CONTROL RESPIRATORIO CONTROL RESPIRATORIO

CURVAS DE CONSUMO DE OXIGENOCURVAS DE CONSUMO DE OXIGENO

Prof. Dra. Silvia González-CalvarProf. Dr. Héctor Coirini

InstruccionesInstrucciones

En la siguiente presentación encontrará En la siguiente presentación encontrará cuadros con textocuadros con texto y y

cuadros con gráficoscuadros con gráficos. .

Para favorecer la lectura de los primeros, cada cuadro está Para favorecer la lectura de los primeros, cada cuadro está

preparado para avance manual, es decir cuando termine de leer preparado para avance manual, es decir cuando termine de leer

este cuadro, deberá pulsar la tecla o bien AvPag para avanzar este cuadro, deberá pulsar la tecla o bien AvPag para avanzar

y si desea retroceder o RePag. y si desea retroceder o RePag.

En los cuadros con gráficos, espere a que aparezca una flecha En los cuadros con gráficos, espere a que aparezca una flecha

verde en el ángulo inferior derecho, antes de pulsar las teclas de verde en el ángulo inferior derecho, antes de pulsar las teclas de

avance o retroceso.avance o retroceso.

En condiciones fisiológicas, el transporte de electrones En condiciones fisiológicas, el transporte de electrones

en la cadena respiratoria mitocondrial está acoplado a la en la cadena respiratoria mitocondrial está acoplado a la

fosforilación de ATP. Recordemos que, desde el punto de fosforilación de ATP. Recordemos que, desde el punto de

vista termodinámico, dos procesos están acoplados cuando la vista termodinámico, dos procesos están acoplados cuando la

energía libre liberada por uno de ellos (proceso exergónico) es energía libre liberada por uno de ellos (proceso exergónico) es

utilizada por el otro (proceso endergónico), el cual, de otra utilizada por el otro (proceso endergónico), el cual, de otra

manera, no podría ocurrir espontáneamente. Esto se pone en manera, no podría ocurrir espontáneamente. Esto se pone en

evidencia cuando observamos que en la cadena respiratoria evidencia cuando observamos que en la cadena respiratoria

(proceso exergónico), los electrones pueden fluir sólo si el (proceso exergónico), los electrones pueden fluir sólo si el

ADP es simultáneamente fosforilado a ATP (proceso ADP es simultáneamente fosforilado a ATP (proceso

endergónico). Así, el consumo de oxígeno mitocondrial está endergónico). Así, el consumo de oxígeno mitocondrial está

regulado no sólo por el aporte de NADH, sino también por los regulado no sólo por el aporte de NADH, sino también por los

niveles de ADP y Pi.niveles de ADP y Pi.

IntroducciónIntroducción

La regulación de la velocidad de fosforilación oxidativa La regulación de la velocidad de fosforilación oxidativa

por los niveles de ADP se denomina CONTROL RESPIRATORIO. por los niveles de ADP se denomina CONTROL RESPIRATORIO.

Este mecanismo regulatorio permite que, cuando los niveles de Este mecanismo regulatorio permite que, cuando los niveles de

ADP se incrementan como consecuencia de un gasto de ATP, ADP se incrementan como consecuencia de un gasto de ATP,

paralelamente aumenta la velocidad de fosforilación oxidativa paralelamente aumenta la velocidad de fosforilación oxidativa

para reponer el ATP consumido. Debido a que la fosforilación para reponer el ATP consumido. Debido a que la fosforilación

oxidativa está acoplada a la cadena de transporte de electrones, oxidativa está acoplada a la cadena de transporte de electrones,

el incremento en la velocidad de la fosforilación oxidativa se el incremento en la velocidad de la fosforilación oxidativa se

refleja por un aumento en el flujo de electrones a través de la refleja por un aumento en el flujo de electrones a través de la

cadena respiratoria y, por lo tanto, del consumo de oxígeno (o cadena respiratoria y, por lo tanto, del consumo de oxígeno (o

bien por una disminución en la concentración del oxígeno del bien por una disminución en la concentración del oxígeno del

entorno).entorno).

IntroducciónIntroducción

En condiciones experimentales, el control respiratorio En condiciones experimentales, el control respiratorio

puede evaluarse en suspensiones mitocondriales de un dado puede evaluarse en suspensiones mitocondriales de un dado

tejido en presencia de oxígeno. Las mitocondrias deben estar tejido en presencia de oxígeno. Las mitocondrias deben estar

intactas y ser incubadas con un medio con sustratos intactas y ser incubadas con un medio con sustratos

oxidables que permitan la generación de coenzimas oxidables que permitan la generación de coenzimas

reducidas. Las variaciones en el consumo de oxígeno son reducidas. Las variaciones en el consumo de oxígeno son

evaluadas por un dispositivo que tiene un electrodo sensible a evaluadas por un dispositivo que tiene un electrodo sensible a

las concentraciones de oxígeno (polarógrafo). Observar que las concentraciones de oxígeno (polarógrafo). Observar que

un aumento en el consumo de oxígeno se traduce en una un aumento en el consumo de oxígeno se traduce en una

disminución en la concentración de oxígenodisminución en la concentración de oxígeno..

IntroducciónIntroducción

Los cambios en la velocidad de consumo de oxígeno Los cambios en la velocidad de consumo de oxígeno

(consumo de oxígeno en la unidad de tiempo)(consumo de oxígeno en la unidad de tiempo) de la de la

suspensión mitocondrial puede comprobarse agregando ADP suspensión mitocondrial puede comprobarse agregando ADP

al medio: esto provoca un rápido aumento en el consumo de al medio: esto provoca un rápido aumento en el consumo de

oxígeno. oxígeno.

Cuando las mitocondrias son suspendidas en un Cuando las mitocondrias son suspendidas en un

medio en el cual existe una alta concentración de sustratos, medio en el cual existe una alta concentración de sustratos,

fosfatos y oxígeno, se encuentran en un estado metabólico fosfatos y oxígeno, se encuentran en un estado metabólico

llamado llamado “estado 4“estado 4” y la respiración es lenta. Cuando se añade ” y la respiración es lenta. Cuando se añade

ADP se estimula la síntesis de ATP y se incrementa la ADP se estimula la síntesis de ATP y se incrementa la

velocidad del transporte de electrones, y por lo tanto, del velocidad del transporte de electrones, y por lo tanto, del

consumo de oxígeno: este estado metabólico se lo llama consumo de oxígeno: este estado metabólico se lo llama

“estado 3”“estado 3”, y permanece así hasta que se consume el ADP , y permanece así hasta que se consume el ADP

añadido. añadido. Gráfico 1

IntroducciónIntroducción

TIEMPO

Mitocondrias de hígado en suspensiónMitocondrias de hígado en suspensión

ADP + PiADP + Pi

Co

nce

ntr

ació

n d

e C

on

cen

trac

ión

de

oxí

gen

oo

xíg

eno

EE44

EE33

Se denomina CONTROL RESPIRATORIO a la relación entre la Se denomina CONTROL RESPIRATORIO a la relación entre la

respiración en el estado 3 y la correspondiente al estado 4. respiración en el estado 3 y la correspondiente al estado 4.

Otro índice útil para evaluar la actividad mitocondrial Otro índice útil para evaluar la actividad mitocondrial

es la relación P:O, es decir, la relación entre el fosfato es la relación P:O, es decir, la relación entre el fosfato

incorporado al ATP y el oxígeno consumido al oxidar el incorporado al ATP y el oxígeno consumido al oxidar el

sustrato. Tanto el control respiratorio como la relación P:O, sustrato. Tanto el control respiratorio como la relación P:O,

son utilizados para expresar el grado de acoplamiento entre son utilizados para expresar el grado de acoplamiento entre

los procesos de oxidación y de fosforilación. Valores bajos de los procesos de oxidación y de fosforilación. Valores bajos de

control respiratorio o de índice P:O indican mitocondrias control respiratorio o de índice P:O indican mitocondrias

dañadas o desacopladas.dañadas o desacopladas.

ESTADOS METABÓLICOS MITOCONDRIALESESTADOS METABÓLICOS MITOCONDRIALES

Estado Estado MetabólicoMetabólico OO22 Nivel de ADPNivel de ADP

Nivel de Nivel de sustrato de sustrato de la cadena la cadena respiratoriarespiratoria

Velocidad de Velocidad de respiraciónrespiración

Factor Factor determinante determinante de la de la actividad actividad respiratoriarespiratoria

11 DisponibleDisponible BajoBajo BajoBajo LentaLenta ADPADP

22 DisponibleDisponible AltoAlto Muy bajoMuy bajo LentaLentaSustrato de la Sustrato de la

cadena cadena respiratoriarespiratoria

33 DisponibleDisponible AltoAlto AltoAlto RápidaRápida Cadena Cadena respiratoriarespiratoria

44 DisponibleDisponible BajoBajo AltoAlto Lenta Lenta ADPADP

55No disponible No disponible (anaerobiosis)(anaerobiosis) AltoAlto AltoAlto NulaNula OxígenoOxígeno

La evolución de la concentración de oxígeno en una La evolución de la concentración de oxígeno en una

suspensión mitocondrial en función de los niveles de ADP y suspensión mitocondrial en función de los niveles de ADP y

sustrato se puede ver en el sustrato se puede ver en el

Inicialmente, las mitocondrias están suspendidas en un Inicialmente, las mitocondrias están suspendidas en un

medio con bajo nivel de sustrato y de ADP, en presencia de medio con bajo nivel de sustrato y de ADP, en presencia de

oxígeno.oxígeno.

Gráfico 2

A.- Las mitocondrias no consumen oxígeno porque al A.- Las mitocondrias no consumen oxígeno porque al

carecer de sustrato oxidable no generan coenzimas carecer de sustrato oxidable no generan coenzimas

reducidas y por lo tanto no requieren oxígeno para su reducidas y por lo tanto no requieren oxígeno para su

reoxidación.reoxidación.

B.- El agregado de malato no modifica marcadamente el B.- El agregado de malato no modifica marcadamente el

consumo de oxígeno por falta de ADP, por lo tanto no se consumo de oxígeno por falta de ADP, por lo tanto no se

observa variación en la concentración de oxígeno. El bajo observa variación en la concentración de oxígeno. El bajo

nivel de ADP sólo produce una ligera disminución de la nivel de ADP sólo produce una ligera disminución de la

concentración de oxígeno (o bien, un ligero incremento en concentración de oxígeno (o bien, un ligero incremento en

el consumo de oxígeno. el consumo de oxígeno.

C.- El agregado de ADP exógeno permite que ocurra la C.- El agregado de ADP exógeno permite que ocurra la

fosforilación oxidativa y, por lo tanto, hay una disminución en fosforilación oxidativa y, por lo tanto, hay una disminución en

la concentración de oxígeno (aumento en el consumo de la concentración de oxígeno (aumento en el consumo de

oxígeno). El ADP agregado se va agotando a medida que la oxígeno). El ADP agregado se va agotando a medida que la

fosforilación oxidativa ocurre. Esto se refleja con el cambio de fosforilación oxidativa ocurre. Esto se refleja con el cambio de

pendiente que se observa al final de esta fase.pendiente que se observa al final de esta fase.

D.- El agregado de ADP no modifica los niveles de oxígeno D.- El agregado de ADP no modifica los niveles de oxígeno

presentes. Esta situación se debe al agotamiento del sustrato.presentes. Esta situación se debe al agotamiento del sustrato.

E.- El agregado de más sustrato reestablece el sistema y la E.- El agregado de más sustrato reestablece el sistema y la

suspensión mitocondrial respira activamente. suspensión mitocondrial respira activamente.

TIEMPO

Mitocondrias de hígado en suspensiónMitocondrias de hígado en suspensión

MalatoMalato

ADP + PiADP + Pi

Co

nce

ntr

ació

n d

e C

on

cen

trac

ión

de

oxí

gen

oo

xíg

eno MalatoMalato

AABB

CC

DDEE

ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA

FOSFORILACION OXIDATIVAFOSFORILACION OXIDATIVA

Tipo de interferencia: Tipo de interferencia: Inhibición de la transferencia de electronesInhibición de la transferencia de electrones

Cianuro (CN-)Cianuro (CN-)Monóxido de carbono (CO)Monóxido de carbono (CO)Azida sódica (NaAzida sódica (Na33N)N)

Inhiben la citocromo oxidasa (Complejo IV)

Antimicina A Antimicina A Bloquea la transferencia de electrones desde el citocromo b al citocromo c1

RotenonaRotenonaAmitalAmitalPiercidina A Piercidina A

Inhiben la transferencia de electrones desde un centro Fe-S de la NADH deshidrogenasa (Complejo I) a la ubiquinona (CoQ)

Malonato Malonato Inhibe la transferencia de electrones a nivel de la succinato deshidrogenasa (Complejo II)

CH3

CH2CH2CH2CH2CH2CH3CH3

CH2CHCH3

CH3

Antimicina A

ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA

FOSFORILACION OXIDATIVAFOSFORILACION OXIDATIVA

Tipo de interferencia: Tipo de interferencia: Inhibición de la ATPsintasaInhibición de la ATPsintasa

OligomicinaOligomicinaVenturicidinaVenturicidina

Bloquea el flujo de protones a través de Fo

Atractilósido Atractilósido Inhibe la adenina nucleótido translocasa.

Tipo de interferencia: Tipo de interferencia: Inhibición del intercambio ATP-ADPInhibición del intercambio ATP-ADP

Oligomicina

O

OO

CH2

COOH

OH

H3C

CH3H3C

H2C-OH

KO3SO

KO3SO

O

Atractilósido

Tipo de interferencia:Tipo de interferencia: Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa y Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa y el transporte de electronesel transporte de electrones

DinitrofenolDinitrofenolCarbonil-cianuro Carbonil-cianuro fenil hidrazona fenil hidrazona

Actúan como ácidos débiles, disminuyendo la concentración de protones en el espacio intermembrana.

ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA

FOSFORILACION OXIDATIVAFOSFORILACION OXIDATIVA

Valinomicina Valinomicina

Proteína desacopladoraProteína desacopladora(termogenina) (termogenina)

Forma poros conductores de protones en la membrana interna de la mitocondria del tejido adiposo marrón.

Ionóforo del K+, disminuyendo el gradiente eléctrico

NO2

NO2

HO

2,4-Dinitro-fenol

2,4-Dinitro-fenol

Valinomicina

EJEMPLOS DE CURVAS DE CONSUMO DE EJEMPLOS DE CURVAS DE CONSUMO DE

OXÍGENO CON EL AGREGADO DE OXÍGENO CON EL AGREGADO DE

COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA

CADENA RESPIRATORIA Y LA CADENA RESPIRATORIA Y LA

FOSFORILACION OXIDATIVAFOSFORILACION OXIDATIVA

Co

nce

ntr

ació

n d

e C

on

cen

trac

ión

de

oxí

gen

oo

xíg

eno

TIEMPO

Mitocondrias de hígado en suspensiónMitocondrias de hígado en suspensión

SuccinatoSuccinato

ADP + PiADP + PiCNCN--

DNFDNF

A.- La suspensión mitocondrial en un entorno aeróbico y sustratos A.- La suspensión mitocondrial en un entorno aeróbico y sustratos oxidables consume oxígeno.oxidables consume oxígeno.

B.- Al agregar un sustrato oxidable se aumenta la velocidad de consumo B.- Al agregar un sustrato oxidable se aumenta la velocidad de consumo de oxígeno y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuye y de oxígeno y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuye y también la del ADP endógeno, por lo tanto este compuesto comienza a ser también la del ADP endógeno, por lo tanto este compuesto comienza a ser limitante.limitante.

C.- Al agregarle ADP + Pi, la velocidad de consumo de oxígeno aumenta C.- Al agregarle ADP + Pi, la velocidad de consumo de oxígeno aumenta significativamente y entonces, la concentración de oxígeno disminuye en significativamente y entonces, la concentración de oxígeno disminuye en forma abrupta.forma abrupta.

D.- Al agregar cianuro, que es un inhibidor del complejo IV (citocromo D.- Al agregar cianuro, que es un inhibidor del complejo IV (citocromo oxidasa) se bloquea el transporte de electrones y, por lo tanto, no hay oxidasa) se bloquea el transporte de electrones y, por lo tanto, no hay consumo de oxígeno. La concentración de oxígeno no se modifica.consumo de oxígeno. La concentración de oxígeno no se modifica.

E.- Al agregar 2,4 dinitro-fenol que es un desacoplante de la fosforilación E.- Al agregar 2,4 dinitro-fenol que es un desacoplante de la fosforilación oxidativa, sigue sin variar la concentración de oxígeno, es decir no se oxidativa, sigue sin variar la concentración de oxígeno, es decir no se reanuda el consumo de oxígeno porque la cadena respiratoria continúa reanuda el consumo de oxígeno porque la cadena respiratoria continúa bloqueada por el cianuro que se agregó en los pasos anteriores.bloqueada por el cianuro que se agregó en los pasos anteriores.

TIEMPO

Mitocondrias de hígado en suspensiónMitocondrias de hígado en suspensión

SuccinatoSuccinatoADP + PiADP + Pi

OLIGOLIG

DNFDNF

[O[O22] = 0] = 0

Co

nce

ntr

ació

n d

e C

on

cen

trac

ión

de

oxí

gen

oo

xíg

eno

A.- La suspensión mitocondrial en un entorno aeróbico y sustratos A.- La suspensión mitocondrial en un entorno aeróbico y sustratos oxidables consume oxígeno.oxidables consume oxígeno.

B.- Al agregar un sustrato oxidable se aumenta la velocidad de consumo B.- Al agregar un sustrato oxidable se aumenta la velocidad de consumo de oxígeno y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuye y de oxígeno y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuye y también la del ADP endógeno, por lo tanto este compuesto comienza a también la del ADP endógeno, por lo tanto este compuesto comienza a ser limitante. ser limitante.

C.- Al agregarle ADP + Pi , la velocidad de consumo de oxígeno aumenta C.- Al agregarle ADP + Pi , la velocidad de consumo de oxígeno aumenta significativamente y entonces, la concentración de oxígeno disminuye significativamente y entonces, la concentración de oxígeno disminuye en forma abrupta.en forma abrupta.

D.- Al agregar oligomicina, que es un inhibidor de la fracción Fo de la D.- Al agregar oligomicina, que es un inhibidor de la fracción Fo de la ATP sintasa, se bloquea la síntesis de ATP y por lo tanto, también se ATP sintasa, se bloquea la síntesis de ATP y por lo tanto, también se bloquea el transporte de electrones porque ambos procesos están bloquea el transporte de electrones porque ambos procesos están acoplados. Así, no hay consumo de oxígeno y la concentración del acoplados. Así, no hay consumo de oxígeno y la concentración del mismo se mantiene constante. mismo se mantiene constante.

E.- Al agregar 2,4 dinitro-fenol que es un desacoplante de la fosforilación E.- Al agregar 2,4 dinitro-fenol que es un desacoplante de la fosforilación oxidativa, se reanuda el consumo de oxígeno (disminuye la oxidativa, se reanuda el consumo de oxígeno (disminuye la concentración del mismo) porque la cadena respiratoria puede funcionar concentración del mismo) porque la cadena respiratoria puede funcionar normalmente a pesar de que no hay síntesis de ATP. normalmente a pesar de que no hay síntesis de ATP.

BibliografíaBibliografía

Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. T.M. Devlin Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. T.M. Devlin

(ed). Wiley Liss, New York, 1997.(ed). Wiley Liss, New York, 1997.

Principios de Bioquímica. Principios de Bioquímica. A.L. Lehninger, D.L. Nelson, M.M. A.L. Lehninger, D.L. Nelson, M.M.

Cox. Cox. Ediciones Omega, Barcelona, 1995.Ediciones Omega, Barcelona, 1995.

Alvarez S, Novoa Bermúdez MJ, Boveris A. La mitochondria: Alvarez S, Novoa Bermúdez MJ, Boveris A. La mitochondria:

estructura, función y especies reactivas del Oxígeno. estructura, función y especies reactivas del Oxígeno.

Antioxidantes y calidad de vida. 2 (5): 14-22, 1995.Antioxidantes y calidad de vida. 2 (5): 14-22, 1995.

Muchas gracias por su atención !

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