Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC

Posttranslační modifikace jsou běžnou záležitostí

• Fosforylace transkripčních faktorů(viz jaderná lokalizace Swi5 z minula)

• Fosforylace CDK samotných

• Ale fosforylací možnosti nekončí ... vazba dalších podjednotek, ubikvitinace, degradace ...

Fosforylace proteinů obecně - rekapitulace

NC

O

H

C

H

R

NC

O

H

C

H

R

O

C

CH2

CH3OH

CH

OHOH

S, Ser T, ThrY, Tyr

O

P

O-

O-O

CH3

CH3

CH

CH3A, Ala

V, Val

F, Phe

CH2

CH2

C

O O-

Q, GluH, His

wee mutanti S. pombe

wtcdc2-w

wee1: tyrosin kinázacdc25: fosfatáza, opačný fenotyp!

(P. Nurse et al.)

(... mik1!)

dvojitý mutant wee1 cdc25??

cdc13(G2 cyklin)

Substrátem Wee1 a Cdc25 je CDK!

cdc2

Y15 - P

cdc13(G2 cyklin)

cdc2

Y15

cdc25

wee1/mik1

nim1

CDC25 obvod je evolučně starý (aspoň u opisthokont)

• Aspergillus: NimT (Nim/Bim terminologie ...)

• S. cerevisiae má ... ale fenotyp??– na první pohled nic– ALE víc dvojjaderných buněk – kontrola kvality

(pučení)

• HeLa: Y15F – předčas. vstup do mitosy!!• Xenopus: Y15 P ace nutná pro blok mitosy po

aphidicolinu• Rostliny???

(Simpson and Roger, Curr. Biol. 14:R693, 2005)

Exprese kvasinkového Cdc25 v rost. buňkách má fenotyp

(Orchard et al. ... Suchomelová, Lipavská ... 2005)

CDC25, Ostreococcus Score E

Sequences producing significant alignments: (bits) Value

gb|AAQ16122.1| dual specificity phosphatase Cdc25 [Ostreoco... 795 0.0 gb|AAH02287.1| Cdc25b protein [Mus musculus] 112 2e-23ref|NP_075606.1| cell division cycle 25 homolog B [Mus musc... 112 2e-23gb|AAH57568.1| Cdc25b protein [Mus musculus] >gi|26335863|d... 112 2e-23ref|XP_331695.1| hypothetical protein [Neurospora crassa] >... 111 4e-23ref|NP_598255.1| cell division cycle 25A [Rattus norvegicus... 109 1e-22ref|NP_598256.1| cell division cycle 25B [Rattus norvegicus... 109 1e-22gb|AAR26469.1| cell division cycle 25B [Homo sapiens] >gi|1... 109 1e-22gb|AAB21139.1| p63 [Homo sapiens] 109 1e-22ref|NP_068658.1| cell division cycle 25B isoform 2 [Homo sa... 109 1e-22ref|NP_004349.1| cell division cycle 25B isoform 1 [Homo sa... 109 1e-22gb|AAH09953.1| CDC25B protein [Homo sapiens] >gi|11641413|r... 109 1e-22ref|NP_997695.1| cell division cycle 25B isoform 5 [Homo sa... 109 1e-22gb|AAP36368.1| Homo sapiens cell division cycle 25B [synthe... 109 1e-22emb|CAE45909.2| hypothetical protein [Homo sapiens] 109 1e-22pdb|1CWR|A Chain A, Human Cdc25b Catalytic Domain Without I... 109 1e-22dbj|BAB46915.1| hypothetical protein [Macaca fascicularis] 109 1e-22

...

ref|XP_456705.1| unnamed protein product [Debaryomyces hans... 94 8e-18ref|XP_446231.1| unnamed protein product [Candida glabrata]... 93 1e-17emb|CAA45885.1| NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi|422216... 92 3e-17

„CDC25“, Arabidopsis Score ESequences producing significant alignments: (bits) Value

pdb|1T3K|A Chain A, Nmr Structure Of A Cdc25-Like Dual-Spec... 273 7e-73gb|AAO39886.1| At5g03455 [Arabidopsis thaliana] >gi|2645085... 271 3e-72emb|CAB83305.1| putative protein [Arabidopsis thaliana] >gi... 271 3e-72gb|AAM63780.1| unknown [Arabidopsis thaliana] 268 3e-71ref|NP_912542.1| Hypothetical protein [Oryza sativa (japoni... 175 2e-43gb|AAU11500.1| rhodanese-like protein [Holcus lanatus] 170 8e-42ref|NP_922597.1| unknown protein [Oryza sativa (japonica cu... 169 2e-41gb|EAA75237.1| hypothetical protein FG05666.1 [Gibberella z... 70 1e-11gb|EAA53924.1| hypothetical protein MG01909.4 [Magnaporthe ... 68 7e-11ref|XP_502979.1| hypothetical protein [Yarrowia lipolytica]... 67 1e-10gb|EAA58015.1| hypothetical protein AN6040.2 [Aspergillus n... 66 2e-10ref|XP_327252.1| predicted protein [Neurospora crassa] >gi|... 62 3e-09ref|XP_462481.1| unnamed protein product [Debaryomyces hans... 56 3e-07gb|EAL22654.1| hypothetical protein CNBB1040 [Cryptococcus ... 53 2e-06gb|EAK93619.1| possible protein phosphatase [Candida albica... 52 4e-06ref|NP_595247.1| rhodanase domain protein [Schizosaccharomy... 51 9e-06ref|NP_869856.1| hypothetical protein RB11227 [Rhodopirellu... 46 2e-04gb|EAA42885.1| GLP_574_157368_157730 [Giardia lamblia ATCC ... 46 3e-04ref|YP_144680.1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo... 45 4e-04ref|ZP_00282577.1| COG0607: Rhodanese-related sulfurtransfe... 44 9e-04sp|P27477|THTR_SYNP7 Putative thiosulfate sulfurtransferase... 44 0.001gb|EAK87236.1| hypothetical protein UM06379.1 [Ustilago may... 44 0.001gb|AAP10445.1| Hydroxyacylglutathione hydrolase [Bacillus c... 43 0.003ref|NP_015526.1| Arr2p [Saccharomyces cerevisiae] >gi|45269... 42 0.003ref|YP_005018.1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo... 42 0.003ref|XP_448265.1| unnamed protein product [Candida glabrata]... 42 0.003emb|CAA45885.1| NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi|422216... 42 0.006

Landrieu et al. 2004(chybí regulační doména?)

A to ještě není všechno: CDK mají i další fosforylační místa.

T14

Y15

T161

T161

Y15

T14

T161

Y15

T14T14

Y15

T161

T14Y15

T161

cdc25

wee1 cyklin

CAKs – CDK activating kinases

Kvasinky:

• S. pombe: – Mcs6/Mcs2 (CDK/cyklin) je CAK i CTD kin.– upstream CAKAK (monomerní)

• S. cerevisiae: – monomerní CAK (Cak1p)– monomerní CTD kin (Kin28p)

A co rostliny?

• Arabidopsis:– CAK1-CAK4– CAK2, CAK4 blízké

CDK7 – substrátem CTD i CDK– CAK1 (CDKF): upstream

od CAK2,4 (CAKAK!), komplementuje cak1ts

Shimotohno et al. (incl. K. Bišová) 2004

CA

K m

ezi rost. CD

K

Robbens et al. 2004

(Doerner lab 2005)

exocytosis via NSF(PCTAIRE! – Liu et al. 2006)

... a u živočichů

Rozdíly jsou v délce kinázové kaskády?

CDK

CAK

CAKAK

S. pombe, metazoa, rostlinyS. cerevisiae

CTD

inaktivní aktivníkináza substrát

Degradace proteinů jakožto „extrémní modifikace“

Zpět k cyklovým hodinám kvasinek

  

G1 S G2 M"start"

Cln3

Cln1,2

Clb5,6

Clb3,4

Clb1,2

Rekapitulace: transkripční regulační obvody pučivé kvasinky

Amon et al. 1993Co brání současné aktivaci CLB a CLN?

Swi4, Swi6

Mbp1, Swi6

Mutanti S.c. s dlouhými pupeny a G1 jádrem

cdc4, cdc34, cdc53

... a také všeobecný nedostatek CLB!

(Schwob et al. 1994)(drženo na živu GAL:CLB5)

Clb/Cdc28 potřebuje k aktivaci ještě něco ...

... co chybí v „dlouhopupenatých“ mutantech.

(pozor na kontroly!!)

p40SIC1: inhibitor CDK

• nalezen biochemicky• esenciální• ale dvojitý mutant

cdc34 sic1 replikuje v pm-

• je cdc34, cdc4, cdc53 třeba pro degradaci?? ANO!

• inhibitory CDK• degradace

Model

Jorgensen and Tyers 2000

Sic1 sám je regulován i transkripčně

CycD

CLB

Inhibitory CDK (CKI):

Cdc28

CDK4CDK4

CycA etc.

CDK2/4

p40Sic1

p15

p21,p27Kip1

CKI a vstup do cyklu (živ. b.)

G0/G1 S

pRB

CycD/CDK4 CycE/CDK2

p15p16 p21p27

p53

CDK inhibitoryjakožto antionkogeny

Co jsou Cdc4, Cdc34, Cdc53??Degradace proteinů zprostředkovaná ubikvitinací

Ubiquitin

76 aa, 8.5 kDa96 % ident. člověk-kvasinka

CDC34 = E2!!!

E3 – ubikvitin ligázy: SCF (Skp1/cullin/F-box)

Cul1 = cullin = Cdc53!!

Sic1

Cdc34Cdc4

NEDD8= Rub1(related to ubiquitin)

Jiné tváře SCF

Cul1 = cullin = Cdc53!!, CUL1

Sic1

Cdc34Cdc4TIR1

auxin responsefotomorfogeneze

Neddylace:AXR1deNeddylace:COP9 signalosom

... degradace cyklinů ...

Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy

(G2/M)?

• Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, CycA/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny?

• Aktivace CDK fosforylací T161

• Dereprese CDK defosforylací T14, Y15

• Ještě něco??

Jakou roli hraje degradace mitotických cyklinů?

• Nedegradovatelný cyklin A,B • Nadprodukce „destruction boxu“

Metaphase arrest!!

Je destrukce cyklinu nutná pro přechod Meta/Ana?

RxxLxxxxN cyclin

„destruction box“

cyclin

CDK

metafáze anafáze telofáze G1

CDK

ALE: cdc15!

Anafáze při vysoké hladině CLB/CDK!!

(Surana et al. 1993)

lND fenotyp

... a nadbytek CLB blokuje v anafázi, ne metafázi!

(Surana et al. 1993)

cyclin

CDK

metafáze anafáze telofáze G1

CDK

Cdc15

... ALE předcházející pokusy s M blokem po inhibici degradace cyklinů!

Jak smířit modely?

cyclin

CDK

metafáze anafáze telofáze G1

CDKCdc15X

... a co tedy degraduje ty cykliny??

CLB se nehromadí v buňkách bez CLN

(Amon et al. 1994)

... a příčinou je specifická degradace!

... a navíc:

• Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB.

• Model!

Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor?

sta rt

repl

ica t

ionm

itos is

rep l

icat

ion m

itos is

CLB activ ity

s ta rtC LN txn

S ic1

C LB

(CKI)

CL

N

CLB

none