1

BỘ Y TẾ

KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM

PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM

IV

PHẦN CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM SINH HỌC

NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC

2

3

Bài 1. PHÉP THỬ HISTAMIN

1. Các bƣớc tiến hành

Dùng chuột lang nặng 250 - 350 g. Để chuột nhịn đói trong 24 giờ, vẫn cho uống

nước theo nhu cầu của chuột. Giết chuột đột ngột bằng phương pháp thích hợp.

Mổ bụng chuột, dùng kẹp, kẹp vào manh tràng, nâng lên và kéo ra phía trước, sẽ thấy hồi

tràng nối vào manh tràng. Cắt lấy một đoạn hồi tràng dài khoảng 2 cm, cho vào khay

đựng dung dịch B (nếu làm chậm phải sục khí carbogen). Loại bỏ các chất còn trong

đoạn ruột bằng cách dùng một pipet có dung dịch B lồng vào đầu đoạn ruột rồi để cho

dung dịch B trong pipet chảy tự nhiên qua đoạn ruột. Cần để pipet ở tư thế nghiêng sao

cho mặt thoáng của dung dịch B không cao quá 2 cm so với đoạn ruột trong khay.

Thay dung dịch B mới vào khay. Buộc vào mỗi đầu của đoạn ruột một sợi chỉ

mảnh và rạch một đường ngang nhỏ ở giữa đoạn ruột.

Cho đoạn ruột vào bình nuôi cơ quan cô lập có dung tích 10 - 20 ml, chứa dung

dịch B, và giữ ở nhiệt độ hằng định 34 - 36oC. Sục một hỗn hợp khí có 95 thể tích oxygen

và 5 thể tích carbon dioxyd qua bình nuôi. Một đầu sợi chỉ buộc vào gần đáy bình nuôi,

đầu kia nối với đầu ghi của một kimograph hoặc thiết bị thích hợp để ghi sự co bóp của

ruột. Nếu dùng bút ghi trên giấy thì điều chỉnh sao cho biên độ có thể khuếch đại lên

khoảng 20 lần. Sức căng của ruột nên vào khoảng 9,8 mN và điều chỉnh theo độ nhạy của

ruột.

Thay dung dịch B trong bình nuôi cơ quan. Để yên 10 phút. Tiếp tục thay dung dịch

B 2 - 3 lần như vậy nữa.

Thêm vào bình nuôi cơ quan, chính xác khoảng 0,2 - 0,5 ml dung dịch histamin

dihydroclorid có nồng độ nhất định để gây nên một đáp ứng gần tối đa có thể lặp lại

được. Liều này gọi là liều "cao".

Thay dung dịch B ở bình nuôi 3 lần trước mỗi lần thêm histamin. Nên thêm

histamin vào những khoảng thời gian cách đều để ruột giãn hoàn toàn giữa các lần thêm

(khoảng 2 phút).

Tương tự, thêm những thể tích bằng nhau của dung dịch có nồng độ histamin thấp

để cho đáp ứng có biên độ bằng khoảng một nửa biên độ của liều "cao" và có thể lặp lại

được. Liều này gọi là liều "thấp".

4

Tiếp tục thêm đều đặn các liều "cao" và liều "thấp" histamin như đã nêu ở trên và

xen kẽ thêm cùng một thể tích dung dịch pha từ mẫu thử. Điều chỉnh độ pha loãng của

dung dịch thử để cho sức co của ruột nhỏ hơn sức co của liều "cao".

Kiểm tra xem sức co của dung dịch thử có lặp lại không và xem đáp ứng với liều

cao và liều thấp có như trước không.

Tính hoạt lực của chất thử ra microgam histamin base căn cứ vào độ pha loãng đã

xác định ở trên. Lượng histamin xác định được không được vượt quá lượng ghi trong

chuyên luận.

Nếu chất thử không gây co bóp ruột, pha một dung dịch khác và cho thêm một lượng

histamin tối đa dung nạp được ghi trong chuyên luận và thử với dung dịch này. Theo dõi

xem sự co cơ của dung dịch này có tương ứng với lượng histamin đã thêm không. Nếu dung

dịch này không gây ra sự co cơ tương ứng hoặc sự co của dung dịch thử không lặp lại được,

hoặc sau khi thử chất thử rồi, thử lại với histamin chuẩn liều "cao" và liều "thấp" mà đáp ứng

co giảm đi thì kết quả thử là không có giá trị và phải thử chất hạ áp của thuốc theo chuyên

luận "Phép thử các chất hạ áp".

Dung dịch A:

Natri clorid 160 g

Kali clorid 4,0 g

Calci clorid khan 2,0 g

Magnesi clorid khan 1,0 g

Dinatri hydrophosphat 50 mg

Nước cất pha tiêm vừa đủ 1000 ml

Dung dịch B:

Dung dịch A 50 ml

Atropin sulfat 0,5 mg

Natri hydrocarbonat 1,0 g

D - glucose 0,5 g

Nước cất pha tiêm vừa đủ 1000 ml

Dung dịch B phải pha ngay trước khi dùng và phải dùng trong vòng 24 giờ.

5

Bài 2. PHÉP THỬ NỘI ĐỘC TỐ VI KHUẨN

Phép thử nội độc tố vi khuẩn dùng để phát hiện hoặc định lượng nội độc tố của vi

khuẩn gram âm có trong mẫu thử cần kiểm tra. Phương pháp sử dụng thuốc thử lysat là

dịch phân giải tế bào dạng amip có trong máu một loài sam biển, Limulus polyphemus

hoặc Tachypleus tridentatus.

Hiện nay có 3 phương pháp để thực hiện phép thử này: phương pháp tạo gel dựa

trên sự tạo thành gel khi cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội độc tố; phương pháp

đo độ đục, dựa vào sự thay đổi độ đục của thuốc thử lysat khi tạo gel; phương pháp đo

màu dựa trên sự thay đổi màu của phức hợp màu - peptid.

Tuỳ theo điều kiện và tính chất của mẫu thử, có thể áp dụng một trong các kỹ

thuật thích hợp để thực hiện phép thử. Tuy nhiên, khi có nghi ngờ hoặc tranh chấp, kết

luận cuối cùng sẽ dựa vào phương pháp tạo gel trừ khi có chỉ dẫn khác.

Phép thử được thực hiện trong điều kiện tránh nhiễm khuẩn.

Thiết bị và dụng cụ: Tất cả dụng cụ dùng trong phép thử này đều phải không có chứa nội

độc tố.

Với những dụng cụ thuỷ tinh hoặc bằng chất liệu chịu được nhiệt, loại chất gây sốt

bằng cách sấy ở 250oC trong ít nhất 30 phút. Nếu dùng các dụng cụ là chất dẻo, như các

đầu hút của micropipet hay các khay lỗ để làm phản ứng, chỉ dùng các loại có chất liệu

không ảnh hưởng tới phép thử và không có chứa nội độc tố.

Nước để thử nội độc tố (nước BET hoặc nước LAL): Là nước tinh khiết cho kết quả âm

tính trong phép thử nội độc tố ở điều kiện quy định. Có thể dùng nước cất 3 lần hoặc một

loại nước tinh khiết thu được bằng phương pháp thích hợp khác đạt yêu cầu trên.

Nếu không có chỉ dẫn gì khác, dùng nước BET hoặc nước LAL làm dung môi để

pha tất cả các dung dịch dùng trong phép thử.

Dung dịch acid hydrocloric 0,1M BET và natri hydroxyd 0,1M BET: là dung dịch được

pha từ acid hydrocloric đậm đặc hoặc natri hydroxid rắn với nước BET trong một dụng

cụ không có chứa nội độc tố. Các dung dịch này đạt yêu cầu nếu sau khi điều chỉnh đến

pH 6,0- 8,0, cho kết quả âm tính trong điều kiện của phép thử.

6

Chuẩn nội độc tố và dung dịch chuẩn gốc: chuẩn nội độc tố được sử dụng trong phép thử

như một chất đối chiếu. Chuẩn được thiết lập và đánh giá theo chuẩn nội độc tố quốc tế.

Hoạt lực của chuẩn được biểu thị theo đơn vị quốc tế qui định bởi Tổ chức Y tế thế giới

(International Unit = IU) hoặc đơn vị nội độc tố (Endotoxin Unit – EU). 1 IU tương

đương với 1 EU.

Dung dịch chuẩn gốc nội độc tố được pha theo quy định đóng gói của từng nhà sản

xuất. Trên nhãn và tờ hướng dẫn sử dụng kèm theo ghi rõ cách pha, điều kiện bảo quản

và số đơn vị nội độc tố có trong dung dịch chuẩn gốc sau khi pha theo hướng dẫn.

Pha dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc với nước BET/ LAL để được dãy chuẩn

có nồng độ thích hợp. Trước khi pha, thường yêu cầu lắc mạnh dung dịch chuẩn gốc

trong ít nhất 15 phút, và mỗi lần pha loãng, trộn các dung dịch pha loãng ít nhất 30 giây.

Dùng các dung dịch chuẩn đã pha loãng càng sớm càng tốt để tránh mất hoạt lực.

Dung dịch thử

Chuẩn bị dung dịch thử bằng cách hoà tan hoặc pha loãng mẫu thử với nước BET/

LAL đến độ pha loãng thích hợp. Một số chất hoặc chế phẩm có thể cần phải hòa tan

hoặc pha loãng trong dung dịch thân nước khác. pH của hỗn hợp phản ứng phải nằm

trong khoảng qui định cho mỗi loại thuốc thử, thông thường trong khoảng 6,0 – 8,0. Do

vậy, nên điều chỉnh pH của dung dịch thử cho phù hợp bằng các dung dịch acid

hydrocloric 0,1M BET, natri hydroxyd 0,1M BET hoặc một đệm thích hợp theo khuyến

cáo của nhà sản xuất thuốc thử.

Phép thử không thích hợp với một số loại mẫu thử như các loại nhũ dịch, hỗn

dịch… Một số chất có thể cho phản ứng dương tính hoặc âm tính giả với thuốc thử như

các chế phẩm từ máu, polynucleotid; chế phẩm có chứa kim loại nặng, chất diện hoạt,

nồng độ ion cao. Do vậy, cần phải khảo sát, tìm phương pháp xử lý và đánh giá trước khi

áp dụng phép thử cho chế phẩm.

Độ pha loãng tối đa:

Độ pha loãng tối đa (MVD) là hệ số pha loãng lớn nhất cho phép để thu được dung

dịch thử có chứa lượng nội độc tố có thể phát hiện được.

MVD được tính như sau:

7

Giới hạn nội độc tố x nồng độ dung dịch thử

MVD =

Trong đó:

Giới hạn nội độc tố (Endotoxin Limit = EL): giới hạn nội độc tố thường được quy định

trong các chuyên luận riêng. Chế phẩm đạt yêu cầu nếu lượng nội độc tố có trong chế

phẩm thấp hơn giới hạn qui định. Giới hạn nội độc tố của các chế phẩm được tính trên cơ

sở liều dùng cho người theo công thức sau:

EL = K/ M

Trong đó, K là ngưỡng nội độc tố tính cho 1 kg thể trọng người có thể chịu đựng

được mà không xảy ra phản ứng độc hại; Giá trị K được tham khảo trong bảng 1 dưới

đây.

M là liều tối đa của sản phẩm tính cho 1 kg thể trọng dùng dưới dạng đơn liều trong

thời gian khoảng 1 giờ. Liều này được hiểu là lượng thuốc tối đa có thể được dùng trong

vòng 1 giờ. Với các loại thuốc tiêm dưới da, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch một lần sẽ

được coi như dùng đơn liều. Với các dịch truyền tĩnh mạch trong thời gian dài, tính M

theo lượng thuốc của liều có thể được truyền tối đa trong một giờ, dựa trên tốc độ truyền

tiêu chuẩn nếu không có qui định riêng nào cho chế phẩm. Giá trị được dùng là l iều tối đa

theo khuyến cáo của nhà sản xuất, có thể mức liều đó vượt quá mức liều theo chỉ dẫn của

thầy thuốc.

Bảng 1:

Loại sản phẩm K (tính cho 1 kg thể trọng)

Các loại thuốc tiêm trong màng 0,2

Các thuốc phóng xạ tiêm tĩnh mạch 2,5

Tất cả các thuốc tiêm trừ loại tiêm trong

màng hoặc thuốc phóng xạ

5,0

Nếu một sản phẩm có thể được dùng theo cả 2 đường tiêm trong vỏ và các đường

tiêm khác thì giới hạn nội độc tố cho sản phẩm được tính theo giá trị K của đường tiêm

trong vỏ vì có yêu cầu chặt chẽ hơn.

8

Trên thực tế, các nhà sản xuất thường qui định giới hạn nội độc tố cho sản phẩm

thấp hơn nhiều so với giới hạn tính theo ngưỡng chịu đựng của người bệnh, để khi dùng

liều tối đa sản phẩm vẫn đảm bảo an toàn cho người bệnh.

Nồng độ của dung dịch thử:

Tính bằng mg/ ml nếu giới hạn nội độc tố trong chuyên luận riêng quy định theo

khối lượng (IU/ mg)

Tính bằng đơn vị/ ml nếu giới hạn nội độc tố trong chuyên luận riêng quy định theo

đơn vị hoạt lực sinh học (IU/ đơn vị)

Tính bằng ml/ ml nếu giới hạn nội độc tố trong chuyên luận riêng quy định theo thể

tích (IU/ ml)

: là độ nhạy của thuốc thử được ghi trên nhãn (kỹ thuật tạo gel) hoặc nồng độ nội độc

tố thấp nhất đã dùng để xây dựng đường cong chuẩn (phương pháp đo độ đục hoặc đo

màu).

PHƢƠNG PHÁP TẠO GEL

Phương pháp tạo gel cho phép phát hiện hoặc xác định lượng nội độc tố dựa trên sự

tạo gel của thuốc thử lysat với nội độc tố. Nồng độ nội độc tố yêu cầu để tạo gel với

thuốc thử lysat trong điều kiện tiêu chuẩn là độ nhạy ghi trên nhãn của thuốc thử. Để đảm

bảo độ chính xác và giá trị của phép thử, phải tiến hành phép thử kiểm tra để khẳng định

độ nhạy ghi trên nhãn của thuốc thử lysat và kiểm tra các yếu tố ảnh hưởng theo hướng

dẫn dưới đây.

1, Chuẩn bị thử

- Kiểm tra độ nhạy của lysat

Độ nhạy của thuốc thử lysat ghi trên nhãn là nồng độ nội độc tố thấp nhất cần thiết

để tạo gel với thuốc thử trong điều kiện xác định.

Phép thử kiểm tra độ nhạy được thực hiện mỗi khi có lô thuốc thử mới hoặc khi có

sự thay đổi điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng tới kết quả của phép thử.

9

Tiến hành:

Chuẩn bị các dung dịch nội độc tố chuẩn với ít nhất 4 nồng độ tương đương 2 ; ;

1/2 và 1/4 bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước BET, mỗi nồng độ cần 4

ống. Trong đó là độ nhạy ghi trên nhãn của lysat muốn kiểm tra. Pha thuốc thử lysat

với nước BET theo hướng dẫn trên nhãn. Trộn một thể tích thuốc thử với đồng lượng

dung dịch chuẩn (thường dùng 0,1 ml) cho mỗi ống. Để các ống nghiệm có chứa hỗn hợp

phản ứng ở 37 1oC trong 60 2 phút, tránh bị rung động mạnh.

Đọc kết quả sau một khoảng thời gian qui định. Phản ứng dương tính nếu gel tạo

thành không bị chảy ra khi nhẹ nhàng dốc ngược ống nghiệm (180o). Phản ứng âm tính

khi không tạo thành gel hoặc gel không đủ chắc, rất dễ bị rã khi dốc ngược ống nghiệm.

Phép thử không có giá trị nếu bất kỳ ống nào của dung dịch chuẩn nội độc tố có

nồng độ thấp nhất (0,25 ) cho phản ứng dương tính. Khi đó, cần kiểm tra kỹ lại các điều

kiện thử nghiệm và lặp lại thí nghiệm.

“Điểm dừng” là ống cuối cùng có hệ số pha loãng lớn nhất trong dãy cho phản ứng

dương tính.

Độ nhạy của thuốc thử được biểu thị là trung bình nhân của nồng độ điểm dừng

(IU/ml), được tính như sau: tính giá trị trung bình của các logarit nồng độ nội độc tố tại

điểm dừng, sau đó lấy đối – logarit của giá trị trung bình.

Trung bình nhân nồng độ điểm dừng = anti log ( e/ f)

Trong đó: ( e = tổng các logarit nồng độ điểm dừng của mỗi dãy đã thử

f = số dãy chuẩn nội độc tố đã thử

Độ nhạy ghi trên nhãn của thuốc thử được khẳng định là đúng nếu trung bình nhân

nồng độ điểm dừng lớn hơn hoặc bằng 0,5 và nhỏ hơn hoặc bằng 2,0 .

Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng

Phép thử có ý nghĩa để kiểm tra xem trong mẫu thử có chứa các yếu tố làm tăng hay

ức chế phản ứng hay không. Khi có bất kỳ sự thay đổi điều kiện nào đó có thể ảnh hưởng

đến kết quả thử nghiệm, cần thực hiện phép thử này.

Chuẩn bị các dung dịch A, B, C và D theo như bảng 2. Các điều kiện thử nghiệm

như nhiệt độ, thời gian ủ và đánh giá kết quả tương tự như trong phần Kiểm tra độ nhạy

của lysat.

10

Trung bình nhân nồng độ điểm dừng của dung dịch B và C được xác định theo

hướng dẫn đã nêu trong phần Kiểm tra độ nhạy của lysat.

Bảng 2: Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng

Dung

dịch

Nồng độ nội độc tố

đƣợc thêm vào

mỗi dung dịch

Dung môi Hệ số

pha

loãng

Nồng độ nội

độc tố sau

khi pha loãng

Số ống

nghiệm

A 0/ dung dịch thử - - - 4

B 2 / dung dịch thử dung dịch

mẫu thử

1

2

4

8

2

1

0,5

0,25

4

4

4

4

C 2 / nước BET Nước

BET

1

2

4

8

2

1

0,5

0,25

2

2

2

2

D 0/ nước BET - - - 2

Dung dịch A (dung dịch thử): mẫu thử pha ở độ pha loãng ≤ MVD

Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): nội độc tố pha trong dung dịch thử để

kiểm tra yếu tố ảnh hưởng.

Dung dịch C (khẳng định độ nhạy của lysat): chuẩn nội độc tố pha trong nước BET với

nồng độ khác nhau.

Dung dịch D (đối chứng âm tính): nước BET

Phép thử có giá trị khi dung dịch A và D cho phản ứng âm tính và kết quả dung dịch

C khẳng định độ nhạy của thuốc thử.

Nếu độ nhạy của lysate tính theo dung dịch B lớn hơn 0,5 và nhỏ hơn 2,0 thì

mẫu thử không chứa yếu tố ảnh hưởng và phép kiểm tra yếu tố ảnh hưởng đạt yêu cầu. Nếu

không thoả mãn các yêu cầu trên thì mẫu thử có chứa yếu tố ảnh hưởng tới phép thử.

11

Nếu mẫu thử không đạt ở độ pha loãng nhỏ hơn MVD, làm lại phép thử với độ pha

loãng lớn hơn nhưng không quá MVD. Sử dụng thuốc thử có độ nhạy lớn hơn sẽ cho phép

mẫu thử được pha loãng nhiều hơn, khi đó có thể hạn chế được yếu tố ảnh hưởng. Ngoài

ra, có thể xử lý để loại các yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp thích hợp như lọc, trung

hoà, thẩm tách hoặc đun nóng. Để đảm bảo phương pháp xử lý đã chọn chắc chắn loại

được yếu tố ảnh hưởng mà không làm mất nội độc tố, cần thực hiện phép thử Kiểm tra yếu

tố ảnh hưởng với dung dịch thử sau khi xử lý và cho thêm chuẩn nội độc tố. Nếu phương

pháp có hiệu quả, cần ghi vào tiêu chuẩn.

2. Phép thử giới hạn

Dựa trên sự tạo gel của thuốc thử lysat với nội độc tố, phương pháp này kiểm tra xem

lượng nội độc tố có trong mẫu thử có lớn hơn giới hạn qui định hay không.

Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch A, B, C và D theo bảng 3, mỗi dung dịch 2 ống. Các

điều kiện thử nghiệm như nhiệt độ, thời gian ủ và đánh giá kết quả tương tự như trong

phần Kiểm tra độ nhạy của lysat.

Bảng 3:

Dung dịch Nồng độ nội độc tố thêm

vào cho mỗi dung dịch

Số ống nghiệm

A 0/ dung dịch thử 2

B 2 / dung dịch thử 2

C 2 / nước BET 2

D 0/ nước BET 2

Trong đó:

- Dung dịch A (dung dịch thử): mẫu thử pha ở độ pha loãng ≤ MVD

- Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): nội độc tố pha trong dung dịch

thử.

- Dung dịch C (đối chứng dương tính): chuẩn nội độc tố pha trong nước BET

- Dung dịch D (đối chứng âm tính): nước BET

Đánh giá kết quả:

12

Phép thử có giá trị nếu cả 2 ống của dung dịch B và C đều cho kết quả dương tính

và dung dịch D âm tính.

Mẫu thử đạt yêu cầu nếu kết quả âm tính ở cả hai ống nghiệm của dung dịch A.

Mẫu thử không đạt yêu cầu nếu kết quả dương tính trên cả hai ống nghiệm của dung

dịch A khi độ pha loãng bằng MVD.

Nếu hai ống của dung dịch A cho kết quả khác nhau, một ống dương tính và một

ống âm tính thì làm lại phép thử. Mẫu thử đạt yêu cầu nếu ở lần thử thứ hai cả hai ống

đều cho kết quả âm tính.

3. Phép thử bán định lƣợng

Phép thử này xác định lượng nội độc tố có trong dung dịch mẫu thử bằng cách thực

hiện phản ứng tiến dần tới điểm dừng trong quá trình tạo gel.

Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch A, B, C và D theo bảng 4, mỗi dung dịch 2 ống

nghiêm.

Dung dịch thử dùng cho dung dịch A và B phải không có chứa yếu tố ảnh hưởng.

Các điều kiện thử nghiệm như nhiệt độ, thời gian ủ và đánh giá kết quả tương tự như

trong phần Kiểm tra độ nhạy của lysat.

Bảng 4:

Dung

dịch

Nồng độ nội độc

tố đƣợc thêm vào

mỗi dung dịch

Dung môi Hệ số

pha

loãng

Nồng độ nội

độc tố sau

khi pha

loãng

Số ống

nghiệm

A 0/ dung dịch mẫu

thử

- 1

2

4

8

- 2

2

2

2

B 2 / dung dịch

mẫu thử

Dung dịch

mẫu thử

1 2

2

C 2 / nước BET Nước BET 1

2

2

1

2

2

13

4

8

0,5

0,25

2

2

D 0/ nước BET - - - 2

- Dung dịch A (dung dịch thử): dung dịch thử có độ pha loãng ≤ MVD, không có yếu

tố ảnh hưởng. Pha mẫu thử với nước BET theo các hệ số pha loãng 1/2, 1/4, 1/8 ...

Có thể pha loãng tiếp để có kết quả phù hợp nhưng hệ số pha loãng dung dịch thử

cuối cùng phải không quá MVD.

- Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): nội độc tố pha trong dung dịch A,

để kiểm tra yếu tố ức chế sự tạo gel.

- Dung dịch C (đối chứng dương tính): 2 dãy chuẩn nội độc tố pha trong nước BET

- Dung dịch D (đối chứng âm tính): dùng nước BET

Tính toán và đánh giá kết quả:

Phép thử có giá trị khi thoả mãn 3 điều kiện sau:

a, Cả 2 ống của dung dịch D đều âm tính (đối chứng âm tính)

b, Cả 2 ống của dung dịch B đều dương tính (đối chứng dương tính có mẫu thử).

c, Trung bình nhân nồng độ điểm dừng của dung dịch C nằm trong khoảng 0,5 - 2

Điểm dừng được xác định là ống nghiệm có hệ số pha loãng cao nhất trong dãy của

dung dịch A cho phản ứng dương tính, và nồng độ nội độc tố ở điểm dừng của dung dịch

A là tích số của độ pha loãng tại điểm đó nhân với hệ số .

Nồng độ nội độc tố trong dung dịch mẫu cần kiểm tra được xác định là trung bình

nhân nồng độ điểm dừng của các dãy thử, tính trung bình nồng độ nội độc tố của 2 dãy

(tương tự như phần Kiểm tra độ nhạy của lysat)

Nếu không có nồng độ nào của dung dịch A cho phản ứng dương tính, thì nồng độ

nội độc tố của dung dịch A nhỏ hơn x hệ số pha loãng thấp nhất của dung dịch A.

Nếu tất cả các độ pha loãng đều cho phản ứng dương tính, nồng độ nội độc tố của

dung dịch A là bằng hoặc lớn hơn tích của hệ số pha loãng lớn nhất của dung dịch A nhân

với .

14

Có thể pha loãng tiếp để tìm được điểm dừng. Tính nồng độ nội độc tố của mẫu thử

(EU/ ml, EU/ mg hoặc mEq hoặc EU/ đơn vị), dựa trên nồng độ nội độc tố trung bình của

dung dịch A. Mẫu thử đạt yêu cầu phép thử này nếu nồng độ nội độc tố có trong mẫu thử

thấp hơn giới hạn nội độc tố qui định trong chuyên luận riêng.

PHƢƠNG PHÁP ĐO QUANG

1. Phƣơng pháp đo độ đục

Phương pháp đo độ đục xác định lượng nội độc tố có trong dung dịch mẫu thử dựa

trên đo mức độ thay đổi độ đục trong quá trình tạo gel của thuốc thử lysat. Hiện nay có 2

kỹ thuật được áp dụng: đo độ đục tại điểm dừng hoặc đo độ đục động học.

Đo độ đục tại điểm dừng dựa trên sự tương quan giữa nồng độ nội độc tố và độ đục

của hỗn hợp phản ứng ở thời điểm xác định vào cuối của giai đoạn ủ.

Đo độ đục động học dựa trên sự tương quan giữa nồng độ nội độc tố và thời gian cần

thiết để đạt tới độ đục định trước của hỗn hợp phản ứng hoặc tốc độ tăng độ đục của hỗn

hợp.

Phép thử thường thực hiện ở 37 1oC, độ đục biểu thị bằng độ hấp thụ hay độ truyền

qua.

2. Phƣơng pháp đo màu

Phương pháp đo màu xác định nồng độ nội độc tố của các dung dịch mẫu thử dựa

trên đo chất màu được giải phóng ra từ một cơ chất mang màu do phản ứng của nội độc tố

với thuốc thử lysat.

Có 2 kỹ thuật đo: đo màu tại điểm dừng hoặc đo màu động học.

Đo màu tại điểm dừng dựa trên tương quan giữa nồng độ nội độc tố và đậm độ chất

màu tạo thành của hỗn hợp phản ứng ở điểm cuối của giai đoạn ủ.

Đo màu động học dựa trên mối tương quan định lượng giữa nồng độ nội độc tố và

thời gian cần thiết để hỗn hợp phản ứng đạt tới độ hấp thụ (hoặc độ truyền qua) định trước

hoặc tốc độ tăng màu của hỗn hợp.

Phép thử thường thực hiện ở 37 1oC.

3. Chuẩn bị:

15

Để đảm bảo độ đúng và giá trị của phương pháp đo màu hoặc đo độ đục, phải tiến

hành phép thử Kiểm tra đường chuẩn và Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng như sau:

- Kiểm tra đường chuẩn: Phép thử được thực hiện với mỗi lô thuốc thử lysat mới. Dùng

dung dịch nội độc tố chuẩn, pha ít nhất 3 nồng độ nội độc tố để tạo được đường chuẩn

trong khoảng nồng độ nội độc tố ghi trong hướng dẫn của thuốc thử lysat đang sử dụng.

Với mỗi nồng độ, phải dùng ít nhất 3 ống tuỳ theo điều kiện qui định cho thuốc thử lysat

đang dùng (về tỷ lệ thể tích, thời gian ủ, nhiệt độ, pH…). *

Giá trị tuyệt đối của hệ số tương quan [r], phải lớn hơn hoặc bằng 0,980 cho khoảng

nồng độ nội độc tố đã dùng.

Nếu phép thử không có giá trị, kiểm tra các điều kiện thử nghiệm và tiến hành lại như

trên.

Phép thử Kiểm tra đường chuẩn phải được thực hiện mỗi khi có thay đổi một điều

kiện nào đó có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

- Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng: Chọn nồng độ nội độc tố vào khoảng giữa của đường chuẩn.

Chuẩn bị dung dịch A, B, C và D theo bảng 5. Tiến hành phép thử với các dung dịch này

sau khi đã chuẩn hoá các điều kiện theo qui định của loại thuốc thử lysat sử dụng (về thể

tích, tỷ lệ thể tích dung dịch thử và thuốc thử lysat, thời gian ủ)

Phép thử Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng phải được thực hiện mỗi khi có sự thay đổi có thể ảnh

hưởng tới kết quả thử nghiệm.

Bảng 5:

Dung

dịch

Nồng độ nội độc tố

thêm vào mỗi dung

dịch

Dung dịch đƣợc

thêm nội độc tố

Số ống nghiệm

hoặc lỗ phản ứng

A 0 Dung dịch mẫu Không ít hơn 2

B Nồng độ ở khoảng

giữa của đường cong

chuẩn

Dung dịch mẫu Không ít hơn 2

C ít nhất 3 nồng độ Nước BET Mỗi nồng độ không

ít hơn 2

D 0 Nước BET Không ít hơn 2

16

- Dung dịch A (dung dịch thử): Dung dịch mẫu pha loãng không quá MVD

- Dung dịch B: Thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch mẫu thử để có nồng độ nội độc

tố vào khoảng đoạn giữa của đường cong chuẩn

- Dung dịch C (đối chứng dương tính): dung dịch chuẩn nội độc tố có nồng độ dùng

trong thẩm định phương pháp như mô tả trong phần Kiểm tra đường chuẩn.

- Dung dịch D (đối chứng âm tính): dùng nước BET

Phép thử chỉ có giá trị khi hệ số tương quan của đường chuẩn thu được từ dung dịch C

lớn hơn hoặc bằng 0,980

Dung dịch D phải cho kết quả không vượt quá giới hạn giá trị trắng theo qui định của

thuốc thử lysat đã dùng, hoặc thấp hơn giới hạn nội độc tố phát hiện của lysat đã dùng.

Khả năng tìm lại được lượng nội độc tố chuẩn thêm vào dung dịch B bằng hiệu số nồng

độ đã tìm thấy trong dung dịch B trừ đi nồng độ nội độc tố tìm được trong dung dịch A.

Nếu khả năng tìm lại lượng nội độc tố thêm vào nằm trong khoảng 50% - 200%, dung

dịch mẫu cần kiểm tra được coi là không có yếu tố ảnh hưởng.

Nếu nồng độ tìm lại được nằm ngoài khoảng qui định, dung dịch mẫu cần kiểm tra có

chứa yếu tố ảnh hưởng. Khi đó, cần xử lý để loại yếu tố ảnh hưởng bằng các phương

pháp thích hợp (như đã nêu trong phương pháp tạo gel). Sau đó, phải thực hiện đánh

giá lại xem phương pháp xử lý có loại được yếu tố ảnh hưởng không.

4. Xác định lƣợng nội độc tố trong mẫu thử

- Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch A, B, C và D theo như bảng 5, và theo qui trình như đã

mô tả trong phần Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng.

- Tính nồng độ nội độc tố

Tính nồng độ nội độc tố trong mỗi ống của dung dịch A theo đường chuẩn thu được từ

dung dịch C. Phép thử không có giá trị trừ khi thoả mãn các yêu cầu sau:

1. Giá trị tuyệt đối của hệ số tương quan của đường chuẩn theo dung dịch C lớn hơn

hoặc bằng 0,980

2. Lượng nội độc tố tìm lại được, tức là hiệu số nồng độ nội độc tố tìm lại được trong

dung dịch B trừ đi nồng độ nội độc tố trong dung dịch A, phải nằm trong khoảng 50% -

200%.

17

Kết quả của dung dịch D không vượt quá giới hạn giá trị trắng của thuốc thử lysat đã

dùng, hoặc phải thấp hơn giới hạn nội độc tố phát hiện của lysat đã dùng.

Đánh giá kết quả:

Mẫu thử đạt phép thử nội độc tố vi khuẩn nếu nồng độ nội độc tố của mẫu thử tính từ

nồng độ nội độc tố trung bình của các ống dung dịch A thấp hơn giới hạn nội độc tố qui

định trong chuyên luận riêng.

* Nếu tỷ số giá trị logarit đáp ứng giữa nồng độ cao nhất so với nồng độ thấp nhất trong

khoảng khảo sát lớn hơn 2, thì nên thêm một số nồng độ để thu được đường chuẩn có

khoảng cách giữa các giá trị log phù hợp.

18

Bài 3. PHÉP THỬ CÁC CHẤT HẠ ÁP

Thử các chất hạ áp là phương pháp sinh học dựa vào tác dụng hạ huyết áp của

thuốc đem thử trên mèo đã được gây mê so với hoạt lực của thuốc histamin chuẩn.

Chuẩn bị thí nghiệm

Động vật: Mèo khoẻ mạnh, trưởng thành, đực hoặc cái (không mang thai), cân nặng từ

1,8 kg trở lên.

Nước muối heparin: Dung dịch chứa 50 đơn vị heparin trong 1ml dung dịch natri clorid

0,9% dùng để chống đông máu. Có thể dùng một dung dịch chống đông thích hợp thay

thế.

Dung dịch histamin chuẩn: Dùng histamin dihydroclorid hoặc histamin hydrophosphat bảo

quản trong lọ kín, làm khô bằng silicagel 2 giờ trước khi cân. Hoà tan trong nước cất một

lượng histamin đã được cân chính xác, sau đó pha loãng bằng dung dịch natri clo rid 0,9%

đã tiệt khuẩn thành dung dịch có nồng độ 0,1 g/ml tính theo histamin base.

Mẫu thử: Pha theo từng chuyên luận tương ứng trong dung dịch natri clorid 0,9% đã tiệt

khuẩn hoặc trong dung môi thích hợp, đến nồng độ cần thiết.

Tiến hành

Mèo được gây mê bằng cloralose hoặc một loại barbiturat thích hợp như phenobarbital

v.v. để duy trì được huyết áp đồng đều trong suốt thời gian thí nghiệm. Cố định động vật

trên bàn mổ, cần làm nhẹ nhàng sao cho mèo không bị kích thích. Có biện pháp giữ để

thân nhiệt mèo không giảm quá giới hạn sinh lý bằng đèn hoặc lò sưởi. Thông khí quản

bằng một canun thuỷ tinh. Bộc lộ động mạch cảnh, lồng canun có chứa đầy nước muối

heparin (hoặc dung dịch chống đông khác) vào động mạch cảnh. Nối canun với huyết áp

kế thuỷ ngân hoặc một thiết bị ghi huyết áp khác đạt yêu cầu về độ nhạy. Bộc lộ tĩnh

mạch đùi, luồn vào đó một kim tiêm đầu tù có chứa nước muối heparin, buộc cố định lại

để tiêm mẫu thử hoặc histamin chuẩn.

Xác định độ nhạy của động vật với histamin bằng cách tiêm tĩnh mạch các liều 1 ml (0,1 g

và 1,5 ml (0,15 g) dung dịch histamin chuẩn cho mỗi kg thể trọng. Khoảng cách thời

gian giữa các lần tiêm ít nhất là 1 phút sau khi huyết áp đã trở lại mức bình thường. Bình

thường một liều histamin 0,1 g/kg thể trọng mèo làm huyết áp hạ khoảng 20 mmHg. Lặp

lại liều thấp histamin chuẩn (1 ml/ kg) ít nhất 2 lần. Động vật được dùng vào thí nghiệm

19

khi sự giảm huyết áp là hằng định ở các liều 1 ml/ kg và với liều 1,5 ml/ kg phải có độ hạ

áp lớn hơn.

Sau khi đã đạt yêu cầu thử độ nhạy với histamin, tiêm tĩnh mạch cho mỗi kg mèo 1 ml

dung dịch histamin chuẩn. Tiếp theo tiêm 2 liều liên tục của mẫu thử theo chỉ dẫn của

từng chuyên luận và cuối cùng lại tiêm dung dịch histamin chuẩn với liều 1 ml/ kg. Thời

gian giữa các lần tiêm là hằng định như đã nêu ở trên. Nhắc lại chuỗi tiêm như trên một

lần nữa và kết thúc bằng 1,5 ml dung dịch histamin chuẩn cho 1 kg mèo.

Đánh giá kết quả

a. Nếu độ hạ áp của dung dịch histamin chuẩn liều 1,5 ml/ kg không lớn hơn liều 1 ml/ kg

thì thí nghiệm không có giá trị.

b. Chế phẩm đạt yêu cầu về thử các chất hạ áp nếu đạt cả 2 điều kiện sau:

Giá trị trung bình của các độ hạ áp khi tiêm mẫu thử không lớn hơn giá trị trung bình của các

độ hạ áp khi tiêm dung dịch histamin chuẩn liều 1 ml/ kg thể trọng mèo.

Mức hạ áp của mỗi lần tiêm mẫu thử đều không cao hơn mức hạ áp của dung dịch

histamin chuẩn liều kết thúc 1,5 ml/kg.

c. Chế phẩm không đạt yêu cầu nếu một trong 2 điều kiện trên không đạt.

Chú ý: Động vật không được dùng để thử tác dụng hạ áp nữa nếu trong quá trình thử, đã

có lần mẫu thử gây hạ áp lớn hơn mức hạ áp do liều kết thúc 1,5 ml dung dịch histamin

chuẩn cho 1 kg mèo, hoặc giá trị hạ áp của dung dịch histamin chuẩn ở liều kết thúc 1,5 ml/

kg nhỏ hơn giá trị trung bình của các liều 1 ml/ kg đã tiêm trước đó .

20

Bài 4. PHÉP THỬ CHẤT GÂY SỐT

Phép thử được xác định bằng cách đo sự tăng thân nhiệt thỏ sau khi tiêm tĩnh mạch dung

dịch vô khuẩn của chất cần kiểm tra.

Lựa chọn động vật thí nghiệm

Dùng thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 giống, cân nặng không dưới 1,5kg, nuôi dưỡng

bằng thức ăn không có chứa kháng sinh và thỏ không có dấu hiệu giảm cân trong quá

trình thử nghiệm. Không dùng để thử nghiệm nếu:

(a) Thỏ mới được dùng thử chất gây sốt có kết quả âm tính trong vòng 3 ngày trước đó,

hoặc

(b) Thỏ đã được dùng thử chất gây sốt có kết quả dương tính trong vòng 3 tuần.

Khu vực lƣu giữ động vật

Thỏ được nuôi giữ riêng từng con trong khu vực yên tĩnh, có nhiệt độ ổn định. Cho thỏ

nhịn ăn từ đêm trước khi thử, không cho uống nước trong quá trình thử. Tiến hành phép

thử trong phòng yên tĩnh, không có tiềng ồn, nhiệt độ phòng chênh lệch không quá 3oC

so với khu vực nuôi giữ, hoặc thỏ phải được lưu giữ ở điều kiện phòng thí nghiệm trong

khoảng ít nhất 18 giờ trước khi thử nghiệm.

Dụng cụ, bơm và kim tiêm: Tất cả các dụng cụ, bơm và kim tiêm phải được rửa sạch và

tráng nước cất, sấy ở nhiệt độ 250oC trong 30 phút hoặc 200

oC trong 1 giờ.

Hộp/ giá giữ thỏ: Các hộp/ giá giữ thỏ cho trường hợp đo nhiệt độ bằng thiết bị điện

được thiết kế để giữ ở cổ con vật nhưng không được chật quá, phần cơ thể còn lại được

thoải mái để thỏ có thể ngồi ở tư thế bình thường. Không giữ thỏ bằng các loại kẹp hoặc

giá có thể gây đau hoặc khó chịu cho con vật. Thỏ phải được cho vào hộp hoặc giá ít nhất

1 giờ trước khi thử và giữ ở đó trong suốt quá trình thử nghiệm.

Nhiệt kế: Nhiệt kế hoặc thiết bị điện dùng để ghi nhiệt độ có độ chính xác 0,1oC và được

đưa vào trực tràng của thỏ với độ sâu 5cm. Độ sâu của nhiệt kế trong trực tràng phải

giống nhau giữa các thỏ. Nếu dùng thiết bị điện, đầu đo nhiệt độ phải được đặt trong trực

tràng trong suốt quá trình thử.

21

Thử nghiệm sơ bộ

Chỉ nên tiến hành thử sơ bộ với những thỏ lần đầu tiên được dùng thử chất gây sốt.

Trong vòng một đến 3 ngày trước khi kiểm tra mẫu thử, tiêm tĩnh mạch tai 10ml/ kg thỏ

dung dịch natri clorid 0,9% không có chất gây sốt, đã làm ấm đến khoảng 38o5 trước khi

tiêm. Ghi nhiệt độ thỏ, bắt đầu ít nhất 90 phút trước khi tiêm và tiếp tục trong 3 giờ sau

khi tiêm. Không dùng những thỏ có nhiệt độ thay đổi quá 0,6oC vào thử nghiệm chính

thức.

Thử nghiệm chính thức

Mỗi mẫu được thử trên một nhóm 3 thỏ.

Chuẩn bị và tiêm mẫu thử: Mẫu thử có thể được hòa tan trong một dung môi không có

chất gây sốt, dung dịch natri clorid 0,9% hoặc một chất lỏng được qui định trong chuyên

luận riêng. Làm ấm dung dịch thử lên khoảng 38o5 trước khi tiêm. Tiêm chậm dung dịch

thử vào tĩnh mạch tai thỏ trong khoảng thời gian không quá 4 phút, trừ khi có chỉ dẫn gì

khác trong chuyên luận riêng. Lượng mẫu thử được tiêm sẽ thay đổi tùy theo chế phẩm

cần kiểm tra và được qui định trong chuyên luận riêng. Thể tích tiêm trong khoảng 0,5 –

10ml/ kg thể trọng thỏ.

Theo dõi nhiệt độ và xác định đáp ứng

Ghi nhiệt độ thỏ 30 phút một lần, ít nhất 90 phút trước khi tiêm và tiếp tục 3 giờ sau khi

tiêm. Theo dõi nhiệt độ trước khi tiêm, không dùng vào thử nghiệm nếu:

- Thỏ có chênh lệch nhiệt độ ≥ 0,2oC giữa 2 lần ghi liên tiếp, hoặc

- Thỏ có nhiệt độ ban đầu cao hơn 39o8 hoặc thấp hơn 38

oC, hoặc

- Nhiệt độ của 3 thỏ trong cùng nhóm khác nhau quá 1oC.

“Nhiệt độ ban đầu” của mỗi thỏ là trung bình của 2 giá trị nhiệt độ ghi được cách nhau 30

phút, xác định trong khoảng 40 phút ngay trước khi tiêm dung dịch thử. “Nhiệt độ tối đa”

của mỗi thỏ là nhiệt độ cao nhất ghi được cho thỏ đó trong vòng 3 giờ sau khi tiêm.

Chênh lệch giữa “nhiệt độ ban đầu” và “nhiệt độ cao nhất” được gọi là đáp ứng. Khi

chênh lệch là âm, kết quả được coi là đáp ứng bằng 0.

Đánh giá kết quả:

Đầu tiên thử trên một nhóm 3 thỏ, tùy thuộc vào kết quả thu được, thử thêm lần lượt từng

nhóm 3 thỏ khác cho đến khi tổng cộng 4 nhóm, nếu cần. Nếu tổng đáp ứng của nhóm

đầu tiên không vượt quá số ghi trong cột 2 của bảng dưới đây, thì mẫu thử đạt yêu cầu.

22

Nếu tổng đáp ứng vượt quá số ghi trong cột 2 nhưng không vượt quá số ghi trong cột 3

thì lặp lại phép thử trên nhóm khác như đã nêu ở trên. Nếu tổng các đáp ứng lớn hơn số

ghi trong cột 3 thì mẫu thử không đạt yêu cầu.

Số thỏ Mẫu thử đạt nếu tổng đáp ứng

không vượt quá

Mẫu thử không đạt nếu tổng

đáp ứng vượt quá

3 1,15 2,65

6 2,80 4,30

9 4,45 5,95

12 6,60 6,60

Những thỏ có nhiệt độ tăng cao quá 1,2oC thì loại và không bao giờ dùng lại cho phép

thử chất gây sốt.

23

Bài 5. THỬ ĐỘC TÍNH BẤT THƢỜNG

Độc tính bất thường của thuốc được xác định bằng cách theo dõi số chuột sống và chết

trong thời gian 48 giờ sau khi cho chuột một liều thuốc qua đường dùng theo qui định.

Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, cân nặng 18 - 22 g, chưa dùng vào thí nghiệm, nếu là chuột

cái phải không có thai hoặc đang cho con bú, được chăn nuôi trong điều kiện bình thường

Chuẩn bị dung dịch thử

Nếu không có hướng dẫn gì khác, chuẩn bị dung dịch thử bằng cách hoà tan mẫu thử

trong dung dịch natri clorid 0,9% hoặc nước cất tiêm (nếu thử theo đường tiêm) hoặc

phân tán đều mẫu thử trong nước cất (nếu thử theo đường uống) để thu được dung dịch

hoặc hỗn dịch có chứa lượng chất cần thử phù hợp với mức liều qui định trong chuyên

luận riêng.

Tiến hành thử

Dùng 5 chuột, cho mỗi con 0,5 ml dung dịch thử bằng một trong những đường dùng sau:

Tiêm tĩnh mạch : Tiêm vào tĩnh mạch đuôi của mỗi chuột với tốc độ hằng định trong 15 -

30 giây.

Tiêm trong màng bụng: Tiêm qua lớp da bụng vào thẳng hốc bụng chuột.

Tiêm dưới da: Tiêm dưới da vào một chỗ ở lưng hoặc bụng.

Uống: Cho uống bằng một kim cong đầu tù hoặc một dụng cụ khác thích hợp, phải đảm

bảo đưa thuốc vào trong thực quản hoặc dạ dày.

Đánh giá kết quả

Nếu không có hướng dẫn gì khác thì quan sát chuột 48 giờ sau khi dùng thuốc.

Nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu.

Nếu có chuột chết, làm lại thử nghiệm với 10 chuột khác, dùng chuột có thể trọng 19 1 g.

Sau 48 giờ, nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu.

24

Bài 6. THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN

Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả

năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc.

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý

không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử.

Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm

của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất.

Thử nghiệm sơ bộ

Tìm chất ức chế có trong thuốc:

Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc cản

trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểm tra trước bằng

cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào môi trường chọn lọc

cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào

đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH 7,2 ít nhất tới

10-3

các vi khuẩn tương ứng. Nếu vi khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng

cách:

1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường.

2. Cho vào môi trường một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp.

3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được.

Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường để trung hoà

chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4 %.

Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra đã được

trung hoà.

Môi trƣờng

Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môi trường khô do

các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi trường tự pha chế phải hấp

tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115oC trong 30 phút trừ khi có những chỉ dẫn riêng đối

với loại môi trường đặc biệt.

Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15%. Nước và các chất dùng trong

các công thức phải tinh khiết.

25

Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat

Casein pancreatic

Lecithin đậu tương

Polysorbat 20

Nước

20,0 g

5,0 g

40,0 ml

960 ml

Hoà tan casein pancreatic và lecithin đậu tương vào 960 ml nước, đun cách thuỷ ở 48 -

50oC khoảng 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn đều, phân chia

vào các dụng cụ thích hợp.

Môi trường thạch casein đậu tương

Casein pancreatic

Natri clorid

Thạch

Bột đậu tương thủy phân bởi

papain

Nước

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2

15,0 g

5,0 g

15,0 g

5,0 g

1000 ml

Môi trường lỏng casein đậu tương

Casein pancreatic

Dikali hydrophosphat

Bột đậu tương thuỷ phân bởi

papain

Glucose

Natri clorid

Nước

17,0 g

2,5 g

3,0 g

2,5 g

5,0 g

1000 ml

Hoà tan các chất rắn vào nước đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở

nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn:7,3

+ 0,2.

Môi trường thạch muối - manitol

26

Casein pancreatic

Thạch

Pepton

Cao thịt

Natri clorid

D - Manitol

Đỏ phenol

Nước

5,0 g

15,0 g

5,0 g

1,0 g

75,0 g

10,0 g

0,025 g

1000 ml

Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn, pH sau khi tiệt

khuẩn : 7,4 + 0,2.

Môi trường thạch Baird - Parker

Casein pancreatic

Cao thịt

Cao men bia

Lithi clorid

Thạch

Glycin

Natri pyruvat

Nước

10,0 g

5,0 g

1,0 g

5,0 g

20,0 g

12,0 g

10,0 g

950 ml

Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1 phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 - 50oC, thêm

10 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng. Trộn kỹ, nhẹ

nhàng rót vào các hộp.

Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách: Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng, đập vỡ

vô khuẩn quả trứng, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn. Thêm nước muối

vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so với nước muối là 3/7. Bỏ vào một cốc khuấy vô

khuẩn, trộn với tốc độ lớn trong 5 phút.

pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 + 0,2.

Môi trường thạch Vogel – Johnson

Casein pancreatic 10,0 g

27

Cao men bia

Manitol

Natri pyruvat

Thạch

Glycin

Lithi clorid

Dikali hydrophosphat

Đỏ phenol

Nước

5,0 g

10,0 g

10,0 g

16,0 g

10,0 g

5,0 g

5,0 g

25,0 mg

1000 ml

Đun sôi để hoà tan các chất rắn trong khoảng 1 phút. Tiệt khuẩn, để nguội đến 45 - 500C.

Thêm 20 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn.

pH sau khi tiệt khuẩn 7,2 + 0,2.

Môi trường thạch cetrimid

Gelatin pancreatic

Cetrimid (Cetyl trimethylamoni

bromid)

Magnesi clorid

Thạch

Glycerin

Nước

20,0 g

0,3 g

1,4 g

13,6 g

10,0 ml

1000 ml

Hoà tan tất cả các chất rắn vào trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi

1 phút cho tan hoàn toàn.

pH sau khi tiệt khuẩn : 7,2 + 0,2

Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Fluorescin

Casein pancreatic

Peton

Dikali hydrophosphat khan

Magnesi sulfat (MgSO4.7H2O)

Thạch

Glycerin

10,0 g

10,0 g

1,5 g

1,5 g

15,0 g

10,0 ml

28

Nước 1000 ml

Hoà tan tất cả các chất rắn vào nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun

sôi 1 phút cho tan hoàn toàn.

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2.

Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin

Gelatin pancreatic

Kali sunfat khan

Thạch

Magnesi clorid khan

Glycerin

Nước

20,0 g

10,0 g

15,0 g

1,4 g

10,0 ml

1000 ml

Hoà tan các chất rắn trong nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi

khoảng 1 phút để tan hoàn toàn.

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2.

Môi trường lỏng lactose

Cao thịt

Lactose

Gelatin pancreatic

Nước

3,0 g

5,0 g

5,0 g

1000 ml

Làm lạnh rất nhanh môi trường sau khi tiệt khuẩn.

pH sau khi tiệt khuẩn : 6,9 + 0,2

Môi trường lỏng selenit - cystin

Casein pancreatic

Natri selenit acid

Dinatri phosphat

Lactose

L- Cystin

Nước

5,0 g

4,0 g

10,0 g

4,0 g

10,0 mg

1000 ml

Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút nữa. Không cần tiệt khuẩn tiếp theo.

29

pH sau khi tiệt khuẩn : 7,0 +0,2

Môi trường lỏng tetrathionat

Casein pancreatic

Calci carbonat

Muối mật

Pepton

Natri thiosulfat

Nước

2,5 g

10,0 g

1,0 g

2,5 g

30,0 g

1000 ml

Đun nóng để hoà tan các chất rắn. Khi sử dụng thêm vào môi trường dung dịch gồm: 5,0

g kali iodid và 6,0 g iod trong 20 ml nước. Sau đó thêm 10ml dung dịch xanh brilliant

1% và trộn đều. Không đun nóng môi trường sau khi thêm dung dịch xanh brilliant.

Môi trường thạch xanh brilliant

Pepton

Đường trắng

Cao men bia

Casein pancreatic

Lactose

Natri clorid

Thạch

Đỏ phenol

Xanh brilliant

Nước

5,0 g

10,0 g

3,0 g

5,0 g

10,0 g

5,0 g

20,0 g

80,0 mg

12,5 mg

1000

ml

Đun sôi để hoà tan tất cả các chất rắn trong 1 phút. Chỉ tiệt khuẩn trước khi dùng. Rót

vào các hộp Petri và để nguội.

pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 +0,2

Môi trường thạch xylose - lysin - desoxycholat

Xylose

Đỏ phenol

3,5 g

0,08 g

30

L-Lysin

Thạch

Lactose

Natri desoxycholat

Đường trắng

Natri thiosulfat

Natri clorid

Săt (III) amoni citrat

Cao men bia

Nước

5,0 g

13,5 g

7,5 g

2,5 g

7,5 g

6,8 g

5,0 g

0,8 g

3,0 g

1000 ml

Đun nóng, lắc tròn để trộn đều chất rắn với nước. Chú ý không để nóng quá. Chuyển

ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50oC. Rót vào các đĩa ngay trước khi môi

trường nguội hoàn toàn.

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 + 0,2

Môi trường thạch bismuth sulfit

Cao thịt

Sắt (II) sulfat

Casein pancreatic

Bismuth sulfit

Pepton

Thạch

Glucose

Xanh brilliant

Dinatri hydrophosphat

Nước

5,0 g

0,3 g

5,0 g

8,0 g

5,0 g

20,0 g

5,0 g

25,0

mg

4,0 g

1000

ml

Đun nóng, lắc tròn để hoà đều các chất rắn với nước, không để nóng quá. Chuyển ngay

vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 500C. Rót vào các đĩa để nguội.

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,6 + 0,2

Môi trường thạch - sắt - ba đường

31

Casein pancreatic

Sắt (II) amoni sulfat

Pepton

Natri clorid

Lactose

Natri thiosulfat

Đường trắng

Thạch

D-Glucose monohydrat

Đỏ phenol

Nước

10,0 g

0,2 g

20,0 g

5,0 g

10,0 g

0,3 g

10,0 g

13,0 g

1,0 g

0,025 g

1000 ml

Hoà nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. Chuyển vào các

dụng cụ thích hợp để tiệt khuẩn.

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2

Môi trường Mac - Conkey

Casein pancreatic

Natri clorid

Gelatin pancreatic

Thạch

Pepton

Lactose

Muối mật

Đỏ trung tính

Tím tinh thể

Nước

1,5 g

5,0 g

17,0 g

13,5 g

1,5 g

10,0 g

1,5 g

30,0 mg

1,0 mg

1000 ml

Hoà nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn.

pH sau khi tiệt khuẩn : 7,1 + 0,2

Môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen

32

Gelatin pancreatic

Dikali hydrophosphat

Thạch

Lactose

Eosin

Xanh methylen

Nước

10,0 g

2,0 g

15,0 g

10,0 g

0,4 g

0,065 g

1000 ml

Hoà tan nóng các thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat và thạch trong

nước, để lạnh. Các thành phần còn lại chỉ thêm vào khi sử dụng bằng cách đun chảy môi

trường rồi thêm vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trường thêm 5 ml dung dịch lactose (1:5) ,

2 ml dung dịch eosin và 2 ml dung dịch xanh methylen (1:300). Môi trường sau khi hoà

trộn phải trong.

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 + 0,2

Môi trường thạch Sabouraud

Glucosa

Casein pancreatic

Pepton

Thạch

Nước

40,0 g

5,0 g

5,0 g

15,0 g

1000 ml

Hoà tan, đun sôi cho tan hoàn toàn.

pH sau khi tiệt khuẩn : 5,6 + 0,2

Môi trường thạch - khoai tây - glucose

Nấu 300 g khoai tây đã bóc vỏ và thái nhỏ trong 500 ml nước cất, lọc qua vải, thêm nước

cất để được 1000 ml, rồi thêm vào các thành phần sau: thạch 15 g; glucose 20 g. Hoà tan

nóng. Tiệt khuẩn. Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45oC. Điều chỉnh môi trường

bằng dung dịch acid tartric (1:10) đến pH 3,5 + 0,1. Rót vào các đĩa.

Chú ý:

Không dùng môi trường đun nóng trở lại lần thứ 2

33

Để ức chế vi khuẩn thường gặp mọc trên môi trường phát hiện nấm, mốc và men (môi

trường Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây- glucose) thêm vào một lít môi

trường 0,1g tetracyclin hoặc 50 mg cloramphenicol, làm đều ngay trước khi dùng.

Dung dịch đệm Natri clorid – pepton pH 7,0

Kali dihydro phosphat 3,56 g

Natri hydro phosphat 7,23 g

Natri clorid 4,30 g

Pepton 1,00 g

Nước cất 1000 ml

Có thể thêm chất hoạt động bề mặt hoặc chất khử tác dụng kháng khuẩn vào dung dịch

này như Polysorbat 80 0,1 đến 1,0%.

Hấp tiệt trựng 1210C trong 15 phỳt.

Môi trường nước thịt

Cao thịt 5,0 g

Nước 1000 ml

Môi trường thạch thường

Pepton

Natri clorid

Thạch

Nước

pH sau khi tiệt khuẩn

10,0 g

5,0 g

15 - 20 g

1000 ml

7,4 + 0,2

Môi trường pepton - natri clorid

Pepton

Natri clorid

Nước

pH sau khi tiệt khuẩn

10,0 g

5,0 g

1000 ml

7,0 + 0,2

Môi trường tăng sinh cho Clostridia

Cao thịt 10,0 g

34

Pepton

Cao men bia

Tinh bột dẽ tan

Glucose monohydrat

Cystein hydroclorid

Natri clorid

Natri acetat

Thạch

Nước cất

10,0 g

3,0 g

1,0 g

5,0 g

0,5 g

5,0 g

3,0 g

0,5 g

1000 ml

Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Hấp tiệt khuẩn 121oC trong

15 phút. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 6,8.

Môi trường thạch Columbia

Casein pancreatic

Thịt

Dịch tim pancreatic

Cao men bia

Tinh bột ngô

Natri clorid

Thạch bột

Nước cất

10,0 g

5,0 g

3,0 g

5,0 g

1,0 g

5,0 g

15,0 g

1000 ml

Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Nếu cần điều chỉnh pH

sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 + 0,2. Hấp tiệt khuẩn 121oC trong 15 phút. Làm

lạnh tới 45oC đến 50

oC. Khi cần có thể thêm 20 mg gentamycin base và rót vào các hộp

Petri.

Môi trường sulfit - lactose

Casein pancreatic

Cao men bia

Cystein hydroclorid

Natri clorid

Lactose

5,0 g

2,5 g

0,3 g

2,5 g

10,0 g

35

Nước cất 1000 ml

Hoà tan tất cả các thành phần trong nước và điều chỉnh để có pH 7,1 + 0,1. Đóng vào các

ống nghiệm 16 x 160 mm mỗi ống 8 ml và một ống nhỏ Durham. Hấp tiệt khuẩn 121oC

trong 15 phút. Bảo quản ở 4oC.

Môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel

Genlatin pancreatic

D-Glucose monohydrat

Mật bò khô

Kali dihydrophosphat

Dinatri hydrophosphat

Xanh brilliant

Nước cất

10,0 g

5,0 g

20,0 g

2,0 g

8,0 g

15 mg

1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,0 - 7,4. Đun sôi trong 30 phút và làm lạnh ngay.

Môi trường muối mật violet - red

Cao men bia

Gelatin pancreatic

Muối mật

Lactose

Natri clorid

D-Glucose monohydrat

Đỏ trung tính

Tím tinh thể

Thạch

Nước cất

3,0 g

7,0 g

1,5 g

10,0 g

5,0 g

10,0 g

30 mg

2 mg

15.0 g

1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 - 7,6. Môi trường được đun sôi để tiệt trùng

nhưng không được hấp tiệt trùng.

Chuẩn bị thí nghiệm

Lấy mẫu:

36

Đối với các thử nghiệm dưới đây, mỗi thử nghiệm lấy 10ml hoặc 10g chế phẩm.

Cách thử nghiệm:

Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực hiện đầy đủ các thử nghiệm

sau:

Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn, nấm mốc có

trong 1g hoặc 1ml chế phẩm.

Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau:

Staphylococcus aureus

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella

Escherichia coli

Chuẩn bị mẫu

Chế phẩm mang thử nghiệm trong quá trình hoà tan hoặc nhũ hoá phải đảm bảo không

làm thay đổi chủng loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thuốc. Để có một dung dịch hoặc

nhũ dịch thích hợp cho thử nghiệm, tiến hành như sau:

Đối với chế phẩm rắn, hoà tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trong bình với dung

môi hoặc chất nhũ hoá thích hợp.

Đối với chế phẩm ở dạng lỏng như dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất rắn hòa tan

dễ dàng và hoàn toàn trong nước..., dùng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch

natri clorid 0,9% để hoà loãng.

Những chế phẩm lỏng không thể hoà lẫn trong nước như dầu, kem hoặc sáp: Chế tạo nhũ

dịch bằng cách thêm một lượng vừa đủ tác nhân nhũ hoá vô khuẩn thích hợp như các loại

polysorbat. Dùng phương pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thời làm ấm bằng nhiệt

nhưng không được vượt quá 45oC để có nhũ dịch chế phẩm đồng nhất.

Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hoá lỏng rồi mở nắp để

lấy một lượng thích hợp mang thử.

Tiến hành

Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí:

Đối với chế phẩm hoà tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương pháp đĩa

thạch. Còn các chế phẩm khác dùng phương pháp hoà loãng trong ống nghiệm.

37

Hoà tan hoặc làm nhũ hoá 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 ml dung dịch đệm

phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng loại chế phẩm, để được

dung dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10. Đối với những chế phẩm dạng nhầy

không thể lấy chính xác bằng pipet ở tỷ lệ 1/10, có thể pha loãng tiếp để lấy được chính

xác, nghĩa là có thể pha loãng đến tỷ lệ 1/50 hoặc 1/100 v.v...

Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trước khi xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí.

Chế phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trường nuôi cấy mà không được để quá 1

giờ.

Dung dịch đệm pH 7,2: Hoà 34g kali dihydrophosphat (KH2PO4) vào khoảng 500 ml

nước cất trong bình định mức 1000 ml. Điều chỉnh pH tới 7,2 + 0,1 bằng cách thêm dung

dịch natri hydroxyd 2%. Thêm nước cất tới vạch. Trộn đều, phân chia vào các bình, tiệt

khuẩn, bảo quản ở lạnh. Khi dùng, hoà loãng với nước cất theo tỷ lệ 1: 800 và tiệt khuẩn.

a) Phương pháp đĩa thạch

Hoà loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong một hộp

Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có độ pha loãng

cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 - 20 ml môi trường

thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy và để nguội đến 45oC.

Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó để yên cho thạch đông cứng ở

nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang ủ ở 35oC từ 24 - 48 h. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi

khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc. Lấy giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn

nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn hơn 300 và tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1g

hoặc 1ml chế phẩm. Nếu thấy không có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết

luận chế phẩm có ít hơn 10 khuẩn lạc trong 1 g hoặc 1 ml.

b) Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm

Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thường, mỗi ống 9,0 ml môi trường lỏng casein đậu

tương. Lấy một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống. Dùng một lô 3 ống để kiểm tra.

Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống A) 1 g (hoặc1 ml) chế phẩm và trộn

đều.

Thêm vào lô 2 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống B) 1 ml dung dịch lấy từ ống A và trộn

đều.

Thêm vào lô 3 gồm 3 ống, mỗi ống 1 ml dung dịch lấy từ ống B và trộn đều.

38

Bỏ không sử dụng ống A và ống B.

Theo cách pha trên có lô 1, lô 2, lô 3, tương ứng với lượng chế phẩm là: 100; 10; và 1 mg

hoặc l trong mỗi ống. Đậy kín các ống mang ủ ở 32 - 35oC trong 24 giờ, quan sát vi

khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với bảng 1 để biết số lượng vi

khuẩn có trong 1 g hoặc 1ml chế phẩm.

Bảng 1: Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm.

Số mg (hoặc l) chế phẩm cho mỗi ống

100 10 1 Số lượng vi khuẩn lớn

nhất có thể có trong 1 g

hoặc 1 ml

Số

ốn

g c

ó v

i k

hu

ẩn

mọ

c

Số

ốn

g

có

vi

kh

uẩn

mọ

c

3

3

3

3

3

3

3

3

3

2

1

0

>1100

1100

500

200

3

3

3

3

2

2

2

2

3

2

1

0

290

210

150

90

3

3

3

3

1

1

1

1

3

2

1

0

160

120

70

40

3

3

3

3

0

0

0

0

3

2

1

0

95

60

40

23

c)Phương pháp màng lọc:

Dùng các màng lọc có kích thước lỗ lọc không lớn hơn 0,45 µm, có khả năng giữ lại các

vi khuẩn cần kiểm tra. Chọn loại màng lọc làm bằng nguyên liệu giữ lại vi khuẩn nhưng

không ảnh hưởng đến mẫu thử. Thí dụ có thể dùng màng Cellulose nitrat để lọc các dung

39

dịch nước, dầu và cồn thấp độ. Dùng màng cellulose acetat để lọc dung dịch cồn cao độ.

Dùng hệ thống lọc có thiết kế cho phép chuyển được màng lọc vào môi trường nuôi cấy.

Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đó pha theo mục “Chuẩn bị mẫu”, (Tốt

nhất là lấy một lượng dung dịch mẫu đó chuẩn bị tương đương với 1g hoặc 1ml mẫu cần

thử; nếu lượng vi khuẩn có nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng dung dịch mẫu ít hơn).

Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung dịch mẫu thử đó chuẩn bị phải lọc ngay qua màng.

Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần khoảng 100ml dung dịch thớch hợp như dung dịch đệm natri

clorid – pepton pH 7,0. Khi cần cú thể thờm chất hoạt động bề mặt như polysorbat 80

hoặc cỏc chất khử hoạt tớnh của cỏc chất khỏng khuẩn vào dung dịch dùng để rửa. Cũng

có thể rửa màng với số lần ít hơn, nếu thấy đủ loại hết thuốc và tác nhân ảnh hưởng đến

kết quả thử nghiệm khỏi màng. Chuyển một màng lọc lên môi trường thạch dùng phát

hiện vi khuẩn. Ủ ở 30° to 35°C, theo dừi, đếm số vi khuẩn mọc trên màng. Chuyển màng

lọc cũn lại lờn mặt mụi trường phát hiện nấm. Ủ ở 20° to 25°C, theo dừi trong khoảng 5

ngày, đếm số nấm mọc trên màng. Nếu chắc chắn về thời gian mọc của nấm cần phát

hiện thỡ cú thể theo dừi, đếm trong khoảng thời gian ngắn hơn. Chọn đếm các đĩa có số

khuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng. Tính số khuẩn lạc có trong 1 gam

hoặc 1ml mẫu thử.

Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán vào bỡnh

đó cú sẵn 500 ml dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0, Lắc đều trong 30 phút. Lọc

qua 2 màng lọc để tỡm vi khuẩn và nấm mỗi màng 50ml dung dịch. Tiếp tục ủ, theo dừi,

đếm vi khuẩn và nấm mốc như ở trên.

Thử nghiệm tìm các vi khuẩn

a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa

Cho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 35 - 370C, kiểm tra vi

khuẩn mọc ở môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường, cấy lên đĩa thạch

Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol - muối) và môi trường

thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, mang ủ. Sau khi ủ kiểm tra nếu không thấy

có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong bảng 2 và bảng 3 (nêu ở phần sau) đối với

từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có Staphylococcus aureus và

Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng

sinh hoá của Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa như sau:

40

*Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus):

Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch Vogel-Johnson (hoặc

thạch Baird - Parket, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống nghiệm, mỗi ống 0,5

ml huyết tương thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37oC, kiểm tra các ống sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ

thêm 24h. Nếu thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ nào), chế phẩm có

Staphylococcus aureus.

Bảng 2: Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn

Môi

trường

Thạch

Vogel -

Johnson

Thạch

manitol - muối

Thạch

Baird - Parker

Đặc

điểm

hình thái

khuẩn

lạc

Màu đen được

bao bọc bằng

một vùng vàng

Khuẩn lạc màu

vàng cùng với một

vùng vàng xung

quanh

Khuẩn lạc màu đen

bóng, viền quanh bằng

một vùng sáng rõ 2 - 5

mm

*Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa):

Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy ria trên

mặt môi trường thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trường Pseudomonas

phát hiện Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần được cấy truyền, có thể

chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc lựa chọn. Đậy và lật

ngược hộp môi trường đã cấy truyền và ủ ở 35 + 2oC ít nhất 3 ngày kiểm tra đường cấy

dưới ánh sáng đèn tử ngoại. Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo

bảng 3 hay không. Xác nhận bất kỳ khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc nhiều môi

trường. Phát hiện Pseudomonas aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên

khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một mẩu (hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trước N -

dimethyl - phenylen diamin dihydroclorid. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu

tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa

bằng các phép thử sinh hoá và nuôi cấy thích hợp khác.

Bảng 3. Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi trường lựa chọn

Môi trường

Thạch cetrimid

Thạch

Pseudomonas để

Thạch

Pseudomonas để

41

phát hiện Fluorescin phát hiện Pyocyanin

Đặc điểm hình

thái khuẩn lạc

Màu lục nhạt

thông thường

Không màu đến

màu vàng nhạt

Màu vàng nhạt

Huỳnh quang ở

ánh sáng tia cực

tím

Màu lục Màu hơi vàng Màu xanh nước

biển

Phản ứng oxydase Dương tính Dương tính Dương tính

Nhuộm Gram Trực khuẩn

Gram âm

Trực khuẩn

Gram âm

Trực khuẩn

Gram âm

b) Tìm Salmonella và Escherichia coli

Cho chế phẩm vào khoảng 100 ml môi trường lỏng lactose, ủ. Kiểm tra nếu có vi khuẩn

mọc, lắc nhẹ nhàng. Lấy 1ml cho vào một ống chứa sẵn 10 ml hỗn hợp môi trường lỏng

selenit - cystin và môi trường lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ trong 18 - 24 h. Phần còn lại

của môi trường lactose sẽ dùng để tìm Escherichia coli.

Tìm Salmonella: Lấy một quai cấy từ canh thang selenit cystin và tetrathionat ria lên mặt

môi trường thạch xanh brilliant, môi trường thạch bismuth sulfit trong các đĩa Petri. Đậy

đĩa, lật ngược, ủ. Kiểm tra, nếu không thấy có khuẩn lạc dạng như mô tả ở bảng 4, chế

phẩm không chứa các nòi Salmonella.

Bảng 4. Đặc điểm hình thái của Salmonella trên môi trường lựa chọn

Môi trường Mô tả khuẩn lạc

Thạch xanh brilliant Khuẩn lạc không màu hoặc màu hồng nhạt tới trắng đục,

nhỏ, rõ nét (thường bao quanh bằng một vùng màu hồng

tới đỏ)

Thạch xylose - lysin

- desoxycholat

Khuẩn lạc màu đỏ, có thể chấm đen ở trung tâm

Thạch bismuth sulfit Khuẩn lạc màu đen hoặc màu xanh

42

Nếu thấy khuẩn lạc, đem nhuộm soi thấy gồm những trực khuẩn hình gậy, Gram âm phù

hợp với mô tả ở bảng 4, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt

sang ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng). Trước tiên cấy ria trên mặt thạch

nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ. Kiểm tra không thấy môi trường bị

kiềm hoá (màu đỏ) ở phần nghiêng và acid hoá (màu vàng) phần dựng đứng, có hoặc

không có kèm theo màu đen ở phần dựng đứng do sinh H2S. Chế phẩm không chứa các

nòi Salmonella.

Tìm Escherichia coli:

Cấy ria một quai cấy từ môi trường lactose đã có vi khuẩn mọc ở trên bề mặt môi trường

thạch Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngược hộp, ủ. Kiểm tra nếu không có khuẩn lạc phù

hợp với mô tả ở bảng 5 thì chế phẩm không có Escherichia coli. Nếu có khuẩn lạc phù

hợp với mô tả ở bảng 5 thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt thạch Levine - eosin -

xanh methylen trong các đĩa Petri . Nếu có nhiều khuẩn lạc nghi ngờ, chia đĩa thành 4

phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc đã lựa chọn. Đậy đĩa, lật ngược, ủ. Kiểm tra nếu

không có những khuẩn lạc thể hiện cả hai đặc tính ánh kim dưới ánh sáng phản chiếu, và

màu đen xuất hiện ở ánh sáng truyền qua, mẫu chế phẩm không có Escherichia coli. Kết

hợp các phản ứng thử nghiệm sinh hoá và đặc điểm nuôi cấy để kết luận sự có mặt của

Escherichia coli trong chế phẩm.

Bảng 5: Đặc điểm hình thái của Escherichia coli trên thạch Mac - Conkey

Đặc điểm hình thái khuẩn

lạc

Khuẩn lạc màu đỏ gạch, có thể có

vùng mật kết tủa bao quanh

Nhuộm Gram Trực khuẩn Gram âm

c) Phát hiện Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác

Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lượng thích hợp như đã mô tả ở

phần chế tạo mẫu thử nghiệm và ủ ở 35 - 37oC một thời gian thích hợp (thường từ 2 - 5 h)

trong môi trường canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm tăng vi khuẩn.

Lắc bình chứa và chuyển một lượng đã đồng nhất của chế phẩm tương đương khoảng 1 g hoặc

1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel và ủ ở 35 - 37oC trong 18

43

- 24 h. Cấy lên đĩa thạch muối mật violet-red có chứa lactose và glucose ủ ở 35 -37oC trong

18 - 48 h. Chế phẩm không có Enterobacteria nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn

Gram âm trên đĩa.

Đánh giá số lượng: ủ một lượng thích hợp môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel với những

lượng chế phẩm đem kiểm tra đã được làm đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1 g và 10 mg hoặc 1,0

ml; 0,1 ml và 10 l. Nếu cần có thể pha loãng chế phẩm, ủ ở 35 -37oC trong 24 - 48 h. Các

khuẩn lạc đã phát triển tốt thường đỏ hoặc đĩa đỏ, nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, chứng

tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và l-

ượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định số lượng Bacteria theo

bảng 6.

Bảng 6. Tính lượng Bacteria trong chế phẩm

Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm Số Bacteria

có trong 1 gam sản phẩm 1,0 g hoặc

1 ml

0,1 g hoặc

0,1 ml

0,01 g hoặc

0,01 ml

+ + + Lớn hơn 102

+ + - ít hơn 102 nhưng lớn hơn 10

+ - - ít hơn 10 nhưng lớn hơn 1

- - - ít hơn 1

Đếm tổng số nấm, mốc, và men

Dùng phương pháp đĩa thạch tương tự như đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nhưng sử dụng

môi trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây- glucose, ủ các đĩa ở nhiệt

độ ở 20 - 25oC, theo dõi trong 5 ngày.

Tìm Clostridia

Thử nghiệm thứ nhất dùng cho những sản phẩm qui định không có Clostridia. Thử

nghiệm thứ hai là bán định lượng đối với Clostridium perfringens ỏp dụng với những

sản phẩm có tiêu chuẩn về số lượng Clostridium perfringens.

Thử nghiệm tìm Clostridia

44

Chuẩn bị mẫu thử như trong mục “ chuẩn bị thí nghiệm”. Lấy hai mẫu để kiểm tra

khoảng 1 g (ml) mỗi mẫu, cho vào hai bình đã chứa sẵn 100 ml môi trường tăng sinh cho

Clostridia. Một mẫu đem đun nóng tới 80oC trong 10 phút rồi làm lạnh ngay. ủ cả hai

mẫu ở điều kiện kỵ khí, ở 35 - 37oC trong 48h. Sau khi ủ từ mỗi bình cấy chuyển sang

một ống môi trường thạch Columbia đã thêm gentamycin và tiếp tục ủ ở 35 - 37oC trong

48h. Nếu không thấy có vi khuẩn mọc, mẫu thử đạt yêu cầu.

Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn một khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch

Columbia không có gentamycin và ủ ở hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí. Khi chỉ thấy mọc

ở điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dương (có hoặc không có nội bào tử); phản ứng

catalase âm tính tức là có Clostridium spp. Nếu cần so sánh sự phát triển của khuẩn lạc

trên hai đĩa và dùng thử nghiệm catalase để loại trừ những nòi Bacillus spp. kỵ khí và

hiếu khí có phản ứng catalase dương tính. Thử nghiệm này cũng được dùng để phân biệt

những khuẩn lạc cùng dạng trên thạch hoặc bằng cách chuyển vi khuẩn lên trên phiến

kính và nhỏ dung dịch nước oxy già loãng, nếu thấy có sủi bọt nghĩa là phản ứng

catalase dương tính.

Đếm Clostridium perfringens

Tạo mẫu thử như mô tả ở mục “chuẩn bị thí nghiệm”. Pha loãng bằng dung dịch đệm

pepton-natri clorid có pH 7,0 đến các dung dịch chế phẩm có nồng độ 10-2

, 10-3

. Tiến

hành xác định tổng số vi khuẩn giống như xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại

được mục “Tiến hành”. Mỗi lần chuyển 1ml đã làm đồng đều sang một ống chứa sẵn 9

ml môi trường sulfit - lactose và một ống nhỏ Durham. Lắc nhẹ nhàng và đem ủ ở 46 +

0,5oC trong khoảng 24 đến 48 h.

Các ống có màu đen (sắt sulfid) và sinh hơi trong ống Durham (ít nhất 1/10 thể tích) là có

Clostridium perfringens. Tính lượng Clostridium perfringens theo bảng 1. mục 13.6

Những nòi vi khuẩn dùng để kiểm tra:

Thử nghiệm thứ 1: Clostridium sporogenes ATCC 19404 và NCTC 532

Thử nghiệm thứ 2: Clostridium perfringens ATCC 13124 và NCTC 6125

Nếu cần, kết hợp với dùng Clostridium perfringens để kiểm tra điều kiện nhạy cảm và

điều kiện kỵ khí.

Lặp lại thí nghiệm

45

Khi nghi ngờ, cần được thử nghiệm lại như hướng dẫn ở trên với một lượng chế phẩm

tăng gấp đôi.

Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn

Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm khuẩn cho các loại

thuốc có quá trình sản xuất không tiệt khuẩn như sau:

Bảng 7. Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn

Mứ

c

Loại chế phẩm Yêu cầu

1 Các chế phẩm dùng cho

bỏng và các vết loét sâu

Không có các vi khuẩn có thể sống lại trong 1 g

(ml) mẫu thử

2 Các chế phẩm dùng tại

chỗ như chữa xưng tấy,

tổn thương, và các màng

nhầy (mũi, họng, tai, âm

đạo ...)

Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đuợc không

quá 100 trong 1 g (ml)

Mẫu thử phải không có Enterobacteria,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml)

3 Các chế phẩm dùng tại

chỗ cho da như kem bôi,

nước thơm, dầu, dung

dịch, bột...

Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không

quá 500 trong 1 g (ml)

Mẫu thử phải không có Enterobacteria,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml)

4 Các chế phẩm dùng

uống; qua trực tràng;

thấm qua da.

Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không

quá 104 trong 1 g (ml)

Tống số Enterobacteria không quá 500 trong 1

g (ml)

Nấm và mốc không quá 100 trong1 g (ml)

Không được có Salmonella trong 10 g(ml)

46

Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus. trong

1g(ml)

5 Các chế phẩm có chứa

các nguyên liệu có

nguồn gốc thực vật,

động vật không thể xử lí

theo qui trình làm giảm

lượng vi khuẩn.

Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được 5.104

trong 1 g (ml)

Nấm và mốc không quá 500 trong 1 g (ml)

Tống số Enterobacteria không quá 500 trong1

g (ml)

Không được có Salmonella trong 10 g(ml)

Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus trong

1g(ml)

47

Bài 7. THỬ VÔ KHUẨN

Qui định chung

Kỹ thuật này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm mốc

và nấm men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần

phải vô khuẩn. Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như trong

buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm. Trong quá

trình thử, mẫu không được tiếp xúc với các tác nhân có ảnh hưởng đến vi khuẩn, nấm

mốc, nấm men (như: tia tử ngoại, chất sát khuẩn, nhiệt độ cao ...). Các dụng cụ, dung

môi, môi trường nuôi cấy phải được diệt khuẩn trước khi dùng.

Phƣơng pháp thử

Nguyên tắc

Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men được cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và nước,

được giữ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp thì chúng sẽ phát triển. Sự có mặt của vi sinh vật

làm cho môi trường biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc có cặn lắng ở đáy môi

trường, hoặc thay đổi màu sắc môi trường.

Chọn một trong hai phương pháp thử thường dùng là phương pháp màng lọc hoặc

phương pháp cấy trực tiếp. Khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc chai,

lọ, bình ...) đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp. Sau đó lấy một lượng chế

phẩm đủ dùng theo qui định, cấy trực tiếp vào môi trường (nếu theo phương pháp cấy

trực tiếp) hoặc theo phương pháp màng lọc: Đem chế phẩm sau khi đã được hoà loãng

với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem

nhúng vào môi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian

qui định.

Chuẩn bị môi trƣờng và dung môi

Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí

Môi trường thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và trong).

Môi trường thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đặc hoặc

đặc sền sệt dạng cao).

Môi trường Soybean - casein (để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc)

48

Cả hai loại môi trường trên phải được pha chế và kiểm tra chất lượng theo đúng qui định ở

mục "Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường" trước khi dùng.

Dung môi dùng để hoà loãng

Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử nghiệm. Chỉ

được dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không có tính kháng khuẩn

và không tác động đến độ xốp của màng lọc. Thường dùng các dung môi sau đây:

Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nước cho vừa đủ 1 lít. Lọc (hoặc ly tâm) cho trong.

Điều chỉnh pH bằng 7,1 0,2. Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng 100 ml. Hấp ở

1210 C trong 18 - 20 phút.

Dung môi B: Như dung môi A, nhưng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung môi, dùng

để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin.

Dung môi C: isopropyl myristat

Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu.

Tiến hành thử theo phƣơng pháp màng lọc

Dụng cụ

Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm:

- Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.

- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện để ghép nối; hệ

thống hút chân không.

- Màng lọc: Thường dùng loại có dường kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 m. Loại màng

Cellulose nitrat được dùng cho các chế phẩm dạng nước, dạng dầu và các dung dịch có

lượng cồn thấp độ. Loại màng lọc dạng cellulose acetat được dùng cho các chế phẩm

dạng có nồng độ cồn cao. Đặc biết đối với các chế phẩm kháng sinh cần phải chọn loại

màng lọc thích hợp đảm bảo không còn dư lượng kháng sinh trên màng sau khi lọc.

- Kéo cắt màng lọc.

Lượng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm

Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo qui định ở bảng 1.

Bảng 1.

49

STT Loại mẫu thử Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy

1

2

3

Dung dịch thuốc tiêm có chứa

trong

một đơn vị đóng gói:

- Dưới 1 ml

- Có từ 1 đến ít hơn 4 ml

- Có từ 4 đến ít hơn 20 ml

- Có từ 20 đến 100 ml

- Lớn hơn 100 ml

Dung dịch thuốc nhỏ mắt và các

chế phẩm lỏng không tiêm

Những mẫu thử là chất rắn, dịch

treo, nhũ dịch, kem, hoặc thuốc

mỡ.

Toàn bộ một đơn vị đóng gói

1/2 đơn vị đóng gói

2 ml

2 - 10 ml

1/2 đơn vị đóng gói

5 - 10 ml của dung dịch đã hoà

loãng đến 10 lần (tt/tt) bằng dung

môi thích hợp nêu ở (mục c)

0,5 - 1 g mẫu thử đã được hoà loãng

thành dung dịch với tỉ lệ 1% (kl/tt)

bằng dung môi thích hợp (nêu ở

mục dung môi dùng để hoà loãng)

Kỹ thuật thử

Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ướt màng lọc. Rót lên màng lọc một lượng mẫu cần thử

như qui định ở bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc. Rửa màng lọc ít

nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn. Lấy màng lọc ra khỏi giá đỡ

trong phễu lọc. Cấy màng lọc vào môi trường bằng nhúng chìm vào loại môi trường để phát

hiện nấm hoặc vi khuẩn (mục chuẩn bị môi trường và dung môi ).

Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ít nhất ba lần bằng cách lọc qua màng

dung môi tiệt trùng đã chọn dùng cho thử nghiệm.Làm thí nghiệm kiểm tra để biết chắc

chắn không còn tác dụng kháng khuẩn của mẫu thử hấp thụ trên màng. Chuyển toàn bộ

màng lọc vào môi trường nuôi cấy thích hợp để phát hiện vi khuẩn, nấm mốc.

Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng, ủ môi trường thyoglycolat ở 300C đến 35

0C

và ủ môi trường soybean - casein ở 200C đến 25

0C ít nhất 14 ngày.

50

Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu...) thì dùng 100 ml dung môi B cho

chảy qua dụng cụ. Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đã được thấm ướt bằng dung môi

A, rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở mục kỹ thuật thử.

Tiến hành thử theo phương pháp cấy trực tiếp

Dụng cụ:

Các dụng cụ dùng cho thử nghiệm đều phải đảm bảo vô khuẩn mới được sử dụng vào thử

nghiệm. Dụng cụ dùng cho phương pháp cấy trực tiếp gồm: Bơm tiêm, pipet, các ống

nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.

Lượng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm

Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy lượng chế phẩm thích hợp theo qui định ở bảng 2.

Kỹ thuật thử

Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trường theo số liệu ở bảng 2.

Nếu mẫu thử là chất rắn thì cấy trực tiếp vào môi trường và chú ý lắc để mẫu thử phân

tán đều trong môi trường. Nếu không có chỉ dẫn ở chuyên luận riêng thì ủ môi trường

phát hiện vi khuẩn ở 300C - 35

0C ; ủ môi trường phát hiện nấm mốc ở 20

0C - 25

0C, thời

gian ít nhất 14 ngày; thường xuyên theo dõi các môi trường đã cấy. Nếu chế phẩm làm

đục môi trường, để có thể dễ dàng quan sát sự mọc của vi khuẩn, sau khi ủ môi trường 3

- 7 ngày nên chuyển một phần nhỏ môi trường này sang một loạt môi trường mới cùng

loại. Tiếp tục ủ các ống môi trường đã cấy lại ít nhất 7 ngày.

Trường hợp mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật: Nếu kích thước và hình dạng cho

phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường tương ứng. Khi mẫu thử là dụng cụ

(dây truyền, ống lọc máu, ...) thì dùng dung môi A hoặc B (mục chuẩn bị môi trường và

dung môi) cho chảy qua để thu được ít nhất 15 ml dịch rửa, cấy vào ít nhất 100 ml mỗi

loại môi trường nuôi cấy. ủ và đọc kết quả như đã ghi ở trên.

Bảng 2

ST

T

Loại mẫu thử

Lượng tối thiểu

chế phẩm cần lấy

Thể tích tối

thiểu môi

trường cần

lấy

Ghi chú

51

1

Mẫu thử là chất lỏng

chứa trong một đơn vị

đóng gói loại:

Dưới 1 ml

Từ 1 ml đến ít hơn 5

ml

Từ 5 ml đến ít hơn 20

ml

Từ 20 ml đến ít hơn

50 ml

Từ 50 ml đến 100 ml

Toàn bộ đơn vị

đóng gói

1/2 đơn vị đóng

gói

2 ml

5 ml

10 ml

15 ml

15 ml

20 ml

40 ml

80 ml

Nếu mẫu thử là

dầu hay dung

dịch dầu phải

thêm vào môi

trường 1%

polyethoxy-

ethanol hoặc 1%

polysorbat để

nhũ hoá.

2

Mẫu thử là chất rắn,

thuốc mỡ hay kem,

chứa trong một đơn vị

đóng gói loại:

Dưới 50 mg

Từ 50 mg đến 200

mg

Lớn hơn 200 mg

Toàn bộ 1 đơn vị

đóng gói

1/2 khối lượng của

1 đơn vị đóng gói

100 mg

40 ml

80 ml

80 ml

Nếu mẫu thử là

thuốc mỡ hay

kem thì cần hoà

loãng với dung

môi B theo tỷ lệ

1/10 (kt/tt) trước

khi cấy vào môi

trường.

Theo dõi và đánh giá kết quả

Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi trường đã cấy màng lọc hoặc

mẫu thử . Nếu không thấy có vi khuẩn, nấm mốc mọc trong suốt thời gian qui định, mẫu

thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.

Nếu có từ 1 trở lên trong số các môi trường nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấm mốc mọc,

cần phải:

Rà soát lại qui trình thử.

52

Thử lại các mẫu thử nghi ngờ.

Giữ lại các môi trường có vi khuẩn, nấm mốc mọc.

Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm trên môi trường, cấy lại với vi khuẩn

hoặc nấm đã mọc ở môi trường cũ.

Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làm lần đầu, mẫu

thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.

Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí nghiệm đầu

tiên, cần thực hiện phép thử lặp lại với số lượng mẫu gấp đôi. Nếu không phát hiện thấy

vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu vẫn thấy vi

khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lần lặp lại này, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô

khuẩn.

Cách pha chế và kiểm tra chất lƣợng các môi trƣờng

Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí

Môi trường thioglycolat:

Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và trong

L - Cystin

Natri clorid

Dextrose (C6H12O6.H2O)

Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%)

Cao men bia (có khả năng tan trong

nước)

Casein pancreatic

Natri thioglycolat

(hoặc acid thioglycolic 0,3 g

)

Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)

Nước cất

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2

0,50 g

2,50 g

5,50 g

0,75 g

5,00 g

15,00 g

0,50 g

1,0 ml

1000 ml

Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và thioglycolat ) trong

cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp. Thêm số

nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch trong. Thêm natri

thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N điều chỉnh sao cho môi trường sau khi

53

tiệt khuẩn có pH7,1 0,2. Đun nóng lại dung dịch (tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua

giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dung dịch resazurin trộn đều. Đóng vào các ống nghiệm

(hoặc bình) thích hợp, hấp vô khuẩn ở 1210C trong 18 - 20 phút. Lấy ra làm nguội nhanh

tới 250C, tiếp tục bảo quản ở nhiệt độ 20 - 30

0C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía

trên của ống (hoặc bình) môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử

nghiệm. Có thể phục hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm

lạnh đột ngột. Nhưng chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần, không dùng môi

trường phục hồi lần 2. Các môi trường thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3 tuần.

Môi trường thioglycolat không có thạch

Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao.

L. Cystin

Natri clorid

Dextrose (C6H12O6.H2O)

Cao men bia (có khả năng tan trong

nước)

Casein pancreatic

Natri thioglycolat

(hoặc acid thioglycolic 0,3 g )

Resazurin (dung dịch 1% mới pha)

Nước cất

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2

0,50 g

2,50 g

5,50 g

5,00 g

15,0 g

0,50 g

10 ml

1000

ml

Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy đều đến

khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh để cho pH sau khi

tiệt khuẩn đạt 7,1 0,2. Có thể lọc (nếu cần). Phân chia vào các ống nghiệm (hoặc bình)

thích hợp. Hấp tiệt khuẩn 1210C trong khoảng 18 - 20 phút. Sau khi tiệt khuẩn đem làm

nguội nhanh tới 250C, môi trường không được đun nóng trở lại.

Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm

Môi trường Soybean - casein

Casein pancreatic

Bột papaic soybean

Natri clorid

17,0 g

3,0 g

5,0 g

54

Dikali hydrophosphat

(K2HPO4)

Dextrose (C6H12O6.H2O)

Nước cất

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 0,2

2,5 g

2,5 g

1000 ml

Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để nguội ở

nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh (nếu cần) cho pH sau

khi tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi trường trong. Phân chia vào

những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 1210C trong khoảng 20 phút.

Kiểm tra chất lượng môi trường

a) Độ vô khuẩn:

Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt độ 30 -

350C trong 4 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ

khí; ủ ở nhiệt độ 20 - 250C trong ít nhất 7 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi

cấy vi khuẩn, nấm mốc. Các loại môi trường phải không được có vi khuẩn, nấm mốc

mọc.

b) Khả năng dinh dưỡng:

Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi khuẩn

sau:

Loại hiếu khí dùng Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633.

Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404.

Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231.

Aspergillus niger ATCC 16404

Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở nhiệt độ

thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối với nấm

mốc. Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc tốt.

c) Kiểm tra tác dụng ức chế ở mẫu mang thử:

Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất hoặc ở những chế phẩm mới người ta đã cho

thêm chất bảo quản. Loại chế phẩm này có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn,

nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với vi khuẩn nấm mốc.

55

Đối với vi khuẩn kỵ khí

Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn kỵ khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào

mỗi ống chứng này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium sporogenes ATCC 9404

(khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi

ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi cũng cấy vào mỗi ống 100 nha bào

Clostridium sporogenes ATCC 9404. Đem ủ tất cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày.

Đối với vi khuẩn hiếu khí

Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào

mỗi ống chứng này 100 tế bào vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus ATCC 6538

(khoảng 0,1 ml nhũ dịch tế bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống

một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, và cũng cấy vào mỗi ống 100 tế bào

Staphylococcus aureus ATCC 6538. Đem ủ tất cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày.

Đối với nấm mốc

Dùng 4 ống môi trường phát hiện nấm, mốc. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi

ống chứng này 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231. Hai ống dùng kiểm tra,

cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 và một lượng chế phẩm

bằng nhau. Đem ủ tất cả các ống ở 20 - 250C ít nhất 7 ngày.

Đánh giá kết quả:

Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt, (dễ dàng và phong phú), đối với từng

loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng: Mẫu thử không có tác dụng ức

chế.

Nếu trên các ống môi trường có cấy mẫu thử, vi khuẩn, nấm, mốc mọc yếu, chậm

phát triển hoặc không phát triển so với ống chứng vẫn mọc tốt: Mẫu thử có tác dụng

ức chế. Phải loại bỏ tác dụng ức chế.

Tác dụng ức chế của mẫu thử có thể loại bỏ được một cách có kết quả bằng cách cấy

truyền nhắc lại trên một loạt môi trường mới hoặc lọc qua màng lọc vi khuẩn.

56

Bài 8. XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN

CỦA CHẤT BẢO QUẢN

Chất bảo quản là những chất được thêm vào các chế phẩm phân liều không vô trùng, nhất

là các loại thuốc nước, để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có sẵn trong chế phẩm

hay nhiễm vào chế phẩm trong quá trình sử dụng. Chất bảo quản cũng được thêm vào các

chế phẩm vô trùng đa liều để ức chế sự phát triển của vi sinh vật nhiễm vào chế phẩm sau

khi mở ra sử dụng.

Không được dùng chất bảo quản như một biện pháp thay thế cho thực hành tốt sản xuất

thuốc, không được dùng chất bảo quản với mục đích duy nhất là làm giảm số lượng vi

sinh vật trong chế phẩm không vô trùng hoặc để làm tăng hiệu quả của quá trình tiệt

trùng đối với chế phẩm vô trùng đa liều.

Đa số các chất bảo quản là những hợp chất độc. Do đó, để bảo đảm an toàn, nồng độ chất

bảo quản trong sản phẩm cuối phải thấp hơn mức có thể gây nguy hiểm cho người sử

dụng.

Nồng độ chất bảo quản cần dùng có thể giảm đến mức tối thiểu nếu một hay nhiều hoạt

chất trong công thức pha chế có khả năng kháng khuẩn và/hoặc kháng nấm.

Chất bảo quản và nồng độ sử dụng của nó phải ghi rõ trên bao bì của sản phẩm.

Hiệu quả bảo vệ sản phẩm của chất bảo quản phải được xác định ngay từ giai đoạn

nghiên cứu và phát triển sản phẩm. Phương pháp xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất

bảo quản được trình bày dưới đây.

Nguyên tắc của phương pháp là cấy một hỗn dịch vi sinh vật chỉ thị thích hợp vào chế

phẩm cần thử, tốt nhất là cấy trực tiếp vào bao bì đóng gói cuối cùng của sản phẩm, nếu

có thể. Ủ chế phẩm đã cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp, sau đó lấy mẫu và đếm số

lượng vi sinh vật sống còn lại trong sản phẩm sau mỗi khoảng thời gian ủ nhất định. Việc

sử dụng chất bảo quản được xem là có hiệu quả nếu số lượng vi sinh vật đếm được giảm

đáng kể hoặc không tăng theo thời gian.

Tiêu chuẩn để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản thay đổi tùy theo loại

chế phẩm và đường dùng thuốc (Xem bảng 1)

Phân loại chế phẩm

57

Đối tượng của thử nghiệm xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản là các loại

chế phẩm có thành phần chính là nước hay có sử dụng nước làm tá dược. Các chế phẩm

này được chia thành 4 nhóm như sau:

Bảng 13.8.1.

Loại chế

phẩm Mô tả

1 Thuốc tiêm và các chế phẩm tiêm khác, bao gồm cả nhũ dịch;

thuốc nhỏ mắt, thuốc nhỏ tai và thuốc nhỏ mũi vô trùng.

2 Thuốc nhỏ mũi không vô trùng, các chế phẩm dùng cho màng

nhày, các chế phẩm dùng ngoài da, bao gồm cả các nhũ dịch.

3 Các loại thuốc uống (trừ thuốc kháng acid).

4 Thuốc uống kháng acid

Vi sinh vật chỉ thị

Aspergillus niger ATCC 16404 (IP 1431.83, IMI 149 007)

Candida albicans ATCC 10231 (IP 48.72, NCPF 3179)

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (CIP 82.118, NCIMB 8626)

Staphylococcus aureus ATCC 6538 (CIP 4.83, NCTC 10788)

Môi trƣờng nuôi cấy

Tất cả các môi trường sử dụng trong phụ lục này phải được kiểm tra khả năng dinh

dưỡng, dùng các vi sinh vật chỉ thị nêu trên để thử, trước khi dùng.

Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật chỉ thị

Cấy riêng rẽ chủng gốc mới cấy lại của mỗi vi sinh vật chỉ thị lên bề mặt môi trường rắn

thích hợp, có thể sử dụng môi trường giới thiệu ở bảng 13.8.2 hoặc môi trường khác có

sẵn trên thị trường, miễn sao chúng có cùng công dụng và có khả năng dinh dưỡng tương

đương, sau đó ủ trong điều kiện như qui định ở bảng 13.8.2. (Xem phụ lục 13.6 Thử giới

hạn nhiễm khuẩn để biết thành phần của các môi trường dinh dưỡng).

Bảng 13.8.2.

58

Vi sinh vật chỉ thị Môi trƣờng nuôi cấy Nhiệt độ

ủ

Thời gian

ủ

Pseudomonas

aeruginosa

Soybean-Casein Digest

Broth;

Soybean-Casein Digest Agar

30 – 35o C 18 – 24 giờ

Staphylococcus aureus Soybean-Casein Digest

Broth;

Soybean-Casein Digest Agar

30 – 35o C 18 – 24 giờ

Candida albicans Sabouraud Dextrose Broth;

Sabouraud Dextrose Agar

20 – 25o C 44 - 52 giờ

Aspergillus niger Sabouraud Dextrose Broth;

Sabouraud Dextrose Agar

20 – 25o C 6 - 10 ngày

Sau khi ủ, nếu cần, có thể tiếp tục cấy chuyển vi sinh vật thu được sang bề mặt môi

trường dinh dưỡng mới, cho đến khi thu được vi sinh vật ở trong trạng thái phát triển tốt

nhất. Tuy nhiên, số lần cấy chuyển nên hạn chế ở mức tối thiểu.

Rửa bề mặt môi trường nuôi cấy các vi khuẩn và C. albicans vài lần, mỗi lần dùng một

lượng nhỏ dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt), tập trung dịch rửa vào vật đựng

thích hợp và bổ sung dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt) để thu được hỗn dịch có

khoảng 108 vi sinh vật sống (cfu) trong một ml. Để thu hoạch bào tử A. niger, cũng tiến

hành như trên nhưng dùng dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt) có chứa 0,05%

(kl/tt) polysorbat 80, thêm dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt) để được hỗn dịch

có khoảng 108 cfu/ml.

Một cách khác, có thể tăng sinh chủng gốc của mỗi vi sinh vật chỉ thị trong môi trường

lỏng thích hợp, ví dụ môi trường giới thiệu ở bảng 13.8.2, thu hoạch vi sinh vật chỉ thị

bằng cách ly tâm, sau đó rửa và phân tán lại trong dung dịch natri clorid vô trùng 0,9%

(kl/tt) để được hỗn dịch có khoảng 108 cfu/ml.

Đếm số lượng tế bào sống của mỗi hỗn dịch thu được bằng phương pháp hộp thạch hay

phương pháp màng lọc (xem phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn). Kết quả đếm

(cfu/ml) được dùng để xác định lượng vi sinh vật đã cấy vào chế phẩm cần thử tại thời

điểm bắt đầu thử nghiệm.

59

Bảo quản các hỗn dịch vi sinh vật chỉ thị trong tủ lạnh nếu không dùng ngay trong vòng 2

giờ. Các hỗn dịch vi khuẩn và C. albicans phải dùng trong 24 giờ sau khi thu hoạch, hỗn

dịch A. niger có thể bảo quản trong tủ lạnh trong 7 ngày.

Tiến hành

Cấy vi sinh vật chỉ thị trực tiếp vào 4 đơn vị đóng gói cuối của chế phẩm cần thử, mỗi

đơn vị đóng gói với một hỗn dịch vi sinh vật đã được chuẩn bị và tiêu chuẩn hóa như

trên, lắc kỹ để trộn đều. Thể tích hỗn dịch vi sinh vật cấy vào các đơn vị đóng gói được

tính toán sao cho nồng độ vi sinh vật chỉ thị trong chế phẩm cần thử ngay sau khi cấy

khoảng từ 105 – 10

6 cfu/ml đối với chế phẩm loại 1, 2 và 3, khoảng 10

3 – 10

4 cfu/ml đối

với chế phẩm loại 4. Thể tích hỗn dịch đem cấy không được vượt quá 1% thể tích chế

phẩm cần thử, tốt nhất là từ 0,5 – 1%. Nếu không thể cấy vi sinh vật chỉ thị trực tiếp vào

đơn vị đóng gói cuối cùng của sản phẩm, chuyển một thể tích đủ lớn của chế phẩm cần

thử, ít nhất 20 ml, vào 4 vật chứa vô trùng có thể tích thích hợp, có nắp kín và tiếp tục

tiến hành như trên.

Ủ các vật chứa đã cấy vi sinh vật chỉ thị ở nhiệt độ 20 – 25 oC, tránh ánh sáng. Lấy mẫu

từ mỗi vật chứa sau những khoảng thời gian ủ nhất định như qui định ở bảng 13.8.3,

lượng mẫu cần lấy thường là 1 ml hoặc 1 g.

Ghi chép mọi thay đổi về mặt cảm quan của chế phẩm cần thử trong quá trình ủ. Xác

định số lượng vi sinh vật tại mỗi thời điểm lấy mẫu bằng phương pháp hộp thạch hay

phương pháp màng lọc, dùng môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ ủ như qui định ở bảng

13.8.2, thời gian ủ từ 3 – 5 ngày đối các vi khuẩn và C. albicans, 3 – 7 ngày đối với A.

niger.

Phải bảo đảm loại bỏ hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn và/hoặc kháng nấm của chế phẩm

cần thử bằng phương pháp pha loãng, lọc, hay dùng chất trung hòa. Nếu sử dụng phương

pháp pha loãng, điểm cần chú ý là độ chính xác của kết quả đếm sẽ giảm khi số lượng vi

sinh vật khá nhỏ (nhỏ hơn 30 cfu/hộp đối với phương pháp hộp thạch, dùng hộp petri có

đường kính từ 90 – 100 mm). Nếu sử dụng chất trung hòa, phải có biện pháp kiểm tra

thích hợp để bảo đảm nồng độ chất trung hòa đã dùng đủ để loại bỏ hoàn toàn hoạt tính

kháng khuẩn của chế phẩm cần thử và để bảo đảm bản thân chất trung hòa không gây bất

cứ ảnh hưởng bất lợi nào đến sự phát triển của vi sinh vật chỉ thị. Dùng nồng độ vi sinh

vật chỉ thị, tính bằng cfu/ml, tại thời điểm bắt đầu thử nghiệm - Ro và nồng độ vi sinh vật

60

sống đếm được tại mỗi thời điểm lấy mẫu t - Rt, tính lượng giảm đi của mỗi vi sinh vật

chỉ thị tại thời điểm đó - R:

R (cfu/ml) = Ro - Rt

Biểu diễn kết quả dưới dạng log10 của R.

Nguyên tắc đánh giá hiệu quả kháng vi sinh vật của chất bảo quản

Hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản hay hệ chất bảo quản được xem là đạt yêu cầu

nếu kết quả thử nghiệm thỏa mãn các nguyên tắc đánh giá ở bảng 13.8.3. Số lượng vi

sinh vật chỉ thị tại một thời điểm tăng không nhiều hơn 0,5 log10 cfu/ml so với kết quả

đếm ở thời điểm gần kề trước đó thì được xem là không tăng.

Bảng 13.8.3.A. Chế phẩm loại 1

Log R

7 ngày 14 ngày 28 ngày

Vi khuẩn ≥ 1,0 ≥ 3,0 Không tăng

Nấm men, nấm

mốc

Không tăng Không tăng Không tăng

Bảng 13.8.3.B. Chế phẩm loại 2

Log R

7 ngày 14 ngày 28 ngày

Vi khuẩn - ≥ 2,0 Không tăng

Nấm men, nấm

mốc

- Không tăng Không tăng

Bảng 13.8.3.C. Chế phẩm loại 3

Log R

7 ngày 14 ngày 28 ngày

Vi khuẩn - ≥ 1,0 Không tăng

Nấm men, nấm

mốc

- Không tăng Không tăng

61

Bảng 13.8.3.D. Chế phẩm loại 4

Log R

7 ngày 14 ngày 28 ngày

Vi khuẩn - Không tăng Không tăng

Nấm men, nấm

mốc

62

Bài 9. XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC THUỐC KHÁNG SINH

BẰNG PHƢƠNG PHÁP THỬ VI SINH VẬT

Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng ức chế một loại chủng chỉ thị nào đó, ở

điều kiện thích hợp. Sự giảm hoạt tính sinh học của kháng sinh được thể hiện trên chủng

chỉ thị, rất khó phát hiện bằng phương pháp phân tích hoá học, vì vậy phương pháp vi

sinh vật thường giữ một vai trò quan trọng trong việc đánh giá khả năng mất hoạt lực của

kháng sinh, nhất là những loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp, hoặc thành phần gồm một

hỗn hợp kháng sinh cùng họ mà mức độ hoạt lực chênh lệch nhau không lớn lắm.

Phương pháp vi sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh tác

động ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi là chủng chỉ thị) bởi những

độ pha loãng đã biết của kháng sinh mang thử (chưa biết rõ hoạt lực) với tác động ức chế

bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã biết rõ hoạt lực).

Thử nghiệm phải dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá những số liệu thu

được. Nếu áp dụng mô hình đường thẳng song song, hai đường log liều - đáp ứng của

chất chuẩn và chế phẩm thử phải song song với nhau và phải tuyến tính trong khoảng liều

đã dùng.

Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm là phương pháp khuếch tán

dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng.

Phương pháp thứ nhất dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp thạch

đặc ở hộp Petri hoặc khay vào khoảng phát triển của vi sinh vật tạo ra một vòng ức chế

hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh.

Phương pháp ống nghiệm dựa vào độ đục của canh khuẩn, biết được sự ức chế phát triển

của vi khuẩn gây ra bởi một loạt dung dịch kháng sinh trong môi trường lỏng là môi

trường thích hợp đối với sự phát triển của vi sinh vật khi không có kháng sinh.

Phƣơng tiện và dụng cụ

Tất cả các dụng cụ phải được làm sạch hoàn toàn trước và sau mỗi lần thí nghiệm. Những

dụng cụ thuỷ tinh và những đồ đựng khác dùng trong thí nghiệm phải được loại hết vi

khuẩn và chất ảnh hưởng. Các dụng cụ dùng để giữ và chuyển chủng chỉ thị cần làm sạch

cẩn thận và tiệt khuẩn bằng sức nóng khô hoặc hơi nước ở điều kiện thích hợp.

63

Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng chỉ thị và chế tạo nhũ dịch cấy truyền, cần thực

hiện trong môi trường đảm bảo nhiệt độ qui định. Đối với phương pháp đo độ đục, cần

kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ sao cho nhiệt độ quanh các ống nghiệm phải

đồng đều và phải đạt được nhiệt độ cần thiết trong ống nghiệm. Nên dùng điều nhiệt bằng

nước luân chuyển sẽ tốt hơn điều nhiệt bằng không khí.

Máy đo quang phổ: Được dùng để đo sự truyền qua hoặc hấp thụ trong khoảng sóng khá

hẹp, do đó cần có máy đo quang thích hợp có thể thay đổi được bước sóng hoặc dùng

dùng kính lọc 650 nm hoặc 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy đã pha chế và dùng kính lọc

530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng ở phương pháp đo độ đục. Dùng canh thang đã tiến

hành như mẫu nhưng thêm ngay dung dịch formaldehyd để chỉnh máy cho độ hấp thụ về

điểm “ 0 ”

Dụng cụ thí nghiệm:

- Phương pháp khuếch tán: Dùng các khay hoặc đĩa Petri bằng thuỷ tinh hoặc plastic, đạt

tiêu chuẩn bằng phẳng. Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhỏ đường kính 100 mm, cỡ lớn đường

kính lớn hơn 160 mm. Các khay thí nghiệm đã được tiêu chuẩn hoá, bằng kính hoặc

plastic với kích thước 25 x 25 cm (loại vuông) hoặc 28,8 x 19,8 cm (loại chữ nhật). Có

thể sử dụng những chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn bằng phẳng.

ống trụ bằng thép không rỉ, bằng thuỷ tinh, hoặc bằng sứ, có kích thước như sau: Đường

kính ngoài 8,0 mm; đường kính trong 6,0 mm; cao 10,0 mm.

Vật liệu dùng làm ống trụ phải là loại trơ, riêng đối với kháng sinh nhạy cảm với ánh

sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu. Khi dùng phải làm sạch cẩn thận, loại hết cặn,

khử khuẩn. Đôi khi phải rửa bằng acid như dung dịch acid nitric 2M, hoặc acid

sulfocromic.

Dụng cụ dùng cho phương pháp đo độ đục: Dùng các ống nghiệm loại 16 x 125 mm hoặc

18 x 150 mm bằng thuỷ tinh có cùng chiều dài, đường kính và độ dày, bề mặt phải

không có vết xước, không dây bẩn. Khi dùng, ống nghiệm phải sạch hoàn toàn, đảm bảo

không còn vết kháng sinh hoặc vết các chất tẩy rửa và phải tiệt khuẩn trước khi dùng.

Môi trƣờng, dung môi và chất pha loãng

Phải dùng các chất đạt từ mức tinh khiết hoá học trở lên để pha chế.

Môi trường

64

Dưới đây là công thức môi trường cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh. Các loại

môi trường này có thể được thay thế bằng môi trường khô tương ứng hoặc bằng một loại

môi trường thúc đẩy vi sinh vật phát triển tốt hơn mà cùng cho một đường đáp ứng tương

tự. Pha môi trường bằng cách hoà tan thành phần trong công thức vào một phần nước,

sau đó thêm nước vừa đủ một lít. Dùng dung dịch acid hydrocloric 1N hoặc dung dịch

natri hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trường sao cho sau khi tiệt khuẩn ở 121oC trong

15 phút có pH như ghi trong công thức. Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn có thể kéo dài

tới 30 phút đối với những môi trường có thể tích lớn hơn 500 ml.

Môi trường số 1

Pepton khô

Casein pancreatic

Cao men bia

Dextrose monohydrat

Thạch

Nước cất

pH: 6,0 đến 7,0

6,0 g

4,0 g

3,0 g

1,0 g

20,0 g

1000 ml

Môi trường số 2:

Pepton khô

Cao men bia

Cao thịt

Thạch

Nước cất

pH: 6,0 đến 7,0

6,0 g

3,0 g

1,5 g

20,0 g

1000 ml

Môi trường số 3:

Pepton khô

Cao men bia

Cao thịt

Dextrose monohydrat

Dikali hydrophosphat

(K2HPO4)

Kali dihydrophosphat

(KH2PO4)

5,0 g

1,5 g

1,5 g

1,0 g

3,58 g

1.32 g

3,5 g

1000 ml

65

Natri clorid

Nước cất

pH: 6,0 đến 7,0

Môi trường số 4:

Giống như môi trường số 2 nhưng có pH là 7,0 đến 8,0.

Môi trường số 5:

Giống như môi trường số 1, nhưng có pH là 7,8 đến 8,0.

Môi trường số 6:

Casein pancreatic

Bột đậu tương papaic

Natri clorid

Dextrose monohydrat

Dikali hydrophosphat (K2HPO4)

Thạch

Polysorbat 80

Nước cất

pH : 7,0 đến 7,3

17,0 g

3,0 g

5,0 g

2,5 g

2,5 g

15,0 g

10,0 ml

1000 ml

Chú ý: Polysorbat 80 được thêm vào một lượng dung dịch nóng của các thành phần khác

trước khi thêm nước vừa đủ dung tích cần thiết.

Môi trường số 7:

Pepton khô

Cao men bia

Cao thịt

Dextrose monohydrat

Natri clorid

Thạch

Nước cất

pH: 6,0 0,2

9,4 g

4,7 g

2,4 g

10,0 g

10,0 g

20,0 g

1000 ml

Dung môi và chất pha loãng

Dung môi và chất pha loãng dùng trong thí nghiệm phải không ảnh hưởng đến sự phát

triển của vi sinh vật. Chúng được dùng để pha các dung dịch theo yêu cầu trong từng thí

66

nghiệm. Các loại dung môi như nước vô khuẩn, acid hydrocloric, ethanol,

dimethylformamid và các dung dịch đệm có dải pH khác nhau hoặc các loại khác tuỳ

thuộc vào từng kháng sinh riêng biệt (bảng 2).

Các dung dịch đệm phosphat được chế tạo bằng cách hoà tan lượng dikali hydrophosphat

và kali dihydrophosphat (theo bảng 1) vào trong nước vừa đủ để được 1000 ml. Sau đó

điều chỉnh với acid phosphoric 18 N hoặc natri hydroxyd 18 N đến pH cần thiết. Giá trị

pH chỉ ra trong bảng là pH của dung dịch sau khi đã tiệt khuẩn.

Bảng 1.

Số

dung

dịch

đệm

Dikali

hydrophospha

t K2HPO4 (g)

Kali

dihydrophospha

t KH2PO4 (g)

pH

điều chỉnh

đến

1

2

3

4

5

6

2,0

16,73

0

20,0

35,0

13,6

8,0

0,523

13,61

80,0

0

4,0

6,0 0,1

8,0 0,1

4,5 0,1

6,0 0,1

10,5 0,1

7,0 0,2

Chất đối chiếu và đơn vị

Chất đối chiếu được dùng trong thử nghiệm là những chất có hoạt lực được xác định chính

xác so với chuẩn quốc tế hoặc chất đối chiếu quốc tế tương ứng.

Hoạt lực của một kháng sinh được thể hiện bằng đơn vị quốc tế. Một đơn vị quốc tế là

hoạt lực đặc biệt chứa trong một lượng (tính theo cân nặng) của chuẩn sinh học quốc tế

tương ứng hoặc chế phẩm đối chiếu sinh học quốc tế. Từng thời kỳ, Hội đồng về chuẩn

sinh học của Tổ chức y tế thế giới sẽ có chỉ dẫn và qui định chính xác cho mỗi chuẩn

quốc tế . Trong một vài trường hợp, định nghĩa số đơn vị quốc tế có thể bao gồm một

tổng lượng của một vài nguyên liệu vì thực tế khó cân một lượng nhỏ dù chính xác của

chất chuẩn sinh học quốc tế hoặc chất đối chiếu sinh học quốc tế.

Hoạt lực của một vài chất kháng sinh có thể được biểu thị bằng g. g hoạt lực không

nhất thiết tương ứng với khối lượng của chất kháng sinh vì nó không thể bao hàm toàn bộ

thực thể hoá học tinh khiết riêng của từng kháng sinh đó.

67

Chủng chỉ thị và dịch cấy truyền

Các chủng chỉ thị dùng phải nhạy cảm, phù hợp với từng kháng sinh, theo qui định ở

bảng 2. Có thể dùng chủng chỉ thị khác với chủng chỉ thị giới thiệu trong chuyên luận này

miễn sao chủng phải nhạy cảm với kháng sinh cần định lượng.

Chế tạo dịch cấy truyền

Chế tạo nhũ dịch vi khuẩn không có nha bào

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae (không tạo vỏ )

Micrococcus luteus

Saccharomyces cerevisiae

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Streptococcus faecium

Dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền lại lên mặt

một ống thạch nghiêng khác hoặc một bề mặt thạch rộng (như trong bình Roux) của môi

trường số 1 (Saccharomyces cerevicae dùng môi trường số 8; Streptococcus faecium dùng

môi trường số 3) ủ ở 32 - 350C trong 24 giờ (riêng với Klebsiella pneumoniae và

Streptococcus faecium ủ ở 370C) với Saccharomyces cerevisiae ủ ở 30

0C. Thu vi khuẩn

đã phát triển trên bề mặt môi trường bằng nước muối sinh lý, rồi hoà loãng với cùng một

chất hoà loãng tới độ đục thích hợp để được đáp ứng thích hợp trong phương pháp đo độ

đục, hoặc để tạo ra vùng ức chế rõ ràng, sắc nét thuận lợi khi đo trong phương pháp

khuếch tán.

Thí dụ: Pha loãng hỗn dịch vi khuẩn tới nồng độ sao cho khi đo ở bước sóng 650 nm, cốc

đo dày 1cm, độ truyền qua T = 50%, ở bước sóng 580 nm T = 25%, hay cho vòng vo

khuẩn rõ, sắc net có đường kính 13 mm.

Nhũ dịch vi khuẩn chế tạo như trên đem bảo quản ở nhiệt độ dưới 40C có thể sử dụng

trong 2 tuần.

Chế tạo nhũ dịch nha bào

Bacillus cereus

Bacillus pumilus

Bacillus subtilis

68

Cho chủng vi khuẩn mọc qua đêm trên ống thạch nghiêng môi trường số 1 ở 370C (riêng

với Bacillus cereus nuôi ở 300C). Thu vi khuẩn đã phát triển trên mặt thạch bằng nước

muối sinh lý, rồi chuyển sang một bề mặt thạch rộng hơn (như trong bình Roux) của môi

trường số 1, trong môi trường này đã thêm vào dung dịch 0,001% (kl/tt) mangan sulfat

(MnSO4) để giúp thúc đẩy sự hình thành nha bào. Nhũ dịch vi sinh vật được trải cho phủ

kín bề mặt môi trường bằng cách cho vào bề mặt thạch một vài viên bi thuỷ tinh vô

khuẩn. Đem ủ ở 370C (riêng với Bacillus cereus ủ ở 30

0C) trong 7 ngày. Dùng nước cất

vô khuẩn rửa vi khuẩn đã mọc (chủ yếu là nha bào) đem hoà loãng tới nồng độ thích hợp,

thí dụ khoảng 107 - 10

8 nha bào trong 1ml, đun cách thủy nhũ dịch nha bào ở nhiệt độ

70oC trong 30 phút. Dùng test phiến kính để kiểm tra khả năng sống của nha bào. Xác

định lượng nhũ dịch nha bào để cho vào 100 ml môi trường định lượng có thể tạo được

vùng ức chế rõ ràng, sắc nét. Nhũ dịch nha bào có thể giữ lâu ở nhiệt độ 40C.

Các loại thử nghiệm

Thử nghiệm hai liều và ba liều.

Phương pháp khuếch tán

Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch chuẩn nồng độ đã biết và dung dịch

thử được coi như xấp xỉ nồng độ dung dịch chuẩn. Các dung dịch chuẩn và thử này ban

đầu được pha vào dung môi thích hợp để được những dung dịch gốc. Sau đó pha loãng

dung dịch gốc bằng dung môi hoặc dung dịch đệm vô khuẩn đến nồng độ thích hợp, có

pH thích hợp cho từng loại kháng sinh ( xem bảng 2). Để xác định hiệu lực của kháng

sinh, dùng ba liều khác nhau của chuẩn (S1, S2, S3) mang so sánh với ba liều khác nhau

của thử (U1, U2, U3) có hoạt lực được coi như dung dịch chuẩn. Nồng độ được pha theo

cấp số nhân, thí dụ pha một loạt độ pha loãng theo tỷ lệ 2 : 1 hoặc 4 : 1. Nếu quan hệ

giữa logarit nồng độ kháng sinh và đường kính vùng ức chế đã chỉ ra gần như thẳng với

hệ số đã dùng thì có thể dùng định lượng thường xuyên bằng cách chỉ dùng hai nồng độ

chuẩn (S1, S2) và hai nồng độ thử (U1, U2) - Thử nghiệm hai liều. Trong trường hợp có

tranh chấp bắt buộc phải sử dụng định lượng ba liều.

Chuẩn bị cấy truyền

Các thử nghiệm có thể tiến hành trên những đĩa Petri hoặc khay bằng phẳng. Đổ vào hộp

Petri hoặc khay môi trường thích hợp đã cấy truyền chủng chỉ thị thích hợp cho từng

kháng sinh. Lớp môi trường này thường có độ dày 3 - 4 mm (riêng với amphotericin B

69

nystatin độ dày là 1 - 2 mm, đối với bleomycin, mithramycin độ dày 2 - 3 mm). Thạch

dinh dưỡng có thể được đổ thành một lớp hoặc hai lớp (gồm lớp nền không có vi khuẩn

và lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy vào môi trường sao cho tạo được vùng

ức chế sắc nét nhất tương ứng với các liều lượng của kháng sinh. Dùng nhũ dịch chủng

chỉ thị đã chế tạo như phần trên, thường cấy vào môi trường với nồng độ 1 ml chủng cho

100 ml môi trường là thích hợp. Khi nhũ dịch chủng là loại không có nha bào, thường

phải cấy vào môi trường thạch đã đun chảy hoàn toàn và để nguội đến 45 - 500C. Trường

hợp nhũ dịch chủng là nha bào, nhiệt độ cho phép khi cấy tối đa là 65 - 700C. Dùng một

lượng thích hợp môi trường đã cấy chủng chỉ thị, rót một cách vô khuẩn vào đĩa petri

hoặc khay kính (trên đĩa thạch hoặc khay đã có thạch nền hoặc không tuỳ theo yêu cầu)

để được một lớp môi trường có độ dày thích hợp, dàn trải nhanh và đậy nắp ngay. Trong

khi đợi thạch đông đặc, đặt khay kính hoặc hộp petri trên một tấm kính để tạo một mặt

phẳng giúp cho môi trường trên khay hoặc hộp có độ dày đồng nhất. Những môi trường

đã chuẩn bị được để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng (riêng đối với

colistin và colistin sulfomethat natri, đĩa petri hoặc khay kính đã cấy truyền phải để ở tủ

lạnh 40C trong vài giờ).

Tiến hành thử:

Đối với thử nghiệm 3 liều, dùng 6 ống trụ vô khuẩn đặt lên mặt thạch đã cấy truyền trong

một hộp petri (với thử nghiệm 2 liều dùng 4 ống trụ cho mỗi hộp). Có thể thay các ống

trụ bằng cách dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn, đục vào môi trường thạch để tạo ra

những lỗ thạch đường kính 6 - 8 mm (hoặc thay bằng những khoanh giấy tẩm kháng

sinh). Phân phối các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử trên mỗi hộp Petri hay

khay vuông sao cho phù hợp với kiểu bố trí thí nghiệm đã chọn (xem phụ lục 13.10).

Việc bố trí ống trụ, lỗ khoan, hoặc khoanh giấy trên mặt thạch phải sao cho các vùng ức

chế không bị trùm lên nhau.

Dùng pipet nhỏ vào ống trụ, hoặc lỗ thạch một lượng bằng nhau các dung dịch kháng

sinh. Nếu dùng các khoanh giấy phải tiêu chuẩn hoá trước thể tích chính xác chất lỏng

cho mỗi khoanh giấy. Giữ hộp petri hoặc khay ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 - 4 giờ

tuỳ theo đặc tính của mỗi kháng sinh. Đối với những kháng sinh nhạy cảm với nhiệt độ,

phải được giữ ở nhiệt độ 40C để sự khuếch tán của kháng sinh vào môi trường xẩy ra

chậm và làm giảm đến mức tối thiểu hiệu quả của sự biến đổi theo thời gian giữa các

dung dịch khác nhau. Đối với colistin và colistin sulfomethat natri nên để 2 - 4 giờ ở

70

nhiệt độ phòng trước khi ủ. Các hộp Petri hoặc khay sau thời gian để khuếch tán, mang ủ

ở nhiệt độ thích hợp cho từng kháng sinh riêng (bảng 2). Nhiệt độ ủ phải được kiểm tra

để khoảng nhiệt độ chênh lệch so với quy định chỉ trong khoảng 0,50C. Thời gian ủ

thường kéo dài 16 - 18 giờ. Dùng dụng cụ đo có độ chính xác tối thiểu 0,1mm, đo đường

kính vùng ức chế tạo bởi các nồng độ khác nhau của chuẩn và thử.

Kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt lực

kháng sinh theo phụ lục 13.10

Phương pháp đo độ đục

Pha các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử

Dung dịch dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử được pha trong dung môi thích hợp

và được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho từng kháng sinh

theo chỉ dẫn ở bảng 2. Để đảm bảo giá trị hiệu lực của phép thử, làm thử nghiệm 3 liều là

thích hợp. Pha song song những độ hoà loãng gồm 3 liều chuẩn (S1, S2, S3) và 3 liều thử

(U1, U2, U3).

Chế tạo canh thang để cấy truyền

Để có được một độ đục thích hợp dùng được ngay ở dịch cấy truyền, pha dịch cấy truyền

như mô tả ở phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền rồi dùng ngay. Chủng chỉ thị và điều kiện

thử nghiệm của từng kháng sinh sử dụng trong phương pháp này được ghi trong bảng 2.

Tiến hành

Các ống nghiệm được xếp thành từng nhóm, mỗi nhóm 3 - 5 ống, thêm vào mỗi ống 1 ml

dung dịch của từng độ pha loãng của dung dịch chuẩn hoặc mẫu thử. Đặt các ống nghiệm

vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối hoặc theo hình vuông latinh.

Trong mỗi giá có 2 ống dùng kiểm tra không thêm kháng sinh, một ống chứa 1 ml dịch

pha loãng, còn ống kia chứa 1 ml dịch pha loãng và 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12%

(tt/tt).

Thêm vào mỗi ống 9 ml canh thang đã cấy truyền. Đặt giá đã chuẩn bị xong ngay vào

trong tủ ấm hoặc cách thuỷ, giữ ở nhiệt độ thích hợp, khống chế nhiệt độ ở mức sai số

0,50C so với nhiệt độ cần ủ (theo bảng 2) trong 3 - 4 giờ. Sau khi ủ, làm ngừng sự phát

triển của vi khuẩn bằng cách thêm vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt)

trừ ống kiểm tra đã thêm formaldehyd 12% trước hoặc nhúng giá có các ống nghiệm đã ủ

71

vào nước sôi . Lấy từng giá ống nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền qua hoặc độ hấp

thụ của mỗi dung dịch bằng máy đo quang ở 530 nm.

Kiểm tra tính có giá trị của định lƣợng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt

lực kháng sinh theo phụ lục 13.10

Phương pháp đường chuẩn

Hoà tan một lượng cân chính xác chất đối chiếu hoặc chất chuẩn sinh học của một kháng

sinh đã cho trong dung môi thích hợp, có thể phải làm khô trước. Pha loãng với dung môi

qui định để được dãy chuẩn có 5 nồng độ. Tỷ lệ tăng giữa các nông độ nên là 1: 1,25.

(xem hướng dẫn ở bảng 2)

Tiến hành

Khi tiến hành xây dựng đường chuẩn, khảo sát trên ít nhất 12 hộp Petri. Khi xác định

hàm lượng của một kháng sinh dùng ít nhất 3 hộp Petri. Đổ vào mỗi hộp Petri 21 ml môi

trường đã đun chảy, đợi thạch đông cứng lại tạo thành lớp có độ dày đồng đều và một bề

mặt bằng phẳng để làm nền. (Riêng với amphotericin B, nystatin thì không dùng lớp nền).

Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin hoặc mytomycin dùng 10 ml làm lớp nền.

Lớp nuôi cấy dùng 4 ml cho mỗi hộp, được đổ và láng đều sau khi lớp nền đã đông cứng,

đặt lên mặt thạch trong đĩa 6 ống trụ bằng thép không rỉ hoặc những ống bằng chất liệu

khác như đã quy định ở phần dụng cụ. Các ống trụ tạo thành một hình lục giác đều cách

tâm khoảng 2,8 cm. Chia 12 hộp Petri để xây dựng đường chuẩn thành 4 nhóm, mỗi

nhóm 3 hộp. Dung dịch có nồng độ trung gian được lấy làm nồng độ kiểm tra dùng hiệu

chỉnh các giá trị đo được ở mỗi nhóm. Đổ đầy dung dịch kiểm tra vào 3 ống trụ, bố trí

xen kẽ trong mỗi hộp Petri. Các ống trụ còn lại được đổ đầy dung dịch có nồng độ của

một nhóm. Sau khi ủ các hộp ở nhiệt độ thích hợp 32 - 350C (theo chỉ dẫn bảng 2)

khoảng 16 - 18 giờ sẽ đo được 9 giá trị đường kính vòng vô khuẩn của nồng độ kiểm tra

theo nhóm. Tổng số cả 4 nhóm sẽ đo được 36 giá trị đường kính vòng vô khuẩn ở nồng

độ kiểm tra. Độ chính xác của mỗi kết quả đo là 0,1 mm.

Cách tính

Giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ là a, b, d, e; giá trị trung

bình các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của mỗi nhóm 3 hộp (9 kết quả)

là Ca, Cb, Cd, Ce và giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn của nồng độ kiểm tra

ở tất cả 12 hộp (ký hiệu là C), gồm 36 kết quả .

72

So sánh giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của mỗi

nhóm với giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của 12

hộp(C). Hiệu của chúng (C - Ca; v. v... ) là số hiệu chỉnh dùng để điều chỉnh giá trị trung

bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ mỗi nhóm. Cộng đại số giá trị hiệu

chỉnh đạt được vào giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của mỗi

nhóm ta được các giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn đã hiệu chỉnh của

mỗi nồng độ là a, b, d, e.

Thí dụ: Giá trị trung bình của đường kính 36 vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra tính được

là 19,2 mm; giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của

nhóm nồng độ a là Ca = 19,0 mm. Số hiệu chỉnh là 19,2 - 19,0 = 0,2 mm. Giá trị trung

bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của nhóm là 17,9 mm. Vậy giá trị trung

bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của nhóm sau khi đã hiệu chỉnh là a =

17,9 + 0,2 = 18,1 mm.

Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đường chuẩn qua các điểm giá trị trung bình đã hiệu

chỉnh. Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh bằng àg hoặc đơn

vị hoạt lực trong ml. Trên trục hoành (chia theo thang số học) lấy giá trị đường kính vòng

ức chế. Như vậy đường chuẩn được vẽ qua điểm tương ứng với giá trị đường kính vòng

ức chế cao nhất và thấp nhất tính được bằng phương trình sau:

L =

3a + 2b + C -

e

5

H =

3e + 2d + C -

a

5

L: Đường kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ thấp nhất của đường chuẩn.

H: Đường kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ cao nhất của đường chuẩn.

C: Đường kính trung bình của 36 kết quả của nồng độ kiểm tra.

a, b, d, và e: Những giá trị đường kính trung bình đã hiệu chỉnh cho từng dung dịch còn

lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thấp nhất tới nồng độ cao nhất.

73

Ba hộp Petri dùng cho mẫu thử nghiệm cũng được tiến hành đồng thời khi xây dựng

đường chuẩn. Trong ba hộp này nhỏ xen kẽ giữa nồng độ trung gian của dung dịch chuẩn

với nồng độ của mẫu thử đã pha loãng với dung dịch đệm thích hợp để có nồng độ giả

định tương đương nồng độ trung gian của chuẩn.

Sau khi đo đường kính các vòng vô khuẩn của mẫu thử, tính trung bình hiệu chỉnh theo

giá trị đường kính nồng độ trung gian sẽ được đường kính của chế phẩm thử. Trên trục

hoành ứng với giá trị đường kính vừa tìm được của mẫu thử, kẻ đường vuông góc với

trục hoành cắt đường đường chuẩn vừa vẽ được tại một điểm và từ điểm này trên đường

chuẩn hạ vuông góc với trục tung sẽ tìm được giá trị nồng độ ứng với đường kính của

mẫu thử.

Hoạt lực của chế phẩm được tính ra phần trăm so với chuẩn theo công thức sau:

R%

=

Hoạt lực tìm thấy của chế phẩm

100

Hoạt lực tìm thấy ở nồng độ trung

gian

74

Bài 10. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG SINH HỌC

1. Mở đầu

Chuyên luận này hướng dẫn cách bố trí thí nghiệm và phương pháp phân tích thống kê

kết quả của các định lượng sinh học có trong Dược điển Việt Nam.

Có thể dùng kiểu bố trí thí nghiệm và cách tính toán kết quả khác với phương pháp mô tả

trong chuyên luận này, miễn sao các phương pháp đó có độ tin cậy tương đương.

Phương pháp sinh học được dùng để định lượng các hợp chất hay chế phẩm mà hoạt lực

của chúng không thể xác định một cách chính xác bằng các phương pháp phân tích Hóa -

Lý. Nguyên tắc của phương pháp là so sánh chế phẩm cần định lượng với một chất chuẩn

để xác định lượng chế phẩm cần định lượng cho cùng tác động sinh học với lượng biết

trước, tính bằng đơn vị, của chất chuẩn. Để đảm bảo độ chính xác của kết quả định

lượng, mọi thử nghiệm tiến hành với chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng phải

thực hiện đồng thời và trong cùng điều kiện thí nghiệm.

Định lượng sinh học luôn luôn mắc phải sai số ngẫu nhiên do tính biến thiên vốn có của

đáp ứng sinh học, do đó nếu có thể, khi tính kết quả của mỗi định lượng phải tính sai số

của định lượng, kể cả khi dùng phương pháp chính thức. Vì vậy, trong chuyên luận này

có hướng dẫn các phương pháp bố trí thí nghiệm và cách tính sai số cho mỗi kiểu bố trí

thí nghiệm tương ứng. Các phương pháp tính toán trình bày ở đây chỉ tính đến sai số

ngẫu nhiên gây bởi chỉ thị sinh học và giả định rằng các sai số hệ thống, ví dụ sai số do

cân, pha loãng, … là rất nhỏ và không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả định lượng (do đó

phải có biện pháp thích hợp để giảm sai số hệ thống đến mức có thể chấp nhận được).

Trong mọi trường hợp, trước khi áp dụng một phương pháp thống kê bất kỳ, phải tiến

hành định lượng sơ bộ một số lần thích hợp để bảo đảm chắc chắn tính khả dụng của

phương pháp đó.

Độ chính xác của kết quả định lượng sinh học được xác định bởi các giới hạn tin cậy, còn

gọi là khoảng tin cậy. Giới hạn tin cậy ở xác suất 95 % thường được sử dụng trong các

định lượng sinh học, do đó cũng được chọn trong chuyên luận này. Khoảng tin cậy tính

bằng các phương pháp toán thống kê giới thiệu ở đây có khả năng chứa hoạt lực thật của

chế phẩm cần định lượng với xác suất 95 %. Một số chuyên luận Dược điển qui định giới

hạn tin cậy phải không được vượt quá một ngưỡng nhất định, ví dụ phải nằm trong

75

khoảng từ 95 % đến 105 % so với hoạt lực tính được, trong những trường hợp như vậy,

có thể phải lặp lại định lượng hai hay nhiều lần để đạt được giới hạn tin cậy cho phép.

Các thuật ngữ dùng trong chuyên luận này được trình bày ở phần cuối của chuyên luận.

2. Ngẫu nhiên hóa

Sự chỉ định những liều khác nhau của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng cho

các đơn vị thí nghiệm (ví dụ động vật thí nghiệm, ống nghiệm, …) phải được thực hiện

một cách hoàn toàn ngẫu nhiên. Những điều kiện thí nghiệm khác, nếu không bắt buộc

phải chuẩn hóa nhằm giảm chênh lệch đáp ứng sinh học giữa các đơn vị thí nghiệm (ví

dụ chọn lựa cân nặng, tuổi của động vật thí nghiệm, điều kiện môi trường thí nghiệm,

…), cũng phải lựa chọn càng ngẫu nhiên càng tốt. Chọn vị trí của chuồng nuôi động vật

thí nghiệm trong phòng thí nghiệm, trình tự phân liều, … là những ví dụ cho các quá

trình phải thực hiện một cách ngẫu nhiên.

Ngẫu nhiên hóa có thể thực hiện bằng cách ném xúc xắc, xào các lá bài có đánh số, dùng

bảng số ngẫu nhiên hay các phần mềm vi tính thích hợp.

3. Các định lƣợng dựa trên đáp ứng định lƣợng

3.1. Mô hình thống kê

3.1.1. Nguyên tắc chung

Hai mô hình thống kê thường dùng trong các định lượng sinh học là mô hình đường

thẳng song song và mô hình tỷ lệ độ dốc. Trong chuyên luận này chỉ giới thiệu mô hình

đường thẳng song song, để tìm hiểu thêm về mô hình còn lại, xin tham khảo Dược điển

Châu Âu IV hay các tài liệu thống kê khác.

Chỉ có thể áp dụng mô hình thống kê đường thẳng song song nếu định lượng hội đủ các

điều kiện sau:

1) Các liều khác nhau của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng đã được chỉ định

cho từng đơn vị thí nghiệm một cách ngẫu nhiên;

2) Các đáp ứng đo được của mỗi liều tuân theo phân phối chuẩn;

3) Độ lệch chuẩn của các đáp ứng trong mỗi nhóm xử lý của cả chế phẩm chuẩn và chế

phẩm cần định lượng không khác nhau có ý nghĩa.

Sau khi tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần, nhà phân tích phải kiểm tra các số liệu thu

thập được bằng các phép kiểm tra thống kê thích hợp để đảm bảo định lượng thỏa mãn

các điều kiện nói trên:

76

- Điều kiện 1 có thể thỏa mãn nếu thực hiện đúng theo các hướng dẫn trình bày ở mục

2 (Ngẫu nhiên hóa).

- Điều kiện 2 thường được chấp nhận là luôn luôn thỏa mãn trong thực tế. Trong những

định lượng mà mỗi xử lý bao gồm một số đáp ứng lặp lại, một sự lệch nhỏ khỏi tính

chuẩn sẽ không gây ảnh hưởng lớn đến kết quả.

- Kiểm tra điều kiện 3 thông qua việc kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai, ví dụ

bằng phép kiểm tra Bartlett hoặc phép kiểm tra Hartley (xem các ví dụ trong mục

3.2.8).

Nếu điều kiện 2 và/hoặc điều kiện 3 không thỏa mãn, thay đáp ứng y bằng ln(y), y hay

y2 có thể cho kết quả tốt.

Phép biến đổi y thành ln(y) rất hữu ích trong trường hợp tính đồng nhất của các phương

sai không thỏa mãn. Phép biến đổi này cũng giúp cải thiện tính chuẩn nếu phân phối bị

lệch về bên phải.

Biến đổi y thành y thường được dùng khi các quan sát tuân theo phân phối Poisson, ví

dụ khi các quan sát thu được bằng phương pháp đếm.

3.1.2. Các định lƣợng thƣờng nhật

Trong các định lượng thường nhật, rất khó kiểm tra một cách hệ thống các điều kiện lý

thuyết mô tả ở mục 3.1.1, bởi vì trong thực tế số quan sát của các định lượng thường nhỏ

do đó ảnh hưởng đến độ nhạy của các phép kiểm tra thống kê. Tuy nhiên, trong những

định lượng cân xứng (là những định lượng có số liều của chế phẩm chuẩn bằng với số

liều của chế phẩm cần định lượng, ví dụ: định lượng 2 + 2, 3 + 3, …) một sự lệch nhỏ

khỏi tính chuẩn hay khỏi tính đồng nhất của phương sai không ảnh hưởng lớn đến kết quả

định lượng. Do đó, chỉ cần kiểm tra lại các điều kiện lý thuyết nói trên khi một loạt các

định lượng liên tục không thỏa mãn phép kiểm tra tính có giá trị (xem mục 3.2.4).

Ngoài 3 điều kiện lý thuyết đã nói trên, mô hình thống kê đường thẳng song song còn yêu

cầu mỗi định lượng phải thỏa mãn 2 điều kiện sau:

4) Đường biểu diễn mối quan hệ giữa logarithm liều và đáp ứng phải tuyến tính trong

khoảng liều đã dùng trong định lượng.

5) Đường thẳng ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm cần định lượng phải song song với

đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm chuẩn.

77

Chỉ có thể kiểm tra điều kiện 4 nếu định lượng được tiến hành với ít nhất 3 nồng độ pha

loãng của mỗi chế phẩm (định lượng 3 liều hay lớn hơn). Tuy nhiên, nếu tính tuyến tính

của đường logarithm liều – đáp ứng, trong một khoảng liều nhất định, đã được chứng

minh bởi một số lượng đủ lớn các định lượng có 3 liều trở lên, có thể tiến hành định

lượng chỉ với 2 liều của mỗi chế phẩm (định lượng 2 liều) trong các định lượng hàng

ngày, dùng khoảng liều đã cho.

Trước khi tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy, cần phải tiến hành phân tích phương sai

để kiểm tra xem định lượng có đáp ứng các điều kiện 4 và 5 hay không.

Các định lượng dựa trên mô hình thống kê đường thẳng song song được trình bày trong

mục 3.2.

Nếu có bất cứ điều kiện nào trong 5 điều kiện nói trên không thỏa mãn, các phương pháp

tính toán giới thiệu ở đây sẽ không có giá trị. Khi đó, phải tiến hành rà soát lại các kỹ

thuật định lượng để tìm ra nguyên nhân.

Nếu các phép kiểm tra thống kê cho thấy một hay một vài điều kiện trong 5 điều kiện nói

trên không thỏa mãn trong một số định lượng hàng ngày, không được chuyển ngay sang

một phép biến đổi khác trừ khi có đủ bằng chứng rằng nguyên nhân gây ra hiện tượng đó

không phải do ngẫu nhiên mà là kết quả của một sự thay đổi có hệ thống của các điều

kiện thí nghiệm. Trước khi áp dụng một phép biến đổi mới vào các định lượng thường

nhật phải lặp lại các phép kiểm tra thống kê đã trình bày ở mục 3.1.1.

Để thu được một kết quả định lượng đáng tin cậy, có thể phải tiến hành một vài định

lượng độc lập, sau đó phối hợp các kết quả định lượng lại với nhau (xem mục 4).

Nhằm mục đích kiểm soát chất lượng của các định lượng hàng ngày, nên ghi chép lại các

kết quả tính độ dốc hồi qui và sai số dư dưới dạng biểu đồ kiểm tra.

Nếu sai số dư lớn một cách bất thường, nguyên nhân đầu tiên phải nghĩ đến là sai sót

trong kỹ thuật định lượng. Nếu các khảo sát khẳng định điều đó là đúng, phải lặp lại định

lượng. Sai số dư cũng có thể rất lớn nếu trong dãy số liệu đo có một giá trị bất thường.

Chỉ được loại bỏ giá trị nghi ngờ là bất thường nếu phép kiểm tra thống kê thích hợp cho

thấy giá trị đó khác có ý nghĩa với các giá trị còn lại.

Sai số dư có thể nhỏ bất thường trong một số định lượng hàng ngày và làm cho các tỷ số

F vượt quá giá trị tới hạn. Trong những trường hợp như vậy, có thể thay sai số dư tính

được của định lượng bằng sai số dư trung bình của các định lượng trước đó trong biểu đồ

kiểm tra.

78

3.1.3. Cách tính toán và một số hạn chế

Dưới đây là 3 hạn chế áp đặt cho mỗi định lượng nhằm làm đơn giản hóa các công thức

tính toán và làm tăng độ chính xác của định lượng:

a) số nồng độ pha loãng của mỗi chế phẩm trong một định lượng phải bằng nhau;

b) tỷ lệ giữa các liều kế tiếp nhau phải là một hằng số đối với tất cả các xử lý trong một

định lượng, ví dụ: S2/S1 = S3/S2 = … = Z3/Z2;

c) số các đơn vị thí nghiệm của mỗi xử lý phải bằng nhau.

Các công thức tính toán áp dụng cho những định lượng có bố trí thí nghiệm tuân thủ

đúng 3 hạn chế nêu trên được giới thiệu ở mục 3.2. Đối với các định lượng có bố trí thí

nghiệm không tuân theo các hạn chế đã nêu các công thức tính toán sẽ rất phức tạp và

không được giới thiệu trong chuyên luận này.

Trong mục 3.2.8 có trình bày một số ví dụ để minh họa cho phần lý thuyết thống kê. Có

thể dùng các số liệu trong các ví dụ đó để kiểm tra các phần mềm dùng trong phân tích

thống kê kết quả định lượng sinh học.

3.2. Mô hình đƣờng thẳng song song

3.2.1. Giới thiệu

Mô hình đường thẳng song song dựa trên quan hệ tuyến tính giữa đáp ứng Y và

logarithm X của liều D.

Y = a + bX

Trong đó:

Y = đáp ứng mong đợi.

X = ln(liều) = ln(D).

a và b là các hằng số.

Mô hình đường thẳng song song có thể được minh họa bởi đồ thị trong hình 3.2.1.-I. Trên

đồ thị, trục hoành biểu diễn các logarithm liều, trục tung biễu diễn các đáp ứng đo được.

Các đáp ứng riêng của mỗi xử lý được biểu thị bằng các chấm đen. Hai đường trên đồ thị

biểu diễn mối quan hệ giữa logarithm liều và đáp ứng đo được của chế phẩm chuẩn và

chế phẩm cần định lượng.

Từ trục tung kẻ một đường thẳng bất kỳ song song với trục hoành, cắt hai đường ln(liều)

– đáp ứng tại hai điểm. Giá trị tương ứng của hai diểm này trên trục hoành là ZS và ZU ,

đây là hai nồng độ của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng cho cùng đáp ứng

sinh học. Vì khi pha các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng

79

ta đã giả định ZS = ZU, do đó, đoạn thẳng ln(ZS) – ln(ZU) là chênh lệch giữa nồng độ thật

và nồng độ giả định của chế phẩm cần định lượng trên thang logarithm. Đó cũng chính là

logarithm tỷ lệ hoạt lực giữa chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng.

U

SUS

Z

ZZZ lnlnln

Vì ZS đã biết, ta có thể tính được ZU.

Hình 3.2.1.-I. – Mô hình đường thẳng song song của một định lượng 3 + 3.

Chú ý: logarithm tự nhiên ln (hay loge) được sử dụng xuyên suốt trong chuyên luận này,

do đó, antilogarithm tương đương với ex. Tuy nhiên, nếu muốn, hoàn toàn có thể dùng

logarithm cơ số 10 ( hay log10 ) thay cho ln, khi đó, antilogarithm tương ứng với 10x.

Trong một định lượng, nếu đoạn thẳng ln(ZS) – ln(ZU) càng nhỏ, tức là nếu hoạt lực giả

định của chế phẩm cần định lượng càng gần với hoạt lực thật của nó, kết quả định lượng

sẽ càng chính xác.

3.2.2. Bố trí thí nghiệm

Các định lượng sinh học có thể được bố trí theo một số cách khác nhau như trình bày

dưới đây.

3.2.2.1. Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn

Nếu toàn bộ các đơn vị thí nghiệm (động vật, ống nghiệm,…) tương đối đồng nhất, việc

chỉ định các đơn vị thí nghiệm cho các xử lý khác nhau phải được tiến hành một cách

ngẫu nhiên, ví dụ dùng bảng hoán vị ngẫu nhiên.

Nếu chia các đơn vị thí nghiệm thành các phân nhóm, ví dụ theo vị trí vật lý hay ngày thí

nghiệm, mà các đáp ứng đo được có độ phân tán nhỏ hơn, ta có thể tăng độ chính xác của

định lượng bằng cách áp dụng một số hạn chế trong cách bố trí thí nghiệm. Sự sắp xếp

lnD

Đáp

ứng (y)

Chất chuẩn

Mẫu thử

ZU ZS

80

các đơn vị thí nghiệm theo các hạn chế đó cho phép loại bỏ một số nguồn gây sai số

không liên quan.

3.2.2.2. Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối

Trong kiểu bố trí thí nghiệm này, có thể giảm sai số của định lượng bằng cách tách độ

phân tán giữa các khối, ví dụ độ phân tán giữa các hộp Petri trong định lượng vi sinh vật

bằng phương pháp khuếch tán, khỏi sai số toàn phần. Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo

khối đòi hỏi mỗi khối phải có số xử lý bằng nhau và chỉ thích hợp nếu khối (ví dụ hộp

Petri) đủ lớn để có thể chứa tất cả các xử lý của định lượng.

Bảng 3.2.3.-V trình bày công thức tính toán áp dụng cho các định lượng có bố trí thí

nghiệm ngẫu nhiên theo khối, trong đó mỗi xử lý chỉ xuất hiện một lần duy nhất trong

mỗi khối (Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối không lặp). Ví dụ minh họa cho kiểu bố

trí thí nghiệm này được trình bày trong ví dụ 3.2.8.2.

3.2.2.3. Bố trí thí nghiệm hình vuông Latin

Kiểu bố trí thí nghiệm này thích hợp với những định lượng mà đáp ứng chịu ảnh hưởng

của 2 nguồn gây sai số khác nhau, trong đó mỗi nguồn sai số có k mức hay k vị trí khác

nhau. Ví dụ, trong định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán các xử lý có thể

được sắp thành kk dãy trên một khay lớn, mỗi xử lý chỉ xuất hiện một lần duy nhất

trong mỗi hàng và mỗi cột. Chỉ có thể áp dụng kiểu bố trí thí nghiệm hình vuông Latin

khi số hàng bằng với số cột và số xử lý của mỗi chế phẩm phải bằng nhau.

Các đáp ứng đo được được ghi vào một bảng hình vuông gọi là hình vuông Latin. Sai số

do chênh lệch đáp ứng giữa k hàng và giữa k cột sẽ được tách khỏi sai số toàn phần, do

đó làm giảm sai số của định lượng.

Bảng 3.2.3.-V trình bày công thức tính toán áp dụng cho các định lượng có bố trí thí

nghiệm hình vuông Latin, trong đó mỗi xử lý chỉ xuất hiện một lần duy nhất trong mỗi

hàng và mỗi cột. Ví dụ minh họa cho kiểu bố trí thí nghiệm này được trình bày trong ví

dụ 3.2.8.3.

3.2.2.4. Bố trí thí nghiệm chéo

Kiểu bố trí thí nghiệm này được áp dụng trong trường hợp các đơn vị thí nghiệm có thể

chia thành các khối khác nhau, nhưng mỗi khối chỉ có thể nhận hai xử lý, ví dụ một khối

chỉ gồm một đơn vị thí nghiệm được thử hai lần vào hai thời điểm khác nhau. Mục đích

của kiểu bố trí chéo là làm tăng độ chính xác của định lượng bằng cách loại trừ ảnh

81

hưởng do sự khác biệt giữa các đơn vị thí nghiệm. Nếu định lượng tiến hành với 2 liều

của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng, ta có kiểu thí nghiệm chéo đôi.

Bảng 3.2.2.-I. – Cách sắp xếp các liều trong bố trí thí nghiệm chéo

Nhóm các

đơn vị thí

nghiệm

Giai

đoạn I

Giai đoạn

II

1 s1 u2

2 s2 u1

3 u1 s2

4 u2 s1

Trong thí nghiệm chéo đôi, định lượng được chia thành hai giai đoạn, mỗi giai đoạn tiến

hành vào những thời điểm khác nhau. Các đơn vị thí nghiệm được chia thành bốn nhóm,

mỗi nhóm nhận một trong bốn xử lý ở giai đoạn đầu của thí nghiệm. Đơn vị nhận một

chế phẩm trong giai đoạn đầu sẽ nhận chế phẩm khác trong giai đoạn sau, các đơn vị

nhận liều thấp trong giai đoạn đầu sẽ nhận liều cao trong giai đoạn sau. Cách sắp xếp các

liều cho ở Bảng 3.2.2.-I. Ví dụ minh họa cho kiểu bố trí thí nghiệm này được trình bày

trong ví dụ 3.2.8.4.

3.2.3. Phân tích phƣơng sai

Mục này trình bày các công thức cần thiết để phân tích phương sai. Người đọc sẽ dễ hiểu

hơn nếu tham khảo thêm các ví dụ ở mục 3.2.8 và các ký hiệu thuật ngữ ở mục 6.

Các công thức trình bày ở đây có thể áp dụng cho các định lượng đối xứng trong đó một

hay nhiều chế phẩm cần thử (U, …, Z) được so sánh với cùng một chế phẩm chuẩn S, với

điều kiện định lượng phải đáp ứng được các điều kiện sau: 1) tỷ lệ giữa các liều kế tiếp

nhau của tất cả các chế phẩm phải là một hằng số, 2) số xử lý của mỗi chế phẩm và 3) số

đơn vị thí nghiệm trong mỗi xử lý phải bằng nhau (xem mục 3.1.3).

Ngoại trừ một vài khác biệt nhỏ trong cách tính sai số dư, phương pháp phân tích các số

liệu của mỗi định lượng sinh học về cơ bản là giống nhau đối với các kiểu bố trí thí

nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn, ngẫu nhiên theo khối và hình vuông Latin. Bố trí thí

nghiệm chéo có công thức tính hoàn toàn khác và do đó được trình bày trực tiếp trong ví

dụ 3.2.8.4.

Để chuẩn bị số liệu cho phân tích phương sai, đầu tiên phải tính tổng đáp ứng của mỗi

liều, tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (linear contrast) của mỗi chế phẩm, đối với

82

các định lượng có nhiều hơn hai liều của mỗi chế phẩm, cần tính thêm tương phản bậc

hai (quadratic contrast). Các Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II và 3.2.3.-III trình bày các công thức

tính đó.

Bảng 3.2.3.-I. – Công thức tính toán cho các định lượng mỗi chế phẩm có hai liều

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm thử thứ

nhất U

Chế phẩm thử thứ (h –

1)

Z

Tổng đáp ứng

của liều thấp S1 U1 Z1

Tổng đáp ứng

của liều cao S2 U2 Z2

Tổng đáp ứng

của chế phẩm S1 + S2 = S U1 + U2 = U Z1 + Z2 = Z

Tương phản

tuyến tính S2 – S1 = LS U2 – U1 = LU Z2 – Z1 = LZ

Bảng 3.2.3.-II. – Công thức tính toán cho các định lượng mỗi chế phẩm có ba liều

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm thử thứ

nhất U

Chế phẩm thử thứ (h –

1)

Z

Tổng đáp ứng

của liều thấp S1 U1 Z1

Tổng đáp ứng

của liều trung

bình

S2 U2 Z2

Tổng đáp ứng

của liều cao S3 U3 Z3

Tổng đáp ứng

của chế phẩm S1 + S2 + S3 = S U1 + U2 + U3 = U Z1 + Z2 + Z3 = Z

Tương phản

tuyến tính S3 – S1 = LS U3 – U1 = LU Z3 – Z1 = LZ

Tương phản

bậc hai

S1 – 2S2 + S3 = QS U1 – 2U2 + U3 =

QU

Z1 – 2Z2 + Z3 = QZ

Bảng 3.2.3.-III. – Công thức tính toán cho các định lượng mỗi chế phẩm có bốn liều

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm thử thứ

nhất

U

Chế phẩm thử thứ

(h – 1) Z

Tổng đáp ứng

của liều thấp

nhất

S1 U1 Z1

Tổng đáp ứng

của liều thứ hai S2 U2 Z2

Tổng đáp ứng

của liều thứ ba S3 U3 Z3

Tổng đáp ứng S4 U4 Z4

83

của liều cao

nhất Tổng đáp ứng

của chế phẩm

S1 + S2 + S3 + S4 =

S

U1 + U2 + U3 + U4

= U

Z1 + Z2 + Z3 + Z4 =

Z

Tương phản

tuyến tính

3S4 + S3 – S2 – 3S1

= LS

3U4 + U3 – U2 –

3U1 = LU

3Z4 + Z3 – Z2 – 3Z1

= LZ

Tương phản

bậc hai

S1 - S2 - S3 + S4 =

QS

U1 – U2 – U3 + U4

= QU

Z1 – Z2 – Z3 + Z4 =

QZ

Tương phản

bậc ba

3S2 – S1 + S4 – 3S3

= JS

3U2 – U1 + U4 –

3U3 = JU

3Z2 – Z1 + Z4 – 3Z3

= JZ

Trong bước kế tiếp, sai số toàn phần của định lượng, còn gọi là sai số chung, được phân

tích thành các sai số riêng phần như trình bày ở Bảng 3.2.3.-IV, các tổng các bình

phương được tính từ các giá trị thu được ở các Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II và 3.2.3.-III.

Bảng 3.2.3.-IV Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Nguồn

gây sai số

Bậc tự

do (f)

Tổng các bình phương

2 liều/chế phẩm 3 liều/chế phẩm 4 liều/chế phẩm

Chế

phẩm h - 1 K

n

Z...US

2

222

Kn

Z...US

3

222

Kn

Z...US

4

222

Hồi qui

tuyến tính

1 Enh

L...LL ZUS

2

2

Enh

L...LL ZUS

2

2

Enh

L...LL ZUS

20

2

Tính

không

song

song

h - 1

En

L...LL ZUS

2

222

En

L...LL ZUS

2

222

En

L...LL ZUS

20

222

Tính

không

tuyến

tính (Độ

cong)

h (3

liều)

2h (4

liều)

- n

Q...QQ ZUS

6

222

n

Q...QQ ZUS

4

222

n

J...JJ ZUS

20

222

Tính sai số dư (residual error) bằng cách lấy sai số toàn phần của định lượng trừ đi các

sai số riêng của các nguồn gây sai số khác nhau (Bảng 3.2.3.-V), nguồn gây sai số có thể

nhận dạng được khác nhau tùy theo kiểu bố trí thí nghiệm. Trong Bảng 3.2.3.-V, ∑y2 là

tổng của bình phương của tất cả các đáp ứng đo được của mỗi định lượng, K là số hiệu

chỉnh:

N

yK

2

Kết thúc phân tích phương sai bằng cách chia các tổng các bình phương tính được từ

Bảng 3.2.3.-IV cho bậc tự do tương ứng để được các bình phương trung bình.

Bình phương trung bình của sai số dư cũng được tính theo cách tương tự, dùng số liệu

tương ứng ở Bảng 3.2.3.-V.

84

Bình phương trung bình của mỗi biến số cần kiểm tra sẽ được biểu diễn dưới dạng một tỷ

số với sai số dư s2, gọi là tỷ số F. Đánh giá mức ý nghĩa của các tỷ số F bằng cách so

sánh F tính được (viết tắt là Fcal.) với giá trị F tới hạn (viết tắt là Fcrit.) tra từ Bảng 3.2.4.-I

hay bằng cách dùng các phần mềm vi tính thích hợp. Nếu dùng bảng tra cứu, đọc Fcrit. từ

Bảng 3.2.4.-I tại giao điểm giữa cột tương ứng với bậc tự do của bình phương trung bình

của biến số cần kiểm tra (f1) và hàng tương ứng với bậc tự do của s2 (f2). Biến số cần

kiểm tra được coi là có ý nghĩa nếu Fcal. > Fcrit. ở xác suất P = 0,05 hay rất có ý nghĩa nếu

Fcal. > Fcrit. ở xác suất P = 0,01.

Bảng 3.2.3.-V. – Tính sai số dư

Nguồn gây

sai số

Bậc tự

do (f)

Tổng các bình phương

Ngẫu nhiên hoàn

toàn Ngẫu nhiên theo khối Hình vuông Latin

Giữa các xử

lý k – 1 K

n

Z...SS d22

221 K

n

Z...SS d22

221 K

n

Z...SS d22

221

Giữa các

khối (hàng) n – 1 - K

k

R...RR n22

221 K

k

R...RR n22

221

Giữa các

khối (cột) n – 1 - - K

k

C...CC n22

221

Sai số dư Hiệu

số * * *

Sai số toàn

phần N – 1 Ky2 Ky2 Ky2

* Lấy sai số toàn phần trừ đi các tổng các bình phương tương ứng của mỗi phương pháp

bố trí thí nghiệm.

3.2.4. Kiểm tra tính có giá trị của định lƣợng

Một định lượng được coi là có giá trị thống kê (statistically valid) nếu:

1) Đại lượng hồi qui tuyến tính rất có ý nghĩa, Fcal. > Fcrit. ở xác suất P = 0,01 (P < 0,01),

chứng tỏ độ dốc của đường ln(liều) – đáp ứng rất khác 0.

2) Đại lượng không tuyến tính (non-linearity) phải không có ý nghĩa, Fcal. < Fcrit. ở xác

suất 0,05 (P > 0,05), chứng tỏ thoả mãn điều kiện 4, tức là các đường ln(liều) – đáp

ứng của chế phẩm chuẩn S và các chế phẩm thử (U,…,Z) thẳng.

85

3) Đại lượng không song song (non-parallelism) phải không có ý nghĩa, Fcal. < Fcrit. ở

xác suất 0,05 (P > 0,05), chứng tỏ định lượng đáp ứng điều kiện 5, hay nói cách khác

các đường ln(liều) – đáp ứng của các chế phẩm thử (U,…,Z) song song với đường

ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm chuẩn S.

Nếu đại lượng không song song có ý nghĩa trong một định lượng có h chế phẩm, kể cả

chế phẩm chuẩn, một trong số các chế phẩm cần thử có thể có độ dốc của đường ln(liều)

– đáp ứng khác với các chế phẩm còn lại. Tính t’ (phép kiểm tra Dunnett) của mỗi chế

phẩm cần định lượng (U, …, Z) theo công thức:

22 ns

LLt US

(3.2.4.-I)

Đối với các định lượng có bốn liều của mỗi chế phẩm, tính t’ theo công thức:

2102 ns

LLt US

So sánh mỗi t’ tính được với giá trị tới hạn đọc từ Bảng 3.2.4.-II, với f1 = h – 1, f2 là bậc

tự do của s2. Nếu t’ có ý nghĩa với một chế phẩm bất kỳ, loại bỏ tất cả các số liệu liên

quan đến chế phẩm đó và lặp lại từ đầu phép kiểm tra tính có giá trị với các chế phẩm còn

lại.

Sai số do chế phẩm không được dùng để kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tuy

nhiên, trong những định lượng mà sai số dư lớn một cách bất thường và tỷ số F của

nguồn gây sai số do chế phẩm rất có ý nghĩa, hoạt lực giả định của chế phẩm cần định

lượng rất khác với hoạt lực thật của nó, cần phải lặp lại định lượng dùng hoạt lực tính

được làm hoạt lực giả định.

Bảng 3.2.4.-I. – Mức ý nghĩa của tỷ số F

f1

1 2 3 4 5 6 7 8 20 ∞

f 2

12 4,7

5

3,8

9

3,4

9

3,2

6

3,1

1

3,0

0

2,9

1

2,8

5

2,5

4

2,30

9,3

3

6,9

3

5,9

5

5,4

1

5,0

6

4,8

2

4,6

4

4,5

0

3,8

6

3,36

15 4,5

4

3,6

8

3,2

9

3,0

6

2,9

0

2,7

9

2,7

1

2,6

4

2,3

3

2,07

8,6

8

6,3

6

5,4

2

4,8

9

4,5

6

4,3

2

4,1

4

4,0

0

3,3

7

2,87

20 4,3

5

3,4

9

3,1

0

2,8

7

2,7

1

2,6

0

2,5

1

2,4

5

2,1

2

1,84

86

8,1

0

5,8

5

4,9

4

4,4

3

4,1

0

3,8

7

3,7

0

3,5

6

2,9

4

2,42

25 4,2

4

3,3

9

2,9

9

2,7

6

2,6

0

2,4

9

2,4

0

2,3

4

2,0

1

1,71

7,7

7

5,5

7

4,6

8

4,1

8

3,8

5

3,6

3

3,4

6

3,3

2

2,7

0

2,17

30 4,1

7

3,3

2

2,9

2

2,6

9

2,5

3

2,4

2

2,3

3

2,2

7

1,9

3

1,62

7,5

6

5,3

9

4,5

1

4,0

2

3,7

0

3,4

7

3,3

0

3,1

7

2,5

5

2,01

40 4,0

8

3,2

3

2,8

4

2,6

1

2,4

5

2,3

4

2,2

5

2,1

8

1,8

4

1,51

7,3

1

5,1

8

4,3

1

3,8

3

3,5

1

3,2

9

3,1

2

2,9

9

2,3

7

1,80

60 4,0

0

3,1

5

2,7

6

2,5

3

2,3

7

2,2

5

2,1

7

2,1

0

1,7

5

1,39

7,08

4,98

4,13

3,65

3,34

3,12

2,95

2,82

2,20

1,60

∞ 3,8

4

3,0

0

2,6

0

2,3

7

2,2

1

2,1

0

2,0

1

1,9

4

1,5

7

1,00

6,63

4,61

3,78

3,32

3,02

2,80

2,64

2,51

1,88

1,00

* Nếu F tính được > F tới hạn, biến số cần kiểm tra được coi là có ý

nghĩa (dòng trên, p = 0,05), hay rất có ý nghĩa (dòng dưới, p = 0,01). f 1

là bậc tự do của tử số, f2 là bậc tự do của mẫu số.

Bảng 3.2.4.-II. – Mức ý nghĩa của t’

f1 = (h – 1) = số chế phẩm cần định lượng

f2 1 2 3 4 5 6 7 8 9

5 2,57 3,03 3,29 3,48 3,62 3,73 3,82 3,90 3,97

6 2,45 2,86 3,10 3,26 3,39 3,49 3,57 3,64 3,71

7 2,36 2,75 2,97 3,12 3,24 3,33 3,41 3,47 3,53

8 2,31 2,67 2,88 3,02 3,13 3,22 3,29 3,35 3,41

9 2,26 2,61 2,81 2,95 3,05 3,14 3,20 3,26 3,32

10 2,23 2,57 2,76 2,89 2,99 3,07 3,14 3,19 3,24

11 2,20 2,53 2,72 2,84 2,94 3,02 3,08 3,14 3,19

12 2,18 2,50 2,68 2,81 2,90 2,98 3,04 3,09 3,14

13 2,16 2,48 2,65 2,78 2,87 2,94 3,00 3,06 3,10

14 2,14 2,46 2,63 2,75 2,84 2,91 2,97 3,02 3,07

15 2,13 2,44 2,61 2,73 2,82 2,89 2,95 3,00 3,04

16 2,12 2,42 2,59 2,71 2,80 2,87 2,92 2,97 3,02

87

17 2,11 2,41 2,58 2,69 2,78 2,85 2,90 2,95 3,00

18 2,10 2,40 2,56 2,68 2,76 2,83 2,89 2,94 2,98

19 2,09 2,39 2,55 2,66 2,75 2,81 2,87 2,92 2,96

20 2,09 2,38 2,54 2,65 2,73 2,80 2,86 2,90 2,95

24 2,06 2,35 2,51 2,61 2,70 2,76 2,81 2,86 2,90

30 2,04 2,32 2,47 2,58 2,66 2,72 2,77 2,82 2,86

40 2,02 2,29 2,44 2,54 2,62 2,68 2,73 2,77 2,81

60 2,00 2,27 2,41 2,51 2,58 2,64 2,69 2,73 2,77

120 1,98 2,24 2,38 2,47 2,55 2,60 2,65 2,69 2,73

∞ 1,96 2,21 2,35 2,44 2,51 2,57 2,61 2,65 2,69

Nếu định lượng thỏa mãn các phép kiểm tra tính có giá trị, hay nói cách khác, định lượng

có giá trị thống kê, có thể tiếp tục tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy bằng các phương

pháp mô tả trong mục kế tiếp.

3.2.5. Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

Để tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy, trước hết phải tính đáp ứng trung bình của mỗi

chế phẩm )y...,,y,y( ZUS :

S

SN

Sy (3.2.5.-1)

Tiến hành tương tự như vậy với các chế phẩm khác.

Gọi I là khoảng cách giữa ln các liều kế tiếp nhau của một chế phẩm bất kỳ (I là hằng số

trong một định lượng), ví dụ I = ln(S2) – ln(S1), độ dốc chung (b) của một định lượng bao

gồm h chế phẩm, mỗi chế phẩm có d liều khác nhau được tính theo công thức:

Inhd

LLLb ZUS

1

... (3.2.5.-2)

Đối với các định lượng mỗi chế phẩm có bốn liều, tính b theo công thức:

Inh

LLLb ZUS

10

...

ln(tỷ lệ hoạt lực) của chế phẩm cần định lượng U được tính theo công thức:

b

yyM SU

U' (3.2.5.-3)

Gọi AU là hoạt lực giả định của chế phẩm U, logarithm hoạt lực của U (MU) sẽ bằng:

UUU AMM ln' (3.2.5.-4)

88

Hoạt lực tính được là ước lượng của hoạt lực thật của chế phẩm cần định lượng. Các giới

hạn tin cậy của hoạt lực tính được là khoảng có khả năng chứa hoạt lực thật của chế

phẩm cần định lượng với xác suất 95 %. Logarithm của các giới hạn tin cậy được tính

theo công thức sau:

22

2' 11

lntsE

yy

NNb

CstCMA US

US

UU (3.2.5.-5)

với: 22tsE

EC (3.2.5.-6)

E là giá trị tính được từ Bảng 3.2.3.-IV, tính s2 bằng cách chia tổng các bình phương của

biến số sai số dư trong Bảng 3.2.5.-V cho bậc tự do tương ứng của nó, t là giá trị đọc

được từ Bảng 5.1 với xác suất P = 0,95 và f là bậc tự do của s2.

Trong những định lượng đối xứng, công thức tính các giới hạn tin cậy có thể đơn giản

hóa thành:

HCMCCMA UUU 21ln2'' (3.2.5.-7)

với: dnb

EH

2

C là tiêu chuẩn đánh giá ý nghĩa của đường hồi qui, trong một định lượng có độ dốc đạt

yêu cầu giá trị của C rất gần với 1. Nếu C < 0 hồi qui tuyến tính không có ý nghĩa.

Tính hoạt lực của chế phẩm U (RU) và các giới hạn tin cậy của nó bằng cách lấy

antilogarithm các giá trị tính được từ các công thức 3.2.5.-4 và 3.2.5.-7.

UU MantiR ln (3.2.5.-8)

HCMCCMAantiFL UUUU 21lnln2'' (3.2.5.-9)

HCMCCMAantiFL UUUL 21lnln2'' (3.2.5.-10)

FLU là giới hạn tin cậy trên và FLL là giới hạn tin cậy dưới của hoạt lực tính được RU.

Nếu nồng độ dung dịch gốc của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử không hoàn toàn

giống nhau, phải hiệu chỉnh hoạt lực tính được và các giới hạn tin cậy với một hệ số, gọi

là hệ số hiệu chỉnh (xem ví dụ 3.2.8.3). Hệ số hiệu chỉnh là tỷ số giữa nồng độ dung dịch

gốc của chất chuẩn và nồng độ dung dịch gốc của mỗi chế cần định lượng.

3.2.6. Các giá trị bị mất

89

Trong những định lượng đối xứng, một sự cố ngẫu nhiên có thể dẫn đến việc mất một

hay nhiều giá trị đo, ví dụ động vật thí nghiệm chết, vòng vô khuẩn bị méo không đo

được, … Nếu sự cố xảy ra không liên quan đến thành phần của chế phẩm cần thử, vẫn có

thể tính được kết quả định lượng một cách chính xác, tuy nhiên khi đó các công thức tính

toán sẽ trở nên rất phức tạp. Để có thể tiếp tục dùng các công thức tính toán đơn giản của

bố trí thí nghiệm đối xứng, có thể phục hồi tính đối xứng của định lượng bằng một trong

hai cách sau:

1) Nếu số đáp ứng của mỗi xử lý đủ lớn, giảm số đáp ứng trong các xử lý có số đáp ứng

lớn hơn cho đến khi số đáp ứng của tất cả các xử lý bằng nhau. Nếu động vật thí nghiệm

đã được chỉ định một cách ngẫu nhiên cho mỗi xử lý, bỏ một hay vài đáp ứng, được chọn

ngẫu nhiên, từ các xử lý có số đáp ứng lớn sẽ làm cho định lượng trở thành đối xứng. Đối

với các định lượng bố trí thí nghiệm theo kiểu ngẫu nhiên theo khối, cách đơn giản nhất

là bỏ tất cả các đáp ứng của khối có giá trị bị mất. Ví dụ, chỉ giữ lại kết quả đo của các

hộp Petri có đủ 6 vòng vô khuẩn trong định lượng kháng sinh 3 + 3 bằng phương pháp

khuếch tán, dùng hộp Petri.

2) Thay các giá trị bị mất bằng các giá trị tính được từ những giá trị còn lại. Công thức

tính các giá trị mất được trình bày ở bên dưới, bậc tự do của sai số toàn phần và sai số dư

sẽ phải giảm đi một đơn vị cho mỗi giá trị bị mất. Cần nhớ rằng đây chỉ là phương pháp

gần đúng, phương pháp chính xác luôn luôn cho kết quả đáng tin cậy hơn.

Nếu có nhiều quan sát bị mất, thay tất cả các giá trị bị mất, trừ một quan sát, bằng các giá

trị ước lượng thô và dùng công thức thích hợp để tính giá trị của quan sát đó dựa trên các

giá trị còn lại, kể cả các giá trị ước lượng thô. Thay quan sát bị mất bằng giá trị vừa tính

được. Tiếp tục tính theo cách trên với giá trị ước lượng thô thứ nhất … Sau khi đã thay

thế tất cả các quan sát bị mất, lặp lại từ đầu chu trình tính toán cho đến khi hai chu trình

kế tiếp nhau cho cùng kết quả.

Kết quả phân tích chỉ được chấp nhận nếu số các giá trị thay thế tương đối nhỏ (nhỏ hơn

5 %) so với tổng số đáp ứng của toàn bộ định lượng. Cần đặc biệt thận trọng trong trường

hợp các giá trị bị mất có khuynh hướng tập trung trong một xử lý hay một khối nhất định.

Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn

Trong kiểu bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn, thay giá trị bị mất bằng trung bình số

học của các đáp ứng khác trong cùng xử lý.

Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối

90

Giá trị bị mất (y’) được tính bằng công thức:

11

''''

kn

GkTnBy (3.2.6.-1)

Trong đó B’ là tổng đáp ứng của khối chứa giá trị bị mất, T’ là tổng đáp ứng của xử lý

chứa giá trị bị mất, G’ là tổng tất cả các đáp ứng còn lại trong định lượng.

Để minh họa, giả sử giá trị của u1 trong khối thứ nhất (trong trường hợp này là hàng hay

hộp Petri) ở ví dụ 3.2.8.2, Bảng 3.2.8.2.-II bị mất (u1 = 174). Với:

B’ = 1.050

T’ = 869

G’ = 7.189

k = 6

n = 6

y’ = 173. Dùng giá trị tính được 173 thay cho đáp ứng của u1 trong hộp số 1 của Bảng

3.2.8.2.-II và tiếp tục tính toán như trình bày trong ví dụ 3.2.8.2 nhưng với bậc tự do của

sai số toàn phần là 34, và bậc tự do của sai số dư là 24.

Bố trí thí nghiệm hình vuông Latin

Giá trị bị mất (y’) được tính bằng công thức:

21

'2''''

kk

GTCBky (3.2.6.-2)

Trong đó, B’ và C’ là tổng các đáp ứng trong hàng và cột chứa giá trị bị mất. Trong bố trí

thí nghiệm hình vuông Latin k = n. Giả sử giá trị 161 của đáp ứng ở cột thứ 1 và hàng thứ

1 trong Bảng 3.2.8.3.-II, ví dụ 3.2.8.3 bị mất, nó sẽ được thay thế bởi giá trị 150 tính

được bằng công thức 3.2.6.-2 với:

B’ = 890

C’ = 876

T’ = 791

G’ = 6.175

k = 6

Các bậc tự do sẽ bị giảm xuống còn 19 đối với sai số dư và 34 đối với sai số toàn phần.

Bố trí thí nghiệm chéo

Nếu có giá trị bị mất trong kiểu bố trí thí nghiệm chéo phải tham khảo các tài liệu thống

kê vì công thức tính sẽ rất khác nhau tùy theo cách phối hợp các xử lý.

91

3.2.7. Các định lƣợng đối xứng một phần

Nếu hoạt lực giả định của chế phẩm cần định lượng, là hoạt lực được dùng để tính lượng

chế phẩm thử cần lấy khi pha các dung dịch thử của chế phẩm thử, khác xa với hoạt lực

thật, nồng độ cao nhất hoặc nồng độ thấp nhất của chế phẩm thử có thể nằm lọt ra ngoài

vùng tuyến tính của đường ln(liều) – đáp ứng, do đó định lượng sẽ không có giá trị thống

kê do không thỏa mãn tính tuyến tính và/hoặc tính song song.

Có thể tính hoạt lực từ các số liệu còn lại, sau khi loại bỏ các đáp ứng của nồng độ cao

nhất hoặc nồng độ thấp nhất của chế phẩm thử và dùng hoạt lực tính được để giả định lại

hoạt lực của chế phẩm thử cho sát với hoạt lực thật hơn trong lần định lượng kế tiếp.

Logarithm tỷ lệ hoạt lực được tính bằng công thức:

2

' I

b

yyM SU

U (3.2.7.-1)

Công thức trên rất giống với phương trình 3.2.5.-3, tuy nhiên, ln(tỷ lệ hoạt lực) sẽ bị trừ

đi một đại lượng bằng I/2 nếu bỏ nồng độ thấp nhất, và cộng thêm I/2 nếu bỏ nồng độ cao

nhất.

Tính các đáp ứng trung bình Sy và Uy theo cách tương tự như định lượng cân xứng hoàn

toàn (phương trình 3.2.5.-1), nhưng công thức tính độ dốc (b) có một số biến đổi tùy theo

bố trí thí nghiệm.

Trong định lượng nhiều chế phẩm, mỗi chế phẩm có 2 liều, tính độ dốc bằng công thức:

)1(

...

hIn

LLb ZS (3.2.7.-2)

Chú ý: trong công thức trên, tử số không bao gồm LU vì chế phẩm U chỉ còn một nồng

độ.

Đối với định lượng chỉ có một chế phẩm thử:

In

Lb S (3.2.7.-3)

Trong định lượng đa chế phẩm, mỗi chế phẩm có 3 liều, tính các tương phản tuyến tính

(LS, …, LZ) theo công thức cho ở Bảng 3.2.3.-II, riêng LU tính bằng công thức ở Bảng

3.2.3.-I. Công thức tính độ dốc sẽ là:

)34(

...2

hIn

LLLb UZS (3.2.7.-4)

Đối với định lượng chỉ có một chế phẩm thử, công thức trên trở thành:

92

In

LLb US

5

2 (3.2.7.-5)

3.2.8. Các ví dụ

Mục này trình bày một số ví dụ minh họa cách sử dụng các công thức tính toán liên quan

đến mô hình đường thẳng song song.

Các ví dụ giới thiệu ở đây chỉ nhằm mục đích minh họa cho các phương pháp tính toán

thống kê và không phải là phương pháp bắt buộc phải áp dụng nếu chuyên luận riêng cho

phép dùng phương pháp khác.

Để có thể sử dụng các ví dụ trong chuyên luận này như nguồn số liệu chuẩn phục vụ cho

việc kiểm tra các chương trình vi tính, thương mại hay tự biên soạn, dùng trong phân tích

thống kê kết quả định lượng sinh học, các kết quả tính toán có thể chứa nhiều số thập

phân hơn mức cần thiết. Có thể dùng phương pháp tính toán khác với phương pháp giới

thiệu trong chuyên luận này, nhưng kết quả cuối cùng phải giống như các kết quả trong

các ví dụ trình bày ở đây.

Ví dụ 3.2.8.1. Định lượng đồng thời nhiều chế phẩm thử, mỗi chế phẩm có 2 liều với bố

trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn

Định lượng corticotrophin bằng phương pháp tiêm dưới da chuột

Liều chỉ định của chế phẩm chuẩn là 0,25 và 1,0 đơn vị cho mỗi 100 g thể trọng chuột thí

nghiệm. Hai chế phẩm thử đều có hoạt lực giả định là 1 đơn vị/mg và có liều chỉ định

giống như chế phẩm chuẩn. Các đáp ứng riêng và đáp ứng trung bình của mỗi nhóm xử

lý cho ở Bảng 3.2.8.1.-I.

Bảng 3.2.8.1.-I - Đáp ứng metameter y - khối lượng Acid ascorbic (mg) trên 100 g tuyến

thượng thận

Chế phẩm

chuẩn S

Chế phẩm thử

U

Chế phẩm thử

Z Tổng số

s1 s2 u1 u2 z1 z2

300 289 310 230 250 236

310 221 290 210 268 213

330 267 360 280 273 283

290 236 341 261 240 269

364 250 321 241 307 251

93

328 231 370 290 270 294

390 229 303 223 317 223

360 269 334 254 312 250

342 233 295 216 320 216

306 259 315 235 265 265

Trung

bình

332,0 248,4 323,9 244,0 282,2 250,0

Phương

sai (vari)

1.026,7 483,8 725,0 718,7 854,6 784,7 4,593.4vari

ln (vari) 6,9341 6,1817 6,5862 6,577

4

6,750

7

6,665

3

6953,39varln i

Bảng 3.2.8.1.-II – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (xem công thức tính ở

Bảng 3.2.3.-I)

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm

thử U

Chế phẩm

thử Z

Tổng số

Liều thấp S1 = 3.320 U1 = 3.239 Z1 = 2.822

Liều cao S2 = 2.484 U2 = 2.440 Z2 = 2.500

Tổng đáp ứng của

chế phẩm S = 5.804 U = 5.679 Z = 5.322 850.16y

Tương phản tuyến

tính LS = -836 LU = -799 LS = -322 957.1L

42,800.706.460

850.16 22

N

yK

447.826.42y

Tính các tổng các bình phương theo công thức trong các Bảng 3.2.3.-IV và 3.2.3.-V dùng

các số liệu tính được ở Bảng 3.3.8.1.-IV:

Chế phẩm 63,256.642,800.706.420

322.5679.5804.5

2

222222

Kn

ZUS

Hồi qui tuyến tính = Enh

LLL ZUS 817,830.6360

322799836

2

...22

Không song song = 233,218.8817,830.6320

322799836

2

...222222

En

LLL ZUS

94

Giữa các xử lý = 68,305.7810

500.2...484.2320.3... 222222

21 K

n

ZSS d

Toàn phần = 58,646.11942,800.706.4447.826.42 Ky

Sai số dư = Toàn phần – Giữa các xử lý = 119.646,58 – 78.305,68 = 41.340,90

Bảng 3.2.8.1.-III – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai số Bậc tự

do

Tổng các

bình

phương

Bình

phương

trung bình

Tỷ số

F

Xác

suất

Chế phẩm 2 6.256,6 3128,3

Hồi qui tuyến tính 1 63.830,8 63.830,8 83,4 < 0,01

Không song song 2 8.218,2 4109,1 5,4 < 0,05

Giữa các xử lý 5 78.305,7

Sai số dư 54 41.340,9 765,6

Sai số toàn phần 59 119.646,6

Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Kết quả phân tích phương sai cho thấy, tỷ số F của biến số hồi qui Fcal = 83,4 rất lớn so với F

tới hạn ở xác suất P = 0,01, f1 = 1 và f2 = 54: F(P = 0,01;f1 = 1;f2 = 54) = 7,131, do đó biến số hồi qui

rất có ý nghĩa.

Biến số không song song cũng có ý nghĩa, Fcal. = 5,4 > F(P = 0,05,f1 = 2,f2 = 54) = 3,17. Khảo sát

Bảng 3.2.8.1.-IV cho thấy chế phẩm Z có tương phản tuyến tính LZ rất khác với LS và LU. Do

đó, có khả năng độ dốc của đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm Z không phù hợp với các

chế phẩm còn lại và là nguyên nhân làm cho định lượng không có giá trị. Kiểm tra giả thuyết

trên bằng phép kiểm tra Dunnett:

Đối với chế phẩm U:

21,0572,765102

799836

2 2ns

LLt US

Đối với chế phẩm Z:

94,2572,765102

322836

2 2ns

LLt ZS

Đối với chế phẩm Z, 94,2t > t’ = 2,27 đọc từ Bảng 3.2.4.-II với P = 0,05, f1 = 2 và f2 =

54, do đó đường ln(liều) – đáp ứng của nó không song song với đường ln(liều) – đáp ứng

1 Vì Bảng 3.2.4.-I không có f2 = 54, nên giá trị F tới hạn được tính bằng hàm FINV(p,f1,f2) của chương trình Bảng tính

Excel. Có thể tính các F tới hạn khác theo cách tương tự hoặc sử dụng các bảng tra cứu chi tiết hơn.

95

của chế phẩm chuẩn. Loại các số liệu liên quan đến chế phẩm Z và lặp lại phân tích chỉ

với chế phẩm U và chế phẩm chuẩn, với 483.11y và 635.1L .

255,482.296.340

438.11 22

N

yK

325.390.32y

Bảng 3.2.8.1.-IV – Phân tích phương sai không có chế phẩm Z

Nguồn gây sai

số

Bậc tự

do

Tổng các

bình

phương

Bình

phương

trung bình

Tỷ số

F

Xác

suất

Chế phẩm 1 390,6 390,6

Hồi qui tuyến

tính

1 66.830,6 66.830,6 90,5 < 0,01

Không song

song

1 34,2 34,2 0,05 > 0,05

Giữa các xử

lý

3 67.255,5

Sai số dư 36 26.587,3 738,54

Sai số toàn

phần

39 93.842,8

Sau khi loại chế phẩm Z, kết quả phân tích phương sai cho thấy định lượng có giá trị

thống kê.

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

2,29020

804.5

S

SN

Sy

95,28320

679.5

U

UN

Sy

Tỷ lệ giữa các liều kế tiếp nhau bằng 1,0/0,25 = 4, do đó I = ln(4) = 1,3863, t = 2,03 với

P = 0,95 và f = 36 (Bảng 5.1).

970,5820

635.1

IInh

LLb US

1060,0970,58

2,29095,283

b

yyM SU

U

Hoạt lực giả định AU của chế phẩm U là 1 đơn vị/mg, do đó:

96

1060,001060,0ln UUU AMM

Hoạt lực của chế phẩm U bằng antiln (MU) = antiln (0,1060) = 1,11 đơn vị/mg.

0477,103,25,7386,830.66

6,830.66222tsE

EC

969091,0102)970,58(

6,830.6622dnb

EH

09223,0969091,021060,00477,110477,121 22HMCC U

Logarithm các giới hạn tin cậy bằng:

3037,01110,0009223,0ln UU MCA

Các giới hạn tin cậy là 0,82 và 1,51 đơn vị/mg.

Ví dụ 3.2.8.2. Định lượng 3 liều với một chế phẩm thử, bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo

khối không lặp

Định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán dùng hộp Petri

Các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn s1, s2 và s3 có nồng độ lần lượt là 2, 4 và 8 IU/ml.

Chế phẩm thử có hoạt lực giả định là 1.500 IU/ml và cũng được pha thành 3 dung dịch

thử u1, u2 và u3 có nồng độ tương đương với nồng độ các dung dịch thử của chế phẩm

chuẩn. Mỗi hộp Petri đều có 3 dung dịch thử của chế phẩm chuẩn và 3 dung dịch thử của

chế phẩm thử, trong đó mỗi dung dịch thử chỉ xuất hiện một lần duy nhất (không lặp).

Trật tự sắp xếp các dung dịch thử trong mỗi hộp hoàn toàn ngẫu nhiên và không giống

nhau giữa các hộp (xem Bảng 3.2.8.2.-I).

Các đáp ứng riêng và đáp ứng trung bình của mỗi dung dịch thử cho ở Bảng 3.2.8.2.-II.

Bảng 3.2.8.2.-I – Cách bố trí các dung dịch thử

Hộ

p

số

Trật tự sắp xếp các nồng độ của S

và U trong mỗi hộp Petri

1 u2 u3 s3 s1 u1 s2

2 s3 u1 s2 u3 s1 u2

3 u3 u2 s1 s3 s2 u1

4 s1 s2 u3 u1 u2 s3

5 u1 s1 u2 s2 s3 u3

6 s2 s3 u1 u2 u3 s1

97

Bảng 3.2.8.2.-II - Đáp ứng y – đường kính vòng vô khuẩn ( 10mm )

Hộp số Chế phẩm chuẩn S Chế phẩm thử U Tổng

khối s1 s2 s3 u1 u2 u3

1 176 205 235 174 202 232 R1 =

1224

2 178 208 238 175 206 234 R2 =

1239

3 178 207 237 177 203 236 R3 =

1238

4 175 205 235 173 201 232 R4 =

1221

5 176 206 235 174 204 231 R5 =

1226

6 174 204 236 170 202 229 R6 =

1215

Trung

bình

176,2 205,8 236,0 173,8 203,0 232,3

Phương

sai

2,6 2,2 1,6 5,4 3,2 5,9

Kiểm tra số liệu thu được bằng các phép kiểm tra tương tự như ở ví dụ 3.2.8.1 cho thấy

định lượng đáp ứng các điều kiện ở mục 3.1.1.

03,938.505.136

363.7 22

N

yK

127.527.12y

Bảng 3.2.8.2.-III – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (xem công thức tính ở

Bảng 3.2.3.-II)

Chế phẩm

chuẩn S

Chế phẩm

thử U

Tổng số

Liều thấp S1 = 1.075 U1 = 1.043

Liều trung bình S2 = 1.235 U2 = 1.218

98

Liều cao S3 = 1.416 U3 = 1.394

Tổng đáp ứng

của chế phẩm S = 3.708 U = 3.655 363.7y

Tương phản

tuyến tính LS = 359 LU = 351 710L

Tương phản bậc

hai QS = 3 QU = 1 4Q

Các tổng các bình phương được tính bằng các công thức trong Bảng 3.2.3.-IV và 3.2.3.-V

với các giá trị ở Bảng 3.2.8.2.-III.

Chế phẩm 026,7818

22

KUS

Hồi qui tuyến tính = ELL US 167,004.21

24

2

Không song song = 666,212

22

ELL US

Độ cong = 278,036

13

6

2222

n

QQ US

Giữa các xử lý = 137,085.216

23

22

21

23

22

21 K

UUUSSS

Giữa các khối = 805,756

26

25

24

23

22

21 K

RRRRRR

Toàn phần = 97,188.212 Ky

Sai số dư = Toàn phần – Giữa các xử lý – Giữa các khối = 28,03

Bảng 3.2.8.2.-IV – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai

số

Bậc tự

do

Tổng các

bình

phương

Bình

phương

trung bình

Tỷ số

F

Xác

suất

Chế phẩm 1 78,03 78,03

Hồi qui tuyến

tính

1 21.004,17 21.004,17 18.737 < 0,01

Không song

song

1 2,67 2,67 2,4 > 0,05

99

Độ cong 2 0,28 0,16 0,1 > 0,05

Giữa các xử

lý

5 21.085,14

Giữa các khối

(hộp Petri)

5 75,80 15,16 13,5 < 0,01

Sai số dư 25 28,03 1,121

Sai số toàn

phần

35 21.188,97

Kết quả phân tích phương sai cho thấy sự khác nhau có ý nghĩa (P < 0,01) của kích thước

đường kính vòng vô khuẩn giữa các hộp Petri. Nếu thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu

nhiên hoàn toàn, sai số giữa các khối sẽ không được tách ra khỏi sai số toàn phần, do đó

sai số dư s2 sẽ lớn hơn, dẫn đến khoảng tin cậy sẽ rộng hơn. Đây là ưu điểm của bố trí thí

nghiệm ngẫu nhiên theo khối so với bố trí thí nghiệm kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.

Kiểm tra giá trị của định lượng

Hồi qui tuyến tính rất có ý nghĩa (P < 0,01), các đại lượng không song song và độ cong

không có ý nghĩa (P > 0,05), do đó định lượng có giá trị thống kê.

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

18

53

3n

SUyy SU

Tỷ lệ giữa các nồng độ kế tiếp bằng 2,0, do đó:

69315,02lnI

Với P = 0,95 và f = 25, t = 2,06 (Bảng 5.1).

6797,4224

710

2 IInh

LLb US

0690,0b

yyM SU

2442,7500.1ln0690,0ln UAMM

Hoạt lực của chế phẩm U là R = antiln(M) = 1.400 IU/ml.

0002,106,2121,117,004.21

17,004.21222tsE

EC

640605,063)6797,42(

17,004.2122dnb

EH

00026,0640605,020690,00002,110002,12122 HMCC

100

Các ln(giới hạn tin cậy) bằng:

0160,02442,700026,00690,00002,1500.1ln00026,0ln MCAU

Các giới hạn tin cậy bằng 1.378 và 1.423 IU/ml.

Nếu phân tích bằng máy tính, các kết quả sẽ là:

000227,1C

00029128,021 2 HMCC

Khoảng tin cậy: 1.376,3 – 1.424,1 IU/ml.

Ví dụ 3.2.8.3. Định lượng 3 liều với một chế phẩm thử, bố trí thí nghiệm theo hình vuông

Latin không lặp

Định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán, dùng khay vuông

Chế phẩm chuẩn có hoạt lực biết trước 4.855 IU/mg. Chế phẩm thử có hoạt lực giả định

là 5.600 IU/mg. Pha các dung dịch gốc bằng cách hòa tan 25,2 mg chế phẩm chuẩn và

21,4 mg chế phẩm thử trong lượng vừa đủ dung môi pha loãng để được 25 ml. Sau đó,

pha loãng các dung gốc đến nồng độ pha loãng 1/20 và tiếp tục pha loãng xa hơn với tỷ lệ

pha loãng 1:1,5 để được các dung dịch thử cuối cùng của chuẩn và mẫu.

Các dung dịch thử của chuẩn và mẫu được bố trí trên khay theo bố trí thí nghiệm hình

vuông Latin như trong Bảng 3.2.8.3.-I. Các đường kính vòng vô khuẩn của định lượng

trình bày trong Bảng 3.2.8.3.-II. Trung bình đường kính vòng vô khuẩn, phương sai (vari)

và ln(vari) của mỗi nhóm dung dịch thử trình bày trong Bảng 3.2.8.3.-III.

Bảng 3.2.8.3.-I. Cách bố trí các dung dịch thử trên khay

1 2 3 4 5 6

1 s1 u1 u2 s3 s2 u3

2 u1 u3 s1 s2 u2 s3

3 u2 s3 s2 s1 u3 u1

4 s3 s2 u3 u1 s1 u2

5 s2 u2 s3 u3 u1 s1

6 u3 s1 u1 u2 s3 s2

Kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai

Đối với một nhóm gồm k phương sai, trong đó mỗi phương sai có f = ( n – 1) bậc tự do,

công thức tính sẽ như sau:

101

13

varlnvar

ln3 2

2

kkf

kkkf i

i

Với k = 6, bậc tự do f = 5, công thức trên sẽ rút gọn thành:

78,3494,206

20,209ln6

97

450

varln6

varln6

97

4502i

i

Giá trị tính được nhỏ hơn giá trị tới hạn 11,07 đọc từ Bảng 5.2 với P = 0,95 và f = (k – 1)

= 5. Do đó, sự khác biệt giữa các phương sai của mỗi nhóm dung dịch thử không có ý

nghĩa thống kê.

Bảng 3.2.8.3.-II Đáp ứng y – đường kính vòng vô khuẩn ( 10mm )

1 2 3 4 5 6

Tổng

hàng

1 161 160 178 187 171 194 R1 =

1.051

2 151 192 150 172 170 192 R2 =

1.027

3 162 195 174 161 193 151 R3 =

1.036

4 194 184 199 160 163 171 R4 =

1.071

5 176 181 201 202 154 151 R5 =

1.065

6 193 166 161 186 198 182 R6 =

1.086

Tổng

cột

C1 =

1.037

C2 =

1.078

C3 =

1.063

C4 =

1.068

C5 =

1.049

C6 =

1.041

Bảng 3.2.8.3.-III Trung bình đường kính vòng vô khuẩn và phương sai của mỗi nhóm

dung dịch thử

Chế phẩm chuẩn S Chế phẩm thử U Tổng số

s1 s2 s3 u1 u2 u3

102

161 171 187 160 178 194

150 172 192 151 170 192

161 174 195 151 162 193

163 184 194 160 171 199

151 176 201 154 181 202

166 182 198 161 186 193

Trung bình 158,67 176,50 194,50 156,17 174,67 195,50

Phương sai

(vari) 43,47 28,70 23,50 22,17 75,07 16,30

20,209vari

ln (vari) 3,772 3,357 3,157 3,099 4,318 2,791 494,20varlni

Bảng 3.2.8.3.-IV – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (xem công thức tính ở

Bảng 3.2.3.-II)

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm

thử U

Tổng số

Liều thấp S1 = 952 U1 = 937

Liều trung bình S2 = 1.059 U2 = 1.048

Liều cao S3 = 1.167 U3 = 1.173

Tổng đáp ứng của

chế phẩm S = 3.178 U = 3.158 336.6y

Tương phản tuyến

tính LS = 215 LU = 236 451L

Tương phản bậc

hai QS = 1 QU = 14 15Q

136.115.136

336.6 22

N

yK

692.124.12y

Các tổng các bình phương được tính bằng các công thức trong Bảng 3.2.3.-IV và 3.2.3.-V

với các giá trị ở Bảng 3.2.8.3.-II và Bảng 3.2.8.3.-IV.

Chế phẩm 1111,11136.115.118

158.3178.3

3

2222

Kn

US

Hồi qui tuyến tính = Enh

LL US 0417,475.824

451

2

22

103

Không song song = 3750,180417,475.812

236215

2

2222

En

LL US

Độ cong (không tuyến tính) = 4722,536

15

6

222

n

QQ US

Giữa các xử lý = 510.8136.115.16

173.1...059.1952 22223

22

21

23

22

21 K

n

UUUSSS

Giữa các hàng = 412136.115.16

086.1...027.1051.1 22226

25

24

23

22

21 K

k

RRRRRR

Giữa các cột =

6667,218136.115.16

041.1...078.1037.1 22226

25

24

23

22

21 K

k

CCCCCC

Toàn phần = 556.9136.115.1692.124.12 Ky

Sai số dư = Toàn phần – Giữa các xử lý – Giữa các hàng – Giữa các cột = 415,3333

Bảng 3.2.8.3.-V – Phân tích phương sai

Nguồn gây

sai số

Bậc

tự do

Tổng các

bình

phương

Bình

phương

trung bình

Tỷ số

F

Xác

suất

Chế phẩm 1 11,1111 11,1111

Hồi qui tuyến

tính

1 8.475,0417 8.475,0417 408,1 < 0,01

Không song

song

1 18,3750 18,3750 0,885 > 0,05

Độ cong 2 5,4722 2,7361 0,132 > 0,05

Giữa các xử

lý

5 8510

Giữa các

hàng

5 412 82,40 3.968 < 0,05

Giữa các cột 5 218,6667 43,73 2,106 > 0,05

Sai số dư 20 415,3333 20,7667

Sai số toàn

phần

35 9.556

104

Phân tích phương sai cho thấy sự khác nhau có ý nghĩa (P < 0,05) giữa các hàng chứng tỏ

bố trí thí nghiệm hình vuông Latin cho độ chính xác cao hơn bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên

hoàn toàn.

Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Hồi qui tuyến tính rất có ý nghĩa (P < 0,01), độ lệch khỏi tính tuyến tính và tính song

song của các đường ln(liều) – đáp ứng không có ý nghĩa (P > 0,05), do đó định lượng

thỏa mãn các phép kiểm tra tính có giá trị.

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

Tỷ lệ giữa các nồng độ kế tiếp nhau bằng 1,5, do đó I = ln(1,5) = 0,405465. Với P = 0,95

và f = 20, t = 2,09 (Bảng 5.1).

556,17618

178.3

S

SN

Sy

444,17518

158.3

U

UN

Uy

346,4624

451

2 IInh

LLb US

023974,0346,46

556,176444,175

b

yyM SU

606548,8600.5ln023974,0ln UAMM

Hoạt lực của chế phẩm U là R = antiln(M) = 5.467,3 IU/mg.

0108,109,27667,200417,475.8

0417,475.8222tsE

EC

2192,063346,46

0417,475.822dnb

EH

Các ln(giới hạn tin cậy) được tính theo công thức:

06878,060629,8

2192,02023974,00108,10108,0023974,00108,1600.5ln

21ln

2

2 HMCCMCAU

Các giới hạn tin cậy bằng 5.102,6 và 5.855,1 IU/mg.

Vì các dung dịch gốc của chế phẩm chuẩn và chế phẩm thử không hoàn toàn bằng nhau,

cần hiệu chỉnh hoạt lực tính được và các giới hạn tin cậy bằng cách nhân với một hệ số

hiệu chỉnh:

02091,125/4,21600.5

25/2,25855.4

105

Sau khi hiệu chỉnh, hoạt lực tính được sẽ bằng 5.582 IU/mg với giới hạn tin cậy từ 5.209

đến 5.977 IU/mg ở xác suất 95 %.

Ví dụ 3.2.8.4. Định lượng chéo đôi

Định lượng insulin bằng phương pháp tiêm dưới da thỏ

Các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn có nồng độ 1 và 2 IU/ml. Hoạt lực giả định của

chế phẩm thử là 40 IU/ml và được pha loãng thành các dung dịch thử có nồng độ tương

đương với các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn. Tiêm dưới da các thỏ thí nghiệm với

liều 0,5 ml mỗi dung dịch thử theo sơ đồ ở Bảng 3.2.8.4.-I. Các kết quả thí nghiệm trình

bày trong Bảng 3.2.8.4.-II. Phương sai lớn cho thấy đáp ứng không đồng nhất của các thỏ

thí nghiệm với hoạt chất cần định lượng và giải thích cho sự cần thiết phải dùng bố trí thí

nghiệm chéo.

Bảng 3.2.8.4.-I – Cách sắp xếp các xử lý

Ngày

thí

nghiệm

Nhóm thỏ

1 2 3 4

Ngày I s1 s2 u1 u2

Ngày

II

u2 u1 s2 s1

Kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai bằng phép kiểm tra Hartley

Tính tỷ số F theo công thức:

3,56,230

1,215.1

var

var

.min

.maxF

Trong đó varmax. là phương sai lớn nhất và varmin. là phương sai nhỏ nhất trong k phương

sai cần kiểm tra. F tính được nhỏ hơn F tới hạn bằng 12,7 đọc từ Bảng 5.3 với P = 0,95, k

= 8 và bậc tự do f = 7. Do đó, sự khác nhau giữa các phương sai của mỗi nhóm dung dịch

thử không có ý nghĩa thống kê. Nếu dùng phép kiểm tra Bartlett với cùng số liệu, giá trị

tính được sẽ là 6,4 so với giá trị tới hạn bằng 14,1.

Trong các định lượng bố trí thí nghiệm chéo, các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính

được tính riêng rẽ cho mỗi giai đoạn thí nghiệm. Kết quả tính toán trình bày trong Bảng

3.2.8.4.-III.

Bảng 3.2.8.4.-II – Đáp ứng y: glucose huyết (mg/100 ml) ở 1 và 1½ giờ

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4

106

s1 u2 Tổng

số s2 u1

Tổng

số u1 s2

Tổng

số u2 s1

Tổng

số

112 104 216 65 72 137 105 91 196 118 144 262

126 112 238 116 160 276 83 67 150 119 149 268

62 58 120 73 72 145 125 67 192 42 51 93

86 63 149 47 93 140 56 45 101 64 107 171

52 53 105 88 113 201 92 84 176 93 117 210

110 113 223 63 71 134 101 56 157 73 128 201

116 91 207 50 65 115 66 55 121 39 87 126

101 68 169 55 100 155 91 68 159 31 71 102

Trung

bình

95,6 82,8 69,6 93,3 89,9 66,6 72,4 106,8

Phương

sai

709,7 627,9 525,1 1.012,5 479,6 230,6 1.214,3 1.215,1

Bảng 3.2.8.4.-III – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính

Chế phẩm

chuẩn S

Chế phẩm

thử U

Tổng số

Ngày I

Nồng độ thấp S1I = 765 U1I = 719

Nồng độ cao S2I = 557 U2I = 579

Tổng số SI = 1.322 UI = 1.298 DI = 2.620

Ngày II

Nồng độ thấp S1II = 854 U1II = 746

Nồng độ cao S2II = 533 U2II = 662

Tổng số SII = 1.387 UII = 1.408 DII = 2.795

Tổng chế phẩm S = 2.709 U = 2.706 415.5y

Tương phản tuyến

tính

107

Ngày I LSI = -208 LUI = -140 LI = -348

Ngày II LSII = -321 LUII = -84 LII = -405

Tổng số LS = -529 LU = -224 753L

Phân tích phương sai trong các định lượng bố trí thí nghiệm chéo phức tạp hơn các kiểu

bố trí thí nghiệm khác do độ phân tán, biểu diễn bằng tổng các bình phương, gây bởi tính

song song không độc lập với độ phân tán giữa các đơn vị thí nghiệm (trong ví dụ này là

thỏ). Tính song song của các đường hồi qui sẽ được kiểm tra bằng một đại lượng sai số

bình phương trung bình phụ, được tính bằng cách lấy tổng các bình phương giữa các thỏ

thí nghiệm trừ đi thành phần song song và hai thành phần tương tác.

Ba thành phần tương tác được đưa thêm vào phân tích phương sai gây bởi sự lặp lại trong

mỗi nhóm thỏ thí nghiệm, gồm:

giữa các ngày chế phẩm; giữa các ngày hồi qui; giữa các ngày tính song song.

Ba đại lượng này biểu thị khuynh hướng biến thiên từ ngày thí nghiệm này sang ngày thí

nghiệm khác của các nguồn gây sai số do chế phẩm, hồi qui và tính song song. Giá trị

thống kê của định lượng phụ thuộc vào mức ý nghĩa của các tỷ số F tương ứng của ba đại

lượng nói trên. Nếu F tính được rất có ý nghĩa, Fcal. > Fcrit. ở P = 0,01, cần phải rất thận

trọng khi suy diễn các kết quả của định lượng, nếu có thể, phải lặp lại định lượng.

77,159.45864

415.5 22

N

yK

583.5112y

Tính giá trị của tổng các bình phương của chế phẩm, hồi qui và không song song theo

công thức trong Bảng 3.2.3.-IV với số liệu trong Bảng 3.2.8.4.-III.

Chú ý trong định lượng này n = 16, là tổng số đáp ứng của mỗi xử lý qua hai ngày thí

nghiệm.

Chế phẩm 14,077,159.45832

706.2709.2

2

2222

Kn

US

Hồi qui tuyến tính = Enh

LL US 52,859.864

753

2

22

Không song song = 51,453.152,859.832

224529

2

2222

En

LL US

Giữa các khối (thỏ) = 73,794.3977,159.4582

102...238216

2

2222

KBi

trong đó Bi là các tổng đáp ứng của mỗi thỏ thí nghiệm trong Bảng 3.2.8.4.-II.

108

Giữa các ngày = 51,47877,159.45832

795.2620.2

2

2222

Kn

DD III

trong đó DI và DII là tổng đáp ứng của mỗi ngày thí nghiệm.

Giữa các ngày Chế phẩm = 64,3164

408.1298.1387.1322.1 22222

N

UUSS IIIIII

trong đó SI, SII, UI và UII là tổng đáp ứng của từng chế phẩm trong mỗi ngày.

Giữa các ngày hồi qui = 77,5064

1408420832122

N

LLLL UIUIISISII

Giữa các ngày Không song song =

27,44664

1408420832122

N

LLLL UIUIISISII

trong đó LSI, LSII, LUI và LUII là tương phản tuyến tính của mỗi ngày thí nghiệm.

Toàn phần = 23,423.5377,159.458583.5112 Ky

Sai số dư giữa các thỏ = Giữa các khối – Không song song – (giữa các ngày chế phẩm)

– (giữa các ngày hồi qui) = 39.794,73 – 1.453,51 – 31,64 – 50,76 = 38.258,81

Sai số dư trong mỗi thỏ = Toàn phần – Giữa các khối – Giữa các ngày – Chế phẩm – Hồi

qui – (giữa các ngày không song song) = 53.423,23 – 39.794,73 – 478,51 – 0,14 –

8.859,52 – 446,27 = 3.844,06

Tính có giá trị của định lượng

Phân tích phương sai cho thấy định lượng thỏa mãn phép kiểm tra tính có giá trị:

1) Hồi qui tuyến tính rất có ý nghĩa: tỷ số F của đại lượng hồi qui được tính dựa trên sai

số bình phương trung bình trong mỗi thỏ, Fcal. = 64,5 > Fcrit. = 7,63 với P = 0,01, f1 =

1 và f2 = 28.

2) Tính song song của đường hồi qui: phép kiểm tra tính song song trong định lượng

chéo dựa trên sai số bình phương trung bình giữa các thỏ, Fcal. = 1,06 < F(P = 0,05, f1 = 1, f2

= 28) = 4,19, chứng tỏ các đường ln(liều) – đáp ứng của chuẩn và mẫu song song với

nhau.

3) Ba thành phần tương tác đều không có ý nghĩa, các tỷ số F tính được lần lượt là 0,02,

0,04 và 3,25 và đều nhỏ hơn Fcrit. = 4,19.

Bảng 3.2.8.4.-IV – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai số Bậc tự

do

Tổng các

bình

Bình

phương Tỷ số F

Xác

suất

109

phương trung bình

Không song song 1 1.453,5 1.453,5 1,06 > 0,05

Giữa các ngày chế

phẩm

1 31,6 31,6 0,02 > 0,05

Giữa các ngày hồi

qui

1 50,8 50,8 0,04 > 0,05

Sai số dư giữa các

thỏ

28 38.258,8 1.366,4

Giữa các khối (thỏ) 31 39.794,7 1.283,7

Chế phẩm 1 0,1 0,1 0,00 > 0,05

Hồi qui 1 8.859,5 8.859,5 64,5 < 0,01

Giữa các ngày 1 478,5 478,5 3,48 > 0,05

Giữa các ngày

không song song

1 446,3 446,3 3,25 > 0,05

Sai số dư trong mỗi

thỏ

28 3.844,1 137,3

Toàn phần 63 53.423,2 847,9878472

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

Tỷ lệ pha loãng bằng 2, do đó I = ln(2) = 0,69315. Với P = 0,95 và f = 28, t = 2,05 (Bảng

5.1).

32

3

32

709.2706.2

2n

SUyy SU

948,3332

753

2 InI

LLb US

00276,0948,3332

3

b

yyM SU

6916,340ln00276,0ln UAMM

Hoạt lực R = antiln(M) = antiln(0,00276) = 40,1 IU/ml.

0697,105,23,1375,859.8

5,859.8222tsE

EC

24023,0162948,33

5,859.822dnb

EH

033488,024023,0200276,00697,10697,021 22 HMCC

110

Logarithm các giới hạn tin cậy bằng:

1830,06918,3033488,0ln MCAU

Giới hạn tin cậy của hoạt lực từ 33,4 đến 48,2 IU/ml.

4. Phối hợp các kết quả định lƣợng

4.1. Mở đầu

Để đáp ứng các yêu cầu của Dược điển, ví dụ yêu cầu về độ chính xác, có thể phải lặp lại

hai hay nhiều định lượng độc lập và phối hợp các kết quả định lượng để được kết quả

cuối cùng chính xác và đáng tin cậy hơn.

Hai định lượng được coi là độc lập với nhau nếu quá trình thực hiện của mỗi định lượng

không gây bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả của định lượng khác. Điều đó có nghĩa là

các sai số ngẫu nhiên của các yếu tố chủ yếu có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng (ví

dụ: sự chuẩn bị các dung dịch thử của chuẩn và mẫu thử, độ nhạy của chỉ thị sinh học)

của một định lượng phải độc lập với các sai số ngẫu nhiên tương ứng của định lượng kia.

Các định lượng thực hiện vào những ngày kế tiếp nhau dùng cùng dung dịch gốc của chế

phẩm chuẩn không phải là những định lượng độc lập.

Có nhiều phương pháp phối hợp kết quả của các định lượng độc lập, tuy nhiên, dưới đây

chỉ trình bày ba phương pháp gần đúng do tính đơn giản và dễ áp dụng của chúng.

Trước khi phối hợp, các hoạt lực phải được hiệu chỉnh với hoạt lực giả định của mỗi chế

phẩm thử (xem ví dụ 3.2.8.3) và phải được biểu diễn dưới dạng logarithm.

4.2. Phối hợp cân chỉnh các kết quả định lƣợng (weighted combination)

Phương pháp này có thể áp dụng nếu thỏa mãn các điều kiện sau:

1) các định lượng phải độc lập với nhau;

2) đại lượng C của mỗi định lượng phải nhỏ hơn 1,1 (xem công thức 3.2.5-6 để biết công

thức tính và ý nghĩa của C);

3) bậc tự do của sai số dư của mỗi định lượng phải lớn hơn 6, tốt nhất là lớn hơn 15;

4) sự khác nhau giữa các hoạt lực cần phối hợp phải không có ý nghĩa thống kê (xem

mục 4.2.2).

Nếu các điều kiện trên không thỏa mãn, dùng phương pháp giới thiệu ở mục 4.3 để tính

hoạt lực trung bình và lấy kết quả tính được làm hoạt lực giả định cho lần định lượng kế

tiếp.

4.2.1. Tính các hệ số cân chỉnh W

111

Giả sử các kết quả đo của mỗi n’ định lượng đã được phân tích để được n’ giá trị

logarithm hoạt lực M và các giới hạn tin cậy tương ứng. Đối với mỗi định lượng, tính

logarithm khoảng giới hạn tin cậy L bằng cách lấy logarithm giới hạn tin cậy trên trừ đi

logarithm giới hạn tin cậy dưới. Tính hệ số W cho mỗi giá trị M theo phương trình 4.2.1.-

1, với t là số Student đã dùng khi tính các giới hạn tin cậy.

2

24

L

tW (4.2.1.-1)

4.2.2. Tính đồng nhất của các hoạt lực

Để kiểm tra tính đồng nhất của một dãy các hoạt lực, thành lập biểu thức có phân phối

xấp xỉ phân phối 2 như sau:

n

n

nn W

WM

WMMMW

2

222 (4.2.2.-1)

với: W

WMM

Nếu 2 tính được nhỏ hơn giá trị tương ứng với bậc tự do f = (n’ – 1) tra từ Bảng 5.2, sự

khác nhau giữa các hoạt lực không có ý nghĩa thống kê và, do đó, có thể tiếp tục tính hoạt

lực trung bình và các giới hạn tin cậy theo các công thức ở mục 4.2.3.

Nếu 2 tính được lớn hơn giá trị tới hạn tương ứng đọc từ Bảng 5.2, các hoạt lực tính

được không đồng nhất và không thể sử dụng các công thức ở mục 4.2.3, thay vào đó, có

thể dùng các công thức ở mục 4.2.4.

4.2.3. Tính hoạt lực trung bình có cân chỉnh (weighted mean) và các giới hạn tin cậy

Logarithm hoạt lực trung bình được tính theo công thức:

W

WMM (4.2.3.-1)

Độ lệch chuẩn của logarithm hoạt lực trung bình là căn bậc hai của nghịch đảo của tổng

các hệ số W:

W

sM

1 (4.2.3.-2)

và các logarithm giới hạn tin cậy của hoạt lực trung bình được tính theo phương trình

sau:

112

M

tsM (4.2.3.-3)

trong đó t là số Student đọc từ Bảng 5.2 với bậc tự do bằng tổng số bậc tự do của các sai

số dư của mỗi định lượng.

4.2.4. Hoạt lực trung bình có cân chỉnh và các giới hạn tin cậy dựa trên độ phân tán

trong mỗi định lƣợng và giữa các định lƣợng

Khi phối hợp các kết quả của một số định lượng lặp lại, giá trị 2 có thể có ý nghĩa. Độ

phân tán của các hoạt lực có thể phân tích thành hai thành phần, gồm:

1) Phương sai trong mỗi định lượng WsM /12

2) Phương sai giữa các định lượng 1

2

2

nn

MMs

M

với M là trung bình chưa cân chỉnh (trung bình số học) của các M. Phương sai đầu thay

đổi từ định lượng này đến định lượng khác, trong khi phương sai sau là chung cho tất cả

các M.

Đối với mỗi M tính hệ số cân chỉnh theo công thức:

22

1

MM ssW

Dùng W’ thay thế cho W trong các công thức ở mục 4.2.3, với t = 2.

4.3. Phối hợp không cân chỉnh các kết quả định lƣợng (unweighted combination)

Phương pháp phối hợp các kết quả định lượng đơn giản nhất là tính trung bình số học của

n’ logarithm hoạt lực M và sau đó tính độ lệch chuẩn của nó theo công thức:

)1(

2

2

nn

MMs

M (4.3.-1)

các logarithm giới hạn tin cậy bằng:

M

tsM (4.3.-2)

trong đó t có (n’ – 1) bậc tự do. Vì số các định lượng cần phối hợp thường nhỏ nên giá trị

của t khá lớn.

4.4. Ví dụ

Bảng 4.4.-1 liệt kê kết quả sáu định lượng độc lập cùng với các giới hạn tin cậy và bậc tự

do của sai số dư tương ứng. Tất cả các định lượng đều đáp ứng điều kiện 1, 2 và 3 trong

mục 4.2. Các hệ số W được tính theo công thức ở mục 4.2.

Kiểm tra tính đồng nhất của các hoạt lực

113

42,46028,070.22

4988,478.2168792,323.123.2

2

2

222

n

n

nn W

WM

WMMMW

2 tính được nhỏ hơn giá trị tới hạn bằng 11,07 đọc từ Bảng 5.2 với bậc tự do f = 5. Do

đó, sự khác nhau giữa các hoạt lực không có ý nghĩa thống kê.

Bảng 4.4.-I – Hoạt lực và các giới hạn tin cậy của sáu định lượng độc lập

Lần

định

lượng

Hoạt lực

R

(IU/lọ)

Các giới hạn tin cậy

(IU/lọ) Bậc tự

do

DF Giới hạn

dưới

Giới hạn

trên

1 18.367 17.755 19.002 20

2 18.003 17.415 18.610 20

3 18.064 17.319 18.838 20

4 17.832 17.253 18.429 20

5 18.635 17.959 19.339 20

6 18.269 17.722 18.834 20

Tổng số 120

Bảng 4.4.-II.

M =

ln(R) L

* W MW WM

2

9,8183 0,0679 3.777,8301 37.091,9101 364.179,9033

9,7983 0,0664 3.951,6825 38.719,7456 379.387,4392

9,8017 0,0841 2.462,5579 24.137,1950 236.584,9721

9,7887 0,0659 4.003,1116 39.185,4586 383.576,6531

9,8328 0,0740 3.175,7400 31.226,4061 307.042,9060

9,8130 0,0609 4.699,6807 46.117,7833 452.552,0054

Tổng số 58,8528 22.070,6028 216.478,4988 2.123.323,8792

* L = ln(giới hạn tin cậy trên) – ln(giới hạn tin cậy dưới)

Hoạt lực trung bình và các giới hạn tin cậy

Hoạt lực trung bình và các giới hạn tin cậy của nó được tính bằng các công thức ở mục

4.2.3 và các số liệu trong Bảng 4.4.-I và 4.4.-II.

114

8085,96028,070.22

4988,478.216

W

WMM

00673,06028,070.22

11

Ws

M

Với số bậc tự do f = 120, P = 0,95, t = 1,98.

8218,9và7951,900673,098,18085,9M

tsM

Bằng cách lấy antilogarithm các giá trị tính được, hoạt lực trung bình bằng 18.187 IU/lọ

với khoảng tin cậy ở xác suất 95 % từ 17.946 đến 18.431 IU/lọ.

5. Các Bảng tra cứu

5.1. Bảng mức ý nghĩa của t (giá trị tuyệt đối)

P P

f 0,95 0,99 f 0,95 0,99

1 12,71 63,66 18 2,10 2,88

2 4,30 9,92 19 2,09 2,86

3 3,18 5,84 20 2,09 2,85

4 2,78 4,60 21 2,08 2,83

5 2,57 4,03 22 2,07 2,82

6 2,45 3,71 23 2,07 2,81

7 2,36 3,50 24 2,06 2,80

8 2,31 3,36 25 2,06 2,79

9 2,26 3,25 26 2,06 2,78

10 2,23 3,17 27 2,05 2,77

11 2,20 3,11 28-29 2,05 2,76

12 2,18 3,05 30 2,04 2,75

13 2,16 3,01 40-43 2,02 2,7

14 2,14 2,98 57-63 2,00 2,66

15 2,13 2,95 102-

126

1,98 2,26

16 2,12 2,92 600-∞ 1,96 2,58

17 2,11 2,90

115

Nếu giá trị quan sát lớn hơn giá trị trong

bảng, nó được coi là có ý nghĩa (P =

0,95) hay rất có ý nghĩa (P = 0,99).

5.2. Bảng mức ý nghĩa của 2

P P

f 0,05 0,01 f 0,05 0,01

1 3,84 6,63 11 19,68 24,73

2 5,99 9,21 12 21,03 26,22

3 7,81 11,34 13 22,36 27,69

4 9,49 13,28 14 23,68 29,14

5 11,07 15,09 15 25,00 30,58

6 12,59 16,81 16 26,30 32,00

7 14,07 18,48 20 31,41 37,57

8 15,51 20,09 25 37,65 44,31

9 16,92 21,67 30 43,77 50,89

10 18,31 23,21 40 55,76 63,69

Nếu giá trị quan sát lớn hơn giá trị

trong bảng, nó được coi là có ý nghĩa

(P = 0,95) hay rất có ý nghĩa (P =

0,99).

5.3. Mức ý nghĩa của tỷ số F = varmax/varmin của k phương sai trong nhóm xử lý, mỗi

phương sai có f bậc tự do (Hartley’s test).

k

f 4 6 8 9 10 12

4 20,6 29,5 37,5 41,1 44,6 51,4

49 69 89 97 106 120

5 13,7 18,7 22,9 24,7 26,5 29,9

28 38 46 50 54 60

6 10,4 13,7 16,3 17,5 18,6 20,7

116

19,1 25 30 32 34 37

7 8,44 10,8 12,7 13,5 14,3 15,8

14,5 18,4 22 23 24 27

8 7,18 9,03 10,5 11,1 11,7 12,7

11,7 14,5 16,9 17,9 18,9 21

9 6,31 7,80 8,95 9,45 9,91 10,7

9.9 12,1 13,9 14,7 15,3 16,6

10 5,67 6,92 7,87 8,28 8,66 9,34

8,6 10,4 11,8 12,4 12,9 13,9

Nếu F tính được lớn hơn giá trị trong bảng,

biến số cần kiểm tra được coi là có ý nghĩa

(dòng trên, P = 0,05), hay rất có ý nghĩa (dòng

dưới, P = 0,01).

6. Các ký hiệu thuật ngữ

Ký hiệu Định nghĩa

b Độ dốc hồi qui tuyến tính của đường thẳng liều – đáp ứng hay

ln(liều) – đáp ứng của tất cả các chế phẩm trong một định lượng

d Số liều của mỗi chế phẩm trong một định lượng đối xứng.

e cơ số của logarithm tự nhiên. e = 2,718281828….

f số bậc tự do

h số chế phẩm trong một định lượng, bao gồm cả chế phẩm chuẩn

k số xử lý trong một định lượng, k = dh

n số đáp ứng hay số lần lặp lại của mỗi xử lý

n’ số các ước lượng hoạt lực

s độ lệch chuẩn, 2ss

s1,s2,s3 Nồng độ thấp, trung bình và cao của chế phẩm S, trong một định

lượng chỉ có 2 nồng độ của mỗi chế phẩm s2 đại diện cho nồng độ

117

cao

s2 ước lượng của sai số dư được tính từ sai số bình phương trung bình.

2Ms là phương sai của logarithm hoạt lực M

t thống kê Student (Bảng 5.1)

t’ thống kê Dunnett (Bảng 3.2.4.-II)

u1…z3 Nồng độ các dung dịch thử của chế phẩm cần định lượng U … Z

y đáp ứng riêng hay đáp ứng riêng đã được biến đổi

y’ đáp ứng tính được dùng để thay thế cho giá trị bị mất

ZS yy ... đáp ứng trung bình của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử

AU…AZ hoạt lực giả định của các chế phẩm cần định lượng, là hoạt lực được

dùng để tính lượng chế phẩm cần lấy khi pha các dung dịch thử

B1…B2n tổng đáp ứng của mỗi đơn vị thí nghiệm (1 đến n) trong định lượng

chéo đôi

B’ tổng đáp ứng của khối hay hàng có chứa giá trị bị mất

C đại lượng biểu thị ý nghĩa của hồi qui, dùng trong tính toán các giới

hạn tin cậy (phương trình 3.2.5-5). Trong một số tài liệu thống kê

định lượng sinh học, ý nghĩa của hồi qui được biểu thị bằng g:

g

C1

1

C1…Cn tổng đáp ứng của mỗi cột (1 đến n) trong bố trí thí nghiệm hình

vuông Latin

C’ tổng đáp ứng của cột có chứa giá trị bị mất trong bố trí thí nghiệm

hình vuông Latin

D liều

DI,DII tổng đáp ứng của giai đoạn I và giai đoạn II trong định lượng chéo

đôi

E tổng các bình phương của đại lượng hồi qui (Bảng 3.2.3.-IV)

F tỷ số của hai ước lượng phương sai độc lập (Bảng 3.2.4.-I)

G’ tổng đáp ứng trong một định lượng có giá trị bị mất

I khoảng cách giữa các ln(liều) kế tiếp nhau, ví dụ I = ln(S2) – ln(S1)

K đại lượng được dùng để tính tổng các bình phương trong phân tích

phương sai

118

N

yK

2

L độ rộng của logarithm giới hạn tin cậy, L = ln(giới hạn tin cậy trên)

– ln(giới hạn tin cậy dưới)

LS…LZ tương phản tuyến tính của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử

(Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II và 3.2.3.-III)

M ước lượng của logarithm hoạt lực, trong định lượng đa chế phẩm M

được dùng kèm với các ký tự U…Z , ví dụ MU, để phân biệt giữa

các chế phẩm

M trung bình của một vài M độc lập

M’ logarithm tỷ lệ hoạt lực hay ước lượng của hoạt lực trước khi hiệu

chỉnh với hoạt lực giả định

N tổng số đáp ứng trong một định lượng

NS,NU tổng số đáp ứng của chế phẩm S và U

P xác suất

QS…QZ tương phản bậc hai của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử

R hoạt lực tính được – dùng với các ký tự đại diện cho chế phẩm thử

để phân biệt giữa các chế phẩm trong một định lượng đa chế phẩm

R1…Rn tổng đáp ứng của mỗi hàng (1 đến n) trong bố trí thí nghiệm hình

vuông Latin, hay mỗi khối trong bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo

khối

S chế phẩm chuẩn

S tổng đáp ứng của chế phẩm chuẩn

S1,S2,S3 tổng đáp ứng của liều thấp, trung bình và cao của chế phẩm S, trong

một định lượng chỉ có 2 nồng độ của mỗi chế phẩm S2 đại diện cho

nồng độ cao

T’ tổng đáp ứng trong một xử lý có giá trị bị mất

U…Z tổng đáp ứng của các chế phẩm thử U…Z

U…Z các chế phẩm cần định lượng

U1,U2,U3 tổng đáp ứng của liều thấp, trung bình và cao của chế phẩm U,

trong một định lượng chỉ có 2 nồng độ của mỗi chế phẩm U2 đại

diện cho nồng độ cao

119

X ln(liều)

W hệ số dùng trong phối hợp kết quả của các định lượng độc lập

(phương trình 4.2.1.-1)

120