Upload
buiphuc
View
231
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
“Plasmodium vivax: avances en la
identificación y caracterización de antígenos
de potencial utilidad en el desarrollo de una
vacuna antimalárica”
Darwin Andrés Moreno Pérez MSc., cPhD Investigador Asociado Grupo Funcional Biología Molecular
Fundación Instituto de Inmunología de Colombia
1
2
Metodología para el Desarrollo de Vacunas
Parásitos
Virus
Bacterias
Hongos
3
Metodología para el Desarrollo de Vacunas
Enfermedad aguda
Fácil diagnóstico
Malaria
Cinchona officinalis
Aotus spp.
OMS, 1988
4
Malaria – Biología Molecular
Malaria atlas project
132 a 391 millones de casos nuevos
Price R et al. Am J Trop Med Hyg 2007,77:79-87
Plasmodium vivax
MPAC de la OMS
Mosquiteros
impregnados con
insecticidas
Fumigación
residual
de interiores
Sedes entomológicas
para estudiar y
controlar el vector
Quimioprevención
Diagnóstico y
tratamiento
oportuno
Organización Mundial de la Salud, 2015
5
1. Etapa pre-
eritrocítica
2. Etapa
eritrocítica
3. Etapa sexual
Ciclo de vida de Plasmodium
Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66
6
1. Genera
hipnozoitos
Ciclo de vida de Plasmodium
Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66
7
1. Genera
hipnozoitos
2. Infecta
reticulocitos
Ciclo de vida de Plasmodium
Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66
8
1. Genera
hipnozoitos
3. Genera gametos
tempranamente
2. Infecta
reticulocitos
Ciclo de vida de Plasmodium
Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66
9
Ciclo de vida de Plasmodium
Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66
10
Proceso de Invasión a eritrocitos
Contacto
Inicial Reorientación Unión
Fuerte
Invasión
Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e1003943
11
Metodología para el diseño de una vacuna
para P. vivax
1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios
2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular
3. Determinar las regiones de interacción proteína-
célula
4. Evaluar la utilidad como vacuna
12
Metodología para el diseño de una vacuna
para P. vivax
1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios
2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular
3. Determinar las regiones de interacción proteína-
célula
4. Evaluar la utilidad como vacuna
13
Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?
Miller L. et al. J Exp Med 1979,149:172-184
Fya-b-
Fya+b+
Duffy-null
Duffy
Merozoitos de
P. knowlesi y P. vivax
African population
Du
ffy-n
ull
D
uff
y-p
osit
ive
14
Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?
Horuk R. et al. Science 1993,261:1182-1184
Reticulocitos
DARC
DBP
P. vivax
Infección
15
Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?
Horuk R. et al. Science 1993,261:1182-1184
Reticulocitos
DARC
DBP
P. vivax
Infección
Eritrocitos Maduros
DARC
DBP
P. vivax
No hay infección
?
16
Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?
Horuk R. et al. Science 1993,261:1182-1184
Infección No hay infección
Reticulocitos
DARC
DBP
P. vivax
DARC
DBP
P. vivax
Eritrocitos Maduros
17
Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?
Del Portillo H. et al. PNA 1991,88:4030-4034
MSA1(MSP1)
Regiones Conservadas
Regiones Semi-conservadas
Cheng Q. et al. Mol Bio Par 1994,65:183-187
AMA1
Galinsky M. et al. Cell 1992,69:1213-1226
RBPs
18
P. vivax
Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?
Micronemas
Micronemas
DBP AMA
Roptrias
RBP1, 2
Superficie MSP1
Reticulocitos
DARC
19
Micronemas
P. vivax
Micronemas
DBP AMA
Roptrias
RBP1, 2
Superficie MSP1
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
20
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
Enfoque Bioinformático
Micronemas
Micronemas
DBP AMA
Roptrias
RBP1, 2
Superficie MSP1
Comparación por homología
21
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
Enfoque Bioinformático
Datos in silico
Bozdech Z et al. PNAS 2008, 105:16290-16295
Transcripción >35h
Secuencia de Secreción
RT, GPI, Dominios
Función en Plasmodium
Proteínas de invasión
en P. vivax
22
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
Validación Experimental
Galinsky M. et al. Adv Par 2013,81:1-26
Galinsky M. et al. Adv Par 2013,81:1-26 23
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
Validación Experimental
Aotus spp.
24
Gen Transcrito Proteína
http://www.ciencia-activa.org/
DivergenAlfabetoGenes.htm
Genoma
http://www.unprofesor.com/ciencias-
naturales/diferencia-entre-adn-y-arn-503.html
ARN DBP
http://humanbetaglobin.weebly.com/be
ta-globin-protein-structure.html
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
25
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
AND genómico
ARN
Aotus spp.
PCR
26
PvRAP1 PvRhopH1
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
27
Pv48 PvGAMA PvARP Pv12 PvRON4
PvRON1 Pv34 PvRAP1 PvRhopH1
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
28
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
Gen Transcrito Proteína
Día 0
ACF
Día 20
AIF
Día 40
AIF
Día 60
Obtención
de sueros PIII Obtención
de sueros PI
29
PvRAP2 PvRhopH3
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
30
Pv48 PvGAMA PvARP PvRON5 PvRON4 Pv12 PvRhopH1
PvRON1 PvRON2 PvTRAMP Pv38 Pv41 PvRhopH3 PvRAP2
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
31
Pv41
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
32
Pv48 Pv12 PvARP Pv41 PvMSP10 PvTRAMP
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
33
Pv48
PvRhopH1
Pv12
PvRON5
PvARP
Pv38
Pv41 PvMSP10
PvGAMA
PvTRAMP
PvRON4 Pv34
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
35
PvGAMA
PvARP Pv12
PvRhopH1 PvRON5
Pv48
Gen Transcrito Proteína
1. Identificación y Caracterización
de Nuevos Antígenos
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
2. Estudio del proteóma de P. vivax
Lasonder E et al. Nature 2002, 419:537-42
Florens L et al. Nature 2002, 419:520-6
P. falciparum P. vivax
1289 proteínas 457 proteínas
Acharya P et al. Prot Clin Appl 2011, 6:e26623
Roobsoong W et al. J Proteomics 2011,74:1701-10
55
2. Estudio del proteóma de P. vivax
Procesamiento de
la muestra
Aislamiento de
estadios sanguíneos
Propagación de la
cepa VCG-1 de P. vivax
Análisis LC-MS/MS
Identificación de
proteínas
Predicción de candidatos a
vacuna
56
2. Estudio del proteóma de P. vivax
P. vivax
Primates del Nuevo mundo
Contaminantes
ORF DE REFERENCIA
Procesamiento de
la muestra
Aislamiento de
estadios sanguíneos
Propagación de la
cepa VCG-1 de P. vivax
Análisis LC-MS/MS
Identificación de
proteínas
Predicción de candidatos a
vacuna
57
2. Estudio del proteóma de P. vivax
734 moléculas
1.309 moléculas
Proteínas esenciales para establecer la
infección por Plasmodium o
desarrollarse dentro de la célula
58
2. Estudio del proteóma de P. vivax
734 moléculas
1.309 moléculas
Contacto
Inicial Reorientación Unión
Fuerte
Invasión
Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e1003943
27%
59
2. Estudio del proteóma de P. vivax
734 moléculas
1.309 moléculas
Contacto
Inicial Reorientación Unión
Fuerte
Invasión
Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e1003943
27%
Pv41, Pv12, MSP-1,
MSP7, SERA, TRAgs
and Pv-fam (a and d)
RON5, RALP1,
RON2, RhopH1
RON3
60
2. Estudio del proteóma de P. vivax
61
Antígenos Descritos a la Fecha
P. vivax
62
Metodología para el diseño de una vacuna
para P. vivax
1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios
2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular
3. Determinar las regiones de interacción proteína-
célula
4. Evaluar la utilidad como vacuna
63
2. Actividad de Unión de Antígenos Identificación de Péptidos de Alta Capacidad de Unión
Ocampo M. et al. Peptides
2002,23:13-22
DBP Receptor-Ligando
+
125I-péptido Reticulocitos
=
Unión
64
2. Actividad de Unión de Antígenos Identificación de Péptidos de Alta Capacidad de Unión
RBP1
Urquiza M. et al. Peptides
2002,23:2265-2277
Ocampo M. et al. Peptides
2002,23:13-22
DBP MSP1
Rodríguez L. et al. Vaccine
2002,20:1331-1339
65
3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA
y Aglutinación
+ =
Eritrocitos Proteína Unión
Anti-His (Proteína)
Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234
66
3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA
y Aglutinación
+ =
Eritrocitos Proteína Unión
Anti-His (Proteína)
Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234
67
3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA
y Aglutinación
+ =
Eritrocitos Perla+Proteína Unión
68
3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA
y Aglutinación
+ =
Eritrocitos Perla+Proteína Unión
Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234
69
3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por Microscopia
+ =
Eritrocitos Proteína
Unión
Anti-CD71 Rodamina (Ret)
Anti-His FitC (Proteína) +
Arévalo-Pinzón G. et al. Mal J 2015,14:106
70
3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría
Anti-CD45 APC (Linfocitos)
Anti-CD71 APC-H7 (Ret)
Anti-His PE (Proteína)
Eritrocitos Maduros
Eritrocitos Inmaduros
+ =
Eritrocitos Proteína
Unión
+
71
3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría
PvGAMA
Mayor porcentaje de unión a reticulocitos
GR Reticulocitos
72
3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría
PvGAMA
Mayor porcentaje de unión a reticulocitos Preferencia por células CD71hi
GR Reticulocitos
73
3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría
PvGAMA
Pv48
GR Reticulocitos
74
3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría
75
P. vivax Reticulocitos
Ligandos Descritos a la Fecha
DARC
76
Metodología para el diseño de una vacuna
para P. vivax
1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios
2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular
3. Determinar las regiones de interacción proteína-
célula
4. Evaluar la utilidad como vacuna
77
4. Inmunogenicidad de Moléculas
+ +
Primates
Proteína+ACF Reto
% Parasitemia
=
78
4. Inmunogenicidad de Moléculas
+ +
Primates
Proteína+ACF Reto
% Parasitemia
=
MSP1
Rodríguez L. et al. Vaccine
2002,20:1331-1339
20 kDa
14 kDa
79
4. Inmunogenicidad de Moléculas
80% de los primates controlaron la infección
+ +
Primates
Proteína+ACF Reto
% Parasitemia
=
80
Conclusiones
La predicción bioinformática es una herramienta útil para identificar proteínas parasitarias con rol en adhesión celular.
La adaptación de la cepa VCG-1 de P. vivax en primates Aotus permitió caracterizar a nivel de biología molecular antígenos con potencial para desarrollar una vacuna contra la especie.
Se estudio por primera vez en Colombia el proteoma de una cepa de P. vivax adaptada en primates.
81
Conclusiones
Hemos utilizado distintas técnicas de interacción proteína-célula para determinar las moléculas o regiones de estas que se unen a los reticulocitos humanos (PvRON5, PvGAMA y Pv48).
Contamos con una fuente de información útil para continuar con
estudios de caracterización de proteínas candidatas a vacuna.
Se demostró el papel inmunogénico y de protección para distintos
fragmentos de una molécula considerada como buen candidato a
vacun (MSP-1).
82
Agradecimientos
Profesor Manuel Elkin Patarroyo MD (Director FIDIC)
Manuel Alfonso Patarroyo MD., DrSc (Jefe del GF Biología Molecular e Inmunología)
Diego Edison Garzón Ospina MS., cPhD (Investigador Asociado GF Biología Molecular)
Luis Alfredo Baquero Suarez BSc (Investigador Junior GF Biología Molecular)
Hernando Curtidor M.S., PhD (Jefe del GF Receptor-Ligando)
Gabriela Arévalo Pinzón MS., cPhD (Investigador Asociado GF Receptor Ligando)
Maritza Alejandra Bermúdez Díaz BSc (Investigador Junior GF Receptor Ligando)
Otros investigadores:
Yago Pico de Coaña (GF Biología Molecular)
Oscar Pérez Leal (GF Biología Molecular)
Álvaro Monguí (GF Biología Molecular)
Diana Ángel (GF Biología Molecular)
83
Ente Financiador
Entidades Internacionales