0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 50 100 150 200 250 300

Re

lati

ve f

luo

resc

en

ce

Tobramycin µg/ml

50

25

12,5

6,25

3,125

0

Miconazol

Materiales y métodos1- Placas de microtitulación:

o Cultivo puro (24h,36 ºC, agitación) en medio Muller-Hintono Formación de biopelículas a las 24h en placas de microtitulación a 36 ºC, en medio Muller-Hinton.o Añadir tratamientos :

o Tobramicina 0-8192 μMo Azoles 0-400 μM

o Cuantificación celular con resarzurina

2- Diluciones seriadas sucesivas y cultivo en Placas de Petrio Cultivo puro (24h,36 ºC, agitación) en medio Muller-Hintono Dividir bacteria en 12 tubos de Falcon y añadir tratamientos : Tobramicina ½ CMI + Azole 50 μM

o 3 tubos sin tratamiento (Control de Infección)o 3 tubos con Azoles (Control de azoles)o 3 tubos con Tobramicina (control de tobramicina)o 3 tubos con Tobramicina + Azoles

o Cultivo en placas de Petri con medio TSA tras dilución seriada sucesivao 48 horas : recuento

3-Protocolo con Galleria Mellonella o Infectar larvas con Burkholderia cenocepacia LMG 16656 y tratarlos con :

o Tobramicinao Azoleso Tobramicina 512 μg/ml + Azoles 50 μMo Establecer controles : No Infectadas, Infectadas y no tratadas, de tobramicina y azoles

o Incubar 24h a 36ºo Contar supervivientes /muertas tras 24, 48 y 72 horaso Triturar, cultivo en placas de Petri con medio BCC tras dilución seriada sucesivao Contar tras 48 horas

Objetivos1. Demostrar el efecto

sinérgico de la

Tobramicina junto con

distintas combinaciones

de Azoles sobre biopelículas de E.Coli

2. Determinar si el sinergismo

podría ser extensible a

células planctónicas de

Burkholderia

cenocepacia LMG 16656,

cuyos resultados en el

biopelículas se han

determinado en

publicaciones anteriores

3. Confirmar resultados in

vivo empleando células

planctónicas de

Burkholderia

cenocepacia LMG 16656

empleado el protocolo

de Galleria mellonella

Resultados1-Placas de microtitulación

Tobramicina + Miconazole en biopelículas de E.Coli

T

Tobramicina + Econazole en biopelículas de E.Coli

2-Diluciones seriadas sucesivas y cultivo en placas de Petri con células planctónicas de

Burkholderia cenocepacia LMG 16656

3-Protocolo con Galleria Mellonella% de supervivencia (24-48-72h)

Recuento de colonias en placas de Petri

Conclusiones1- Estudios anteriores con biopelículas de diferentes especies de Burkholderia cenocepacia

han demostrado un sinergismo entre la Tobramicina + Azoles2- Hemos observado que este sinergismo, a falta de ensayos en placas de microtitulación,

podría ser extensible a células planctónicas de Burkholderia cenocepacia LMG 166563- Hemos confirmado el sinergismo en otras biopelículas de bacterias Gram negativas, como

E.Coli4- Los resultados en los modelos in vivo no fueron significativos para concluir que la

combinación Tobramicina + Azoles se traduzca en un mayor % de supervivencia en las larvas de Galleria Mellonella. No obstante en una segunda fase de cuantificación se demostró la

combinación Tobramicina + Azole como más eficaz frente a la Tobramicina de forma aislada (menos UFC/ml)

5- Combinaciones de Tobramicina + Azoles podrían suponer una nueva estrategia farmacológica en el tratamiento de las infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis

quística

Resistencia bacteriana por formación de biopelículas en pacientes con fibrosis quística. Nuevas perspectivas de tratamiento

Ruiz Sanz J **Facultad de Farmacia UCM

Agradecimientos a Freija Van den Driessche y Tom Coenye, Dpto. de Microbiología UGent

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 50 100 150 200 250 300

Re

lative

flu

ore

sce

nc

e

Tobramycin µg/ml

50

25

12,5

6,25

3,125

0

Econazole

1.00E+00

1.00E+01

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

1.00E+07

1.00E+08

1.00E+09

- ECO -

TOB ECO GC

100 C

FU

/ml

0

20

40

60

80

100

120

NI+FW I+T I+O I+O+T I+FW

Pe

rce

nt

of

surv

iva

l

0

20

40

60

80

100

120

NI+FW I+O I+O+T I+FW I+T

Pe

rce

nt

of

surv

iva

l

-20

0

20

40

60

80

100

120

NI+FW I+T I+O I+O+T I+FW

Pe

rce

nt

of

surv

iva

l

1.00E+00

1.00E+01

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

1.00E+07

1.00E+08

I T E T+E K K+T

CFU

/la

rva

e

24 p.i.

Bibliografía1- Alejandro A.Pezzuelo, Xiao Xiao Tang, Mark J. Hoegger, Mahmoud H.Abou Alaiwa, Shyam

Ramachandran, Thomas O.Moninger , Philipp H. Karpp, Christine L. Wohlford-Lenane,. Rediuced airwaysurface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung . Nature 2012 ; 487 : 109-113

2- Isabelle Sermet-Gaudel us , Jacques de Blic, Muriel LeBourgeois, Iwona Pranke, Aleksander Edelmanand Bonnie W. Ramsey. Potentiating and correcting mutant CFTR in patients with cystic fibrosis. Faculté de

Medicine René Descartes, Paris, France, 2014 ; 64 :129-1493- Gilles Brackman Paul Cos, Louis Maes, Hans. J Nelis and Tom Coenye. Quorum sensing inhibitors

increase the suceptibility of Bacterial biofilms to antibiotics. In vitro and in vivo . American Society of Microbiology 2011 ; 81 : 774-782