Szegedi Tudományegyetem

Farmakognóziai Intézet

Ritka, oldalláncban gyűrűs ekdiszteroidokat tartalmazó

növények vizsgálata

Ph.D. értekezés tézisei

Ványolós Attila

Témavezető: Prof. Dr. Báthori Mária

Szeged

2012

1

Bevezetés

Az ekdiszteroidok az ízeltlábúak szteránvázas hormonjai, de

megtalálhatók más gerinctelen fajokban is. A rovarokban vedlést és

fejlődést szabályozó szerepet töltenek be, számos biokémiai és élettani

folyamatot befolyásolnak. Az első ekdiszteroidot Butenandt és Karlson

izolálta 1954-ben selyemhernyóbábból. Több mint tíz évvel később

fedezték fel az ízeltlábúak ekdsizteroidjaival szerkezetileg rokon

vegyületeket, a fitoekdiszteroidokat. A növények több nagyságrenddel

nagyobb mennyiségben szintetizálják az ekdiszteroidokat, mint a rovarok.

Szerepük a növényekben nem teljesen tisztázott, de valószínűleg védelmi

szerepet töltenek be a nem adaptálódott növényi rovarkártevőkkel szemben.

A növényekből nyert nagy mennyiségű ekdiszteroid tette lehetővé

farmakológiai vizsgálatukat, amelyek igazolták, hogy emlősökben számos

élettani folyamatot jótékonyan befolyásolnak, és toxicitásuk igen alacsony.

A farmakológiai hatások közül a legkiemelkedőbb a fehérjeszintézis

fokozása, amelyhez nem társulnak a gerinces szteroidokra jellemző

mellékhatások. A hatás mechanizmusa, ill. a metabolizmus folyamatai

emlős, így humán szervezetben alig ismert. Anabolikus hatásuk mellett

adaptogén, sebgyógyulást elősegítő, antidiabetikus és multidrog-

rezisztenciát csökkentő hatásuk érdemel említést.

Az ekdiszteroidok rovarokban betöltött szerepük és alacsony emlős

toxicitásuk miatt alkalmasak szelektív, környezetbarát inszekticidek

kifejlesztésre: funkcionális analógjaikat, a bisz(acil)-hidrazinokat már

használják növényvédelmi célokra.

Az elmúlt évtizedek fitokémiai vizsgálatai eddig több mint 300

ekdiszteroidot azonosítottak. Szerkezetüket tekintve ciklopentano-perhidro-

fenantrén vázzal rendelkező vegyületek, a 17-es helyzetben β térállású alkil

oldalláncot viselnek (1. ábra).

2

Az ekdiszteroidok jellegzetes szerkezeti elemei a B gyűrű 7-én-6-on

kromofór csoportja, az A/B gyűrű cisz és a C/D gyűrű transz anellációja. A

vázhoz kapcsolódó hidroxi csoportok száma általában 2-8.

1. ábra A leggyakoribb ekdiszteroid, a 20-hidroxiekdizon szerkezete

Célkitűzés

A Szegedi Tudományegyetem Farmakognóziai Intézetében több mint

három évtizede folynak ekdiszteroidokkal kapcsolatos kutatások, amelyek

magukban foglalják a növények szűrővizsgálatát, a biológiailag aktív

komponensek azonosítását és gyakorlati alkalmazásaik vizsgálatát

egyaránt. A kutatások során egy új, hatékony izolálási módszer került

kidolgozásra az ekdiszteroidok kinyerésére. Ez a módszer különböző,

optimalizált kromatográfiás módszerek kombinálásán alapszik. Az

ekdiszteroidok szintézise nem gazdaságos, így nagyobb mennyiségben

történő előállításukra egyetlen lehetőség, a növényekből történő izolálás

kínálkozik.

A disszertáció fő célkitűzései:

Az Ajuga reptans var. reptans földfeletti rész, a Polypodium vulgare

gyöktörzs és a Serratula wolffii gyökér ekdiszteroidprofiljának

vizsgálata, és új ekdiszteroidok izolálása az említett fajokból

Szokatlan szerkezetű, új ekdiszteroidok izolálása:

- ritka sztigmasztánvázas ekdiszteroidok kinyerése

- oldalláncban gyűrűt tartalmazó ekdiszteroidok felfedezése

3

Potenciálisan magas rovarhormon-aktivitással rendelkező új

ekdiszteroidok izolálása

Változatos szerkezetű ekdszteroidok izolálása multidrog-rezisztencia

vizsgálatokhoz, amelyek hozzásegítenek a szerkezet-hatás összefüggések

elemzéséhez, a hatásos komponensek azonosításához.

Anyagok és módszerek

Növényi nyersanyag

Az A. reptans var. reptans (indás ínfű) földfeletti részét 2003

augusztusában Budapest környékén, a Növényvédelmi Kutatóintézet

kísérleti telepén termesztett állományból, a P. vulgare (közönséges

édesgyökerű páfrány) gyöktörzsét 2008 októberében Veszprém, Egerbakta

és Kőszeg környékéről, míg a S. wolffii (pompás zsoltina) gyökerét 2003

augusztusában Herencsényben, termesztett állományból gyűjtöttük. A

mintapéldányok a Növényvédelmi Kutatóintézet Ökotoxikológiai

Tanszékén A0308-as számon (A. reptans var. reptans) és a Szegedi

Tudományegyetem Farmakognóziai Intézetében P71-es (P. vulgare) és

S94-es számon (S. wolffii) megtalálhatók.

Reagensek és tesztanyagok

Az analitikai tisztaságú oldószereket a Reanal (Budapest, Magyarország),

a HPLC tisztaságúakat a Merck (Darmstadt, Németország) szállította. Az

referencia ekdiszteroidok korábbi izolálási munkáinkból származnak.

Az izolálás során alkalmazott módszerek

A növényi nyersanyagból metanolos kivonatot készítettünk. A metanolos

kivonat előtisztítása során frakcionált acetonos kicsapást, majd oldószer-

oldószer közti megosztást (vizes-metanolos oldat és n-hexán között), végül

poliamid oszlopon szilárd fázisú extrakciót végeztünk. Az előtisztított

kivonatból az ekdiszteroidokat különböző elválasztástechnikai műveletek

kombinált alkalmazásával izoláltuk: klasszikus oszlopkromatográfia

4

(alumínium-oxid állófázison), vákuum oszlopkromatográfia (szilikagél

állófázison), centrifugális rétegkromatográfia és végső tisztítási lépésként

normál fázisú HPLC. Az elválasztás követésére rétegkromatográfiát

használtunk.

Szerkezetvizsgálat

Az ismert ekdiszteroidok azonosítása fizikai és spektroszkópiai

tulajdonságaik szakirodalmi adatokkal való összehasonlításán alapult. Az

izolált ekdiszteroidok szerkezetét spektroszkópiai vizsgálatok (UV, NMR,

MS) segítségével állapítottuk meg. A vegyületek szerkezetére vonatkozó

alapvető információkat az NMR (13

C és 1H) és tömegspektrumok elemzése

során nyertünk. Az ekdiszteroidok szerkezetének meghatározása a vizsgálat

során kapott spektrumok és a leggyakoribb ekdiszteroid, a 20-

hidroxiekdizon megfelelő spektrumaival való összehasonlításával történt.

Eredmények és értékelésük

Ekdiszteroidok izolálása

Különböző kromatográfiás módszerek kombinálásával 3 új és 2 ismert

ekdiszteroidot izoláltunk az A. reptans var. reptans földfeletti részéből. A

P. vulgare gyöktörzsének metanolos kivonatából 3 új és 11 ismert

komponenst, míg a S. wolffii gyökeréből 2 új és 1 ismert ekdiszteroidot

izoláltunk. Az izolált ekdiszteroidok szerkezetét a 2. és 3. ábra, ill. az 1.

táblázat mutatja. Az új, természetes vegyületeket * jelöli.

5

2. ábra Az Ajuga reptans var. reptans földfeletti részéből izolált ekdiszteroidok:

24-dehidropreciaszteron (1), reptanszlakton A (2), reptanszlakton B (3),

brevifloraszteron (4) és szendreiszteron (5).

3. ábra A Serratula wolffii gyökeréből izolált ekdiszteroidok: ponaszteron A-22-

apiozid (19), 3-epi-22-dezoxi-20-hidroxiekdizon (20) és 3-epi-sidaszteron (21).

R:

19* 20 21*

1 2*

3* 4 5*

R:

6

1. Táblázat. A Polypodium vulgare gyöktörzséből izolált ekdiszteroidok

Ekdiszteroid R1 R2 R3 R4 R5

pteroszteron (6) OH H βH OH

rubroszteron (7) OH H βH OH

5-hidroxirubroszteron (8) OH H βOH OH

5-hidroxiekdizon (9)* OH H βOH OH

5-hidroxiposztszteron (10) OH H βOH OH

posztszteron (11) OH H βH OH

abutaszteron (12) OH H βH OH

sidaszteron (13) OH H βH OH

5-hidroxisidaszteron (14) OH H βOH OH

7

20-deoxisidaszteron (15)* OH H βH OH

polipodin B-2-glükozid (16)* Glu H βOH OH

polipodoszaponin (17) H Rha-

Glu αH H

26-metoxi-polipodoszaponin

(18) H

Rha-

Glu αH H

Az izolált ekdiszteroidok jelentősége

Kivételes szerkezetű ekdiszteroidok

Laktongyűrűt tartalmazó ekdiszteroidok

Az Ajuga fajokból korábban izolált ekdiszteroidok sorát további ritka

lakton típusú vegyületekkel gazdagítottuk. Az A. reptansból izolált

ekdiszteroidok közül négy komponens (1-4) szerkezetében található

laktongyűrű, amely a 26-os helyzetű karboxil csoport és a 22-es vagy 23-as

hidroxi csoport között alakul ki. A 24-dehidropreciaszteron (1) hattagú, a

reptanszlakton A és B (2-3), továbbá a brevifloraszteron (4) öttagú gyűrűt

tartalmaz. A laktongyűrűs ekdiszteroidokat korábban az Ajuga fajok

specifikus vegyületeinek tartották, de mára kiderült, hogy más növények,

például a Cyathula, Leuzea és Silene nemzetség tagjai is bioszintetizálnak

ilyen komponenseket.

Az oldalláncban gyűrűs étert vagy félacetált tartalmazó ekdiszteroidok

A gyűrűs éter csoportot tartalmazó ekdiszteroidok a gombák jellegzetes

vegyületei, de a növényvilágban a Lamiaceae család képviselőiből (Ajuga

macrosperma, A. nipponensis, Vitex canescens), Polypodium fajokból és a

8

Serratula wolffiiból is kimutattak ilyen szerkezetű ekdiszteroidokat.

Az általunk izolált vegyületek közül a sidaszteron (13) és a sidaszteron

származékainak oldallánca (14-15) a 22-es és a 25-ös helyzetű hidroxi

csoporton keresztül alkot étergyűrűt A sidaszteron meglehetősen gyakran

előfordul a növényekben, származékai viszont ritkák. A 20-

deoxisidaszteron (15) új természetes vegyület, amelyet korábban

szintézissel állítottak elő 20-hidroxiekdizonból.

Az indás ínfűből izolált szendreiszteron (5), ill. az édesgyökerű páfrányból

izolált polipodoszaponin (17) és annak metilszármazéka (18) gyűrűs acetál

szerkezeti részt tartalmaz az oldalláncban. Ezek a vegyületek az A.

nipponensisből ismert ajugacetálszteron A-hoz hasonló szerkezetű

ekdiszteroidok.

C-5 helyzetben hidroxileződött ekdiszteroidok

Az édesgyökerű páfrány kivonatából izolált komponensek között számos

olyan ekdiszteroid található, amely 5-ös helyzetű hidroxi csoportot

tartalmaz. A hidroxilezett ekdiszteridok és alapvegyületeik együttes

előfordulása a növényben igazolja azt a korábbi feltevést, miszerint a

hidroxileződés végső lépése az ötös szénatomon zajlik le. Az általunk

izolált hidroxilezett vegyületek közül a 9-es jelzésű új, természetes anyag,

amely minor komponensként a páfrányban nagy mennyiségben előforduló

ekdizon kísérő vegyülete.

Epimer vegyületek

A 3-epi-22-dezoxi-20-hidroxiekdizon (20) és a 3-epi-sidaszteron (21) a 3α-

hidroxi csoportot tartalmazó ekdiszteroidok csoportjába tartozik. Eddig 21

ilyen komponenst azonosítottak, ami a több mint 350 ismert ekdiszteroid

töredékét képezi. Jelenlétük a növényekben szokatlannak számít,

bioszintézisük főként a rovarokban megy végbe. A 3-epi-ekdiszteroidokkal

szemben a 14-, 22- és 25-epi-származékok csak a növényekben találhatók

meg.

9

Biológiailag aktív vegyületek kinyerése

Kutatásaink igazolták, hogy mindhárom vizsgált növényfaj értékes

forrása olyan szokatlan szerkezetű, ritka ekdiszteroidoknak, amelyek az

oldalláncban öt- vagy hattagú gyűrűt képeznek. A gyűrűs szerkezet lehet

lakton-, éter- vagy félacetál csoport. Ezek szerkezeti újdonságuk miatt

fontosak szerepet töltenek be a szerkezet-hatás összefüggések vizsgálatánál.

Néhány komponens biológiai aktivitását zöldborsó levéltetű

[Acyrtosiphon pisum (Harris)] rovartesztrendszerben vizsgáltuk. A

brevifloraszteron (4) kiemelkedő aktivitással rendelkezett (LC50 = 3,65),

míg a reptanszlakton B (3) (LC50 = 78,81) és a szendreiszteron (5) (LC50 =

95,14) alacsony aktivitásúnak bizonyult. A 4-es vegyület kiemelkedő

aktivitása a komponens oldalláncának viszonylag alacsony polaritásával és

könnyebb receptorkötődésével magyarázható, szemben a 3-as vegyülettel,

amely több hidroxi csoportja révén polárisabb. Az 5-ös komponens

csökkent aktivitása polaritásán kívül az oldalláncban levő gyűrűn

elhelyezkedő nagyobb térigényű szubsztituenseknek (metoxi, etil), és így

gyenge receptorkötődési affinitásának tulajdonítható.

10

Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Báthori Mária

professzorasszonynak munkám folyamatos irányításáért, támogatásáért, és

disszertációm elkészítéséhez nyújtott segítségéért.

Köszönettel tartozom Dr. Máthé Imre professzor úrnak a Farmakognóziai

Intézet korábbi, és Dr. Hohmann Judit professzorasszonynak, az intézet

jelenlegi vezetőjének, hogy lehetőséget biztosítottak munkám elvégzéséhez.

Külön köszönet illeti Dr. Szendrei Kálmán professzor urat értékes

tanácsaiért, józan és pontos meglátásaiért.

Köszönettel tartozom Dr. Cservenka Juditnak, Kóródi Blankának, Sulyok

Józsefnek és Dr. Polgár Lászlónak a növénygyűjtésben nyújtott

segítségéért. Köszönetemet fejezem ki társszerzőimnek: Dr. Tóth

Gábornak, Dr. Simon Andrásnak és Dr. Béni Zoltánnak az NMR mérések

elvégzéséért és kiértékeléséért, Dr. Kele Zoltánnak és Dr. Dékány

Miklósnak a tömegspektrometriai vizsgálatokért, és Dr. Fekete Gábornak a

rovarhormon-aktivitási vizsgálatokért.

Hálával tartozom Hevérné Herke Ibolyának, akinek kiemelkedő

laboratóriumi tapasztalata komoly segítségnek bizonyult izolálási munkám

során. Köszönöm továbbá a laboratóriumban dolgozó munkatársaimnak,

Dr. Hunyadi Attilának, Dr. Liktor-Busa Erikának, Dr. Tóth Noéminek, Dr.

Dankó Balázsnak és Dr. Ana Martinsnak, segítségüket és támogatásukat.

Köszönöm mindazoknak, akik időt és fáradságot nem kímélve átolvasták

disszertációmat gépelési és szerkesztési hibák után kutatva.

A Farmakognóziai Intézet minden munkatársának köszönöm a

munkámhoz nyújtott segítséget és a kiegyensúlyozott, jó munkahelyi

légkört. Köszönöm a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány nagylelkű

anyagi támogatását.

Végül, de nem utolsósorban köszönöm családom szerető támogatását.

11

Az értekezés alapjául szolgáló közlemények

I. Ványolós A, Báthori M. 2008. New perspectives in the analysis of

ecdysteroids: a promising group of biologically active compounds.

Curr. Pharm. Anal. 4: 162-75. If: 1.033

II. Ványolós A, Simon A, Tóth G, Polgár L, Kele Z, Ilku A, Mátyus

P, Báthori M. 2009. C-29 ecdysteroids from Ajuga reptans var.

reptans. J. Nat. Prod. 72: 929-32. If: 3.159

III. Simon A, Ványolós A, Béni Z, Dékány M, Tóth G, Báthori M.

2011. Ecdysteroids from Polypodium vulgare L. Steroids 76:

1419-24. If: 3.106

IV. Ványolós A, Béni Z, Dékány M, Simon A, Báthori M. 2012.

Novel ecdysteroids from Serratula wolffii. ScientificWorldJournal

(közlés alatt). If: 1.524

Előadások az értekezés témájában

Ványolós A, Simon A, Béni Z, Dékány M, Báthori M.

Az édesgyökerű páfrány (Polypodium vulgare L.) ekdiszteroidprofiljának

vizsgálata.

MGYT Gyógynövény Szimpózium, 2011. május 5-7., Szeged.

Ványolós A, Simon A, Tóth G, Báthori M.

Ajuga reptans var. reptans: egy új ekdiszteroidforrás a növényvilágból.

MTA Szteroidkémiai Munkabizottság Előadóülése, Szeged, 2009. november

27.

Ványolós A.

Sztigmasztánvázas ekdiszteroidok új képviselői az indás ínfűből.

Magyar Tudomány Ünnepe, MTA SZAB Gyógyszerészeti Szakbizottság és

Műszaki Szakbizottság, Szeged, 2009. november 10.

12

Ványolós A, Simon A, Ilku A, Báthori M.

Ritka, sztigmasztánvázas ekdiszteroidok új képviselői az Ajuga reptans var.

reptansból.

“Lippay János – Ormos Imre – Vas Károly” Tudományos Ülésszak,

Budapest, 2009. október 28–30.

Ványolós A.

Ritka C-29 ekdiszteroidok új képviselői az Ajuga reptans var. reptansból.

IX. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 2009. április 23-24.