dalam beberapa botolyang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang besar. Setelah pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka, dan temperatur akan terus-menerus naik sampai 1210C. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan ada sebesar 15 lbs (pound) per inch persegi yang berarti 1 atmosfer per 1 cm2. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit itu dimulai semenjak thermometer pada autoklaf menunjuk 1210C. Aetelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan dengan demikian akan kita saksikan, bahwa suhu mulai turun sedikit demi sedikit, demikian pula manometer. Autoklaf tidak bolehj dibuka sembarangan. Jika dilakukan hal demikian, maka isi botol yang ada diautoklaf akan meluap kemana-mana. Kita menunggu sampai manometer menunjuk 0, barulah autoklaf kita buka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit. Jika medium mengandung vitamin, gelatin maka setelah sterilisasi sependek-pendeknya dalam autoklaf, medium tersebut haruslah segera didinginkan sesudahnya dikeluarkan dari autoklaf. Perlakuan ini pertlu untuk menghindarkan terurainya zat-zat tersebut. Medium yang sudah steril dapat disimpan dalam lemari es.4. Dengan Penyaringan (filtrasi). Medium disaring dengan saringan porselin atau dengan tanah diatom. Dengan jalan ini, maka zat-zat organik tidak akan mengalami penguraian sama sekali. Hanya sayang, virus tak dapat terpisah dengan penyaringan semacam ini. Oleh karena itu, sehabis penyaringan, medium masuh perlu dipanaskan dalam autoklaf, meskipun tidak selam 15 menit dengan temperatur 1210C. Penyaringan dapat juga dengan menggunakan saringan yang dibuat dari asbes, Saringan ini lebih murah dan lebih mudah penggunaannya daripada saringan porselen. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselen terlalu mahal untuk dibuang, dan terlalu sulit untuk dibersihkan.

Pensteril Dengan Gelas-GellasGelas, botol, pipa, pipet yang sudah bersih tidak disterilkan didalam autoklaf, karena barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari gelas dimasukkan didalam oven kering selama 2-3 jam pada temperatur 1600-1700C, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan dalam oven. Kapas masih dapat bertahan dalam oven kering selama waktu dan pada temperatur seperti tersebut diatas. Alat-alat yang belum bersih dan belum kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering.Pensterilan peralatan dapat pula dilakukan dengan gas etilen oksida. Hal ini harus dikerjakan dengan hati-hati, karena ada bahaya letusan.

4. PENANAMAN BAKTERI (INOKULASI)Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru meminta banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua peralatan yang ada sangkut-pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi harus benar-benar steril, ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan.

A. Menyiapkan Ruangan.Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel kepadanya. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali jika meja tempat inokulasi itu dibasahi dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan juga didalam suatu kotak berkaca. Dalam laboratorium didalam untuk membuat vaksin, serum dan sebagainya, udara yang masuk kedalam ruangan itu dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar ultra-ungu.

B. Memindahkan Dengan Kawat InokulasiUjung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari micron, ujung itu boleh lurus, boleh juga berupa kolongan dengan diameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat dipijarkan, sedang sisanya dalam tangki cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu kolini. Mulut tabung tempat pengkulturan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (yaitu sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.

C. Pemindahan Dengan PipetCara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau pada penyelidikan susu. Untuk itu diambillah 1 ml contoh untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang steril. Kemudian ambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair (suhu antara 42-450C). Lalu agar-agar yang masih encer itu dituangkan dalam cawan Petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan petri yang berisi kultur baru itu disimpan dalam tempat yang aman, misalnya didalam lemari atau dalam laci. Penyimpanan cawan dilakukan dengan meletakkannya secara terbalik, yaitu permukaan medium menghadap kebawah, ini untuk menghindari tetesnya air yang mungkin melekat pada dinding dalam tutup cawan. Kultur diperoleh dengan jalan seperti disebut diatas ini dikenal sebagai kultur adukan. Dengan cara yang demikian ini bakteri yang diinokulasikan tadi dapat menyebar luas keseluruh medium. Bakteri yang aerob maupun yang anaerob dapat tumbuh disitu, dan banyaknya koloni dapat dihitung dengan mudah.Pengenceran 1 ml sampel dengan 99 ml air murni itu tidak mutlak, hal ini tergantung kepada keadaan air atau susu yang akan diselidiki.

5 CARA MENYENDIRIKAN KULTUR MURNI Dalam keadaan sebenarnya (dialam bebas) boleh dikata tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama-sama bakteri saprobe. Yang terakhir ini boleh disebut penyerbuk yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri patogen yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan siapa yang memboncengi diberikan pedoman siapa yang kedapatan disitu lebih dulu, dan siapa yang datang kemudianUntuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu:A. Dengan PengenceranCara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia berhasil mengkultur murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari susu yang sudah asam.Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa bemacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu, dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan kultur murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

B. Dengan Penuangan Robert Koch (1843-1905) mempunyai metode lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan didalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperolehnyalah suatu kultur adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti tersebut diatas ini, maka akhirnya akan diperoleh kultur murni yang lebih terjamin.Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan petri (petri dish). Pembantu yang kedua adalah Hesse yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Memang agar-agar ternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental suatu medium. Agar-agar tidak lekas mencair, titik cairnya 950C.

C. Dengan PenggesekanMetode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.Jika ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian dari pada itu (kurang lebih setelah 12 jam) akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar dipermukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu kultur murni.

D. Dengan Mengucilkan Satu SelAlangkah baiknya, jika kita mempunyai alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak, dengan tidak ikut sertanya bakteri lain. Alat semacam itu ada, meskipun cara menggunakannya tidak gampang. Alat itu berupa mikropipet yang ditempatkan pada tangan-tangan suatu micromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakukan dibawah objektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan kata lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh kultur murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran, lagi pula, micromanipulator itu sangat mahal.

E. Dengan Inokulasi HewanMetode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh didalam tubuh seekor hewan. Misalnya kita ambil dahak dari seseorang yang disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan kedalam tubuh tikus putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita peroleh semata-mata basil tbc saja. Kultur Pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu akhirnya dapat dipindahkan kedalam medium yang sesuai.Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), dapat di bawah kulit (subcutaneous), dapat di dalam otot (intramuscular), dapat di dalam rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi.

15