Place de l'ADN mitochondrial en pathologie humaine

Les Challenges à relever?

27 Septembre 2012Meetochondrie

Vincent Procaccio, Angers

Mitochondrie

Noyau

ADN mitochondrial

MitochondrieMitochondrie estestsoussousll ’’ influenceinfluence de de 2 g2 géénomesnomes

Mutations ADN Nucléaire

MutationsADN mitochondrial

Génétique Mitochondriale

ADN de transmission maternelle2 à 10 copies ADNmt/mitochondrieCentaines à milliers de mitochondries/cellule

Hétéroplasmie mitochondriale

Ségrégation aléatoire au cours des divisions cellulaires

Correlation entre le taux de mutation et la sévérité du déficitNotion d’effet seuil

F

V

LUUR

T

PE

LCUN

SAGY

H

ND5ND6

ND4

ND4L

ND3R

COIIIG

ATPase6/8KCOIID

SUCN

COI

AN

CY

W

ND2

IM

Q

ND1

16S

12S

D-loopCyt.b

D

EL

E

T

I

ON

S

3243A->GMELASCPEODDM

tRNA-Ile mutationsCARDIOPATHY

8344A->GMERRF

tRNA-Ser mutationsDEAFNESS

1555A->GDEAFNESS (aminoglycosides)

cyt. b mutationsMYOGLOBINURICMYOPATHY

8993T->GNARP/MILS

3460G-A11778G->A14484T->CLHON

PEO, KSS, Pearson

Maladies mitochondriales représentent un large spectre d’atteintes cliniques reflétant la

dépendance énerg étique des organes

Pathologies MitochondrialesPathologies les plus communes erreurs du métabolisme

Prévalence : 1/5000 mais sous-estimation probable ! (Shaefer et al, 2008)

Taux de mutations de l’ADNmt: varie en fonctiondes études (5-20%)

FréquencePorteurs asymptomatiques mutations ADNmt : 1/200 (Eliot H et al, 2008)

Vieillissement

Maladies Mitochondriales

Autres maladies rares

Cancer Stress & maladies métaboliques

> 300 entités~ 100,000 patients en EU

« Growing Old: The most common mitochondrial

disease of all ? » Anita Harding, 1992, Nat. Genet.

Maladies Neurodegeneratives(Parkinson et Alzheimer)

Amélioration du Diagnostic MitochondrialAmélioration du Diagnostic Mitochondrial

1er Challenge

Amélioration du Diagnostic Mitochondrial

Projet National de l’Etude du Génome mitochondrial(V Paquis-Flucklinger)

Amélioration du Diagnostic Mitochondrial

Projet National de l’Etude du Génome mitochondrial(V Paquis-Flucklinger)

Bannwarth et al, in preparation

• Objectifs:– Analyse de 750 patients

– Recrutement sur toute la France/10 centres mitochondriaux

– Durée 3 ans

– Techniques: Surveyor + Puce resequencageADNmt

Analyse systématique et exhaustive de l’ADN mitochondrial

Résultats20 à 30% des patients porteurs d’une anomalie

génétique de l’ADN mitochondrial

• Devant un tableau de pathologie mitochondrialeCriblage total de l’ADN mitochondrial

• 2eme Challenge:– Volume et Interprétation des données– Apport des nouvelles technologies

Mutation ou Polymorphisme ?

• 254 mutations codantes• 283 mutatios ARNt/ARNr

• 5648 polymorphismes mtDNA

• L’ADNmt évolue 10-15 plus que l’ADN

nucléaire

Mitochondrial Mitochondrial

PolymorphismsPolymorphisms

Pathogenic Pathogenic

mutationsmutations

web-based analytical tool for analyzing mitochondrial sequence variation

Mitomaster

Pour répondre à ce challlenge

Curation of mutations for which disease-associations have been proposed by the referenced publications

Mitomap

www.mitomap.org

Buts:

- Nouvelle base de données centralisée- Comité Expertise international

Soutiens: Human Variome Project NCBI/NIH

Consortium Mitochondrial International

Une maladie mitochondriale commune:Syndrome de MELAS

Episodes accidents vasculaires < 40 ans

Epilepsie

Début vers l’âge de 10 ans

Atteinte cardiaque

Acidose lactique

Episodes accidents vasculaires < 40 ans

Epilepsie

Début vers l’âge de 10 ans

Atteinte cardiaque

Acidose lactique

BoucleDCytb

ND5

ND4

ND4L

ND3

COII I

ATPase6

ATPase 8

COII

CO I

ND2

ND1

GIM

L

VF TP

E

ND 6

L SH

R

GS

A NC Y

W

D K

ARNr12S

Complexe I

Complexe III

Complexe IV

Complexe V

ARNr16SA3243G

Mutations ADN mitochondrial

Phénotype extrèmement variable

Comment moduler le taux de mutation?Concept de l’hétéroplasmie shifting

Métabolisme glycolytique prédominant des cellules mutantesRationnel: Privilégier le métabolismeoxidatif afin de sélectionner les cellules non mutantes

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Control 70%M 100%M LG 100%M

Com

plex

IV

/CS

rat

io

**,&

*0

0,5

1

1,5

2

2,5

Control 70%M 100%M LG 100%M

Com

plex

I/C

S r

atio

*

*,&

*

Low glucose : résultats (1)

Modifie le taux d’hétéroplasmie de 100% à 90% en 4 semaineset restaure les activités enzymatiques des complexes I et IV

Culture de cellules cybrides de type neuronal avec la mutation homoplasmique mutante 3243A>G MELAS dans un milieu low glucose

(Desquiret et al, 2012)

Low glucose : résultats (2)

(Desquiret et al, 2012)

Blue Native PAGE (NDUFB6)

Le passage à 90 % mutant restaure l’assemblagedu complexe I

Patient C.

• Patient 26 ans syndrome MELAS Troubles neurologiques importantsAccidents vasculaires itératifs - EpilepsieMis sous traitement arginine avec

amélioration temporaire

Après 10 jours : échappement au traitementTroubles neurologiques majeurs

L’utilisation de corps cétoniques réduit le taux d’hétéroplasmie mutant dans un modèle cellulaire avec délétions ADNmt

Rationnel du régime cétogène

Association régime low glucose + régime cétogène

Suivi du taux d’hétéroplasmiePassage de 98% mutant à 88 % en 4 semainesDiminution du taux d’hétéroplasmie sous régimecétogène

Amélioration clinique avec récupération totale

Septembre 2012 90% mutant

Projet THERAMIT (2011-2013)

• Fondation pour la Recherche Médicale

• Necker-Bordeaux-Brest-Orsay- GifAngers

• Modèles: levure, nématode, fibroblastes

• Criblage de molécules à haut débit: 12.000 molécules

Diagnostic et Recherche: Les questions• Mieux Diagnostiquer

• Comprendre la Physiopathologie

• Modèles cellulaires et animaux

• Thérapie– Pharmacologie– Identifier de nouvelles molécules

UPENN, USAD.C WallaceD.C Wallace

M M LottLott

DDéépartementpartement de de BiochimieBiochimie GGéénnéétiquetiqueCHU AngersCHU AngersP. P. ReynierReynier

D. D. BonneauBonneauP P AmatiAmati --BonneauBonneauM BarthM BarthC. C. VernyVernyV. V. DesquiretDesquiret--DumasDumasN. N. GueguenGueguenA.A. ChevrollierChevrollierM. M. FerreFerreD. D. LoiseauLoiseauA.A. GoislardGoislardG. G. LemanLeman

Hopital Necker, Paris

A A MunnichMunnichA A RotigRotig

JP JP BonnefontBonnefontAS AS LebreLebre

V Paquis-FlucklingerS. Bannwarth

CHU Nice

Réseau Francais MitoDiagnostic

Team TheramitJP Dirago (Bordeaux)M Blondel (Brest)G. Dujardin (Gif)A. Delahode (Orsay)