1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Trần Thúy Hằng

PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH

VẬT (BIOFILM) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011

2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Trần Thúy Hằng

PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH

VẬT (BIOFILM) PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2011

3

Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật

có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) phân lập ở Việt Nam

1. Đặt vấn đề

Màng sinh vật là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt

các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra và là

một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên. Các vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật đóng

vai trò quan trọng trong các chu trình dinh dưỡng cũng như trong xử lý ô nhiễm môi trường.

Thêm vào đó, sự tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật còn góp phần kiểm soát sự

xâm nhiễm của các tác nhân gây hại cây trồng, làm giảm sự ăn mòn kim loại và sự phá hủy

những hợp kim khác.

2. Nguyên liệu và phương pháp

Các vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật được phân lập từ mẫu nước thải các khu

vực làng nghề ở Hà Nội và Hưng Yên theo phương pháp nuôi cấy làm giàu. Các chủng vi sinh

vật phân lập được thử nghiệm hoạt tính tạo thành màng sinh vật nhờ phương pháp nhuộm tím

kết tinh. Các chủng có khả năng tạo màng sinh vật được nuôi cấy trong môi trường khoáng tối

thiểu có bổ sung nguồn cacbon, nitơ khác nhau và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng ở các

điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tạo

thành màng sinh vật của các chủng phân lập.

Các chủng phân lập được thử nghiệm khả năng tạo chất hoạt động bề mặt thông qua

chỉ số nhũ tương hóa E24. Các chủng có khả năng tạo màng được nghiên cứu khả năng kháng

khuẩn theo phương pháp của De Angelis và cộng sự. Đồng thời các chủng này được nuôi cấy

trên các bề mặt vật liệu môi trường khác nhau để quan sát các dạng màng. Cuối cùng, chúng

tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái và phân loại các chủng có hoạt tính biofilm mạnh

nhất bằng phương pháp nhuộm Gram và phân tích gen 16S rDNA.

3. Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật

3.1.1 Phân lập vi sinh vật

Từ mẫu nước thải các khu vực ô nhiễm làng nghề ở Hà Nội và Hưng Yên, chúng tôi

đã phân lập được 75 chủng vi sinh vật, trong đó 23 chủng vi sinh vật thu được từ mẫu nước

thải khu vực làng nghề miến Lại Trạch; 25 chủng vi sinh vật thu được từ mẫu nước thải nhà

máy sản xuất bia và 27 chủng vi sinh vật phân lập được từ mẫu nước thải làng bún Phú Đô.

Trong đó, các chủng vi sinh vật phân lập được chủ yếu từ khu vực nước thải ở tầng

giữa và tầng đáy. Điều này phù hợp với giải thích về khả năng bám dính của các chủng vi sinh

vật ở các phần nước này. Đây là khu vực ít có sự biến động và xáo trộn về dòng chảy; đồng

thời cũng là nơi tập trung nhiều nguồn dinh dưỡng thuận lợi cho sự tăng trưởng và phát triển

của vi sinh vật.

4

Hình 1. Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch

3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập

Đánh giá sự phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập từ

nguồn nước thải làng nghề miến Lại Trạch, chúng tôi nhận thấy: Trong môi trường nuôi cấy ở

điều kiện tĩnh, khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 620 nm (OD620) đặc trưng cho mật độ

tế bào sống trôi nổi giảm thấp, trong khi khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm

(OD570) đặc trưng cho mật độ tế bào trong cấu trúc màng sinh vật tăng lên đáng kể. Trong số

đó, có 2 chủng vi sinh vật tạo màng tốt nhất mà chúng tôi lựa chọn để thực hiện các thí

nghiệm tiếp theo đó là M1.10 và U1.3.

Kết quả đánh giá tương tự được chúng tôi thực hiện với các chủng vi sinh vật phân lập

từ nguồn nước thải nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm và làng nghề bún

Phú Đô.

Đối với mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia, chúng tôi thu được khá nhiều chủng vi

sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật tốt; trong đó 3 chủng có hoạt tính tạo màng tốt nhất

được chúng tôi lựa chọn sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo đó là A3.3, M3.8 và U3.7.

Kết quả thí nghiệm cho thấy trong 3 khu vực lấy mẫu thì mẫu nước thải từ làng nghề

bún Phú Đô chúng tôi phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật

nhất và các chủng này cũng có hoạt tính tạo màng cao nhất. Trong số đó, chúng tôi lựa chọn

được 3 chủng có khả năng tạo màng sinh vật tốt nhất để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp

theo đó là M4.3, M4.9 và M4.10.

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành màng sinh vật cho thấy: Các

chủng vi sinh vật được nghiên cứu hầu hết biểu hiện hoạt tính tạo màng sinh vật mạnh nhất ở

nhiệt độ 37oC. Tuy nhiên, ở 50oC một số chủng như M1.10, U1.3, M3.8, M4.9 vẫn có hoạt

tính tạo màng sinh vật tương đối tốt.

5

Các kết quả thu được này cũng khá phù hợp với các kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn

Quang Huy và cộng sự. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ 37oC thích hợp cho nhiều chủng vi

khuẩn phân lập trong môi trường ô nhiễm ở Việt Nam phát triển và tạo màng sinh vật.

3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị pH phù hợp nhất cho sự tăng trưởng và tạo màng

sinh vật của các chủng phân lập là pH7 - pH7,5.

Các kết quả thu được của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả của một số tác giả

trên thế giới. Kết quả nghiên cứu của Oliveira và cộng sự cho thấy chủng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens tạo màng sinh vật tối ưu ở môi trường nuôi cấy pH7 [64] còn chủng

Stenotrophomonas maltophilia tạo màng sinh vật tối ưu ở môi trường pH7,3.

Kết quả nghiên cứu còn cho thấy chủng M4.9, M4.3 vẫn tạo màng sinh vật tốt nhất

tương ứng trong môi trường pH8, pH8,5 được chúng tôi nhận định là chủng vi khuẩn ưa kiềm.

3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Kết quả thu được ở bảng 2 chúng tôi nhận định chủng M1.10 thích hợp với việc sử

dụng nguồn cacbon là đường galactose, chủng M4.10 sử dụng tốt nhất nguồn cacbon là đường

glucose và chủng M4.3 sử dụng đường mannose tối ưu nhất. Các kết quả này phù hợp với

đánh giá của các tác giả trong nước như Nguyễn Quang Huy và cộng sự hay tác giả nước

ngoài như Haggag. Tuy nhiên khả năng tạo màng sinh vật của các chủng này trong kết quả

nghiên cứu là không cao đối với từng loại đường riêng biệt.

Trong số 8 chủng vi sinh vật được lựa chọn nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy 4 chủng

có hoạt tính tạo màng sinh vật cao nhất là M3.8, M4.9, U1.3, U3.7; và cả 4 chủng này đều có

khả năng sử dụng tất cả các loại đường cho sự tạo thành màng sinh vật với các mức độ khác

nhau.

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số chủng như U1.3, M3.8, M4.9, M4.10 tạo màng

sinh vật tương đối tốt với nguồn nitơ từ muối (NH4)2SO4. Kết quả này tương đối phù hợp với

nghiên cứu của Lee và cộng sự cho thấy chủng Aureobasidium pullulans tạo màng sinh vật tốt

với nguồn nitơ từ muối (NH4)2SO4. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cao nấm

men là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho sự tạo thành màng sinh vật của nhiều chủng phân lập.

Từ kết quả này chúng tôi lựa chọn được 4 chủng vi sinh vật lần lượt ký hiệu là U1.3,

U3.7, M3.8, M4.9 tạo thành màng sinh vật tốt nhất với nhiều nguồn nitơ khác nhau được bổ

sung vào môi trường nuôi cấy.

3.2.5 Ảnh hưởng của giá thể

3.2.5.1 Khả năng tạo màng sinh vật trên bề mặt các giá thể khác nhau

6

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 4 chủng U1.3, U3.7, M3.8, M4.9 đều có khả năng tạo

các dạng màng sinh vật trên bề mặt các giá thể khác nhau như: Dạng màng nổi (floating

biofilm) được tạo thành trên bề mặt dịch môi trường, phần tiếp xúc với không khí tạo thành

một lớp váng nổi, màu trắng (hình 2). Hay dạng màng bám dính trên bề mặt rắn mà cụ thể ở

đây là trên ống eppendorf nhựa tạo thành một lớp màng màu tím bao xung quanh thành ống

(hình 3).

Hình 2. Màng nổi của 4 chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi cấy

M3.8 M4.9 U1.3 U3.7 ĐC

Hình 3. Màng sinh vật trên bề mặt nhựa

3.2.5.2 Cấu trúc màng sinh vật quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét

Quan sát cấu trúc không gian ba chiều của màng sinh vật dưới kính hiển vi điện tử

quét (hình 4) chúng tôi nhận thấy màng sinh vật của cả 4 chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 đều

được tạo thành bởi các vi khuẩn lạc, bao quanh là mạng lưới chất ngoại bào.

7

M3.8 M4.9

U1.3 U3.7

Hình 4. Cấu trúc màng sinh vật của các chủng phân lập (× 1000)

3.3 Một số đặc tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật phân lập

3.3.1 Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt

Nhằm mục đích đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh

vật phân lập, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của chúng và thu

được kết quả như ở hình 5.

Hình 5. Khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của các chủng vi sinh vật

8

Kết quả thu được: 4 chủng có khả năng nhũ tương hóa dầu mạnh nhất là:

Ký hiệu chủng U1.3 A3.3 M3.8 U3.7

Chỉ số nhũ hóa (%)

74,19 80,58 80,77 67,33

Kết quả nhũ tương hóa dầu ăn cho thấy một số chủng vi sinh vật có hoạt tính hình

thành màng sinh vật mạnh đồng thời cũng có khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt. Chất

hoạt động bề mặt sinh học do vi sinh vật tạo ra là chất có thành phần cấu trúc đa dạng với bề

mặt rất hoạt động. Bởi vậy, có một mối liên hệ giữa sự hình thành màng sinh vật và khả năng

tạo chất hoạt động bề mặt. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các phân tử chất hoạt động bề mặt

có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự gắn kết và phát triển của các vi sinh vật trên một bề mặt.

Bởi chúng làm giảm sức căng bề mặt và nhờ đó tăng cường khả năng lan rộng và bám dính

của vi sinh vật, hình thành dạng màng nổi hay dạng màng bám dính với bề mặt rắn.

3.3.2 Khả năng kháng khuẩn

Bảng 1: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Ký hiệu chủng

Hoạt tính kháng khuẩn

(Đường kính vòng kháng khuẩn: mm)

E. coli Vibrio

parahaemolyticus Samonella

typhi Ralstonia

solanacaerum Staphylococcus

aureus

M3.8 7 9 2 3 2

M4.9 8 10 2 2 2

U1.3 7 9 2 3 3

U3.7 3 2 7 7 8

Kết quả ở bảng 1 cho thấy các chủng M3.8, M4.9, U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối

với E. coli và Vibrio parahaemolyticus còn U3.7 có hoạt tính mạnh đối với 3 chủng

Samonella typhi, Ralstonia solanacaerum và Staphylococcus aureus.

3.3.3 Đặc điểm hình thái

Để phân loại các chủng phân lập có khả năng tạo thành màng sinh vật mạnh M3.8,

M4.9, U1.3, U3.7, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram các

chủng, kết quả bước đầu cho thấy các tế bào vi khuẩn có dạng hình que ngắn, nằm riêng rẽ

nhau, không xếp thành chuỗi và đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (hình 6).

9

Ký hiệu Hình thái khuẩn lạc Kết quả nhuộm Gram

M3.8

M4.9

U1.3

U3.7

Hình 6. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật

3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA

Để xác định phân loại chính xác của các chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9,

U1.3 và U3.7, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen 16S rDNA của chúng.

Kết quả hình 7 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng M3.8 tương đồng

99,9% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,5% với

10

đoạn 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843. Trình tự gen 16S rDNA của chủng

M4.9 tương đồng 100% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416;

tương đồng 99,6% với đoạn trình tự 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843.

Hình 7. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào

trình tự gen 16S rDNA

Kết quả hình 8 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng U1.3 tương đồng

99,9% với đoạn 16S của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970

và tương đồng 99,8% với chủng Bacillus subtilis_AB042061. Trình tự gen 16S rDNA

của chủng U3.7 tương đồng 99,8% với đoạn trình tự 16S của vi khuẩn Bacillus

Staphylococcus aureus_X68417

Bacillus cibi_AY550276

Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033

100

Bacillus isabeliae_AM503357

Bacillus safensis_AF234854

Bacillus pumilus_AY876289

Bacillus altitudinis_AJ831842

Bacillus aerophilus_AJ831844

Bacillus stratosphericus_AJ831841

100

99

100

Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416

M3.8 100

M4.9

80

77

Bacillus sonorensis_AF302118

72

Bacillus atrophaeus_AB021181

Bacillus velezensis_AY603658

Bacillus nematotocita_AY820954

Bacillus amyloliquefaciens_X60605

59

Bacillus vallismortis_AB021198

Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061

Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970

Bacillus axarquiensis_AY603657

Bacillus malacitensis_AY603656

Bacillus mojavensis_AB021191 2661

59

79

23

69

100

98

100

100

85

100

54

0.01

11

velezensis_AY603658 và tương đồng 99,5% với chủng Bacillus

nematotocita_AY820954.

Hình 8. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen

16S rDNA

Chi Bacillus được đánh giá đa phần gồm các chủng vi khuẩn không gây bệnh, có khả

năng tạo màng sinh vật cao và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Sự tạo thành màng sinh vật ở

chủng Bacillus subtilis đóng vai trò quan trọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp,

nông nghiệp, thực phẩm, hóa mỹ phẩm. Bằng cách tạo ra hợp chất surfactin trong quá trình

tạo màng sinh vật, B. subtilis giúp các cây trồng có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây

bệnh như Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Khả năng tạo gramicidin của chủng Bacillus

brevis 18-3 có tác dụng làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai

chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6. Mặt khác, khả năng tạo chất hoạt động bề

mặt của các chủng vi sinh vật trong quá trình tạo màng cũng làm tăng mức độ nhũ tương hóa

và tạo bọt trong chế biến thực phẩm và tạo nhũ hóa cho các sản phẩm mỹ phẩm. Đồng thời,

Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033 100

Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289

Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841

99

100

99

Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416

Bacillus sonorensis_AF302118

100

Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658

U3.7 Bacillus nematotocita_AY820954

82

Bacillus amyloliquefaciens_X60605

79

Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus axarquiensis_AY603657

Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191

78

Bacillus subtilis subsp spizizenii_ AF074970

59

U1.3 Bacillus subtilis_AB042061

67

5479

70

72

100

99

100

98

77

100

66

0.01

12

đặc tính này cũng đã mở ra triển vọng mới trong việc chế tạo chất hoạt động bề mặt sinh học

hoạt tính cao từ nguồn vi sinh vật ứng dụng cho công nghiệp dầu khí để xử lý các sự cố tràn

dầu.

4. Kết luận và kiến nghị

Kết luận

1. Từ mẫu 75 chủng vi sinh vật phân lập được từ nước thải các làng nghề ở Việt Nam,

chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9 và M4.10

có hoạt tính tạo màng sinh vật cao hơn các chủng còn lại.

2. Tám chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất

ở 37oC và pH từ 7 - 7,5. Trong số các chủng này, bốn chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 có khả

năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung

các nguồn cacbon (fructose, rhamnose, glucosamine) và trong môi trường khoáng cơ sở có bổ

sung các nguồn nitơ ((NH4)2SO4, cao nấm men) khác nhau.

3. Các chủng M3.8, M4.9 và U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối với E. coli và Vibrio

parahaemolyticus, với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm và 9 mm; 8 mm và 10

mm; 7 mm và 9 mm; trong khi đó chủng U3.7 có hoạt tính kháng mạnh đối với 3 chủng

Staphylococcus aureus, Samonella typhi và Ralstonia solanacaerum với đường kính vòng

kháng khuẩn lần lượt là 7 mm, 7 mm và 8 mm.

4. Những phân tích về đặc điểm hình thái và phân tích gen 16S rDNA của 4 chủng cho

phép chúng tôi nhận định 4 chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 là vi khuẩn Gram dương thuộc chi

Bacillus. Trong đó, chủng M3.8, M4.9 gần với loài Bacillus licheniformis; chủng U1.3 gần

với loài Bacillus subtilis còn chủng U3.7 gần với loài Bacillus velezensis.

Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt và đặc tính

kháng khuẩn của bốn chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 để ứng dụng trong

công nghệ xử lý nước thải và trong phòng chống dịch hại gây bệnh trên cây trồng.

Tìm hiểu thành phần protein và vai trò của sự điều hòa biểu hiện gen trong quá trình

tạo thành màng sinh vật của bốn chủng vi khuẩn phân lập.