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PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA96 TESTES 62796O PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA É UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICOEM MICROPLACA TIPO SANDUÍCHE PARA DETECÇÃO DO ANTIGÉNIOGALACTOMANNAN DE ASPERGILLUS NO SORO.
1- DESCRIÇÃO O Platelia™ Aspergillus EIA é um ensaio imunoenzimático em microplaca tipo sanduíche paradetecção do antigénio galactomannan de Aspergillus em amostras de soro.
2- INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO O Platelia™ Aspergillus EIA é um teste que, quando utilizado em simultâneo com outrosprocessos de diagnóstico, nomeadamente cultura microbiológica, exame histológico deamostras de biopsia e evidência radiográfica, pode actuar como ajuda no diagnóstico deaspergilose invasiva.
3- RESUMO E EXPLICAÇÃOAs infecções por Aspergillus ocorrem habitualmente após a inalação de esporos de Aspergillus quese encontram no ambiente. As formas invasivas, que têm registado um crescimento durante osúltimos 10 anos, constituem as formas mais graves de infecção. Tais infecções ocorremprincipalmente em doentes neutropénicos (após tratamento oncológico) e outros submetidos atratamentos com imunosupressivos (transplantes de órgãos, sobretudo transplantes de medulaóssea) e corticosteróides 7. O Aspergillus isola-se raramente da cultura sanguínea. O diagnóstico baseia-se com frequência nodiagnóstico não específico ou na evidência radiológica (sintomatologia clínica, TAC, radiografiatorácica, etc.) Na actualidade, o teste para detecção do antigénio galactomannan solúvel no soro parece constituirum método serológico capaz de contribuir para o diagnóstico da aspergilose invasiva 6, 9, 14, 34, 39.
4- DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO 27
O Platelia™ Aspergillus EIA é um ensaio imunoenzimático em microplaca tipo sanduíche de fase 1que detecta o galactomannan no soro humano. O ensaio utiliza os anticorpos monoclonais de ratoEBA-2, que são dirigidos contra o Aspergillus galactomannan, e foram caracterizados em estudosanteriores 16, 28. Os anticorpos monoclonais são utilizados, (1) para revestir os poços da microplaca eligar o antigénio, e (2) para detectar o antigénio ligado à microplaca sensibilizada (reagenteconjugado: anticorpos monoclonais ligados a peroxidase). As amostras de soro são sujeitas a umtratamento térmico na presença de EDTA para dissociar complexos imunes e para precipitarproteínas séricas que possam eventualmente interferir no teste 15. As amostras de soro tratadas sãoadicionadas nos poços revestidos com anticorpos monoclonais e incubadas. É formado umcomplexo anticorpo monoclonal - galactomannan – anticorpo monoclonal / peroxidase na presençado antigénio galactomannan. As tiras são lavadas para eliminar qualquer vestígio de material não ligado. Seguidamente, éadicionada a solução de substrato, que reagirá com os complexos ligados ao poço para formar umareacção de cor azul. A reacção enzimática é interrompida através da adição de ácido, que provoca aalteração de cor de azul para amarelo. A absorbância óptica das amostras e controlos é determinadaatravés de um espectrofotómetro regulado para um comprimento de onda de 450 e 620 nm.
5- REAGENTES Platelia™ Aspergillus EIA: produto Nº. 62796 (96 Testes) Armazene o kit a uma temperatura de 2-8°C. Coloque todos os reagentes à temperatura ambiente(18-25°C) antes de os utilizar. Restabeleça a temperatura de todos os reagentes, excepto controlos,para 2-8°C imediatamente após o uso. Após a reconstituição, o controlo negativo, o controlo cut-offe o controlo positivo devem ser congelados à temperatura de -20°C. Volte a colocar as tiras/placasnão utilizadas na carteira e volte a fechar. Não retire o dessecante. As tiras devem ser utilizadas até5 semanas após a abertura e selagem da carteira. Após a diluição, a solução de lavagem pode serconservada durante 14 dias a 2-8°C. Todos os restantes reagentes permanecem estáveis até à datade validade após abertura. Os reagentes são fornecidos em quantidade suficiente para realizar96 testes num máximo de 9 lotes.
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♦Nota: A TMB (Tetrametilbenzidina) é um cromogénio anticarcinogénico e antimutagénico paraperoxidase. *Nota: qbp: Quantidade que baste para
6- AVISOS AOS UTILIZADORES 1. Para utilização em diagnóstico in vitro.
2. Reservado a profissionais.
3. A utilização deste kit com amostras que não sejam de origem humana não é recomendada.
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Componente Conteúdo QuantidadeR1 Microwell
Strip Plate
Microplaca :- 96 poços (12 tiras de 8 poços cada ) revestidas
com anticorpos monoclonais anti-galactomannan
1 Placa / 12 x 8 poços
R2 ConcentratedWashing Solution
Solução de lavagem concentrada (10X): - Tampão Tris NaCl- Tween® 20 a 1%- Timerosal a 0,01%
1 x 100 mL
R3 NegativeControlSerum
Soro de controlo negativo:- Soro humano congelado e desidratado negativo
para galactomannan- Negativo para anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-2,
anti-HCV e antigénio HBs
3 x qbp* 1 mL
R4 Cut-off Control Serum
Soro de controlo cut-off:- Soro humano congelado e desidratado com
galactomannan- Negativo para anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-2,
anti-HCV e antigénio HBs
3 x qbp* 1mL
R5 Positive Control Serum
Soro de controlo positivo:- Soro humano congelado e desidratado com
galactomannan - Negativo para anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-2,
anti-HCV e antigénio HBs
3 x qbp* 1 mL
R6 Conjugate Conjugado (pronto a utilizar):- Anticorpo monoclonal anti-galactomannan /
peroxidase etiquetado - Conservante: Timerosal a 0,01%
1 x 8 mL
R7 Serum TreatmentSolution
Solução de Tratamento à Base de Soro (pronto autilizar):- Solução ácida EDTA
1 x 10,5 mL
R8 TMBSubstrate
Buffer
Tampão/Substrato TMB (pronto a utilizar):- Solução de ácido cítrico e acetato de sódio - Peróxido de hidrogénio a 0,009% - Dimetilsulfóxido (DMSO) a 4%
1 x 60 mL
R9 Chromogen: TMB
Solution
Solução de cromogénio TMB (concentrada):- Solução de dimetilsulfóxido a 90% (DMSO) com
tetrametilbenzidina (TMB)♦
a 0,6%
1 x 1 mL
R10 Stopping Solution
Solução de paragem (pronta a utilizar):- Ácido sulfúrico 1,5 N (H2SO4)
1 x 12 mL
Plate sealers - Folhas adesivas para microplacas 1 x 8 folhas
4. O Controlo Positivo, o Controlo de Cut-Off e o Controlo Negativo são realizados a partir de sorohumano testado e considerado como não reactivo para o antigénio Hbs e anticorpos ao VIH-1,VIH-2 e VHC, em testes com a marcação CE. Contudo, todos os reagentes devem sermanuseados como se tivessem capacidade de transmitir a infecção. Todos os testes devem serrealizados de acordo com a Norma OSHA [Occupational Safety and Health Administration –organismo para a segurança e saúde ocupacional] sobre patogénios transmitidos pelo sangue,biossegurança de nível 2 ou outras práticas de biossegurança apropriadas.
5. Usar vestuário protector, incluindo uma bata de laboratório, equipamento de protecção para osolhos e a face e luvas descartáveis (recomenda-se a utilização de luvas sintéticas, sem látex) emanusear os reagentes do kit e as amostras do paciente cumprindo o requisito das boas práticaslaboratoriais. Lavar muito bem as mãos após efectuar o teste.
6. Não pipetar com a boca.
7. Não fumar, beber ou comer nas áreas onde as amostras ou os reagentes do kit estão a sermanipulados.
8. Evitar os salpicos de amostras ou de soluções.
9. Os derrames biológicos que não tenham ácido devem ser cuidadosamente limpos com umdesinfectante eficaz. Os desinfectantes que podem ser utilizados incluem (entre outros) umasolução de lixívia a 10% (solução de hipoclorito de sódio a 0,5%), etanol a 70% ou WescodynePlus™ a 0,5%. Os materiais utilizados na limpeza dos derrames poderão necessitar de sereliminados como resíduos biológicos.
ATENÇÃO: Não coloque soluções com lixívia na autoclave.
10. Os derrames que contenham ácido devem ser adequadamente absorvidos (limpos) ouneutralizados com bicarbonato de sódio, devendo a área afectada ser lavada e seca; casocontenham materiais biológicos, a área deve ser limpa com um dos desinfectantes químicos.
11. Eliminar todas as amostras e materiais utilizados para efectuar o ensaio como se contivessem umagente infeccioso. Os resíduos químicos e biológicos laboratoriais devem ser manuseados eeliminados de acordo com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais.
12. ATENÇÃO: A lista seguinte apresenta os potenciais perigos químicos associados a algunscomponentes do kit (consultar a secção 5 – REAGENTES):
A solução de paragem à base de ácido sulfúrico (7.2% H2SO4) a 1,5 N é corrosiva,podendo provocar queimaduras nos olhos e na pele; pode ser nociva se ingerida ouquando em contacto com a pele; pode provocar lesões oculares graves, incluindo aperda permanente da visão ou cegueira. Manter afastado de bases fortes e de agentes redutores.
O R34-41 provoca queimaduras. Risco de lesões oculares graves. S24/25-26-30-36/37/39-60. Evitar o contacto com a pele e os olhos. Em caso de contacto comos olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista. Nuncaadicionar água a este produto. Usar vestuário de protecção, luvas e equipamento protector paraos olhos e a face adequados. Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados comoresíduos perigosos. Os resíduos deste material são considerados como resíduos ácidos perigosos. No entanto, se talfor permitido pelos todos os requisitos aplicáveis, o mesmo pode ser neutralizado para o pH 6,9para eliminação segura, se o utilizador tiver formação e estiver equipado para o fazer.O Timerosal a 0,01% (Mertiolato de Sódio), um conservante biocida à base de mercúrio orgânicoque afecta o sistema nervoso central (SNC), é um tóxico reprodutivo e um sensibilizadorsignificativo; a exposição prolongada ou repetida a esta substância pode provocar reacçãoalérgica em indivíduos predispostos; existem múltiplos casos de sensibilização resultante daexposição a soluções de Timerosal diluído. Evitar a libertação no ambiente; risco de efeitoscumulativos. As soluções utilizadas que contenham mercúrio numa concentração superior a0,2 ppm devem ser eliminadas como resíduos perigosos segundo a lei federal RCRA [ResourceConservation and Recovery Act – lei relativa à gestão de resíduos perigosos] dos Estados Unidosda América (D009); contudo, todos os resíduos devem ser eliminados de acordo com todos osrequisitos aplicáveis.
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C - Corrosivo
(Nota: a molécula de Timerosal é composta em 49,55% por mercúrio (Hg), pelo que umcomponente com Timerosal a 0,01% contém aproximadamente 0,005% (~ 50 ppm) demercúrio p/v). Em caso de contacto com a pele, lavar imediatamente com água abundante. Atenção: no estadoda Califórnia, o Timerosal é considerado um causador de toxicidade reprodutiva.
13. A Ficha de Dados de Segurança (FDS) está disponível mediante solicitação.
7- PRECAUÇÕES PARA OS UTILIZADORES 1. AS AMOSTRAS DE SORO CONGELADAS EM CONDIÇÕES DESCONHECIDAS PODERÃO
PRODUZIR RESULTADOS POSITIVOS FALSOS DEVIDO A CONTAMINAÇÃO POR FUNGOSE/OU BACTÉRIAS.
2. Não utilize o kit ou quaisquer reagentes do kit após a data de validade indicada. 3. Para além da solução de lavagem concentrada (R2) e da solução de paragem (R10), não
misture reagentes de outros kits com números de lotes diferentes. 4. Coloque todos os reagentes à temperatura ambiente, pelo menos 15 minutos antes de os
utilizar. 5. Misture completamente durante a reconstituição dos reagentes, tendo cuidado para evitar a
contaminação microbiana. 6. Não realize o teste na presença de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldeídos) ou poeira,
pois podem afectar a actividade enzimática do conjugado. 7. Use recipientes limpos descartáveis em polipropileno para preparar a solução de reacção de
substrato-cromogénio. Se for obrigatório o uso de óculos de protecção, deverá primeirolavá-los com ácido clorídrico 1N, enxaguá-los com água destilada e por fim secos.
8. Para a pipetagem manual de controlos e amostras, utilize pontas de pipetas individuais paraevitar a contaminação de amostras.
9. De modo a garantir a lavagem adequada dos poços, execute o número de ciclos de lavagemrecomendado e certifique-se de que todos os poços são completamente cheios e depoiscompletamente vazios. A lavagem não deve ser efectuada manualmente com um esguicho.
10. Não deixe a microplaca secar entre o final do ciclo de lavagem e a adição de reagentes. 11. Não utilize o mesmo recipiente para o conjugado e para as soluções de substrato. 12. Não deixe as soluções de conjugado ou de reacção de substrato-cromogénio entrar em contacto
com metal ou iões metálicos. 13. Evite a exposição do cromogénio ou da solução de reacção de substrato-cromogénio à luz forte
durante a fase de armazenamento ou incubação. Não permita que as soluções de cromogénioentrem em contacto com um agente oxidante.
14. Evite o contacto da solução de paragem com qualquer agente oxidante. Não deixe que a soluçãode paragem entre em contacto com metal ou iões metálicos.
15. Utilize materiais limpos e sem pó (tubos, pontas, recipientes, etc.) para minimizar a possibilidadede contaminação com esporos de Aspergillus do meios ambiente. Em virtude de ogalactomannan ser estável ao calor, a esterilização do material utilizado não garante a ausência deantigénio contaminante. Os materiais sem pirogénio são óptimos, mas o material habitual podeser utilizado com as precauções adequadas.
16. Limite a exposição de soluções (soros, solução de tratamento, conjugado) ou a abertura derecipientes (placas, tubos, pipetas) ao ar.
17. Não volte a colocar nenhuma quantidade de conjugado por utilizar no recipiente original. 18. A solução de reacção de substrato-cromogénio deve ser incolor. O surgimento da cor azul após a
diluição indica que o reagente se encontra contaminado, não podendo por isso ser utilizado.Elimine-o e prepare um novo reagente.
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8- PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO DO REAGENTE
Placa / tira com micropoços (R1)Depois de abrir a carteira das placas, as tiras de micropoços permanecem estáveis durante5 semanas quando armazenadas à temperatura de +2-8°C no respectivo saco original comdessecante no seu interior.
Solução de lavagem de trabalho (R2):Prepare a solução de lavagem de trabalho de acordo com o necessário, adicionando uma parte desolução de lavagem concentrada para 9 partes de água desionizada esterilizada ou água destilada.A solução de lavagem de trabalho pode ser armazenada durante 14 dias à temperatura de 2-8°C.Prepare uma quantidade suficiente de solução de lavagem de trabalho para concluir a série (80 mLpara uma tira: 8 mL de R2 + 72 mL de água destilada). Após a abertura, a solução de lavagem concentrada, armazenada à temperatura de +2-25°C, semcontaminação, permanece estável até à data de validade indicada na etiqueta.
Soro de controlo negativo (R3)
Reconstitua o conteúdo de um frasco de controlo com 1000 µL (1 mL) de água purificadaesterilizada (de preferência, água sem pirogénio). Os soros devem ser rehidratados precisamenteantes da realização do teste. Misture completamente depois de um período de 2-3 minutos pararehidratação do soro. Aliquote 300 µL em cada um dos 3 tubos de microcentrifugação empolipropileno. Congele imediatamente à temperatura de -20°C os restantes tubos de centrifugaçãoem polipropileno que serão utilizados após a rehidratação. Nota: Os soros de controlo que foram previamente rehidratados e imediatamente congelados àtemperatura de -20°C podem ser descongelados e utilizados sem necessidade de novarehidratação. Os controlos rehidratados congelados podem ser armazenados até cinco semanas àtemperatura de -20°C. Manuseie os soros de controlo do mesmo modo que as amostras dosdoentes (300 µL de soro + 100 µL de solução de tratamento, etc...).
Soro de controlo cut-off (R4) e soro de controlo positivo (R5) Prepare de acordo com a descrição acima relativa ao soro de controlo negativo.
Solução de reacção de substrato-cromogénio (R8 + R9) Prepare a solução de reacção de substrato-cromogénio, adicionando uma parte de soluçãoTMB de cromogénio concentrada, R9, para 50 partes de tampão de substrato TMB, R8.Prepare 2 mL de solução de reacção de substrato-cromogénio por tira: 40 µL de R9 + 2 mL deR8. A solução permanece estável durante 6 horas quando armazenada no escuro àtemperatura ambiente (+18-25°C). Após a abertura, os reagentes R8 e R9 armazenados à temperatura de +2-8°C, semcontaminação, permanecem estáveis até à data de validade indicada na etiqueta.
Conjugado (R6), solução de tratamento à base de soro (R7) e solução de paragem (R10)Após a abertura, os reagentes R6, R7 e R10 armazenados à temperatura de +2-8°C, semcontaminação, permanecem estáveis até à data de validade indicada na etiqueta.
9- COLHEITA DE AMOSTRAS Realize a colheita de amostras de sangue de acordo com os procedimentos laboratoriais de rotina.O teste é realizado no soro. As amostras de soro não devem estar contaminadas com esporosfúngicos e/ou bactérias. Transporte e armazene amostras em tubos selados e não expostos ao ar.Enquanto não forem abertas, as amostras podem ser armazenadas à temperatura de 2-8°C até5 dias antes da realização dos testes. Após a abertura inicial, as amostras podem ser armazenadas àtemperatura de 2-8°C durante 48 horas antes da realização dos testes. Para um armazenamentomais prolongado, guarde o soro a -70°C. As amostras de soro podem ser sujeitas a um máximo de 4 ciclos de congelamento /descongelamento. As amostras congeladas previamente devem ser devidamente misturadas após odescongelamento antes da realização dos testes.
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Os resultados não são afectados por amostras que contenham 20 mg/L de bilirrubina, amostraslipémicas que contenham o equivalente a 2 g/L de trioleina (triglicéridos) ou amostras hemolisadasque contenham 165 mg/L de hemoglobina. Não foram testadas interferências relacionadas com oexcesso de albumina.Não descomplemente os soros.
10-PROCEDIMENTO
Materiais fornecidos Consulte a secção REAGENTES.
Materiais necessários, mas não fornecidos 1. Água destilada esterilizada ou desionizada para diluição da solução de lavagem. 2. Água purificada estéril para reconstituição dos soros de controlo. 3. Papel absorvente. 4. Luvas descartáveis. 5. Óculos de protecção. 6. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio.7. Pipetas ou multipipetas, reguláveis ou fixas, para medir e dispensar 50 µL, 100 µL, 300 µL e
1 000 µL.8. Tubos de microcentrífugação em polipropileno de 1,5 mL com rolhas herméticas, com
capacidade para suportarem temperaturas até 120°C (bloco de aquecimento) ou 100°C (banhoem água a ferver).a. Tubos com tampa roscada: Tubos cónicos de 1,5 mL, Bio-Rad Cat. Nº. 224-0100 ouequivalente.b. Tubos com tampa de encaixe: Tubos de ensaio EZ Micro, 1,5 mL, Bio-Rad Cat. Nº. 223-9480 ou equivalente.
9. Microtubos com tampa de segurança (VWR Cat. Nº. 6054001 ou equivalente). Estes“eppendorfs” vedam com segurança os tubos com tampa de encaixe impedindo a aberturadas tampas em condições de mudança de temperatura e de pressão, permitindo tambémque os tubos sejam facilmente retirados do bloco de aquecimento ou do banho de água aferver.
10. Centrifugador de bancada de laboratório para tubos em polipropileno de 1,5 mL comcapacidade para 10 000 g.
11. Rack de microcentrífugação flutuante redonda para proveta de 1 L. 12. Agitador de vórtice. 13. Bloco de aquecimento. São recomendados os seguintes modelos de blocos de
aquecimento: a. Modelo do bloco 1: Grant Cat. Nº. QBD1 (VWR Cat. Nº. 460-0074) b. Modelo de bloco 2: Grant Cat. Nº. QBD2 (VWR Cat. Nº. 460-0076)
14. Bloco para o bloco de aquecimento: ambos os blocos de aquecimento devem ser utilizadoscom o bloco Grant Cat. Nº. QB-E1 (VWR Cat. Nº. 460-8517)
15. Banho em água em ebulição a 100°C16. Incubador de microplaca a 37 ± 1°C. 17. Dispositivo de lavagem de microplacas automático ou semi-automático.18. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620 nm.
Comentários para procedimentos Os controlos negativos, positivos e cut-off devem ser testados em cada série para validaçãodos resultados do teste.
Tratamento dos sorosTodos os soros de controlo: negativo(R3), cut-off(R4) e positivo(R5) devem ser processados aomesmo tempo como amostras de teste:1. Pipete 300 µL de cada soro de teste e controle em tubos de polipropileno individuais de 1,5 mL.
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2. Adicione 100 µL de solução de tratamento à base de soro (R7) em cada tubo. 3. Misture bem os tubos vigorosamente ou no agitador de vórtice. Feche hermeticamente o tubo
para impedir a abertura durante o aquecimento; para tubos com tampa de encaixe: utilize um“eppendorf”. Não perfure a rolha.
4. Opção com bloco de aquecimento:Aqueça os tubos durante 6 minutos num bloco de aquecimento a 120oC. Os tubos devem sercolocados no bloco apenas quando for atingida a temperatura indicada.(*)
OUOpção com banho-maria:Se utilizar banho em água a ferver: aqueça os tubos durante 3 minutos a 100oC. (*)
5. Remova cuidadosamente os tubos quentes do bloco de aquecimento ou do banho de água emebulição e coloque num centrifugador. Centrifugue os tubos a 10 000 x g durante 10 minutos.
6. O líquido sobrenadante é utilizado para detecção do antigénio galactomannan.7. Teste os líquidos sobrenadantes utilizando o seguinte procedimento. Após a preparação, o líquido
sobrenadante pode ser removido e armazenado a 2-8°C até 48 horas antes de ser testado. Se aanálise dos resultados indicar que é necessário repetir o teste, será necessário tratar outra alíquotade soro para testar.
(*) É essencial um cumprimento rigoroso da temperatura indicada e do período de validade indicado,bem como a utilização do material recomendado. Não confie na temperatura registada nodispositivo; certifique-se de que a temperatura está em conformidade com as especificaçõesutilizando um termómetro calibrado, que será instalado num tubo com óleo mineral: Deve seralcançada uma temperatura de 120°C no interior do tubo inserido num bloco de aquecimento e umatemperatura de 100°C num banho de água em ebulição.
Procedimento EIA Cumpra rigorosamente o protocolo proposto.Cumpra as boas práticas laboratoriais.1. Coloque os reagentes à temperatura ambiente (18 - 25°C), pelo menos 15 minutos antes de os
utilizar. 2. Prepare a solução de lavagem, a solução de reacção de substrato-cromogénio e os controlos
negativo, positivo e cut-off. 3. Prepare uma tabela para identificação de soros de teste e controlos na microplaca. Utilize um
poço para o soro de controlo negativo (R3), dois poços para o soro de controlo cut-off (R4) e umpoço para o soro de controlo positivo (R5).
4. Remova o suporte de placas e as tiras de micropoços (R1) da carteira das placas. Coloquenovamente na carteira todas as tiras que não sejam utilizadas, com o dessecante, e fechenovamente a carteira.
5. Misture o conteúdo do frasco de conjugado (R6) invertendo antes de utilizar. Adicione 50 µL deconjugado (R6) em cada poço. De seguida, adicione 50 µL de soro sobrenadante tratado em cadapoço, conforme acima indicado. Não adicione amostras de soro nos poços antes do conjugado.
6. Tape a placa com o selante de placas, ou outro meio para impedir a evaporação, certificando-sede que toda a superfície fica coberta e impermeável.
7. Incube a microplaca num incubador de microplacas seco durante 90 ± 5 minutos a 37°C (± 1°C). 8. Remova o selante de placas. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de
resíduos (com hipocloreto de sódio). Lave a placa 5 vezes, utilizando no mínimo 370 µL desolução de lavagem de trabalho. Após a última lavagem, inverta a microplaca e bata levemente nopapel absorvente para remover o líquido restante.
9. Adicione rapidamente 200 µL de solução de reacção de substrato-cromogénio (R8 + R9) em cadapoço, evitando a exposição à luz forte.
10. Incube a microplaca no escuro à temperatura ambiente (18 a 25°C) durante 30 ± 5 minutos. Nãoutilize película adesiva durante esta fase de incubação.
11. Adicione 100 µL de solução de paragem (R10) em cada poço utilizando a mesma ordem para aadição da solução de substrato. Misture bem.
12. Limpe bem o fundo de cada placa.
100
13. Leia a densidade óptica de cada poço a 450 nm (filtro de referência de 620 nm). As microplacasdevem ser lidas no período de 30 minutos após a adição de solução de paragem.
11-CONTROLO DE QUALIDADE (CRITÉRIOS DE VALIDADE)
Controlo cut-off: A DO de cada soro de controlo cut-off deve ser ≥ 0,300 e ≤ 0,800.
Controlo positivo: O índice do soro de controlo positivo deve ser superior a 2,00.
I =DO controlo positivo (R5)
> 2,00DO média do controlo cut-off
Controlo negativo: O índice do soro de controlo negativo deve ser inferior a 0,40.
I =DO controlo negativo (R3)
< 0,40DO média do controlo cut-off
Caso algum dos controlos não cumpra os critérios de validade supracitados, o ensaio perderáa validade e os resultados da amostra do doente não deverão ser reportados. O operadorpoderá optar por repetir o ensaio, depois de rever o procedimento, ou então contactar ofabricante para obter assistência. Caso o ensaio seja repetido, será necessário utilizar umanova alíquota da mesma amostra.
Exemplo de cálculo:
Cálculos
Valor médio do controlo cut-offPara calcular a DO média do controlo cut-off (R4), adicione os valores da DO para cada réplicado controlo cut-off e divida o resultado por 2:
(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586
Índice do controlo negativo Para calcular o índice do controlo negativo, divida a DO do controlo negativo pela DO média docontrolo cut-off:
I =0,117
= 0,200,586
Índice do controlo positivo Para calcular o índice do controlo positivo, divida a DO do controlo positivo pela DO média docontrolo cut-off:
I =2,602
= 4,440,586
Validade
No exemplo acima:
• Cada DO do controlo cut-off é ≥ 0,300 e ≤ 0,800 indicando que o controlo cut-off é válido. • O índice do controlo negativo é < 0,40, indicando que o controlo negativo é válido. • O índice do controlo positivo é > 2,00, indicando que o controlo positivo é válido. A série de testes neste exemplo é considerada válida visto que os resultados cumprem oscritérios de validade para cada controlo.
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Amostra Absorbância (DO)DO do controlo negativo (R3) 0,117
DO do controlo cut-off (R4) 0,5960,576
DO do controlo positivo (R5) 2,602
12- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A presença ou a ausência de antigénio galactomannan na amostra de teste é determinada pelocálculo de um índice para cada amostra de doentes. O índice (I) é o valor da DO da amostradividida pela densidade óptica média dos poços que contêm soro de controlo cut-off.
Cálculo da densidade óptica média do controlo cut-off: Adicione as densidades ópticas dos dois poços que contêm soro de controlo cut-off (R4) e divida ototal por 2.
Cálculo de um índice (I) para cada soro de teste: Calcule o seguinte índice para cada soro de teste:
I =Amostra DO
DO média do controlo cut-off
Os soros com um índice < 0,50 são considerados negativos para antigénio galactomannan. Nota: Um resultado negativo pode indicar que o resultado do doente se encontra abaixo donível detectável do ensaio. Nota: Os resultados negativos não excluem o diagnóstico de aspergilose invasiva. Recomenda-se a repetição do teste se o resultado for negativo, mas se houver suspeita de doença. Os soros com um índice ≥ 0,50 são considerados positivos para antigénio galactomannan. Para todos os pacientes com resultados positivos, recomenda-se a repetição de uma alíquota damesma amostra, bem como a colheita de uma nova amostra do paciente para teste de seguimento. Nota: Um valor de absorvência inferior a 0,000 pode indicar um erro no procedimento ou dosinstrumentos, o qual deve ser avaliado. Esse resultado não é válido e a amostra deve ser novamenteprocessada. Recomenda-se o rastreio regular (duas vezes por semana) dos pacientes de alto risco para aumentara sensibilidade e a positividade precoce do teste.Nota: O teste EIA Platelia™ Aspergillus destina-se a ser utilizado como auxiliar no diagnóstico daaspergilose invasiva. Os resultados positivos obtidos com o teste EIA Platelia™ Aspergillus devemser considerados em conjunto com outros procedimentos de diagnóstico como, por exemplo,culturas microbiológicas, exames histológicos de amostras de biopsias e dados radiográficos.
Exemplo de cálculo:
Cálculos Consulte a secção Controlo de Qualidade (Critérios de Validade) para obter exemplos de cálculosque permitem determinar a validade dos controlos de ensaio.
Valor médio do controlo cut-off
Para calcular a DO média do controlo cut-off (R4), adicione os valores DO para cada réplica docontrolo cut-off e divida o resultado por 2:
(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586
Amostra do doente nº 1
Para calcular o índice da amostra do doente nº 1, divida a DO da amostra do doente nº 1 pelaDO média do controlo cut-off:
I =0,134
= 0,230,586
102
Amostra Absorbância (DO)DO do controlo negativo (R3) 0,117
DO do controlo cut-off (R4) 0,5960,576
DO do controlo positivo (R5) 2,602Amostra do doente nº 1 0,134Amostra do doente nº 2 0,436Amostra do doente nº 3 1,196
Neste exemplo, a amostra do doente nº 1 é negativa, visto que o índice de 0,23 é < 0,50.
Amostra do doente nº 2
Para calcular o índice da amostra do doente nº 2, divida a DO da amostra do doente Nº 2 pelaDO média do controlo cut-off:
I =0,436
= 0,740,586
Neste exemplo, a amostra do doente nº 2 é positiva, visto que o índice de 0,74 é ≥ 0,50.
Amostra do doente nº 3
Para calcular o índice da amostra do doente nº 3, divida a DO da amostra do doente nº 3 pelaDO média do controlo cut-off:
I =1,196
= 2,040,586
Neste exemplo, a amostra do doente nº 3 é positiva, visto que o índice de 2,04 é ≥ 0,50.
13-LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO1. Um teste negativo não pode excluir o diagnóstico de aspergilose invasiva. Os doentes em
risco de contraírem aspergilose invasiva devem ser submetidos a testes duas vezes porsemana.
2. O procedimento Platelia™ Aspergillus EIA e a interpretação dos resultados devem realizar-sequando se testarem amostras para detecção de antigénio galactomannan. Recomenda-seque o utilizador do kit leia atentamente a bula antes de realizar o teste. O procedimento deteste deve ser seguido atentamente, sobretudo quanto à pipetagem da amostra e doreagente, lavagem das placas e tempo dos procedimentos de incubação.
3. Caso não se adicione amostra ou reagente conforme indicado no procedimento, pode obter-se um teste com um resultado negativo falso. Deve considerar-se a repetição do teste deamostras adicionais quando houver a suspeita clínica de aspergilose invasiva ou errode procedimento.
4. Há a possibilidade de contaminação de poços de amostras de doentes negativos por poçosde amostras de doentes/controlos positivos caso ocorra o derrame do conteúdo de um poçopara outro devido a um manuseamento descuidado da microplaca ou a uma má técnica depipetagem durante a adição dos reagentes.
5. O desempenho do Platelia™ Aspergillus EIA não foi avaliado com amostras de soro derecém-nascidos ou pediátricas.
6. O Platelia™ Aspergillus EIA pode proporcionar uma reduzida detecção de galactomannanem doentes com doença granulomatosa crónica (DGC) e síndroma de Job 36, 37.
7. A utilização concomitante de terapêutica antifúngica activa em alguns doentes comaspergilose invasiva pode provocar uma reduzida sensibilidade com o Platelia™ AspergillusEIA 20.
8. O Platelia™ Aspergillus EIA foi avaliado para utilização com plasma ou outros tipos deamostras tais como urina, BAL ou CSF.
9. O desempenho do Platelia™ Aspergillus EIA não foi determinado para a leitura manual e/oudeterminação de resultados visuais.
10. Outros géneros de fungos como, por exemplo, Penicillium, Alternaria, Paecilomyces,Geotrichum e Histoplasma mostraram reactividade com os anticorpos monoclonais EBA-2 deratos utilizados em ensaio para detecção de Aspergillus galactomanano. Deve ser consideradaa histoplasmose em áreas endémicas, incluindo partes dos Estados Unidos 23, 32, 38.
11. Reacções positivas sem sinais clínicos: Tendo em consideração a detecção precoce do antigénio galactomannan no soro mesmoantes do aparecimento de sinais clínicos e/ou radiológicos, geralmente observam-sereacções positivas sem sinais clínicos: correspondem a testes "positivos verdadeiros" emdoentes para quem é determinado posteriormente tarde o diagnóstico de aspergiloseinvasiva comprovada ou provável.
103
No entanto, em alguns casos particulares, deverão ser considerados alguns factoresaquando da interpretação do teste: a. Foram reportadas reacções positivas sem sinais clínicos, sobretudo em crianças
pequenas 26. Apesar de alguns destes casos poderem estar relacionados com acirculação real de antigénios Aspergillus 5, a maioria dos casos podem ser consideradosfalsos positivos.
b. A galactofuranose foi demonstrada em vários alimentos, particularmente em cereais,produtos à base de cereais e sobremesas com natas 1, 17. Ao contrário do leite humano, éfrequente os leites humanizados conterem elevadas concentrações de galactomannan 10.Por conseguinte, o factor dietético deve ser levado em consideração no que concerne àinterpretação do desenvolvimento da antigenemia em crianças pequenas e, nageneralidade, em todos os doentes com barreira intestinal alterada 4, 10. Qualquer caso deantigenemia positiva não acompanhada por sinais clínicos deve ser interpretado aindacom mais cuidado nesta população de doentes 17.
c. Existem relatos de resultados de testes de galactomannan positivos em doentes tratadoscom piperacilina / tazobactam . Também existem relatos de alguns lotes ou grupos depiperacilina / tazobactam que foram considerados positivos quanto a antigéniogalactomannan. Por conseguinte, os resultados de testes positivos em doentes tratadoscom piperacilina / tazobactam devem ser interpretados com cuidado e confirmados poroutros métodos de diagnóstico. Também foi relatada a detecção de galactomannan emalguns lotes de amoxicilina associada a preparações injectáveis de ácido clavulânico. Porconseguinte, os tratamentos com b-lactam semi-sintética devem ser levados emconsideração ao interpretar o teste 1, 21. Não obstante, visto que o Platelia™ AspergillusEIA pode detectar antigénio galactomannan muito antes de surgirem sinais clínicos ouradiológicos, a ocorrência de aspergilose invasiva não pode ser excluída. Porconseguinte, os doentes tratados com piperacilina/tazobactam com resultados de testespositivos devem ser acompanhados atentamente.
d. Potencialmente, podem ser observadas reacções positivas na ausência de sinais clínicosnos pacientes que recebam, por via parentérica ou oral (na presença de uma alteração dabarreira intestinal), produtos contendo galactomanano.A presença de galactomanano nestes produtos deve-se frequentemente à utilização deum processo de fermentação a partir de microrganismos fúngicos.Todavia, só será observado um resultado positivo no paciente caso a concentraçãosérica de galactomanano exógeno atinja ou ultrapasse o limite de detecção do teste.Deste modo, na presença de um resultado positivo suspeito com ausência de outrossinais indicadores, recomendamos que se informe sobre os produtos administrados aopaciente e, em particular, sobre os seus processos de fabrico e a origem das matérias-primas utilizadas 11, 24, 31.
14-VALORES ESPERADOSA prevalência esperada de aspergilose invasiva varia com a população de doentes; foram reportadastaxas de 5-20% 7, 13. Realizou-se um estudo clínico num total de 4 873 amostras de soro de 239 episódios(203 doentes) com malignidade hematológica ou transplante de estaminais diagnosticadas come sem aspergilose invasiva em dois centros de testes na Europa para determinar ascaracterísticas de desempenho do Platelia™ Aspergillus EIA.Visto que um doente podia ser incluído no estudo em mais do que uma ocasião, a análise foirealizada de acordo com os episódios por tratamento. Considera-se um episódio o período de tempo que rodeia um evento clínico (p. ex., transplante,GVHD (enxerto contra hospedeiro), etc.). Por conseguinte, pode ter sido observado mais do que umepisódio para um único doente.A taxa de prevalência média para este estudo foi de 16% (38/239). A distribuição dos índices paraestas populações é representada nas seguintes tabelas.
104
Doentes diagnosticados sem aspergilose invasiva (população de controlo)
Foi testado um total de3 691 amostras de soroobtidas de 201 episódios(168 doentes) em doiscentros de testes na Europacom o teste Platelia™Aspergillus EIA.A distribuição dos valoresdo índice é apresentada naseguinte tabela.
Este gráfico de dispersãoilustra os resultados doensaio galactomannan paraas 3 691 amostras de sorode 201 episódios (168doentes de controlo) nesteestudo (doentes submetidosa terapia imunosupressivapara TCTH (transplante decélulas-troncohematopoéticas) ou paratratamento da malignidadehematológica).
Doentes a quem foi diagnosticada aspergilose invasiva
Este gráfico de dispersãoilustra os resultados doensaio galactomannan paraas 1 182 amostras de sorode 38 episódios (35doentes) neste estudo aosquais foi diagnosticadaaspergilose invasivacomprovada ou provável deacordo com as definiçõesda EORTC/NIAID.
Não se prevê que todas as amostras de soro de cada doente sejam positivas. A prevalênciaesperada de aspergilose invasiva varia com a população de doentes; foram relatadas taxas de5-20% 7, 13. A taxa de prevalência para este estudo foi de 16%.Os seguintes gráficos representam exemplos de um doente sem sinais clínicos de aspergiloseinvasiva (negativo para Aspergillus) e de um doente com aspergilose invasiva comprovada(positivo para Aspergillus) respectivamente.
105
ASPERGILOSE INVASIVA COMPROVADA / PROVÁVEL:DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE / EPISÓDIO
(N= 38 episódios de 35 doentes)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Número do episódio
Cut-off0,5
Índ
ice
Distribuição do valor do índice de soro da populaçãode doentes de controlo N=3691
3240
33054 32 13 4 4 3 0 1 0 0 3 1 0 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Índice
Nú
mer
o d
e so
ros
POPULAÇÃO DE CONTROLO:DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE/EPISÓDIO
(N= 201 episódios de 168 doentes)
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Número do episódio
Índ
ice
Doente negativo :
Doente positivo :
15. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICO
A. Estudos de reprodutibilidadeA variabilidade inter-ensaio e intra-ensaio para o Platelia™ Aspergillus EIA foi determinada numestudo utilizando um painel de 6 amostras de soro de doentes em pools (uma negativa, uma positivabaixa, duas positivas e duas altamente positivas) obtidas em três locais de ensaios clínicos naAmérica do Norte. Todos os 6 membros do painel foram testados em triplicado (x3) em 3 diasdiferentes, num lote, em dois locais (número total de réplicas em cada local = 9). Todos os6 membros do painel foram testados em duplicado (x2) em três dias diferentes, em 1 lote, numterceiro local (número total de réplicas no terceiro local = 6). Um (1) operador realizou todos os testesde precisão em cada local. Os dados foram analisados de acordo com as normas da ComissãoNacional para a Normalização de Laboratórios Clínicos (NCCLS - National Committee for ClinicalLaboratory Standards). A densidade óptica (DO) média e o valor médio do índice, o desvio padrão(DP), o coeficiente de variação percentual (%CV), a precisão do intervalo de referência (intra-ensaio)e a precisão no local (inter-ensaio) para cada membro do painel são ilustrados nas seguintes tabelas.
106
DOENTE DE CONTROLO
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 10 20 30 40 50 60
Dias
Índ
ice
DOENTE COM ASPERGILOSE INVASIVA COMPROVADA
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 10 20 30 40 50 60
Dias
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B. Reactividade cruzadaRealizou-se um estudo para avaliação do efeito de condições clínicas que podem interferir, nãorelacionadas com a aspergilose invasiva, com um lote do kit Platelia™ Aspergillus EIA. Utilizou-se oPlatelia™ Aspergillus EIA para testar as seguintes amostras de soro relativamente à reactividadecruzada. Foram testados um total de 151 soros.
* Da bexiga, da mama(2), do cólon, endometrial, do pulmão, da próstata, renal e escamoso(3).
C. Ensaio clínicoRealizou-se um ensaio clínico para avaliar a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo doPlatelia™ Aspergillus EIA em dois locais na Bélgica e na Holanda. O estudo foi realizadoretrospectivamente utilizando um total de 4 873 amostras de soro recolhidas de 203 doentes dasseguintes populações*: • doentes sem sinas de aspergilose invasiva (doentes de controlo) • doentes com aspergilose invasiva provável • doentes com aspergilose invasiva comprovada * O Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) da European Organization for Research andTreatment of Cancer (EORTC - Organização Europeia para a Investigação e Tratamento do Cancro) eo Mycosis Study Group (MSG) do National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID -Instituto Nacional de Alergias e Doenças Infecciosas dos Estados Unidos) definiram os critérios para odiagnóstico da aspergilose invasiva (IA) em doentes com malignidade hematológica ou transplantedas células estaminais hematopoéticas 2.
A aspergilose invasiva comprovada é definida como pelo menos um critério microbiológico, e umcritério clínico principal ou dois secundários de um local consistente com infecção, num hospedeirocom sintomas atribuídos à infecção fúngica.
A aspergilose invasiva provável é definida como pelo menos um critério microbiológico, e umcritério clínico principal ou dois secundários de um local consistente com infecção, num hospedeirocom sintomas atribuídos à infecção fúngica.
A aspergilose invasiva possível é definida como pelo menos um critério microbiológico, ou umcritério clínico principal ou dois secundários de um local consistente com infecção, num hospedeirocom sintomas atribuídos à infecção fúngica.
108
Patologia Nº de amostras testadas Nº de positivas
Factor reumatóide 10 0
Anticorpo anti-nuclear 10 0
Hipergamaglobulinemia IgG 10 0
Hipergamaglobulinemia IgM 10 0
Cancro* 11 0
Cirrose não viral (sobretudo biliar; provocada pelo álcool; provocada por drogas) 10 0
Várias transfusões 10 0
Mulheres multíparas 10 0
VHA 10 0
VHC 10 0
Rubéola 10 0
CMV 10 0
Sífilis (RPR+) 10 0
Toxoplasmose 10 0
Micoplasma 10 0
Considerando a relativa raridade da aspergilose invasiva provável ou comprovada, tecemos aseguinte definição de sensibilidade e especificidade clínica para as finalidades deste estudo.
SENSIBILIDADE Os resultados deste estudo foram analisados em termos de sensibilidade do doente. Realizou-se umensaio de sensibilidade utilizando o Platelia™ Aspergillus EIA em dois locais num total combinado de38 episódios de 35 Transplantes de medula óssea (TMO) e doentes com leucemia com aspergiloseinvasiva comprovada ou provável diagnosticada.
1. Aspergilose comprovada (conforme determinado pelo IFICG / EORTC ; ver acima)Locais combinados N = 19 episódios de 16 doentesSensibilidade: 100% (19/19).Nota: Não foi possível calcular o intervalo de confiança de 95% devido ao tamanho insuficiente daamostra.
2. Aspergilose provável (conforme definida pelo IFICG / EORTC ; ver acima)Locais combinados N = 19 episódios de 19 doentesSensibilidade: 94,7% (18/19).Nota: Não foi possível calcular o intervalo de confiança de 95% devido ao tamanho insuficiente daamostra.
3. Aspergilose comprovada e provável combinadas (conforme definida pelo IFICG /EORTC ; ver acima)
Locais combinados N = 38 episódios de 35 doentesSensibilidade: 97,4% (37/38). O intervalo de confiança de 95% é de 86,2 – 99,9%.
ESPECIFICIDADE Realizou-se um ensaio de especificidade utilizando o Platelia™ Aspergillus EIA em dois locais num totalcombinado de 3 691 amostras obtidas de 201 episódios (168 doentes) sem sinais de aspergiloseinvasiva (doentes de controlo).
Local 1: N = 3 060 amostras, de 103 episódios (70 doentes) Especificidade : 92,2% (95/103) O intervalo de confiança de 95% é de 85,3 – 96,6%.
Local 2: N = 631 amostras de 98 episódios (98 doentes) Especificidade : 88,8% (87/98) O intervalo de confiança de 95% é de 80,8 -94,3%.
Locais combinados N = 3 691 amostras de 201 episódios (168 doentes)Especificidade : 90,5% (182/201) O intervalo de confiança de 95% é de 85,6 -94,2%.
VALOR PREDITIVO Os valores preditivos positivos e negativos (VPP, VPN) foram analisados para a população dedoentes destes estudo, com base na média real da taxa de prevalência de 16% observada nesteestudo.VPP: 66,1% (37/56) VPN: 99,4% (182/183) A análise também foi realizada considerando resultados positivos quando 2 amostrasconsecutivas apresentaram um índice superior ou igual a 0,5.O desempenho é resumido na seguinte tabela:
*: a sensibilidade foi calculada na aspergilose invasiva comprovada e provável
109
Sensibilidade* Especificidade VPP VPN
Locais combinados considerando 1amostra ≥ 0,5
97,4%(37/38)
90,5%(182/201)
66,1%(37/56)
99,4%(182/183)
Locais combinados considerando 2 amostras consecutivas ≥ 0,5
92,1%(35/38)
97,5%(196/201)
87,5%(35/40)
98,5%(196/199)
16-CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTETodos os reagentes fabricados são preparados em conformidade com o nosso Sistema deQualidade, começando na recepção da matéria-prima até à comercialização final do produto.Todos os lotes são sujeitos a avaliações de controlo de qualidade e apenas serão lançados nomercado depois de cumprirem critérios de aceitação predefinidos.Os registos relacionados com a produção e o controlo de cada lote individual são mantidos naBio-Rad.
17-BIBLIOGRAFIAVeja a versão Inglesa.
110
17-BIBLIOGRAPHY1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P. M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus galactomannan
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