Upload
others
View
14
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT Enterococcus faecium
SEBAGAI PENGHASIL BAKTERIOSIN PADA KONDISI AEROB dan
ANAEROB
Oleh
MELINDA SANGGU ARTHA
B1D 012 181
PROGRAM STUDI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS MATARAM
MATARAM
2016
ii
PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT Enterococcus faecium
SEBAGAI PENGHASIL BAKTERIOSIN PADA KONDISI AEROB dan
ANAEROB
Oleh
MELINDA SANGGU ARTHA
B1D 012 181
SKRIPSI
Diserahkan Guna Memenuhi Sebagian Syarat yang Diperlukan
untuk Mendapatkan Derajat Sarjana Peternakan
pada Program Studi Peternakan
FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS MATARAM
MATARAM
2016
iii
iv
D E D I K A S I
Bukan hanya kepuasan yang bisa menciptakan senyuman, tidak selalu materi yang bisa mendatangkan bahagia, dan tidak perlu kaya untuk mendapatkan perhatian, sederhanalah sebagai dirimu sendiri dengan perlahan cinta akan menghampirimu...
Kupersembahkan karya sederhana ini kepada Ayahanda Jupri dan ibunda Hurniati, atas segala nasihat, motivasi dan perjuangan yang tak pernah kenal lelah hingga saya bisa seperti sekarang ini.
My all Girang Jova Lingga, my lovely sister Nirmala Hikmah, my partner Lina Eka Sari, terima kasih untuk tetap ada disampingk. For my spirit Pasukan Bodrex, Ilham Gagah, Ojan, Bus, Sudir, ajis, man, bang andi, bang fi’il. Kepada teman-teman penelitan ine, atin, kaq etiq, kaq dany dan a’an, terima kasih atas bantuan kalian selama di Lab.Mikrobiologi. Buat Mita, Yana, Ziad, Leny, kadri dan semua keluarga besar Kelas B 2012.
Dosen pembimbing tugas akhirku….. Bapak Dr. M. Ali, S.Pt, M.Si dan bapak Dr. Ir Djoko Kisworo, M.Sc, terima kasih banyak pak saya telah dibantu hingga akhir. Tidak dilupakan juga bapak Dedi Iswaini, S.Pt pembimbing 3 dan Ibu Evy pembimbing 4 , terima kasih banyak pak, buk atas bantuannya.
v
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah
memberikan rahmat serta nikmat sehat wal‟afiat sehingga penulis dapat
menyelesaikan tugas akhir kuliah (skripsi) ini pada waktunya. Shalawat serta
salam semoga senantiasa terlimpah dan tercurahkan kepada Nabi Muhammad
SAW, kepada keluarganya, para sahabatnya, hingga kepada umatnya hingga akhir
zaman, amin.
Penulisan skripsi ini diajukan untuk memenuhi syarat untuk mendapatkan
gelar Sarjana pada Program Studi Peternakan di Fakultas Peternakan Universitas
Mataram. Judul yang penulis ajukan adalah “Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat
Enterococcus faecium Sebagai Penghasil Bakteriosin Pada Kondisi Aerob dan
Anaerob”.
Dalam penyusunan dan penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan,
bimbingan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan
ini penulis dengan sepenuh hati menyampaikan terima kasih kepada yang
terhormat :
1. Bapak Dr. Ir. Maskur, M.Si, selaku Dekan Fakultas Peternakan
Universitas Mataram.
2. Bapak Dr. Ir. M. Ashari, M.Si, selaku Ketua Program Studi Fakultas
Peternakan Universitas Mataram.
3. Bapak Dr. Ir. I Wayan Wariata, M.Si, selaku Ketua Laboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas
Mataram.
vi
4. Bapak Dr. Muhamad Ali, S.Pt, M.Si, selaku pembimbing utama yang
selalu menyempatkan diri setiap saat untuk memberikan arahan,
masukan dan cara yang benar dari mulai penyusunan proposal hingga
tersusunnya skripsi ini.
5. Bapak Dr. Ir. Djoko Kisworo, M.Sc, selaku dosen pembimbing kedua
yang telah banyak membantu meluruskan dan memberikan masukan
sampai penulisan skripsi ini terselesaikan.
6. Kepada kedua penyemangat hidupku Ayahanda Jupri dan Ibunda
Hurniati atas do‟a, dukungan, nasihat dan perjuangannya yang belum
terbalaskan hingga saat ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, untuk
itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan demi
penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat
sebagaimana mestinya.
Mataram, Juli 2016
Penulis
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i
PENGESAHAN PEMBIMBING.................................................................. iii
DEDIKASI .................................................................................................... iv
KATA PENGANTAR .................................................................................. v
DAFTAR ISI ................................................................................................. vii
DAFTAR TABEL ......................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR .................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xi
ABSTRAK .................................................................................................... xii
ABSTRACT .................................................................................................. xiii
PENDAHULUAN ........................................................................................ 1
Latar Belakang .................................................................................. 1
Tujuan dan Kegunaan Penelitian ...................................................... 3
TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................... 4
Bakteriosin ........................................................................................ 4
Bakteri Enterococcus faecium........................................................... 5
Bakteri asam laktat sebagai pengawet daging ................................... 7
Faktor pertumbuhan bakteri asam laktat ........................................... 8
Media pertumbuhan bakteri asam laktat ........................................... 9
Hipotesis ............................................................................................ 11
MATERI DAN METODE PENELITIAN .................................................... 12
Waktu dan Lokasi Penelitian ............................................................ 12
Materi Penelitian ............................................................................... 12
Alat dan Bahan Penelitian ................................................................. 12
Variabel yang Diamati ...................................................................... 13
Cara Penelitian .................................................................................. 13
Analisis Data ..................................................................................... 19
viii
HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 20
Pertumbuhan bakteri asam laktat ...................................................... 20
Perhitungan waktu generasi .............................................................. 24
Perhitungan biomasa bakteri ............................................................. 25
Purifikasi bakteriosin dari bakteri ..................................................... 26
Uji aktivitas bakteriosin bakteri Enterococcus faecium .................... 28
KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 30
Kesimpulan ....................................................................................... 30
Saran .................................................................................................. 30
RINGKASAN ............................................................................................... 31
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 33
LAMPIRAN .................................................................................................. 37
RIWAYAT HIDUP ....................................................................................... 44
PENGESAHAN DEWAN PENGUJI ........................................................... 45
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Hasil pengukuran Optical Density Bakteri
Enterococcus faecium ...................................................................... 22
Tabel 2. Hasil perhitungan waktu generasi pada masing-masing media ...... 25
Tabel 3. Produksi Biomasa Bakteri Enterococcus faecium .......................... 25
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Kurva fase pertumbuhan bakteri asam laktat .............................. 9
Gambar 2. Kurva Pertumbuhan BAL Enterococcus faecium pada media
MRS dan media LB ..................................................................... 24
Gambar 3. Grafik rata-rata produksi biomasa dari
BAL Enterococcus faecium ........................................................ 26
Gambar 4. Produksi Bakteriosin dari Bakteri Enterococcus faecium ........... 27
Gambar 5. Visualisasi ukuran pita protein bakteriosin
bakteri asam laktat Enterococcus faecium .................................. 28
Gambar 6. Uji anti mikroba bakteri asam laktat E. faecium
terhadap bakteri patogen Listeria Monocytogenes ...................... 29
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Grafik pertumbuhan bakteri Enterococcus faecium
pada masing-masing media pertumbuhan ................................ 38
Lampiran 2. Tabel Analisis sidik ragam pengukuran Optical Density ......... 41
Lampiran 3. Gambar penelitian di Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi ...................................................................... 42
xii
PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT Enterococcus faecium
SEBAGAI PENGHASIL BAKTERIOSIN PADA KONDISI AEROB dan
ANAEROB
ABSTRAK
Oleh
Melinda Sanggu Artha
B1D 012 181
Bakteriosin adalah senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri
asam laktat (BAL). Bakteriosin dapat digunakan sebagai biopreservatif pangan,
guna menambah masa simpan dari suatu bahan pangan secara alami. Salah satu
bakteri asam laktat yang menghasilkan bakteriosin yaitu bakteri Enterococcus
faecium. Sejumlah BAL yang ditumbuhkan pada media kompleks semi sintetis
seperti MRS (de Mann Rogosa Sharpe) dapat menghasilkan populasi sel bakteri
yang tinggi dan bakteriosin yang relatif banyak. Tujuan penelitian ini yaitu untuk
melihat pertumbuhan bakteri E. faecium pada media MRS dan LB dengan kondisi
aerob dan anaerob. Kultur dilakukan selama 4,5 jam, 5 jam, 5,5 jam, 6 jam, 6,5
jam dan 7 jam. Jumlah bakteriosin yang dihasilkan dilihat dengan SDS-PAGE.
Sedangkan daya hambat bakteriosin tersebut dilakukan terhadap bakteri patogen
Listeria monocytogenes. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri E. faecium
tumbuh lebih baik pada media MRS dengan kondisi anaerob daripada pada media
MRS dengan kondisi aerob maupun dalam media LB dengan kondisi aerob dan
anaerob. Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya band protein berukuran sekitar
90 kDa yang diduga merupakan bakteriosin. Uji daya hambat menunjukkan
adanya zona bening pada kultur LM walaupun berukuran kecil, yang
menunjukkan bahwa bakteri tersebut menghasilkan bakteriosin yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Kata Kunci : Pertumbuhan, Bakteri Asam Laktat, Enterococcus faecium,
Bakteriosin, Kondisi aerob dan anaerob
xiii
THE GROWTH OF LACTIC ACID BACTERIA Enterococcus faecium AS
THE BACTERIOCINS PRODUCING BACTERIA IN THE AEROBIC
AND ANAEROBIC CONDITIONS
ABSTRACT
By
Melinda Sanggu Artha
B1D 012 181
Bacteriocins is antimicrobial compound produced by lactic acid bacteria
(LAB). Bacteriocins can be used as food biopreserfative, prolog the self life. One
of the lactic acid bacteria which produce bacteriocins is the bacterium
Enterococcus faecium. A number of LAB that were grown on a complex medium
semi synthetics such as MRS. (de Mann Rogosa Sharpe) can produce a high
bacterial cell population and the relatifly lot of bacteriocins. The was purpose of
this research to study the growth of the E. faecium in MRS and LB media,
aerobily or anaerobily conditions.. Cultures were performed for MRS and LB
media 4,5 hours, 5 hours, 5,5 hours, 6 hours, 6,5 hours and 7 hours. The generated
bacteriocins was analyzed using SDS-PAGE and the activity inhibiti was
measured thronge clering zone against Listeria monocytogenes. The results
showed that the E. faecium grew better in MRS media anaerobicly than MRS
media aerobicly as well as in LB media aerobicly and anaerobicly. Results of
SDS-PAGE showed a band of about 90 kDa size protein that is thought to be the
bacteriocins. Inhibitory test showed a clearing zone in the culture of LM.
Key Words : The growth, Lactic Acid Bacteria, Enterococcus faecium,
Bacteriosins, Aerob and anaerob conditon
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Besarnya kontaminasi mikroba terhadap bahan pangan dapat menentukan
kualitas dan masa simpan suatu bahan pangan. Untuk menghindari kerusakan
yang lebih cepat, bahan pangan atau pangan sangat perlu untuk diawetkan dengan
tetap memperhatikan kualitas dan keamanan pangan, sehingga tidak menyebabkan
suatu hal yang negatif bagi konsumen jika digunakan ataupun dikonsumsi
(Hafsan, 2014).
Berbagai macam bahan kimia berbahaya seperti formalin dan boraks,
hingga saat ini masih banyak dijumpai penggunaannya sebagai pengawet bahan
pangan. Formalin ataupun boraks dapat mempertahankan kesegaran bahan pangan
secara fisik yang dapat terlihat dari luar dan juga dapat memperlambat proses
pembusukan bahan pangan. Namun, penggunaan bahan kimia sebagai pengawet
bahan pangan tetap tidak baik bagi kesehatan (Anonim, 2014).
Menurut Meymey (2012) salah satu cara atau alternatif untuk menambah
atau memperpanjang masa penyimpanan suatu bahan pangan secara alami dan
lebih aman yaitu dengan penggunaan biopreservatif (pengawetan alami)
menggunakan bakteriosin yang dapat disintesis oleh bakteri asam laktat (BAL).
Biopreservatif dapat memperpanjang masa simpan suatu bahan pangan dan
terjaga keamanannya.
Bakteriosin merupakan polipeptida yang mempunyai aktifitas antibakteri
yang dihasilkan oleh sejumlah mikrobia termasuk bakteri asam laktat.
Kemampuannya dalam membunuh bakteri pembusuk atau patogen serta
2
keamanannya yang terjamin telah menjadikan bakteriosin sebagai biopreservatif
pada sistem pangan (Siti, 2006).
Enterococcus faecium merupakan salah satu mikroba yang digolongkan ke
dalam BAL yang dapat menghasilkan bakteriosin. Bakteriosin yang dihasilkan
oleh BAL E. faecium dapat digunakan sebagai bahan pengawet (biopreservatif)
terutama dalam pengolahan produk peternakan seperti susu dan daging. Efek dari
pengawetan dengan biopreservatif disebabkan oleh salah satu metabolit
yang dihasilkan oleh bakteri tersebut, yaitu bakteriosin (Winkowski dan
Montville, 1992).
Untuk menghasilkan bakteriosin dalam skala tertentu maka kultur bakteri
penghasil bakteriosinnya sangat perlu dilakukan, mempelajari faktor-faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan maupun produksi bakteriosin seperti media,
biomasa, maupun kondisi pertumbuhan pada lingkungan banyak oksigen ataupun
tanpa oksigen harus dilakukan.
Untuk mempelajari secara detail tentang pertumbuhan bakteri E. faecium
sebagai penghasil bakteriosin, maka penelitian ini perlu untuk dilakukan.
Penelitian ini bertujuan untuk melihat pertumbuhan BAL E. faecium sebagai
penghasil bakteriosin, produksi bomasa dan karakteristik bakteriosin yang
dihasilkan. Data yang diperoleh dari penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk
kultur E. faecium dalam skala yang lebih besar untuk menghasilkan bakteriosin.
3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengetahui pertumbuhan BAL E. faecium sebagai penghasil bakteriosin
pada kondisi aerob dan anaerob menggunakan media tumbuh MRS dan LB.
2. Mengetahui karakteristik bakteriosin yang dihasilkan oleh E. faecium.
3. Untuk melihat aktifitas daya hambat dari bakteriosin yang dihasilkan oleh
bakteri E. faecium.
Kegunaan Penelitian
Adapun kegunaan dari penelitian ini yaitu :
1. Untuk mendapatkan informasi dan data tentang pertumbuhan bakteri E.
faecium.
2. Mengembangkan teknologi, ilmu dan pengetahuan dalam bidang
pengolahan dan pengawetan bahan pangan secara alami yang tidak
memiliki dampak negatif dan membahayakan bagi kesehatan manusia.
3. Sebagai pembanding bagi mahasiswa yang akan melakukan penelitian
berikutnya.
4
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteriosin
Bakteriosin asal BAL merupakan peptide atau senyawa protein yang peka
terhadap enzim proteolitik, tetapi tahan panas pada kondisi asam. Substansi
protein yang umumnya mempunyai berat molekul kecil serta memiliki akttivitas
sebagai bakterisidal yang bersifat letal terhadap intraspesies (Abdelbasset, 2008).
Bakteriosin diproduksi oleh bakteri BAL didefinisikan sebagai protein
yang aktif secara biologi atau kompleks protein (agregat protein, protein
lipokarbohidrat, glikoprotein) yang disintesis secara ribosomal, dan menunjukkan
aktivitas anti bakteri. Bakteriosin disintesis pada fase eksponensial pertumbuhan
sel mengikuti pola klasik sintesis protein. Sistem ini diatur oleh plasmid DNA
ekstrakromosomal dan dipengaruhi oleh beberapa factor utama seperti pH
(Hafsan, 2014).
Istilah bakteriosin sering dihubungkan dengan senyawa antimikroba
berupa protein yang mudah didegradasi oleh enzim proteolitik dan mampu
menghambat pertumbuhan mikroba spesies lain yang biasanya berkerabat dekat
dengan spesies penghasil substansi ini diproduksi oleh berbagai strain bakteri
(Jack et al.,1995), termasuk dalam hal ini bakteri asam laktat (Gorris dan Bennik,
1994). Umumnya, hampir semua substansi yang diproduksi oleh bakteri asam
laktat mampu menghambat pertumbuhan bakteri asam laktat lainnya, dan
beberapa diantaranya memiliki efek bakterisidal atau destruktif terhadap bakteri
lain yaitu bakteri pembusuk dan patogenik asal makanan seperti Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes dan Clostridium botulinum.
5
Bakteriosin yang dihasilkan bermacam-macam jenisnya tergantung dari
strain yang menghasilkannya atau organisme penghasilnya. Contoh bakteriosin
yang banyak diteliti antara lain Nisin yang dihasilkan oleh Lactococcus lactis
subs. lactis, pediocin yang dihasilkan oleh bakteri Pediococcus acidilactici,
Enterococcus EFS2 yang dihasilkan dari bakteri Enterococcus faecalis (Anonim,
2014).
Berdasarkan karakter umum bakteriosin, potensi penggunaannya
berpeluang terutama pada bidang preservasi makanan yang dikenal dengan
biopreservatif, yaitu kemampuan substansi mikroba ini dalam mengawetkan
makanan (Kurniawati, 2000). Selain itu bakteriosin memiliki potensi sebagai
kemoterapeutik, terutama pemakaiannya dalam tindakan pencegahan ataupun
pengobatan di bidang Kedokteran Hewan seperti daging, susu dan telur tidak
khawatir lagi mengenai efek residu antibiotik sintesis yang belakangan ini
menimbulkan kasus resistensi “Mikroorganisme Super Bug” atau mikroorganisme
yang kebal terhadap atimikroba (NCBI, 2016).
Bakteri Enterococcus faecium
Enterococcus faecium merupakan bakteri kokus gram positif
berbentuk ovoid berdiameter antara 0,5 – 1 um yang dapat berkoloni secara
rantai, berpasangan ataupun soliter. Bakteri ini bersifat fakultatif anaerob,
mempunyai kemampuan untuk hidup dan berkembang biak dengan oksigen
maupun tanpa oksigen. Bakteri ini mengkatabolisme berbagai sumber energi
antara lain karbohidrat, gliserol, laktat, malate, sitrat, arginin, agmatin dan
asam α keto lainnya. Enterococcus faecalis merupakan mikroorganisme yang
6
dapat bertahan dalam lingkungan yang sangat ekstrim, termasuk pH yang
sangat alkalis dan konsentrasi garam yang tinggi (Shand, 2007).
Bakteri Enterococcus pada umumnya dapat tumbuh pada rentang
pertumbuhan yang luas. Beberapa strain dapat tumbuh pada suhu serendah 1 0C
dan dapat mencapai 50 0C, namun suhu optimal untuk sebagian besar strain yaitu
37 0C. Enterococcus dapat bertahan selama proses pembekuan dan dilaporkan
dapat bertahan hidup pada penyimpanan dengan suhu -70 0C selama beberapa
tahun. Pertumbuhan dapat terjadi pada rentang pH 4,4-10,6. Aw minimun yang
digunakan untuk pertumbuhan tergantung pada zat terlarutnya. Seperti misalnya
E. faecium dilaporkan dapat tumbuh pada Aw 0,93 (Anonim, 2013).
Bakteri E. faecium dapat tumbuh pada suhu 10 – 45 0C, suhu optimal atau
asam, dan dalam lingkungan yang isotonik atau hipertonik. E. faecium adalah
Gram-positif, sel bulat yang dapat terjadi pada pasangan atau rantai (Fitri, 2009).
Bakteri E. faecium dianggap sebagai super bug. Dikarenakan bakteri ini
dapat menjelajah banyak organ tubuh termasuk saluran pencernaan dan kulit, dan
juga bisa bertahan untuk waktu yang lama pada benda mati, dengan karakteristik
tahan multi obat yang membuatnya menjadi patogen ganas (NCBI, 2016).
Aplikasi E. faecium pada bidang bioteknologi menghasilkan peptida
antibakteri disebut bakteriosin. Bakteriosin mempunyai efek bakterisida dan
bakteriostatik terhadap bakteri perusak atau pembusuk. Mikroba ini dapat
digunakan dalam pengolahan bahan makanan seperti keju, susu, daging dan
sayuran. E. faecium juga dapat digunakan sebagai probiotik untuk bakteri
merugikan di saluran pencernaan (Nurliana et, al., 2009).
7
Bakteri Asam Laktat Sebagai Pengawet Daging
Bahan pangan hewani seperti daging merupakan sumber protein hewani
yang sangat penting bagi kehidupan manusia karena kandungan asam-asam amino
esensial, disamping sebagai sumber vitamin, mineral dan asam-asam lemak
esensial lainnya. Berbagai cara pengawetan telah dilakukan untuk meperpanjang
masa simpan, seperti pendinginan dan pengalengan, namun penerapan metode ini
masih jarang digunakan di beberapa negara mengingat biaya yang cukup besar.
Produk-produk daging yang telah lama dikenal dan dikonsumsi secara luas
oleh negara-negara maju antara lain di Amerika Serikat, Jerman, Inggris, Belanda,
Prancis, Italia dan Australia adalah sosis terfermentasi (salami, thuringer,
pepperoni, cervelat, lebanon bologna). Sosis ini dapat dibuat secara alamiah
(tanpa kultur starter BAL) dan dengan penambahan kultur starter BAL (Aryanta,
2013).
Prinsip pengawetan daging dan produk olahannya menggunakan metode
fermentasi BAL adalah dengan meningkatkan konsentrasi asam laktat dan
penurunan pH melalui metabolisme gula (karbohidrat) oleh BAL. Konsentrasi
asam laktat yang relatif tinggi dan pH yang rendah akan menghambat
pertumbuhan mikroba pembusuk dan patogen, sehingga produk pangan
terfermentasi akan dapat disimpan lebih lama dan aman bagi konsumen (Aryanta,
2013).
8
Faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat
Menurut Andika (2014) dari berbagai macam faktor yang dapat
mempengaruhi petumbuhan BAL salah satunya adalah kompetisi untuk nutrien.
BAL secara alami hidup di lingkungan yang kaya nutrient. Faktor kedua yaitu
pengaruh oksigen dalam hal ini dibedakan menjadi, aerobik hanya dapat tumbuh
apabila ada oksigen bebas. Anaerob hanya dapat tumbuh apabila tidak ada
oksigen bebas. Anaerob fakultatif dapat tumbuh dengan atau tanpa oksigen bebas
dan Mikroaerofilik dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam jumlah kecil. Untuk
BAL ada yang dapat tumbuh pada keadaan aerobik sampai anerobik.
Faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan BAL yaitu pH.
Perubahan pH merupakan suatu fungsi dari ketersediaan nutrisi dan metabolit yang
dihasilkan selama pertumbuhan yang terdapat dalam medium. BAL merupakan
mikroba yang mempunyai kemampuan dalam menciptakan respon terhadap
keasaman medim (Arina, 2007).
Kurva pertumbuhan bakteri E. faecium terdiri dari fase lag, fase log
(eksponensial) dan fase stasioner (kematian). Pada fase lag bakteri berada pada
periode penyesuaian yang sangat penting untuk penambahan metabolit pada
kelompok sel, menuju tingkat yang setaraf dengan sintesis sel maksimum.
9
Gambar 1. Fase pertumbuhan bakteri asam laktat
Fase kedua adalah fase log atau eksponensial, pada fase ini bakteri E.
faecium mengalami pertumbuhan yang sangat cepat, sel mulai membelah diri
menjadi dua kemudian masing-masing lagi membelah jadi dua hingga pada setiap
generasi sel bertambah menjadi dua kali lipat, fase log dimulai pada jam ke-2
sampai pada jam ke-16 (Fardiaz 1992).
Fase pertumbuhan yang terakhir yaitu fase stasioner (fase kematian).
Selama fase ini, jumlah sel yang hidup tetap konstan untuk periode yang berbeda,
bergantung pada bakteri, tetapi akhirnya menuju periode penurunan populasi.
Pada penelitian ini, fase stasioner dari bakteri E. faecium tidak terlihat,
dikarenakan perhitungan OD hanya dilakukan sampai pada jam ke-7 (Hanimatul
et al., 2014).
Media Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat
Media selektif untuk pertumbuhan spesies bakteri asam laktat adalah
deMan-Rogosa-Sharpe Agar (MRS Agar). Komposisi media MRS agar pada pH
6,2 ± 0,2 dan suhu 25 °C. Komposisi MRS agar per liter yaitu, glukosa 20 gram,
pepton 10 gram, agar 10 gram, ekstrak daging 8 gram, natrium asetat (3NH2O) 5
gram, ekstrak ragi 4 gram, K2HPO4 2 gram, Triamonium sitrat 2 gram,
10
MgSO4.7H2O 0,2 gram, Sorbiton monooleat 0,05 gram, MnSO4.4H2O 1,0 ml.
Sejumlah BAL yang ditumbuhkan pada media kompleks semi sintesis yang
mengandung protein tinggi seperti tripton, pepton, ekstrak daging dan ekstrak
khamir seperti MRS dapat menghasilkan populasi bakteri yang tinggi dan
bakteriosin yang relatif banyak (Anonim, 2012).
Media Lysogeny broth atau yang belakangan ini dikenal sebagai Luria
bertani telah digunakan secara luas sebagai media untuk pertumbuhan bakteri.
Sebenarnya Luria bertani pada awalnya secara khusus sebagai media
bakteriofage. Penemu media ini Guiseppi Bertani mencoba formula ini ketika
ingin mengoptimalkan produksi flak pada bakteri Shigela (Bertani, 1952).
Singkatan LB berasal dari Lysogeny broth. Meskipun pada awalnya media ini
digunakan dalam rangka studi bakteriofag dan shigela namun belakangan ini
media LB secara umum digunakan untuk E. coli juga (Williams et al., 2013).
Menurut Luc De Vuyst (2007) jenis media dan nutrisi yang ada
didalamnya sangat mempengaruhi laju pertumbuuhan sel BAL, seperti sumber
karbon dan sumber nitrogen yang digunakan dalam medium. Selanjutnya
berpengaruh terhadap metabolisme produksi bakteriosin, selain itu tingkat
salinitas medium produksi seperti kandungan garam dari media turut
mempengaruhi metabolisme produksi bakteriosin. Secara umum kondisi optimum
produksi bakteriosin selain dipengaruhi oleh fase pertumbuhan, pH media, suhu
inkubasi, jenis sumber karbon dan sumber nitrogen juga dipengaruhi oleh
konsentrasi NaCl.
11
Hipotesis
Berdasarkan uraian latar belakang, hipotesis yang digunakan dalam
penelitian ini adalah pertumbuhan BAL pada media MRS dengan kondisi anaerob
akan lebih cepat dibandingkan dengan pada media MRS dengan kondisi aerob dan
media LB dengan kondisi aerob ataupun anaerob.
12
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi, Fakultas Peternakan, Universitas Mataram pada bulan Februari
hingga bulan Juni 2016.
Materi Penelitian
Materi penelitian ini menggunakan BAL E. faecium yang diambil dari stok
gliserol milik Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan
Universitas Mataram. Materi penelitian ini dikelompokkan menjadi 4 kelompok
(media MRS pada kondisi aerob dan anaerob, dan media LB pada kondisi aerob
dan anaerob) dengan 6 perlakuan lama waktu kultur dan masing-masing
menggunakan 3 ulangan.
Alat dan Bahan Penelitian
Alat Penelitian
Timbangan analitik, erlenmeyer, hot plate stirrer, rak tabung, cawan
Petri, maghnet stirrer, pH meter, autoclave, laminar air flow, lampu bunsen,
tabung reaksi, gelas ukur, incubator, alat centrifugasi, tip, nano drop, tabung
konical (falcon), kulkas (Freezer) 4 0C, micro pipet, spektrofotometer, alat SDS -
PAGE dan shaker.
13
Bahan Penelitian
Media MRS Broth, media MRS Agar, media Lysogeny Broth (trypton
powder, NaCl, yeast ekstrak), gliserol stok BAL E. faecium, aquades, alkohol
70%, aluminium foil, kapas/kasa dan kertas label.
Variabel Yang di Amati
Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini yaitu, pertumbuhan
BAL E. faecium pada media MRS dan media LB pada kondisi aerob dan anaerob,
berat biomasa, dan karakteristik bakteriosin (ukuran dan daya hambat).
Cara Penelitian
Persiapan
Persiapan Media MRS Cair
Pembuatan media MRS sebanyak 50 ml membutuhkan 2,6 g media MRS
dan 50 ml aquades, dilarutkan dalam tabung Erlenmeyer (penggunaan media
MRS adalah 52% dalam 1000 ml). Media di larutkan pada hotplate stirrer dengan
bantuan maghnet stirrer hingga larutan homogen. Tingkat pH diatur dengan
penambahan HCl untuk mendapatkan pH asam. Larutan kemudan dituangkan ke
dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml dan ditutup menggunakan
kapas. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam beker glass dan ditutup
dengan aluminium foil untuk disterilisasi pada autoclave selama 15 menit.
14
Persiapan Media MRS Padat
Sebanyak 3,1 g MRS ditimbang dan dilarutkan pada tabung erlenmeyer
menggunakan aquades sebanyak 50 ml dan ditutup dengan kapas dan aluminium
foil (penggunaan MRS adalah 62% dalam 1000 ml). Larutan dihomogenkan pada
hotplate stirrer. Kemudian pH diatur dengan penambahan HCl untuk mendapatkan
pH asam. Selanjutnya larutan dimasukkan ke dalam autoclave untuk di sterilkan
selama 15 menit. Setelah 15 menit, media didiamkan pada suhu ruang hingga
media tidak terlalu panas untuk selanjutnya dituangkan pada cawan Petri.
Sebanyak 25 ml media MRS dituangkan pada masing-masing cawan Petri dan
dibiarkan hingga padat di bawah sinar UV selama kurang lebih 5 menit.
Persiapan Media LB Cair
Untuk membuat 50 ml media LB dibutuhkan tryptone powder 0,5 g, yeast
ekstrak 0,25 g, NaCl 0,5 g dan aquades 50 ml. semua bahan dimasukkan ke dalam
tabung erlenmeyer dan dihomogenkan pada hot plate stirrer dengan bantuan
maghnet stirrer. Setelah homogen larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 ml dan ditutup menggunakan kapas. Tabung reaksi
berisi larutan kemudian dimasukkan ke dalam beker glass dan ditutup dengan
aluminium foil untuk disterilisasi selama 15 menit pada autoclave.
Persiapan Media LB Padat
Pembuatan media LB padat membutuhkan tryptone powder 0,5 g, yest
extract 0,25 g, NaCl 0,5 g, agar 0,015 g dan aquades 50 ml. Bahan dimasukkan ke
dalam tabung erlenmeyer dan dihomogenkan menggunakan hot plate stirrer.
Larutan yang telah homogen disterilisasi selama 15 menit pada autoclave. Setelah
15
proses sterilisasi selesai larutan dikeluarkan dari autoclave dan didiamkan pada
suhu ruang hingga tidak terlalu panas untuk selanjutnya dituangkan pada cawan
Petri. Media didiamkan hingga menjadi padat di bawah sinar UV selama kurang
lebih lima menit.
Tahapan Penelitian
Peremajaan
Peremajaan bakteri E. faecium sebagai penghasil bakteriosin diawali
dengan menginokulasi bakteri E. faecium dari stok gliserol ke media MRS 5 ml
menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan terlebih dahulu. Kultur kemudian
diinkubasi semalaman atau kurang lebih 24 jam pada shaker dengan suhu 37 0C.
Kultur BAL pada Media MRS
Bakteri yang telah dikultur 12 jam, keesokan harinya kemudian di
inokulasi kembali pada media MRS dengan metode streak (goresan)
menggunakan jarum ose. Hasil kultur pada media MRS selanjutnya di inkubasi
pada incubator 37 0C, minimal kurang lebih selama 24 jam hingga bakteri
tumbuh. Jika bakteri tidak tumbuh dalam waktu 24 jam, kultur kembali
dimasukkan ke dalam incubator hingga 24 jam berikutnya. Jika bakteri kembali
tidak tumbuh, lakukan kembali metode dari peremajaan hingga bakteri benar-
benar tumbuh.
Kultur BAL pada Media MRS
Bakteri yang tumbuh setelah di kultur pada media MRS, selanjutnya
diinokulasi pada media MRS untuk pembuatan starter. Selanjutnya dilakukan
16
inkubasi pada suhu 37 0C menggunakan shaker selama semalaman atau kurang
lebih 24 jam.
Kultur BAL pada Media MRS dan Media LB (pada kondisi aerob dan
anaerob)
Starter yang dikultur pada media MRS dimasukkan ke dalam 6 tabung
media MRS dan 6 tabung media LB, masing-masing sebanyak 50 µl
menggunakan mikro pipet. Tabung kemudian dimasukkan ke dalam shaker untuk
perlakuan aerob dan inkubator untuk perlakuan anaerob. Pada masing-masing
perlakuan terdapat tiga kultur media MRS dan tiga kultur media LB.
Pertumbuhan BAL pada kondisi aerob dan anaerob diukur menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 200 µl kultur
dimasukkan ke dalam tabung kuvet, kemudian dilakukan pengenceran dengan
aquades 1800 µl. Pertumbuhan diukur sebanyak 6 kali.
Penentuan Waktu Generasi
Waktu generasi memiliki rumus g=
. Dimana g adalah waktu generasi
(generation time), ln2 = 0,69 dan µ adalah waktu spesifik generasi (Brock et al.,
1994). Sebelum mendapatkan waktu generasi, terlebih dahulu menentukan waktu
spesifik generasi (µ) dengan rumus yang digunakan adalah µ =
(Brock et al., 1994). Dimana ln1 adalah nilai OD awal dan ln2 adalah nilai OD
akhir yang telah dipilih dari hasil pengukuran OD, sedangkan nilai t1 dan t2
adalah waktu kultur dari nilai OD yang telah dipilih tersebut.
17
Purifikasi bakteriosin dengan Amonium Sulfat (NH4)2SO4
Ammonium sulfat (NH4)2SO4 sebanyak 15 g ditimbang dan dilarutkan
dengan aquades 15 ml pada tabung falcon. Larutan ammonium sulfat kemudian
dimasukkan kedalam beker glas yang berisi 25 ml kultur BAL pada media MRS
yang telah dishaker selama 24 jam, selanjutnya kultur dihomegenkan
menggunakan hot plate stirrer selama 4 jam untuk mendapatkan lendir yang
diasumsikan sebagai bakteriosin. Setelah 4 jam stirrer, kultur dimasukkan ke
dalam tabung falcon dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 4000
rpm. Lendir yang tersisa pada maghnet stirrer dan pada dinding beker glasss
dibilas menggunakan PBS. Lendir hasil centrifuge dan hasil bilasan PBS pada
beker glass disimpan pada tabung ependrop sebelum dilakukan metode
berikutnya. Metode yang sama juga dilakukan pada kultur BAL pada media MRS
yang dishaker 48 jam.
Deteksi Kuantitas Bakteriosin Dengan SDS – PAGE
Preparasi Gel
Disiapkan 2 lempeng kaca sebagai alat pencetak gel. Dalam pembuatan gel
dengan konsentrasi 10 %, gel yang pertama kali dibuat adalah separation gel
sebagai gel bawah, yang terdiri dari 30 % acrilamide solution 2,1 ml, 4x
separation buffer 1,5 ml, 50 % gliserol 1,2 ml, aquades 1,14 ml, 10 % APS 60 µl
dan TEMED 60 µl. Semua bahan dicampur dan dihomegenkan untuk selanjutnya
di masukkan ke dalam cetakan kaca menggunakan mikropipet dan ditunggu
sampai memadat (membentuk gel). Setelah memadat, cetakan sumuran berupa
sisiran dimasukkan ke dalam cetakan gel. Kemudian di siapkan stacking gel yang
terdiri dari 30 % akrilamid solution 188 µl, 4x stacking gel buffer 313 µl, aquades
500 µl, 10 % APS 10 µl dan TEMED 2 µl. Larutan kemudian dimasukkan ke
dalam tabung dan dihomogenkan. Larutan stacking gel dimasukkan ke dalam
18
cetakan gel yang sudah terdapat cetakan untuk sumuran dan di tunggu hingga
membeku. Setelah membeku, sisiran dilepas dan lempengan kaca yang berisi gel
dipindahkan ke dalam alat elektroforesis.
Preparasi Sampel
Sampel yang disimpan menggunakan tabung ependrop pada freezer -20 0C
kemudian diresuspensi dengan aquades dan 2x sampel buffer. Penambahan
aquade dan 2x sampel buffer tergantung dari jumlah pellet yang diperoleh.
Kemudian sampel didenaturasi selama 5 menit dalam air mendidih suhu 100 0C.
Setelah itu, sampel diloading ke sumuran yang ada pada gel untuk kemudian
dilakukan elektroforesis.
Elektroforesis Gel
Dam mesin running diisi dengan elektroforesis buffer. Sampel yang telah
didenaturasi kemudian di masukkan ke dalam sumuran gel sebanyak 15 µl. setelah
semua sampel dimasukkan, mesin running di tutup dan dinyalakan dengan voltase
100 volt selama 2 jam. Gel selanjutnya diwarnai menggunakan CBB (Commasie
Briliant Blue) sambil digoyangkan menggunakan mesin shaker selama 30 menit.
Kemudian gel dibilas (destaining) menggunakan campuran larutan aquades,
methanol, dan asam asetat dengan perbandingan 6 : 3 : 1. Kertas tissue
ditambahkan pada gel yang dibilas yang berfungsi sebagai penyerap warna pada
saat pembilasan. Pembilasan dilakukan sampai gel bersih dari sisa pewarna CBB.
19
Uji Daya Hambat Bakteriosin Terhadap Bakteri Patogen
Uji daya hambat aktivitas bakteriosin terhadap bakteri patogen dilakukan
menggunakan metode difusi sumur agar. Sebanyak 100 µl bakteri indikator
Listeria monocytogenes diinokulasi pada media LB padat, kemudian dibuat
sumuran berdiameter kurang lebih 6 mm pada agar yang telah memadat. Sumuran
dibuat menggunakan yellow tip yang diputar pada media LB padat sesuai dengan
label yang diberikan. Pada setiap sumuran dimasukkan sebanyak 10 µl sampel
(control positif menggunakan ampisilin). Cawan LB padat kemudian di inkubasi
pada suhu 370C selama 24 jam. Aktivitas bakteriosin ditunjukkan dengan adanya
zona bening di sekitar sumuran.
Analisis Data
Data pertumbuhan bakteri E. faecium yang diperoleh pada penelitian ini
dianalisis menggunakan analisis sidik ragam. Sedangkan kuantitas bakteriosin
yang dihasilkan diamati menggunakan SDS-PAGE. Untuk uji aktifitas daya
hambat bakteri E. faecium terhadap bakteri patogen Listeria monocytogenes
dilakukan dengan melihat ada tidaknya zona bening di sekitar sumuran yang telah
diisi dengan supernatant E, faecium.
20
HASIL DAN PEMBAHASAN
Bakteri Asam Laktat Enterococcus faecium merupakan bakteri gram
positif, yang umumnya dapat tumbuh dengan baik pada suhu 10 – 45
0C. Namun
suhu optimum pertumbuhan bakteri tersebut adalah 370C pada pH 4,2 – 4,6 dan
masih dapat tumbuh pada pH 9,6 (John et al., 1994).
Bakteri E. faecium dapat menghasilkan bakteriosin yang bermanfaat
sebagai biopreservatif (pengawet alami) bahan pangan. Selain sebagai
biopreservatif, bakteri E. faecium juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri
gram positif maupun gram negatif dan sebagai trapeutik (Ali dan Radu, 1998).
Pada penelitian tentang pertumbuhan Bakteri Asam Laktat E. faecium
sebagai penghasil bakteriosin, pH media yang digunakan adalah pH asam, yaitu
5,43 untuk media MRS, pH 5,45 untuk media MRS, dan pH 5,03 untuk media LB
dan dengan menggunakan suhu optimum pertumbuhan BAL secara umum yaitu
37 0C.
Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat E. Faecium
BAL E. faecium merupakan bakteri gram positif yang dapat tumbuh
dengan baik pada media MRS, dimana pada media MRS bakteri E. faecium
mendapatkan nutrisi yang cukup untuk pertumbuhannya. Media MRS
mengandung pepton 10 gram, ekstrak daging 8 gram, yeast ekstract 4 gram,
dextrose 20 gram, tween 80 1 gram, dipotasium phosphate 2 gram, sodium acetate
5 gram, ammonium citrate 2 gram, magnesium sulfate 0,20 gram, manganese
sulfat 0,05 gram (Anonim, 2012).
21
Menurut Rinto (2012), beberapa media yang sering digunakan untuk
pembiakan bakteri asam laktat adalah media MRS (de Man Rogosa and Sharpe),
Triptone Glukose yeast Extract (TGE), dan Glucose, Yeast Pepton (GYP).
Beberapa komponen nutrisi penyusun media kultur bakteri asam laktat yaitu
glukosa dan gliserol sebagai sumber karbon dan energi, yeast extract dan beef
extract sebagai sumber vitamin dan nitrogen, pepton/tripton sebagai sumber asam
amino, N, S, dan P, serta berbagai mineral KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, MnSO4,
dan FeSO4 serta CaCO3 sebagai penstabil pH.
Pertumbuhan bakteri asam laktat E. faecium dapat dilihat dari tingkat
kekeruhan pada media pertumbuhannya. Semakin keruh media setelah inkubasi
dan kultur dapat menjadi petunjuk bahwa bakteri tersebut telah tumbuh. Tingkat
kekeruhan atau kepadatan bakteri dapat diukur dengan menghitung Optical
Density (OD) menggunakan alat spekterofotometer.
Hasil pengukuran OD bakteri E. faecium menunjukkan adanya perbedaan
tingkat kepadatan bakteri dari masing-masing perlakuan. Tabel 1 menampilkan
OD kultur yang diukur pada panjang gelombang 600 nm. Pada media MRS
dengan kondisi anaerob, kepadatan sel bakteri didapatkan paling tinggi,
berikutnya diikuti oleh media MRS pada kondisi aerob. Sedangkan media LB
pada kondisi anaerob dan pada kondisi aerob lebih rendah. Hasil ini menunjukkan
bahwa pertumbuhan BAL E. faecium lebih baik pada media MRS dibandingkan
dengan media LB.
22
Tabel 1. Hasil pengukuran OD600 nm bakteri E .facium pada kondisi aerob dan anaerob menggunakan media MRS dan LB.
Waktu
Kultur
(jam)
Jenis Media
MRS LB
Aerob Anaerob Aerob Anaerob
1 2 X 1 2 X 1 2 X 1 2 X
4,5 0,27 0,19 0,23±0,06 0,94 1,07 1,01±0,09 0,07 0 0,04±0,05 0,05 0,04 0,05±0,01
5 0,67 0,45 0,56±0,16 1,84 1,96 1,90±0,08 0,19 0,01 0,10±0,13 0,07 0,05 0,06±0,14
5,5 0,74 0,82 0,78±0,06 2,43 2,62 2,53±0,13 0,11 0,02 0,07±0,06 0,08 0,07 0,08±0,01
6 1,30 1,18 1,24±0,08 3,01 2,89 2,95±0,08 0,13 0,04 0,09±0,06 0,08 0,12 0,10±0,03
6,5 1,19 1,45 1,32±0,18 3,06 2,89 2,96±0,12 0,14 0,07 0,11±0,05 0,11 0,12 0,12±0,01
7 1,96 1,27 1,62±0,49 3,83 3,39 3,61±0,31 0,18 0,08 0,13±0,07 0,14 0,16 0,15±0,02
23
Jika dibandingkan antar medium pertumbuhan, bakteri E. faecium tumbuh
paling baik pada kondisi anaerob. Namun bakteri tersebut masih dapat tumbuh
pada kondisi aerob meski sedikit lebih lambat jika dibandingkan dengan pada
kondisi anaerob. Hasil ini menandakan bahwa bakteri E. faecium bersifat anaerob
fakultatif, yang mempunyai kemampuan untuk berkembang biak dengan atau
tanpa oksigen.
Sebagian besar bakteri asam laktat bersifat anaerobic fakultatif meskipun
ada yang bersifat anaerobic obligat seperti Bifidobacteria. Keberadaan oksigen
pada kultur bakteri asam laktat akan berpengaruh terhadap pertumbuhan sel dan
berbagai komponen metabolit yang dihasilkan (Kamoun et al., 2009).
Medium untuk pertumbuhan BAL yang umum digunakan yaitu medium
MRS yang dikembangkan oleh de Man, Rogossa, dan Sharpe. Medium tersebut
dibuat untuk menunjang pertumbuhan BAL genus Lactobacillus secara umum,
namun media ini dapat pula digunakan untuk pertumbuhan seluruh BAL lain
seperti Streptococcus, Pediococcus, dan Leuconostoc (Yuliana, 2008).
Hasil pengukuran kepadatan bakteri pada Tabel 1 selanjutnya ditampilkan
pada Gambar 2, dapat dilihat bahwa pertumbuhan bakteri E. faecium di media
MRS pada kondisi anaerob terus meningkat memasuki fase log setelah 4,5 jam
kultur. Selanjutnya diikuti oleh media MRS pada kondisi aerob dan media LB
pada kondisi anaerob dan aerob.
24
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
4.5 Jam 5 Jam 5.5 Jam 6 Jam 6.5 Jam 7 Jam
Op
tica
l D
en
sity
60
0 n
m
Waktu Kultur
MRS Aerob
MRS Anaerob
LB Aerob
LB Anaerob
Gambar 2. Kurva Pertumbuhan BAL E. faecium pada media MRS aerob, MRS
anaerob, LB aerob dan media LB anaerob
Bakteriosin umumnya diproduksi secara optimal oleh BAL pada fase akhir
yaitu fase logaritmik hingga awal fase stasioner (Jimenez 1993). Menurut Rinto
(2012) bakteriosin disintesis selama fase eksponensisal pertumbuhan sel
mengikuti pola klasik sintesis protein. System ini diatur oleh plasmid DNA ekstra
kromosomal dan dipengaruhi oleh beberapa factor utama seperti pH. Umumnya
bakteriosin disintesis melalui jalur ribosomal sebagai peptide kemudian
mengalami modifikasi. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin diatur oleh adanya gen
pengkode produksi dan pengkode imunitas. Grafik pertumbuhan bakteri E.
faecium untuk masing-masing media perlakuan selanjutnya dapat dilihat pada
Lampiran 1.
Perhitungan Waktu Generasi BAL Enterococcus faecium
Waktu generasi bakteri E. faecium dihitung dengan menggunakan rumus
g=
. Dimana g adalah waktu generasi (generation time), ln2 = 0,69 dan µ
adalah waktu spesifik generasi (Brock et al., 1994). Sebelum mendapatkan waktu
25
generasi, terlebih dahulu menentukan waktu spesifik generasi (µ) dengan rumus
yang digunakan adalah µ =
(Brock et al., 1994). Dimana ln1 adalah
nilai OD awal dan ln2 adalah nilai OD akhir yang telah dipilih dari hasil
pengukuran OD, sedangkan nilai t1 dan t2 adalah waktu kultur dari nilai OD yang
telah dipilih tersebut.
Tabel 2. Hasil perhitungan waktu generasi bakteri asam laktat E. faecium
pada masing-masing media perlakuan.
Media pertumbuhan Waktu spesifik generasi
(generasi/jam)
Waktu generasi
(jam)
MRS Aerob 1,73 0,40
MRS Anaerob 1,82 0,38
LB Aerob 2,88 0,24
LB Anaerob 1,64 0,42
Perhitungan Biomasa Bakteri Enterococccus faecium
Produksi biomasa bakteri E. faecium didapatkan dari pemisahan pellet
dengan supernatan menggunakan alat centrifugasi pada kecepatan 1200 rpm
selama lima menit. Sehingga di dapatkan hasil seperti yang ditampilkan pada
Tabel 3, yang memperlihatkan bahwa rata-rata produksi biomasa dari masing-
masing perlakuan pada media pertumbuhan berbeda-beda.
Tabel 3. Produksi Biomasa Bakteri E. faecium pada media MRS dan
media LB
Rataan berat pellet pada masing-masing jenis media (mg/ml)
MRS LB
Aerob Anaerob Aerob Anaerob
1 2 X 1 2 X 1 2 X 1 2 X
17,2 13,6 15,40 17,8 32,8 25,30 15,4 25,8 20,60 24,4 20,6 22,50
Produksi biomasa dari bakteri E. faecium terlihat lebih tinggi pada media
MRS dengan kondisi anaerob, berikutnya diikuti oleh media LB pada kondisi
26
anaerob. Sedangkan media MRS pada kondisi aerob dan media LB dengan
kondisi aerob lebih rendah. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pertumbuhan
bakteri E. faecium lebih baik pada media MRS dengan kondisi anaerob. Hasil
tersebut konsisten dengan pengukuran kepadatan bakteri pada (Tabel 1). Adams
dan Maurice (2008) mengatakan bahwah BAL pada umumnya bersifat anaerob
dan tumbuh baik pada media MRS.
Untuk lebih jelasnya, rata-rata produksi biomasa dapat dilihat pada
Gambar 2. Dari rata-rata produksi biomasa yang dihasilkan oleh bakteri E.
faecium dapat dilihat bahwa, media MRS pada kondisi anaerob memiliki jumlah
biomasa yang paling banyak, berikutnya menyusul media MRS pada kondisi
aerob, selanjutnya media LB pada kondisi anaerob dan media LB pada kondisi
aerob.
0
5
10
15
20
25
30
MRS Aerob MRS Anaerob LB Aerob LB Anaerob
Bio
ma
sa (m
g)
Media Pertumbuhan
Gambar 3. Grafik rata-rata produksi biomasa dari BAL E. faecium
Purifikasi Bakteriosin dari Bakteri E.faecium
Stern et al., (2006) melakukan purifikasi terhadap bakteriosin dari
Lactobacillus salivarius. Aktivitas bakteriosin hasil purifikasi meningkat
89,8% dibandingkan dengan supernatant dari kultur bakteri. Purifikasi
27
bakteriosin pada penelitian ini menggunakan amonium sulfat (NH4)2SO4 15 g
dan pelarut PBS. Hasil purifikasi ditampilkan pada Gambar 3.
(1)
(2)
Gambar 4. Produksi bakteriosin dari bakteri E. faecium (1) Hasil
sentrifugasi kultur falcon 24 jam (2) Hasil sentrifugasi
kultur 48 jam.
Berdasarkan visualisasi bakteriosin dari keempat hasil purifikasi pada
Gambar 3 yang dielektroforesis pada SDS-PAGE (Gambar 4), terlihat ban
pita protein bakteriosin yang berukuran sama sekitar 95 kDa pada kultur
24 jam maupun 48 jam dan pada hasil bilasan kultur 48 jam dengan
PBS pada beker glas. Sedangkan hasil bilasan PBS pada dinding beker
glas yang dikultur 24 jam menunjukkan adanya ban pita protein yang
berukuran sekitar 90 kDa. Hasil penelitian ini berbeda dengan yang
dilakukan oleh Stern et al., (2006), namun menunjukkan kemiripan dengan
yang dilakukan Albano et al., (2007) yang menyatakan bahwa bentuk
separasi bakteriosin dengan tricine SDS-PAGE yang kurang jelas juga
didapatkan pada penelitian yang melakukan separasi peptide bakteriosin HA-
5692 dari Pediococcus acidilactici dengan presipitasi menggunakan
ammonium sulfat jenuh 60%.
28
kDa 250
130
100
70
55
35
25
15
10
M S1 S2 S3 S4
Gambar 5. Visualisasi ukuran pita protein bakteriosin bakteri asam
laktat E. Faecium setelah purifikasi menggunakan
ammonium sulfat. (M) Marker protein, (S1) Bakteriosin
dari kultur 24 jam yang menempel pada dinding beker glas,
(S2) Bakteriosin dari kultur 24 jam yang diperoleh setelah
sentrifugasi, (S3) Bakteriosin dari kultur 48 jam yang
menempel pada dinding beker glas, (S4) Bakteriosin dari
kultur 48 jam yang diperoleh setelah sentrifugasi
Uji Aktivitas Bakteriosin Bakteri E. faecium
Uji antimikrobia bakteri asam laktat terhadap bakteri patogen
menggunakan bakteri Listeria monocytogenes, dikarenakan bakteri LM adalah
kontrol positif yang berarti bahwa, bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri E.
faecium positif dapat menghambat pertumbuhan bbakteri LM. Uji antimikroba ini
menggunakan metode difusi sumur, menurut Cadirci dan Citak (2005) metode
difusi sumur memiliki kelebihan yaitu seluruh metabolit yang dihasilkan bakteri
asam laktat dapat diproduksi selama uji antimikrobia.
29
Hasil pengujian aktivitas penghambatan menggunakan hasil purifikasi
dengan ammonium sulfat menunjukkan adanya zona bening yang terlihat di
sekitar sumuran (Gambar 4). Hal ini menandakan bahwa bakteriosin yang
dihasilkan oleh bakteri E. faecium dapat menghambat bakteri patogen LM.
(a) (b) (c)
Gambar 6. Uji anti mikroba supernatant bakteri asam laktat E. faecium
terhadap bakteri patogen Listeria Monocytogenes, (a) Sampel
yang dikultur selama 24 jam (b) Sampel yang dikultur selama
48 jam (c) kontrol Ampisilin.
Penghambatan bakteri asam laktat E. faeium kurang optimal jika
dibandingkan dengan kontrol positif menggunakan antibiotik (Ampisilin). Hal ini
dapat disebabkan karena jumlah senyawa antimikroba yang dihasilkan selain
asam organik jumlahnya relatif lebih sedikit dibanding dengan produksi asam
organik (Daeschel, 1989).
Umumnya bakteriosin memiliki spektrum penghambatan yang luas
dan stabil pada kisaran suhu dan pH yang luas. Keluasan spektrum daya
hambat bakteriosin biasanya diuji terhadap bakteri Gram negatif dan positif
yang bersifat patogen. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, bersifat
parasit di usus manusia dan hewan, dan banyak diantaranya bersifat patogen
(Wilson dan Miles, 1964 dalam Bell dan Kyriakides 2002).
30
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1. Bakteri asam laktat E. faecium tumbuh paling baik di media MRS pada
kondisi anaerob.
2. Hasil elektroforesis pada SDS – PAGE, dapat memperlihatkan bakteriosin
dengan ukuran sekitar 90 kDa.
3. Uji aktifitas anti mikroba bakteri E. faecium memperlihatkan adanya zona
bening di sekitar sumuran, yang menandakan bahwa bakteri asam laktat E.
faecium dapat menghambat bakteri patogen.
Saran
1. Untuk dapat memastikan efektifitas hambat bakteri patogen oleh bakteri E.
faecium diperlukan uji lanjutan di lapangan.
2. Diperlukan kultur yang lebih besar dan purifikasi yang lebih optimal untuk
menguji aktivitas bakteriosin agar zona hambatan pada sumuran dapat
terlihat dengan jelas.
31
RINGKASAN
Bakteri Enterococcus faecium merupakan salah satu mikroba yang
digolongkan ke dalam BAL yang dapat menghasilkan bakteriosin. Bakteriosin
yang dihasilkan oleh BAL E. faecium dapat digunakan sebagai bahan pengawet
(biopreservatif) terutama dalam pengolahan produk peternakan seperti susu dan
daging. Efek dari pengawetan dengan biopreservatif disebabkan oleh salah
satu metabolit yang dihasilkan oleh bakteri tersebut, yaitu bakteriosin
(Winkowski dan Montville, 1992).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri E.
faecium sebagai penghasil bakteriosin pada kondisi aerob dan anaerob.
Mengetahui karakteristik bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri E. faecium
dengan melihat berat molekul dan aktivitas uji daya hambat dari bakteriosin yang
dihasilkan. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram pada bulan maret hingga
bulan juni 2016. Variabel yang diamati pada penelitian ini yaitu pertumbuhan
BAL E. faecium pada media MRS dan media LB pada kondisi aerob dan anaerob,
berat biomasa, dan karakteristik bakteriosin (ukuran dan daya hambat dengan
bakteri patogen Listeria monocytogenes (LM).
Hasil penelian menunjukkan bahwa bakteri E. faecium tumbuh paling baik
pada media MRS dengan kondisi anaerob, diikuti oleh media MRS pada kondisi
aerob, kemudian media LB pada kondisi anaerob dan aerob. Hal ini menandakan
bahwa bakteri E. faecium bersifat fakultatif anaerob, dapat tumbuh pada kondisi
dengan atau tanpa oksigen.
32
Hasil Elektroforesis dari hasil purifikasi bakteriosin menggunakan
ammonium sulfat pada SDS-PAGE memperlihatkan adanya ban pita protein
bakteriosin yang berukuran sekitar 95 kDa. Uji daya hambat bakteri E. faecium
terhadap bakteri patogen Listeria monocytogenes dengan menggunakan metode
sumur menunjukkan adanya zona bening disekitar sumuran yang menandakan
bahwa bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri E. faecium dapat menghambat
bakteri patogen LM setelah diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam.
33
DAFTAR PUSTAKA
Albano H., S. D. Todorov, C. A. Van Reenen, T. Hogg, L. M. T. Dicks and P.
Teixeira. 2007. Characterization of two bacteriocins produced by
Pediococcus acidilactiti isolated from" Alheira", a fermented
sausage traditionally produces in Portugal. Int. J . Food Microbial.
116:239-247.
Abdelbasset M and Kirane Djamila., 2008. Antimicrobial activity of
autochthonouslactic acid bacteria isolated from Algerian traditional
fermented milk “Raïb” AfricanJournal of Biotechnology.7:2908-
2914.
Adam dan maurince. 2008. Karakteristik Bakteri Asam Laktat.
http//dagalih.unila.ac.id/13382/37/pdf. [Diakses tanggal 03-07-
2016].
Ali. G.R.R. and S. Radu. 1998. Isolation and Screening of Bakteriosin Producing
LAB from Tempe. University of Malaysia.
Andika, benson. 2014. Faktor Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat.
(http//:bensonandika.blogspot.co.id/2014/05/faktor-faktor-yang-
mempengaruhi.html) [ Diakses tanggal 12-02-2016].
Anonim. 2012. Media Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat.
(http//:teknologipascapanen.blogspot.com/2012/01/optimalisasi-
produksi-bakteriosin.html). [Diakses tanggal 25-02-2016].
. 2013. Kondisi Umum Pertumbuhan Enterococcus faecium.
http://foodsafety.blogspot.com/2013/09/enterococci.html. [Diakses
tanggal 25-02-2016].
. 2014. Pertumbuhan Bakteri Enterococcus.
(http//:lovefoodsafety.blogspot.com/2013/09/eneterococci.html).
[Diakses tanggal 11-02-2016].
Aryanta, I W.R.2013. Mikrobiologi Pangan dan Pakan. Udayana University Press.
Udayana Denpasar.
34
Arina. 2007. Kemampuan Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat Pertumbuhan
dan Produksi Aflatoksin B2 Aspergillus flavus. Jurnal BIOMA. 9:45-51.
Bell, C. and A. Kyriades. 2002. Pathogenic Eschericia coli. In: Foodborne
Pathogens: Hazards, Risk Analysis and Control (Blackburn, Clive De
W. and Peter J. Mcclure, (Eds.), Woodhead Publishing Limited,
England. 280.
Bertani, G. 1952. „‟Studies on Lysogenesis. I. The mode of phage liberation by
lysogeny Escherichia coli.‟‟ J Bacteriology. 62:293-300.
Brock, T. D., M. T. Medigan, J. M. Maktiriko, and J. Parker. 1994. Biology of
microorganisms. Practice hall. England chffts, New yersy.pp. 323-324.
Cardici, B.H. and S. Citak. 2005. A comparison of two methods used for
measuring antagonistics activity of lactic acid bacteria. Pakistan
Journal of Nutrition 4:237-241.
Daeschel MA. 1989. Antimicrobial substance from lactic acid bacteria for use as
food preservation. J Food Technol. 1989; 43: 148-155.
Fardiaz, S. 1992. Analisis Mikrobiologi Pangan. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Fitri, SA. 2009. Analisis Mikrobiologi Pangan. Universitas Padjajaran.
Yogyakarta.
Gorris, L.G.M. and M.H.J.Bennik.1994. Bacteriocins for food Preservation.
International Zeitschrift fur-Lebensmittel-Technik,-Marketing,-
Verpackung-und-Analytik. 45:65-68.
Hafsan. 2014. Bakteriosin Asal Bakteri Asam Laktat Sebagai Biopreservatif
Pangan. Jurnal Teknosains. UIN Alauddin Makasar. 8:175-184.
Hanimatul, K. Puji, A. dan Afghani, J. 2014. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Terhadap Aktivitas Bakteriosin Lactobacillus sp. RED. JKK. 3:7-12.
Jack, R.W., Tagg J.R. and Ray, B. 1995. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria.
Microbiol. Rev. 59:171-200.
Jimenez-Diaz, R. 1993. Plantaricin S and two new bacteriocins produced by
Lactobacillus plantarum LPC010 isolated from a green olive
fermentation, Appl. Environ. Microbiologi. 59: 1416-1429.
35
John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H. A. Sneath, James T. staley, Stanley T.
Williams. 1994. Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology.
Ninth Edition.
Kamoun , F., N. Zouari, I. Saadaoui, and S. Jaoua. 2009. improvement of Bacillus
thuringiensis bacteriocin production through culture condition
optimization. Preparative Biochemistry & Biotechnology. 39: 400-412.
Kurniawati, N. 2000. Peranan Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat Listeria
monocytogenes Pada Bahan Pangan. Jurnal Teknologi Pangan dan Gizi.
1:16.
Luc De Vuyst. 2007. Bakteriosins from Lactic Acid Bacteria: Production,
Purification, and Food Apllication, Journal of Molecular Micribiology
and Biotechnology. 13:194-199.
Meymey. 2012.Kegunaan Bakteri Asam Laktat Dalam Pengolahan Pangan.
(http//:meymeyrahma.blogspot.com/2012/03/bakteri-asam-laktat.html).
[Diakses tanggal 10-02-2016]
NCBI. 2016.Description and Significance Enterococcus Faecium.
(https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Enterococcus faecium).
[Diakses tanggal 15-02-2016].
Nurliana, S. 2009. Aplikasi Bakteri Enterococcus faecium. Jurnal Mikrobiologi
Indonesia. 2:50-53.
Rinto. 2012. Optimalisasi Produksi Bakteriosin.
(http://teknologipascapanen.blogspot.co.id/2012/01/optimalisasi-
produksi-bakteriosin.html) [Diakses tanggal 30-05-2016].
Shand RF, Leyva KJ. 2007. Peptide and protein antibiotics from the domain
archaea: halocins and sulfolobicins. In: Riley MA, Chavan MA, editors.
Bacteriocins: ecology and evolution. Berlin (Germany): Springer Berlin
Heidelberg. p. 93-109.
Stern, N. J., E. A Svetoch, B. V. Eruslanov, V. V. Perelygin, E. V. Mitsevich, I.
P. Mitsevich, V. D. Phokilenko. V. P. Levchuk, O. E Svetoch and B.
S. Seal. 2006. Isolation of a Lactobacillus salivarius strain and
purification of it‟s bacteriocin, wich is inhibitory to Campylobacter
36
jejuni in the chicken gastrointestinal system antimicrob. Agents
Chemother. 50:3111-3116.
Williams, M.P.M., Liao, M.K. 2013. Luria Broth (LB) and Luria Agar (LA)
Media and Their User Protocol.
(http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-
test/3031-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-
protocol. [Diakses tanggal 14-05-2016].
Winkowski, K. and Montville, T.J., 1992. Use of Meat Isolate, Lactobacillus
bavaricus MN to Inhibit Listeria monocytogenes Growth in Model
Meat Gravy System. J. Food Safety 13: 19-31.
Yuliana, N. 2008. Kinetika Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat. Jurnal Teknologi
Industri dan Hasil Pertanian, 13:2-5.
37
Lampiran 1. Grafik Perumbuhan bakteri Enterococcus faecium pada masing-
masing media
Sampel 1 MRS Aerob
y = 0.302x - 0.035R² = 0.909
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
Sampel 2 MRS Aerob
y = 0.250x + 0.017R² = 0.890
0
0.5
1
1.5
2
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
Sampel 3 MRS Anaerob
y = 0.534x + 0.649R² = 0.957
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
38
Sampel 4 MRS Anaerob
y = 0.418x + 1.004R² = 0.892
0
1
2
3
4
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
Sampel 5 LB Aerob
y = 0.020x + 0.048R² = 0.974
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
Sampel 6 LB Aerob
y = 0.017x - 0.023R² = 0.964
-0.02
-0.01
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
39
Sampel 7 LB Anaerob
y = 0.016x + 0.031R² = 0.913
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
Sampel 8 LB Anaerob
y = 0.024x + 0.007R² = 0.949
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0 2 4 6 8
Series1
Linear (Series1)
40
Lampiran 2. Tabel analisis sidik ragam pengukuran Optical Density
Tabel Analisis Variansi Hasil Pengukuran OD Bakteri Asam Laktat Enterococcus
faecium.
S.K DB JK KT F hitung F tabel
0,05 0,01
Kelompok 7
5,63 0,80 4,71** 2,30 3,21
Perlakuan 5
46,41 9,28
Galat 14
6,03 0,17
Total 26
58,07
Pada tabel terlihat bahwa F. hitung lebih besar dari F. tabel (0,05) dan (0,01)
sehingga (H0) pada hipotesis diterima dan disimpulkan bahwa terdapat perbedaan
yang sangat nyata pada setiap perlakuan penelitian.
41
Lampiran 3. Foto pelaksanaan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.
Pembuatan Media MRS
Stirrer Kultur Purifikasi Bakteriosin
Penyimpanan Media pada Anaerob Jar
Penimbangan Bahan untuk Pembuatan
Media
Supernatan Bakteri E. faecium pada
Media MRSB
Supernatan Bakteri E. faecium pada
Media LB
42
Perlakuan untuk kondisi aerob dan
anaerob
Pengenceran untuk pengukuran OD
Sentrifugasi untuk memisahkan pellet
dengan supernatan
Kuktur yang telah dipurifikasi dengan
ammonium sulfat
Pengecatan gel hasil SDS-PAGE
Pembilasan gel hasil pengecatan
43
Membuat sumuran untuk uji daya
hambat
Perlakuan aerob dengan shaker
Mix kultur sebelum diukur OD
Inokulasi bakteri
Penuangan media padat
Penambahan HCl untuk mengatur pH
44
RIWAYAT HIDUP
Penulis atas nama Melinda Sanggu Artha dilahirkan pada
tanggal 20 Mei 1994 di Dusun Montong Wasi Desa
Jerowaru Kec. Jerowaru Kab. Lombok Timur. Merupakan
anak pertama dari dua bersaudara pasangan bapak Jufriandi dengan ibu Hurniati.
Riwayat pendidikan penulis sebagai berikut :
1. Lulus Sekolah Dasar pada Tahun 2006 di SD Negeri 11 Jerowaru.
2. Lulus Sekolah Menengah Pertama pada Tahun 2009 di SMP Negeri 1
Keruak.
3. Lulus Sekolah Menengah Atas pada Tahun 2012 di SMA Negeri 1
Keruak.
4. Pada Tahun 2012 Masuk Fakultas Peternakan Universitas Mataram dan
Memperoleh Gelar Sarjana Peternakan pada Tahun 2016.
45