HYPERHOMOCYSTEINÉMIA A JEJ VPLYV NA TVORBU REAKTÍVNYCH FORIEM

KYSLÍKA (ROS) A AKTIVITU MnSOD PO ISCHEMICKO-REPERFÚZNOM POŠKODENÍ MOZGU A

INDUKOVANEJ ISCHEMICKEJ TOLERANCII

Petráš, M.1, Kovalská, M.2, Tatarková, Z.1, Lehotský, J.1, Drgová, A.1

1Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave, Slovenská republika

2Ústav histológie a embryológie, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave, Slovenská republika

14. VĚDECKO-PEDAGOGICKÁ KONFERENCE UČITELŮ BIOCHEMICKÝCH OBORŮLÉKAŘSKÝCH FAKULT V ČR A SR

30.-31.5.2013Plzeň

Oxidačný stres a ischemicko-reperfúzne poškodenie

• tvorba reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a dusíka (RNS)• mozog – nižší obsah antioxidačných mechanizmov v porovnaní s

inými orgánmi

WARNER, D. S. – SHENG, H. – BATINIC-HABERLE, I. 2004. Oxidants, antioxidants and the ischemic brain. J Exp Biol. 2004, vol. 207, p. 3221-31.

Homocysteín (Hcy)• aminokyselina obsahujúca síru, medziprodukt metylačnej dráhy metionínu, produkt

metabolickej premeny metionínu na cysteín

• hladina Hcy : 5-15 µmol/l

• hyperhomocysteinémia (hHcy) – zvýšená hladina Hcy v krvi => Hcy-tiolaktón spôsobuje tioláciu a

homocysteinyláciu proteínov

• príčiny hHcy : nedostatok vitamínov B6 a B12, nízka enzymatická aktivita

(MTHFR, CBS)

Ischemická tolerancia

• aplikácia subletálnej ischémie na tkanivá => rezistencia voči podobnému vážnejšiemu ischemickému inzultu nad prahom poškodenia, (Hirtz et al., 2007)

Typ ischemickej tolerancie

Krížová PC znížil hladinu MDA a zvýšil aktivitu antioxidačných enzýmov CAT a SOD, (Jiasi et

al., 2008)

Vzdialená PC končatiny indukuje IT mozgu, (Ren et al., 2008)

Imunologická tolerancia navodená LPS potláča zápalovú odpoveď bunky, (Rosenzweig et al., 2004)

Farmakologická inhibícia dýchacieho reťazca kyselinou nitropropiónovou, (Weih et al., 1999) a

kyselinou acetylsalicylovou, (Riepe et al., 1997)

Anestetická IT vyvolaná sevofluránom znížila veľkosť infarktu, (Wang et al., 2011)

Ciele projektu

• sledovanie vplyvu hHcy na tvorbu ROS, ako aj na zmeny aktivity antioxidačných enzýmov v kombinácii s navodenou ischemickou toleranciou, ischémiou mozgu a rôznym obdobím reperfúzie

1.sledovanie markerov oxidačného poškodenia lipidov a bielkovín nervového tkaniva indukovanom ischemickou toleranciou (preconditioning)2.analýza expresie sledovaných bielkovín metódou Western blot3.privedenie k usmerneniu neuroprotektívneho procesu

Materiál a metódy

samce potkanov kmeňa Wistar Extrakcia mozgu Homogenizácia Izolácia mitochondrií (6-8 mesačné) imunohistochemická analýza

Oxidačné poškodenie Aktivita MnSOD Analýza pomocou lipidov a proteínov Western blotu a

imunodetekcia

Kontrolná skupina

Skupina s navodenou

hHcy

IR skupina s Hcy

a reperfúziou (1,3,24 hodín)

IPC skupina s Hcy

a reperfúziou (1,3,24 hodín)

Výsledky

Oxidačné poškodenie lipidov

- štatisticky významné rozdiely v porovnaní s kontrolnou skupinou a Hcy skupinou *** P<0.001

Výsledky Oxidačné poškodenie proteínov

- štatisticky významné rozdiely medzi Hcy a kontrolnou skupinou (*** P<0.001) a medzi IR a IPC skupinou (# P<0.05, ### P<0.001)

Výsledky

Aktivita MnSOD Hladina proteínu MnSOD

- štatisticky významné rozdiely v porovnaní s kontrolnou skupinou a Hcy skupinou *** P<0.001

Výsledky

Aktivita MnSOD Hladina proteínu MnSOD

- štatisticky významné rozdiely medzi Hcy skupinou a kontrolnou skupinou (*** P<0.001) - štatisticky významné rozdiely medzi IR skupinou a Hcy skupinou (*** P<0.001), medzi IPC skupinou a Hcy skupinou (++ P<0.01, +++ P<0.001) a medzi IR a IPC skupinou (# P<0.05, ### P<0.001)

Imunohistochémia

kontrolná skupina hHcy skupina

Primárna protilátka : anti-SOD2 (A2) mouse monoclonal antibody (Santa Cruz Biotech., sc-133134)

Sekundárna protilátka : goat anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) TR

Závery

• hHcy spôsobila zvýšenie peroxidácie lipidov (TBARs) a oxidácie proteínov (dityrozíny). V IR a IPC skupinách neboli pozorované štatisticky významné zmeny v množstve TBARs.

• IPC prispel k štatisticky významným zmenám v tvorbe dityrozínov medzi IR a IPC skupinami po 3 a 72 hodinovej reperfúzii.

• hHcy znížila aktivitu MnSOD, ale zvýšila hladinu proteínu.

Závery• Aktivita MnSOD bola závislá na dĺžke trvania reperfúzie s

maximom dosiahnutým po 3 hodinovej reperfúzii.

• Western blottovou analýzou bola detegovaná zvýšená hladina MnSOD vo všetkých skupinách.

• IPC prispel k výraznému zníženiu aktivity, ako aj hladiny proteínu MnSOD v porovnaní s IR skupinami.

• Imunohistochemickou analýzou bola zistená zvýšená imunoreaktivita MnSOD v kortexe v hHcy skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou.

Ďakujem za pozornosť

Táto práca bola podorená grantom VEGA 1/0027/08 “Molekulové, neurologické a farmakologické korelácie neuroprotekcie a ischemickej tolerancie.” a grantom UK/400/2012 „Vplyv hyperhomocysteinémie na génovú expresiu antioxidačných enzýmov nervového tkaniva po indukovanej ischemickej tolerancii.“