Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego

w Warszawie

Wydział Nauk o Zwierzętach

Mirosław Łańcut

Pracownia hodowli i badań prowadzonych

na modelu danio pręgowanego (Danio rerio)

w Ośrodku Medycyny Doświadczalnej

Uniwersytetu Medycznego w Lublinie -

projekt, wyposażenie i hodowla

Praca dyplomowa

na kierunku Zwierzęta laboratoryjne hodowla, utrzymanie i użytkowanie

Praca wykonana pod kierunkiem

Lek. wet. Piotr Korzeniowski

Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie

1

Oświadczenie promotora pracy

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego.

Data .................................... Podpis promotora pracy ...................................................

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami.

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną.

Data ..................................... Podpis autora pracy ...............................................

2

Spis treści:

1. Wstęp str. 4

2. Ośrodek Medycyny Doświadczalnej str. 4

3. Regulamin Ośrodka Medycyny Doświadczalnej UM w Lublinie str. 6

4. Pracownia hodowli ryb Danio pręgowanego str. 15

5. Opis gatunku str. 20

6. Hodowla str. 24

7. Zdrowie i dobrostan w hodowli str. 26

8. Rozmnażanie ryb w warunkach laboratoryjnych str. 29

9. Żywienie str. 32

10. Znieczulenie i uśmiercanie str. 34

11. Import i eksport str. 37

12. Choroby str. 39

13. Piśmiennictwo str. 41

3

Wstęp

Ośrodek Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie powstał

w 2015r. Jest to nowoczesny kompleks badawczy z zapleczem hodowlanym, wybudowany na

zapotrzebowanie kadry naukowej Uniwersytetu Medycznego, dla której stworzył

odpowiednie warunki do badań z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. Ośrodek

Medycyny Doświadczalnej spełnia wymagania zgodne z rozporządzeniem Ministerstwa

Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 10 marca 2006r w sprawie szczegółowych warunków

utrzymania zwierząt laboratoryjnych w jednostkach doświadczalnych, jednostkach

hodowlanych i u dostawców oraz dyrektywą 123 Unii Europejskiej w sprawie ujednolicenia

praw, regulacji i decyzji administracyjnych państw członkowskich dotyczących ochrony

zwierząt używanych do eksperymentów i innych celów naukowych wraz z aneksami.

Obiekt został zaprojektowany, wybudowany i wyposażony przy współfinansowaniu

przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego

w ramach Programu Operacyjnego Rozwoju Polski Wschodniej 2007-2013

Ośrodek Medycyny Doświadczalnej

Aby wypełnić wszystkie założone zadania Ośrodek Medycyny Doświadczalnej został

zaprojektowany zgodnie z najlepszą wiedzą dotyczącą takich obiektów. Na powierzchni

2000 tys. m2 Ośrodka znajduje się część laboratoryjna, w której powstały specjalistyczne

pracownie naukowe z pełnym wyposażeniem w aparaturę badawczą, sale operacyjne

z pomieszczeniem pooperacyjnej opieki lekarskiej, część hodowlana, w której warunki

środowiskowe spełniają wymagania hodowli SPF, czyli wolnej od specyficznych patogenów,

kwarantanna oraz część gospodarcza w postaci zaplecze gospodarczo-technicznego

z magazynami, myjnią dwustrefową (czystą i brudną), sterylizatornią, stacją uzdatniania

wody. Pomieszczenia hodowlane oraz utrzymania zwierząt w eksperymencie, sale operacyjne

i pokoje laboratoryjne są klimatyzowane poprzez nowoczesny system zapewniający

optymalne warunki do utrzymania zwierząt laboratoryjnych. Każde pomieszczenie ma stałe

warunki środowiskowe na poziomie 55% wilgotności powietrza z temperaturą 22 +/- 2 st. C

i 15-krotną wymianą powietrza na godzinę. Period świetlny dzień/noc wynosi 12 godzin i jest

regulowany przez oprogramowanie. Wszystkie parametry środowiskowe jak i monitoring

pomieszczeń są pod nadzorem centralnego programu monitorującego Ośrodek.

4

Pomieszczenia hodowlane wyposażone są w specjalistyczny sprzęt do hodowli i utrzymania

zwierząt, klatki indywidualnie wentylowane (IVC), umożliwiające utrzymanie najwyższych

rygorów sanitarnych hodowli, stacje bezpiecznej wymiany klatek i stację usuwania ściółki,

zapewniające maksymalną ochronę operatora, jak i środowiska przed patogenami

przenoszonymi drogą powietrzną. Część hodowlana jak i laboratoryjna są izolowane od

pomieszczeń ogólnie dostępnych za pomocą śluz osobowo-towarowych, do których dostęp

zabezpieczony jest systemem kart indywidualnego dostępu. Integralną częścią zaplecza

gospodarczo-technicznego jest zmywalnia wyposażona w automatyczną myjnię tunelową,

myjącą regały, klatki hodowlane i butelki. Szczelna komora myjni służy także do sterylizacji

sprzętu i aparatury w atmosferze nadtlenku wodoru. Centralna sterylizatornia wyposażona jest

w trzy autoklawy przelotowe. Sterylizacji podlega cały sprzęt hodowlany, a także woda do

picia, pasza i ściółka dla zwierząt. Zaplecze gospodarcze posiada również magazyny ściółki,

paszy oraz sprzętu hodowlanego.

Ten nowoczesny kompleks o charakterze naukowo-hodowlanym, umożliwia realizację

największych projektów badawczo-rozwojowych, stwarza warunki pracy naukowej dla

eksperymentatorów wywodzących się z jednostek Uniwersytetu Medycznego, oraz

wszystkich chętnych do współpracy najlepszych specjalistów z kraju i zagranicy.

Najważniejszą funkcją Ośrodka jest stworzenie platformy badawczej skupiającej wszystkie

badania prowadzone z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. Infrastruktura badawcza

w postaci nowoczesnej aparatury badawczej, to takie urządzenia jak Aparat Rezonansu

Magnetycznego o mocy 7 tesli, system do przyżyciowego obrazowania czy w pełni

wyposażona pracownia hodowli komórkowej, pracownia badań ryb z gatunku Danio rerio.

5

Plan pomieszczeń OMD, kolorem niebieskim oznaczone pomieszczenia pracowni hodowli i badań ryb

Danio rerio.

REGULAMIN ORGANIZACYJNY OŚRODKA MEDYCYNY DOŚWIADCZALNEJ

UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W LUBLINIE

I. POSTANOWIENIA OGÓLNE

§ 1

1. Ośrodek Medycyny Doświadczalnej zwany dalej OMD lub Ośrodkiem jest

ogólnouczelnianą jednostką Uniwersytetu Medycznego w Lublinie o charakterze

eksperymentalno-hodowlanym.

2. OMD działa na podstawie:

a) Statutu Uniwersytetu Medycznego w Lublinie,

6

b) Ustawy z dnia 15 stycznia 2015r. o ochronie zwierząt wykorzystywanych

do celów naukowych lub edukacyjnych,

c) aktów wykonawczych wydanych na podstawie w/w ustawy,

d) wytycznych wydanych przez instytucje nadzoru weterynaryjnego,

e) niniejszego Regulaminu.

3. Użyte w Regulaminie pojęcia oznaczają:

UM w Lublinie – Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Eksperymentator – osoba przeprowadzająca lub uczestnicząca w doświadczeniach

z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych,

Personel obsługujący – opiekunowie zwierząt, wyznaczeni pracownicy OMD

Użytkownik – osoba fizyczna, osoba prawna lub jednostka nieposiadająca osobowości

prawnej, która wykorzystuje zwierzęta w procedurach.

§ 2

1. OMD zlokalizowany jest w budynku przy ul. Dra K. Jaczewskiego 8 d w Lublinie.

2. Jednostką podległą OMD jest Laboratorium Badań Behawioralnych zlokalizowane

przy ul. W. Chodźki 8 w Lublinie.

§ 3

Nadzór merytoryczny i finansowy nad działalnością OMD sprawuje Prorektor do Spraw

Nauki UM w Lublinie.

§ 4

Niniejszy Regulamin określa zasady i zakres działalności OMD.

II. ZADANIA OMD

§ 5

1. Podstawowym rodzajem działalności Ośrodka jest hodowla zwierząt laboratoryjnych.

7

2. OMD umożliwia realizację szkoleń w zakresie czynności wykonywanych

z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych.

3. Wyposażenie i aparatura OMD mogą być wykorzystywane wyłącznie w celach

hodowlano – eksperymentalnych z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych, między

innymi w zakresie badań biologicznych.

4. Wyposażenie i aparatura OMD mogą być wykorzystywane przez zespoły badawcze

w skład których wchodzą pracownicy Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, tworząc

samodzielne zespoły lub współpracujące z osobami zatrudnionymi w zewnętrznych

podmiotach i instytucjach badawczych, zgodnie z Zarządzeniem Nr 49/2014 Rektora

UM w Lublinie z dnia 24 kwietnia 2014r. w sprawie wprowadzenia Regulaminu

wykorzystania aparatury badawczej.

III. ZARZĄDZANIE OMD

§ 6

1. Ośrodkiem kieruje Kierownik OMD, który zarządza jednostką zgodnie

z obowiązującymi przepisami.

2. Kierownik OMD jest bezpośrednim przełożonym wszystkich pracowników OMD.

3. Kierownik OMD odpowiada za działalność Ośrodka wobec Prorektora do Spraw

Nauki UM w Lublinie

§ 7

1. Do obowiązków Kierownika OMD należy w szczególności:

a) planowanie, organizacja i koordynacja pracy OMD,

b) nadzór nad prawidłowym funkcjonowaniem OMD,

c) nadzór nad należytym zapewnieniem dobrostanu zwierząt laboratoryjnych,

d) nadzór nad badaniami prowadzonymi z użyciem zwierząt laboratoryjnych,

e) prowadzenie ewidencji zwierząt laboratoryjnych wykorzystywanych

do doświadczeń,

8

f) realizacja obowiązków sprawozdawczych między innymi na temat stanu

epidemiologicznego i sanitarnego OMD, stanie liczebnym zwierząt oraz

wykonywanych doświadczeniach.

2. Ponadto Kierownik OMD:

a) przedstawia Prorektorowi do Spraw Nauki wnioski dotyczące budżetu OMD,

b) sprawuje nadzór nad przestrzeganiem praw i obowiązków podległych

mu pracowników,

c) dba o należyty stan powierzonego mienia, za które wg obowiązujących przepisów ponosi

odpowiedzialność,

d) odpowiada za organizację szkoleń dla osób wyznaczonych do sprawowania opieki nad

zwierzętami utrzymywanymi w Ośrodku, wyznaczonych i odpowiedzialnych za

planowanie procedur i doświadczeń oraz za ich przeprowadzanie, wyznaczonych do

wykonywania procedur, uczestniczących w procedurach, opiekujących się zwierzętami

oraz uśmiercających zwierzęta wykorzystywane w procedurach.

IV. FUNKCJONOWANIE OMD

§ 8

1. Spośród pracowników naukowo-dydaktycznych zatrudnionych w UM w Lublinie

powołuje się Radę Naukową dla OMD

2. Przewodniczącym Rady jest Prorektor do Spraw Nauki UM w Lublinie

3. Do zadań Rady Naukowej dla OMD należy:

a) koordynacja realizowanych projektów naukowych

b) inicjacja nowych projektów badawczych

c) pozyskiwanie partnerów zewnętrznych do badań naukowych

d) nadzór nad wdrażaniem procedur związanych z uzyskaniem Certyfikatu GLP (Good

Laboratory Practice), będącego międzynarodowym świadectwem dobrej jakości

prowadzonych badań.

9

e) stałe utrzymywanie standardów GLP w Ośrodku Medycyny Doświadczalnej.

§ 9

1. Spośród pracowników Uniwersytetu Medycznego w Lublinie powołuje się Zespół

Doradczy do Spraw Dobrostanu Zwierząt.

2. Do zadań Zespołu należy:

a) udzielanie porad w sprawach związanych z zapewnieniem dobrostanu zwierząt oraz

innych dotyczących opieki i postępowania ze zwierzętami,

b) opracowanie i dokonywanie przeglądu wewnętrznych zasad postępowania

ze zwierzętami utrzymywanymi w Ośrodku,

c) monitorowanie przypadków uśmiercania zwierząt w celu pozyskania narządów lub

tkanek,

d) monitorowanie dobrostanu zwierząt utrzymywanych w Ośrodku,

e) zgłaszanie przypadków naruszenia dobrostanu zwierząt i określaniu czynności, które

należy podjąć w celu przywrócenia tego dobrostanu,

f) kontrola przeprowadzania doświadczeń i ich wyników, z uwzględnieniem wpływu

tych doświadczeń na wykorzystywane w nich zwierzęta oraz ocenie zgodności

przeprowadzanych doświadczeń z zasadami zastąpienia, ograniczenia

i udoskonalania.

§ 10

1. W Ośrodku Medycyny Doświadczalnej wyznacza się osoby, posiadające odpowiednie

kwalifikacje do:

a) nadzoru nad osobami sprawującymi opiekę nad zwierzętami oraz dobrostanem

zwierząt utrzymywanych w Ośrodku,

b) świadczenia usług weterynaryjnych,

c) opieki nad zwierzętami

10

§ 11

Użytkownik przekazuje Kierownikowi OMD pisemne wyznaczenia osób odpowiedzialnych

za:

a) planowanie procedur i doświadczeń

b) przeprowadzanie procedur i doświadczeń

c) wykonywanie procedur

d) uczestniczenie w wykonywaniu procedur

e) uśmiercanie zwierząt

§ 12

W budynku OMD wyróżnia się niżej wymienione strefy, w których udostępnia się

eksperymentatorom określone pomieszczenia i laboratoria:

1. Strefa hodowlana

2. Strefa laboratoryjna

a) Laboratorium badań behawioralno-metabolicznych

b) Laboratorium hodowli komórkowych

c) Laboratorium modyfikacji genetycznych

d) Laboratorium biologiczne

e) Laboratorium biochemiczne

f) Laboratorium hematologiczne

g) Sala zabiegowa

h) Sala sekcyjna

i) Sale operacyjne z salą pooperacyjną

j) Pomieszczenia zamrażarek

3. Strefa eksperymentalna

a) Laboratorium rezonansu magnetycznego MRI

11

b) Laboratorium badań przyżyciowych IVIS

c) Pomieszczenia zwierząt w eksperymencie

4. Kwarantanna

a) Laboratorium badań genetycznych i behawioralnych ryb

b) Pomieszczenie do hodowli ryb

c) Pomieszczenie do kwarantanny zwierząt

5. Izolatka

6. Strefa czysta ze sterylizatornią

7. Strefa brudna

8. Strefa administracyjno-socjalna

9. Strefa gospodarczo-techniczna

§ 13

Na terenie OMD wyodrębnia się specjalne pomieszczenia i wyposażenie przeznaczone

na działalność Zakładu Inżynierii Genetycznej, w zakresie zamkniętego użycia GMO.

§ 14

1. Realizację projektów badawczych polegających na wykonywaniu doświadczeń

z użyciem zwierząt laboratoryjnych poprzedza:

a) uzyskanie indywidualnego wyznaczenia, o którym mowa w § 11,

b) złożenie wniosku do Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach,

c) w przypadku podmiotów zewnętrznych - zawarcie umowy z UM w Lublinie

na realizację prac badawczo rozwojowych, zgodnie z Zarządzeniem Nr 49/2014

Rektora UM w Lublinie z dnia 24 kwietnia 2014r. w sprawie wprowadzenia

Regulaminu wykorzystania aparatury badawczej.

2. Po spełnieniu wymogów, o których mowa w § 14 Kierownikowi OMD należy

dostarczyć:

a) kopię wniosku, o którym mowa w § 14 ust.1 lit. a,

12

b) decyzję Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach,

c) kopię aktualnych wyznaczeń wszystkich osób uczestniczących i wykonujących

doświadczenie,

d) wypełnionej Karty Zgłoszenia Eksperymentu, uwzględniającego zapotrzebowanie na

akcesoria oraz sprzęt laboratoryjny z podaniem dokładnych terminów ich

wykorzystywania

e) w treści Zgłoszenia Eksperymentu, o którym mowa powyżej należy uwzględnić

również zapotrzebowania na zwierzęta laboratoryjne, o ile w doświadczeniu

przewiduje się wykorzystanie zwierząt aktualnie hodowanych w OMD.

§ 15

1. Na terenie OMD przebywać mogą tylko osoby wyznaczone do czynności, o których

mowa w § 11.

2. Osoby korzystające z aparatury OMD obowiązuje konieczność pisemnego

potwierdzenia zaznajomienia się z Regulaminem Ośrodka oraz obsługą wybranych

urządzeń.

3. Osoby korzystające z wyposażenia OMD UM w Lublinie obowiązuje konieczność

pisemnego potwierdzenia zaznajomienia się z wewnętrznymi procedurami

i szczegółowymi wytycznymi, wydanymi przez Kierownika OMD.

§ 16

OMD zapewnia eksperymentatorom:

a) pomieszczenia laboratoryjne wyposażone w sprzęt laboratoryjny,

b) pomieszczenia zwierząt w eksperymencie,

c) zwierzęta laboratoryjne, z uwzględnieniem § 14 ust.2 lit. e,

d) jednorazowe kombinezony, rękawiczki, czepki i okulary ochronne tylko do pracy za

barierą eksperymentalną

§ 17

OMD nie zapewnia eksperymentatorom niżej wymienionych materiałów wykorzystywanych

do pracy w laboratoriach:

13

a) odzieży ochronnej wielokrotnego użytku (obuwie, fartuch),

b) materiałów i sprzętu jednorazowego oraz odczynników chemicznych.

§ 18

1. Opiekę nad zwierzętami sprawują wyznaczeni do tego celu i odpowiednio

wykwalifikowani pracownicy OMD.

2. Opieka nad zwierzętami w OMD obejmuje:

a) karmienie i pojenie zwierząt,

b) wymianę klatek,

c) utrzymywanie pomieszczeń w porządku,

d) informowanie eksperymentatora o wszelkich dostrzeżonych zmianach

w zachowaniu zwierząt i ich stanie zdrowia.

e) kontrolę sprawowaną przez lekarza weterynarii.

§ 19

1. W OMD przeprowadza się badania naukowe z użyciem zwierząt laboratoryjnych:

a) aktualnie hodowanych w Ośrodku

b) zamawianych, przez jednostki naukowe lub eksperymentatorów zgodnie

obowiązującymi w UM w Lublinie procedurami, z innych placówek

krajowych lub zagranicznych wpisanych do rejestru dostawców zwierząt

laboratoryjnych prowadzonego przez właściwego ministra.

2. Na terenie OMD obowiązuje łagodne i humanitarne traktowanie zwierząt

laboratoryjnych.

§ 20

1. W przypadku wykorzystania w badaniach naukowych zwierząt laboratoryjnych

o których mowa w § 19 ust.1 lit. b należy, z co najmniej 30 dniowym

wyprzedzeniem:

a) poinformować Kierownika OMD o planowanym terminie przybycia zwierząt,

14

b) przedłożyć Kierownikowi OMD kopię właściwych certyfikatów

i zaświadczeń dotyczących pochodzenia i stanu zdrowia zwierząt

laboratoryjnych

2. Zwierzęta laboratoryjne dostarczone do OMD poddawane są obowiązkowej

kwarantannie. Dalsze postępowanie ze zwierzętami uzależnione jest od ich ogólnej

kondycji, stwierdzonej przez osobę wykonującą obowiązki lekarza weterynarii.

V. POSTANOWIENIA KOŃCOWE

§ 21

1. Wszelkie zmiany Regulaminu wymagają zastosowania trybu przewidzianego do jego

wprowadzenia.

2. Naruszenie postanowień niniejszego Regulaminu stanowi naruszenie obowiązków

pracowniczych w rozumieniu art. 100 Kodeksu pracy.

3. W sprawach nieuregulowanych niniejszym Regulaminem mają zastosowanie

odpowiednie przepisy aktów prawnych wymienionych w § 1 niniejszego Regulaminu.

Pracownia hodowli ryb danio

W ramach nowo powstałego Ośrodka Medycyny Doświadczalnej a w odpowiedzi na

zapotrzebowanie kadry naukowej Uniwersytetu Medycznego na nowy model zwierząt

laboratoryjnych, powstała Pracownia hodowli i badań danio pręgowanego. Ze względu na

zaawansowany stopień prac budowlanych w Ośrodku w momencie podjęcia decyzji

o stworzeniu laboratorium ryb, projekt dla tego laboratorium musiał uwzględniać istniejące

pomieszczenia Ośrodka. Na Pracownię hodowli i badań ryb zostały zaadaptowane cztery

pomieszczenia w strefie kwarantanny. Pomieszczenia laboratorium zostały odgraniczone od

korytarza i pozostałych pomieszczeń kwarantanny przez śluzę osobową. Pracownia mieści

cztery pomieszczenia: pomieszczenie hodowli ryb, kwarantanna ryb, utrzymania ryb

w doświadczeniu, oraz laboratorium badań na modelu danio.

Wejście do części hodowlanej, kwarantanny i utrzymania ryb w eksperymencie prowadzi

przez śluzę osobową wyposażoną w szczelne drzwi z zamkiem dostępowym. W śluzie

15

znajduje się lampa UV przepływowa, podajnik środka do odkażania rąk i pojemnik

z jednorazowymi rękawiczkami.

Ze śluzy prowadzą szczelne drzwi do pomieszczeń Pracowni. Pomieszczenie hodowlane

o powierzchni 14.09 m2 wyposażone jest w system doprowadzenia wody uzdatnionej do

regałów hodowlanych, system odprowadzenia wody zużytej, kratkę ściekową w centralnej

części podłogi, system zasilania w energię elektryczną przez uziemione wodoszczelne

gniazda, system klimatyzacji i wymiany powietrza utrzymujący stałe warunki środowiskowe,

system programowanego periodu świetlnego dzień/noc. W pomieszczeniu hodowlanym

zainstalowano sześć wolnostojących regałów hodowlanych ryb typu Stand-Alone model

Active Blue (Tecniplast), uwzględniając przestrzeń do obsługi i wymiany pojemników

bytowych ryb.

Regał hodowlany typu Stand-Alone model Active Blue

Kolejne przejście prowadzi do pomieszczenia kwarantanny ryb. Kwarantanna to

pomieszczenie o powierzchni 5.33 m2 wyposażone jest w system doprowadzenia

i odprowadzenia wody uzdatnionej do regałów hodowlanych, kratkę ściekową w centralnej

16

części podłogi, system zasilania w energię elektryczną przez uziemione wodoszczelne

gniazda, system klimatyzacji i wymiany powietrza utrzymujący stałe warunki środowiskowe,

system programowanego periodu świetlnego dzień/noc. W kwarantannie zainstalowano jeden

wolnostojący regał hodowlany Active Blue, stół, krzesła i szafki laboratoryjne z materiałów

wodoodpornych.

Trzecie szczelne drzwi prowadzą do pomieszczenia utrzymania ryb w doświadczeniu. Na

powierzchni 14.09 m2 zainstalowano podobnie jak w poprzednich pomieszczeniach system

doprowadzenia i odprowadzenia wody, kratkę ściekową w centralnej części podłogi, system

zasilania w energię elektryczną przez uziemione wodoszczelne gniazda, system klimatyzacji

i wymiany powietrza utrzymujący stałe warunki środowiskowe, system programowanego

periodu świetlnego dzień/noc. W pomieszczeniu zainstalowano dwa wolnostojące regały do

genotypowania ryb typu (Genotype Stand-Alone Aquatic System, Tecniplast) i dwa

wolnostojące regały toksykologiczne typu Stand-Alone ( Tox Aquatic System, Tecniplast).

Regał toksykologiczny typu Stand-Alone Tox Aquatic System.

17

Regały do genotypowania ryb typu Genotype Stand-Alone Aquatic System.

Pomieszczenie laboratorium badań na modelu danio o powierzchni 14.09 m2 posiada

oddzielne wejście z korytarza zabezpieczone szczelnymi drzwiami. Laboratorium zostało

wyposażone w meble laboratoryjne zapewniając cztery stanowiska pracy. Specjalistyczny

sprzęt do badań na modelu danio w postaci trzech stanowisk do mikromanipulacji

zaopatrzone w mikroskopy Stemi 508 (Zeiss), mikromanipulatory i mikro-iniektory

Programmable Microinjector IM 300 (Narishige), mikroskop fluoroscencyjny Stereo

Discovery V8 (Zeiss), aparaturę do badań behawioralnych ZebraBox i ZebraCube

(ViewPoint), inkubatory hodowlane, stanowi wyposażenie laboratorium.

18

Stanowiska do mikromanipulacji wyposażone w mikroskopy stereoskopowe.

Stanowisko do obrazowania wyposażone w mikroskop fluoroscencyjny Stereo Discovery V8

Aparatura do badań behawioralnych ryb View Point Zebrabox

19

Opis gatunku - danio pręgowany (Danio rerio; Hamilton 1822)

Danio pręgowany należący do rodziny karpiowatych (Cyprinidae) w naturze

występuje w wolno płynących i stojących wodach Indii, Pakistanu, Bangladeszu, Nepalu

i Birmy, jest to ryba smukła, posiadająca na bokach ciała pięć równoległych niebieskich

pasów. Długość jej ciała osiąga 4,5–5,0 cm. Posiada silnie zaznaczony dymorfizm płciowy.

Samce są smuklejsze a ich ubarwienie posiada wyraźną domieszkę barwy pomarańczowej,

szczególnie dotyczy to płetw. Samice o ubarwieniu żółto-srebrnym mają wyraźnie

uwydatnioną partią brzuszną. Cechy te są dobrze wyrażone u linii posiadających ubarwienie

charakterystyczne dla typu dzikiego (WT). W przypadku ryb o innym fenotypie, szczególnie

gdy są młode, określenie płci na podstawie ubarwienia może być trudniejsze.

Danio pręgowany charakteryzuje się łatwością utrzymania w warunkach

laboratoryjnych. Krótki cykl rozwojowym ok. 2–4 miesięcy od zapłodnionego jaja do

osiągnięcia dojrzałości płciowej jest dodatkowym atutem modelu. Dostępność dużej ilości

materiału do badań, łatwość manipulacji genetycznych oraz zasobność kolekcji mutantów

i linii transgenicznych sprzyja prowadzeniu prac badawczych. Przezroczystość ciała danio we

wczesnych stadiach rozwojowych, w połączeniu z małym rozmiarem larw umożliwia

prowadzenie bardzo zaawansowanych badań mikroskopowych in vivo. Genom danio został

zsekwencjonowany. Danio pręgowany posiada 25 chromosomów, na których znajdują się

odpowiedniki ponad 70% genów ludzkich, co daje duże podobieństwo zjawisk zachodzących

u tej ryby do tych, które zachodzą w organizmie człowieka.

Kierunki badań z zakresu biologii i medycyny prowadzone z zastosowaniem danio

pręgowanego:

• genetyka i rozwój,

• neurologia i neuropatologia,

• kardiologia,

• onkologia,

• farmakodynamika i toksykologia.

• biochemia

20

• behawior

• kontrola środowiska

Behawior ryb

Danio są bardzo aktywnymi zwierzętami stadnymi, które powinny być utrzymywane

w grupach powyżej 5 sztuk. W stadach liczących mniej ryb często robią się agresywne.

Odpowiednimi są dla nich długie i płytkie baseny. Lubią polować (żywy pokarm). Posiadają

bardzo czułe zmysły, pozwalające szybko reagować na bodźce pochodzące z otoczenia. Danio

ma tendencję do skakania w momentach działania stresora, na co trzeba zwrócić uwagę przy

pracy (ryzyko utraty ryb oraz zagrożenie pomieszania linii o identycznym ubarwieniu). Inną

reakcją na stres jest szybkie pływanie lub pozostanie w bezruchu przy dnie zbiornika.

W momentach silnego przestraszenia gatunek ten ma zdolność do opróżnienia przedniej

części przewodu pokarmowego („pseudożołądek”) z treści pokarmowej. Może dojść również

do intensywniejszego oddawania kału. Spokojne ryby przebywają w górnych i środkowych

partiach zbiornika. Podczas karmienia, żywo reagują na obecność opiekuna i jeszcze przed

podaniem pokarmu gromadzą się przy powierzchni wody.

Naturalne zachowanie – swobodne pływanie po całym zbiorniku

21

Reakcją na stres jest pływanie przy dnie.

Podczas karmienia ryby gromadzą się przy powierzchni wody.

22

Hodowla ryb danio

W pracowni hodowli OMD, ryby danio utrzymuje się w akwariach o pojemności 3,5 litra oraz

8 litrów w zautomatyzowanych systemach typu Stand-Alone model Active Blue. Systemy do

hodowli zapewniają:

- filtracje wody – posiadają wydajne układy filtracji mechanicznej, chemicznej i biologicznej

oraz lampy UV.

- monitorowanie parametrów środowiskowych oraz prawidłowego działania sprzętu - system

powiadomień i alarmów – co zapewnia większe bezpieczeństwo hodowli

- utrzymanie odpowiednich parametrów wody

- automatyczną wymianę wody

- uniezależnienie się od złej jakości wody wodociągowej (system przygotowuje wodę na

bazie wody RO z dodanymi roztworami soli i wodorowęglanu sody)

Dla ryb w OMD środowiskiem jest woda systemowa o następujących parametrach:

• temperatura 26–28,5°C, pH 6,9–7,5,

• przewodnictwo wody 600–1000 µS,

• Zawartość związków azotowych

- NH4+ /NH3–0,0 mg/l,

- NO2– – 0,0–0,1 mg/l,

- NO3–1–5 mg/l,

Bardzo ważne jest manualne monitorowanie i kontrola parametrów wody systemowej

w zakresie zawartości w wodzie związków azotowych ze względu na zagrożenie

toksycznością amoniaku i azotynów. Kontrola w OMD prowadzona jest z zastosowaniem

testów firmy JBL. Monitorowane są również następujące parametry :

• Twardość ogólna 3–6°

• twardość węglanowa 1–3°,

• zawartość rozpuszczonego tlenu >6 mg/l lecz nie przekraczająca 15 mg / l

• średni dobowy cykl wymiany wody z systemu 10–15%.

23

Oprócz odpowiedniej jakości wody ważne jest także zapewnienie odpowiedniego oświetlenia.

W pracowni zainstalowano lampy jarzeniowe o białej barwie, zapewniające co najmniej 350

luksów i pracujące ( w pracowni danio) w cyklu 14/10 godzin (dzień/noc) z możliwością

programowania natężenia światła i czasu rozjaśniania. Sterowanie parametrami oświetlenia

realizowane jest przez programowalny panel sterowania.

Procedura nr 1 Hodowla ryb Danio rerio

Utrzymanie ryb w akwariach w OMD – 5 sztuk na 1 litr wody

Przed wejściem do pomieszczeń należy zdezynfekować ręce i założyć rękawiczki !

Sprawdzić we wszystkich regałach:

• wyświetlacze (parametry i alarmy; prawidłowe parametry to pH 6.9-7,5, temp 28

stopni, przewodność 600 lub 1000 w regale gdzie narybek karmi się wrotkami)

• pojemniki z roztworami soli morskiej i węglanów oraz sondy w sumpach (sondy

muszą być zanurzone w roztworze); w razie potrzeby roztwory należy uzupełnić.

W przypadku wcześniejszego pozostawienia ryb do rozmnażania należy podnieść przegrody

w pojemnikach.

8:00 karmienie wszystkich ryb:

• podnosi się przepływy

• po podaniu karmy należy odczekać 15 minut aż ryby zjedzą

• po zakończeniu karmienia należy opuścić przepływy

Czyszczenie pojemników w regałach- nie więcej niż 5 pojemników dziennie w jednym regale

– zmywarka

Wymiana filtrów w zależności od zanieczyszczenia (intensywność karmienia, grupy

wiekowe).

9:30 odłowienie ryb po tarle, płukanie ikry roztworem E3, rozłożenie ikry na szalkach

24

Petriego (50 sztuk na szalkę), włożenie szalek do inkubatora (temp. 28,5 stopni)

10:00 karmienie młodego narybku

11:30 odłączenie napowietrzania w pojemniku z artemią i jej pozyskanie, nastawienie nowej

hodowli artemii.

12:00 karmienie wszystkich ryb

14:00 karmienie młodego narybku

16:00 karmienie wszystkich ryb

W przypadku przygotowywania ryb do rozmnażania, należy nalać wody systemowej do

małych pojemników tarliskowych a następnie odłowić ryby do rozrodu 2 samice na 4 samce,

1 samica na 3 samce lub 1 samica na 1 samca (oddzielenie samic od samców przegrodą).

Pozostałe czynności

Codzienne mycie pojemnika z artemią .

Dwa razy w tygodniu odnawianie hodowli wrotek.

Raz w tygodniu kontrola poziomu azotanów, azotynów, amoniaku.

Raz na dwa tygodnie kontrola parametrów pH, przewodność, temp. przy użyciu mierników,

ewentualna kalibracja.

Raz w miesiącu badanie bakteriologiczne, mikologiczne, parazytologiczne ryb

wskaźnikowych (sentinele) oraz badanie osadu biologicznego. Badania wykonuje lekarz

weterynarii.

Raz w miesiącu mycie regałów.

Raz w miesiącu zliczamy wszystkie ryby.

Co pół roku wysyłamy ryby do badań bakteriologicznych, mikologicznych,

parazytologicznych i wirusologicznych ryb wskaźnikowych (sentineli).

Zdrowie i dobrostan ryb w hodowli

Obowiązuje zasada czystości i sterylności całego sprzętu stanowiącego wyposażenie

pracowni, dokładne mycie, odkażanie i sterylizacja sprzętu, oraz przestrzegania zasad higieny

pracowników „zasada czystych rąk”. Przed wejściem do pracowni zainstalowano urządzenia

do sterylizacji rąk i podajniki rękawiczek jednorazowych.

25

Ryby które wprowadzamy do pracowni hodowli przechodzą kwarantannę

w oddzielnym pomieszczeniu kwarantanny i wydzielonym autonomicznym systemie

hodowlanym. Ryby, które po 30-dniowej obserwacji, w trakcie której nie wykazały objawów

chorobowych, mogą otrzymać zgodę na dopuszczenie do tarła, ale dopiero odkażona ikra

takich ryb jest wprowadzana do hodowli w systemie głównym akwakultury. Kwarantanna ma

więc charakter ostateczny a nie okresowy.

Odkażanie ikry - zewnętrzne odkażanie ikry nie zabezpiecza przed przeniesieniem

niektórych chorób (np. transmisja spor Pseudoloma neurophilia). Do odkażania ikry używane

są wodne roztwory podchlorynu sodu, a następnie ikra jest inkubowana w temperaturze

28.5°C w E3 przez 5 dni.

W trakcie prowadzenia zabiegów hodowlanych usuwane są stare ryby bez wartości

hodowlanej, ponieważ dodatkowo mogą wykazywać wzrost podatności na choroby,

w wyniku zmniejszającej się z wiekiem wydolności układu immunologicznego. Prowadzi się

intensywną obserwację wyglądu i zachowania ryb. Natychmiast usuwane, bądź izolowane są

ryby z objawami klinicznymi chorób oraz wprowadzana jest szybka diagnostyka lekarsko-

weterynaryjna, celem wyeliminowania szerzenia się infekcji w systemie.

Do hodowli wprowadzone są ryby testowe (strażnicy) – które poddawane są okresowym

badaniom zdrowia. W pakiecie badań prowadzi się badania: bakteriologiczne, mikologiczne

i parazytologiczne, na podstawie których podejmowane są dalsze decyzje co do przydatności

ryb do hodowli.

Prowadzone są także badanie osadu biologicznego gromadzącego się w systemie. Osad

lub tzw. nawis biologiczny zazwyczaj składa się z niewywołujących chorób u ryb:

śluzowców, wrotków, pierwotniaków, licznych bakterii oraz z zalegających resztek pokarmu

i odchodów ryb . Stanowi jednak idealne środowisko rozwoju bakterii i grzybów patogennych

dla ryb. W osadach również mogą przetrwać liczne formy przetrwalnikowe patogenów.

Przyrost zanieczyszczeń biologicznych należy ograniczać poprzez regularne, mechaniczne

oczyszczanie wszystkich dostępnych elementów systemu: zbiorników hodowlanych, filtrów,

rynien odpływowych, systemu rozprowadzenia wody.

Przekroczenie górnej wartości stężeń azotynów i amoniaku grozi zatruciem

objawiającym się zaburzeniami oddychania (duszność), nadprodukcją śluzu ze zmętnieniami

gałek ocznych i skóry oraz martwicą płetw. Ostre zatrucie prowadzi w krótkim czasie do

śmierci ryb. Zagrożenie to jest większe szczególnie przy intensywnym karmieniu i wzroście

26

zagęszczenia ryb w hodowli. Woda systemowa nie może zawierać substancji, takich jak:

chlor, metale ciężkie (miedź, rtęć, ołów, chrom i kadm), środków ochrony roślin czy

detergentów, które są wysoko toksyczne dla ryb.

Zachwianie cyklu świetlnego prowadzi do zaburzeń w rozmnażaniu, ogólnych

zaburzeń behawioralnych oraz zmian w żerowaniu.

Realizacja dobrostanu jest zapewniona przez utrzymanie kontrolowanych, właściwych

warunków środowiska, optymalne żywienie, umiejętne postępowanie z rybami , gwarantujące

minimalizację stresu w czasie manipulacji, prawidłowo stosowaną anestezję i analgezję oraz

właściwe metody eutanazji ograniczające cierpienie. Gwarancją spełnienia tych warunków

jest doświadczony, autoryzowany personel, posiadający uprawnienie przewidziane polskim

ustawodawstwem regulującym postępowanie ze zwierzętami laboratoryjnymi. Istotna jest rola

nadzorująca powołanego zespołu d/s dobrostanu zwierząt.

Procedura nr 4 - Mycie regałów i akcesoriów używanych w hodowli

Mycie regałów (częstotliwość mycia – w/g grafiku rozkładu pracy)

Przed myciem należy przełowić ryby do czystego akwarium pamiętając o tym, aby do

nowego akwarium wlać 1/3 objętości wody z akwarium w którym ryby były utrzymywane do

tej pory, w celu utrzymania niezmienionych parametrów wody w regale.

Do mycia używamy wyłącznie wody demi.

Myciu ręcznemu podlegają :

- filtry, pokrywy, syfony

- tylne rynny z przegrodami

- rury odpływowe

- wnętrze sumpa

- podstawy na których stoją akwaria w regale

Myciu mechanicznemu podlegają

- akwaria – pojemniki 3,5 litra oraz 8 litrów

Procedura mycia mechanicznego w myjni

- uruchomienie sprężarki

27

- włączenie zasilanie myjni

- wybór program STD Chemical

Wszelkie stałe elementy regału należy przetrzeć używając wody demi.

Mycie akcesoriów używanych w hodowli

- pojemniki do rozmnażania

- siatki do przeławiania ryb

- osprzęt do hodowli wrotków oraz artemii

Wszelkie elementy używane w hodowli a wykonane z materiałów zdatnych do

autoklawowania sterylizuje się w temp 120 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Rozmnażanie danio w warunkach laboratoryjnych

Przed nastawieniem ryb do tarła należy rozdzielić samce od samic do oddzielnych akwariów

Tarło prowadzi się w systemie:

• Tarła indywidualne (jedna samica, jeden samiec)

• Tarła zbiorowe (jeżeli to możliwe z przewagą liczebną samców)

Należy pamiętać o tym, że oprócz tareł planowych, w grupach mieszanych dochodzi do

spontanicznego rozrodu.

Do przeprowadzenia tarła planowego konieczne są pojemniki wyposażone w ruszty

i siatki, które zapewniają zabezpieczenie ikry przed zjadaniem przez tarlaki. Ryby przeławia

się do pojemników tarliskowych w godzinach popołudniowych. Do tarła dochodzi następnego

dnia, w godzinach porannych, po zapaleniu się światła lub po wyciągnięciu przegrody. Po

kilku minutach do godziny, ryby przystępują do tarła. Pozyskaną ikrę zbiera się na sitku,

przepłukuje się roztworem E3 i sortuje.\

28

RECEPTURY

Roztwór E3

• Mieszaninę soli

• 17,4g NaCl + 0,8g KCl + 2,9g (CaCl2 x 2H2O) + 4,89 (MgCl2 x 6H2O)= sól

• sól + woda demi = 1 litr roztworu = 60x koncentrat

• Przy użyciu NaOH doprowadzamy do uzyskania w roztworze 7,2 pH

• Sterylizujemy i utrzymujemy w temp 4 stopni

• 16,5 ml koncentratu (60x) rozcieńczamy w 1 litrze wody demineralizowaną

i trzymamy w temp. pokojowej.

Podchloryn Sodu

• 360 µl NaOCl (podchloryn sodu) na 1 litr wody systemowej lub roztworu E3 (ikra do

wysyłki)

Pojemniki do rozmnażania ryb.

29

Ikrę umieszcza się na szalce Petriego w roztworze E3 (max 50 szt. na szalce). Ilość E3

ma wypełniać 2/3 wysokości szalki. Szalki wkładane są do inkubatora (temp. 28,5 stopnia).

Dobrą praktyką jest sortowanie ikry (usunięcie niezapłodnionych ziaren i nieprawidłowo

rozwijających się embrionów) po kilku godzinach inkubacji. Po 18-27 godzin po zapłodnieniu

(przed pojawieniem się pigmentu) szalki z ikrą wyjmuje się z inkubatora, usuwa się

zanieczyszczenia i odkaża roztworem podchlorynu sodu - na drobnym sitku umieszcza ikrę

i moczy 5 minut w roztworze podchlorynu sodu, następnie 5 minut w jałowym roztworze E3,

kolejne 5 minut w roztworze podchlorynu sodu oraz 5 minut w jałowym roztworze roztworze

E3. Po odkażeniu ikrę z powrotem umieszcza się na szalkach Petriego w roztworze E3 i dalej

inkubuje w temp 28,5 stopnia. Należy pamiętać , że wyniku odkażania związkami chloru,

osłona jajowa znacznie twardnieje co w większości przypadków wymaga mechanicznego lub

enzymatycznego wspomagania przy wylęgu. Łączny czas inkubacji ikry wynosi 4-5 dni od

momentu zapłodnienia. Przed przeniesieniem ryb do systemu hodowlanego, po wyjęciu

z inkubatora, do szalki Petriego z larwami danio dodaje się niewielką ilość wody systemowej

– adaptacja do nowych warunków środowiskowych.

Cała zawartość szalki Petriego przenoszona jest do pojemnika z niewielką ilością wody

systemowej (2-3 cm głębokości) bez włączonego przepływu. W takich warunkach narybek

utrzymywany jest do 7 dnia po zapłodnieniu. W tym czasie hodowla karmiona jest wyłącznie

wrotkami a po 7 dniu włączany jest minimalny przepływ wody systemowej i wprowadza się

karmienie karmę suchą o granulacji 75.

Żywienie ryb danio

Najczęściej ryby karmi się 2–5 razy dziennie, w zależności od wieku i wielkości ryb,

takimi porcjami pokarmu, które są szybko zjadane i nie zalegają w zbiornikach, gdyż

rozkładający się pokarm nadmiernie obciąża system i prowadzi do wzrostu stężenia

toksycznych związków azotowych oraz wzrostu zapotrzebowania na tlen.

W trakcie karmienia ważna jest obserwacja ryb i dopasowanie porcji w zależności od

potrzeb, które mogą się zmieniać się pod wpływem wielu czynników, np.

- pory dnia,

- spontanicznego tarła,

30

- aktywności ruchowej personelu.

- zmian parametrów wody lub pojawienia się w niej substancji niepożądanych

Karmienie stanowi też dobry moment do oceny stanu zdrowia hodowanych ryb -

wszelkie nieprawidłowości w zachowaniu lub wyglądzie są sygnałem do rozpoczęcia

postępowania mającego na celu wykrycie i eliminację potencjalnych zagrożeń.

Gotowe pokarmy zapewniają:

- zbilansowaną dietę właściwą dla potrzeb żywieniowych danego gatunku,

- skład i średnicę granulek dostosowane do danej grupy wiekowej hodowanych ryb,

(granulaty o trzech gramaturach, Gemma 75, Gemma 150, Gemma 300)

- czystość mikrobiologiczną eliminującą ryzyko transmisji zakażeń przez karmę.

W karmieniu wykorzystujemy też spirulinę i żywy pokarm (wrotki i wylęg artemii)

Hodowlę żywego pokarmu prowadzimy zgodnie z poniższą procedurą

Procedura nr 3 Hodowla wrotków

Prowadzi się 2 hodowle wrotek w dwóch pojemnikach 6 L.

Pierwsza hodowla odnawiana jest w poniedziałek a druga w czwartek.

Przy odnawianiu hodowli zbiera się również wrotki do karmienia narybku.

Przygotowanie roztworu dla wrotków:

5g soli na litr wody systemowej

Odnawianie hodowli:

Raz w tygodniu przed odnawianiem hodowli przelewa się część wrotków do butelki,

przechowywanej w lodówce.

Wyłączenie napowietrzania, oczyszczanie kamienia i przewodu.

1/3 hodowli należy przecedzić na filtrze (np. do kawy) umieszczonym w lejku, co pewien

czas płukać filtr we wcześniej przygotowanym, czystym roztworze soli w 6l pojemniku.

31

Następnie karmimy wrotki 1,5 – 2,0 ml glonów i uruchamiamy napowietrzanie.

Przygotowanie wrotków do skarmienia:

Należy przygotować niewielkie naczynie z małą ilością wody systemowej.

Część przeznaczoną do skarmiania (2/3 z hodowli) cedzi się na filtrze, który co pewien czas

powinien być przepłukiwany w przygotowanym naczyniu z wodą systemową.

Po zakończeniu tej procedury wrotki dokarmia się małą porcją glonów (napowietrzanie nie

jest konieczne)

Wrotki z hodowli karmione są 2 razy dziennie w dni powszednie o 7:30 i 15:30 porcją 1,5-

2,0 ml (cała pipeta) a w weekendy 1 raz dziennie.

Wrotki do skarmiania karmione są 2 razy dziennie 30 min przed karmieniem narybku (7.30 i

13.30).

Procedura nr 4 Hodowla artemii

Hodowle artemii prowadzi się w specjalnym zbiorniku z wodą demii, wzbogaconą solą

morską w proporcji: na 5 litrów wody 7 łyżeczek soli (….gr).

Wodę podgrzewa się do 28 0C i włącza napowietrzenie.

Zbiornik z przygotowaną wodą zasypuje się jajami artemii w ilości zależnej od potrzeb

hodowli. Po 24 godzinach wylęgu artemia jest gotowa do skarmiania ryb.

Hodowlę artemii za każdym razem odtwarza się od początku.

32

Hodowla żywego pokarmu: artemia (po lewej) i wrotki (po prawej).

33

Znieczulenie i uśmiercanie

Wszystkie działania laboratoryjne, których obiektem są organizmy żywe muszą być

wykonywane z uwzględnieniem minimalizacji stresu i bólu.

Obecnie najczęściej stosowanym preparatem w anestezji i eutanazji ryb jest MS-222 (TMS)

(Tricaine Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% ) Metylosulfonian trikainy

W celu znieczulenia lub uśmiercenia wybranych ryb odławiamy je i umieszczamy

w pojemniku wypełnionym wodą systemową o ustalonej objętości co ułatwia dawkowani

roztworu roboczego używanego do anestezji lub eutanazji .

Najczęściej stosowanym jest roztwór roboczy przygotowywany wg. następującej receptury:

400 mg trikainy (forma proszku)

97,9 ml wody RO (demineralizowanej)

około 2,1 ml 1 M TRIS do uzyskania pH około 7

(wg. ZFIN- TRICAINE PROTOCOL)

Dawka praktyczna przy znieczulaniu to 4,2 ml roztworu roboczego na 100 ml wody. Należy

jednak uwzględniać zmienność reakcji osobniczych .Duży wpływ na przebieg znieczulenia

ma wiek ryb jak również linia z jakiej ryby pochodzą. Paradoksalnie ryby młodsze i narybek

są bardziej oporne na działanie tego środka. Właściwa obserwacja znieczulanych ryb

i doświadczenie w ocenie stopnia znieczulenia są gwarantami poprawnego przebiegu tego

procesu i minimalizuje upadki w wyniku przedawkowania. Bezwzględnie należy pamiętać

o wysokiej toksyczności produktów rozkładu trikainy. Dlatego roztwory najlepiej jest

przyrządzać tuż przed użyciem. Jeśli roztwór roboczy ma być przechowywany to tylko

w ciemnym opakowaniu i w niskiej temperaturze. Kontrola anestezji to również ocena

skutków zastosowania trikainy (np. obrzęk skrzeli i możliwość krwawień z tego narządu).

Nadal prowadzone są prace mające na celu udoskonalenie znieczulania dorosłych danio

pręgowanych np. z użyciem propofolu z lidokainą, izofluranu, butarfanolu i medetomidyny

czy innych substancji stosowanych w weterynarii i medycynie. Istotą powodzenia jest

zwiększeni wchłaniania stosowanych preparatów przez skrzela i skórę.

Pierwszymi objawami działania znieczulenia jest spowolnienie ruchów, zwolnienie

oddychania, spowolnienie akcji serca. Następnie ryby przestają pływać ale nadal reagują na

34

próbę dotykową. Kolejny etap to bezruch ze spowolnionym jeszcze bardziej oddychaniem

i zanik reakcji na próbę dotykową.

Uśmiercanie

Jest to zabieg, który musi być przeprowadzony szybko i przy użyciu wysokich dawek

trikainy. Stosuje się od 300-1000 mg /litr wody w celu szybkiego efektu wywołania śmierci

ryb. W ten sposób zmniejsza się czas trwania pobudzenia, często towarzyszący zastosowaniu

tego związku. W wielu ośrodkach w Europie i USA stosuje się również eutanazję przez

schłodzenie ryb w kąpieli lodowej (trzy części lodu i jedna część wody) a następnie w celu

potwierdzenia śmierci umieszczenie w zamrażarce. Metoda ta zmniejsza również ilość

stosowanej trikainy, która jest stosunkowo droga.

Martwe ryby należy umieścić np. w woreczkach strunowych, które składujemy

w zamrażalce (oznakowanej KAT.1) znajdującej się w pomieszczeniu na odpady medyczne.

Import i eksport

Najczęściej sprowadzana i wysyłana jest zapłodniona ikra poszczególnych linii,

dedykowanych określonym rodzajom badań. Rzadziej sprowadza się dorosłe ryby. Materiał

hodowlany jest wymieniany między placówkami naukowo-badawczymi, rzadziej

pozyskiwany z licencjonowanych hodowli komercyjnych. W przypadku importu z krajów

trzecich (pozaunijnych) wymagane jest urzędowe unijne świadectwo zdrowia (w języku

angielskim i w języku kraju odbiorcy) a przesyłka musi być zgłoszona na przejściu

granicznym, którym materiał zostanie wpuszczony na teren UE. Wcześniej musimy uzyskać

zgodę Głównego Lekarza Weterynarii na import zapłodnionej ikry lub dorosłych ryb.

O fakcie sprowadzenia (wysłania) jednostka informuje Powiatowego Lekarza Weterynarii

sprawującego nadzór nad terenem, na którym znajduje się placówka.

W przypadku przemieszczania ikry i ryb w obrębie UE, przesyłka jest zaopatrzona

w dokumenty potwierdzające pochodzenie materiału oraz aktualne wyniki badań w kierunku

chorób typowych dla danio utrzymywanych w laboratoriach. W tym przypadku również

informujemy Powiatowego Lekarza Weterynarii o sprowadzeniu lub wysłaniu ikry lub ryb.

W przypadku ryb dorosłych wymagane jest zgłoszenie do systemu TRACES.

35

W przypadku przemieszczania zwierząt GMO bezwzględnie wymagana jest zgoda

Ministerstwa Środowiska. Wszelkie niedopatrzenia w przestrzeganiu przytoczonego

postępowania mogą narazić ośrodek na konsekwencje prawne i udaremnić wykonanie

sprowadzenia lub wysyłki.

Nowo przyjęte ryby muszą trafić do kwarantanny i być stopniowo przyzwyczajane do

nowych warunków środowiskowych, także optymalnie żywione (unikanie obfitego karmienia

w pierwszych 12 godzinach po przesyłce w przypadku ryb dorosłych). Ikra, która była

odkażana może wymagać pomocy w wykluwaniu. Dalsze postępowanie z wyklutymi larwami

i narybkiem jest takie samo jak w przypadku własnej hodowli, z ta różnicą, że odbywa się

w obrębie kwarantanny.

Przy wysyłaniu ryb do innego ośrodka, pakuje się ryby w akwarystyczne torebki plastikowe

lub butelki:

- dla ryb dorosłych - torebki plastikowe bez rogów (≤ 5 ryby / 1 litr)

- dla ikry - butelki plastikowe

Musimy zapewnić proporcje wody do powietrza w stosunku 1:3, opakowanie termiczne np.

wkłady grzewcze w zimie, odpowiednie oznaczenie. Na 12 godzin przed i po transporcie nie

karmimy ryb.

Transport może być realizowany przez firmę z uprawnieniami do przewozu zwierząt.

36

Choroby danio w warunkach hodowli laboratoryjnej.

Utrzymanie zdrowej populacji w akwakulturze laboratoryjnej jest jednym z podstawowych

warunków uzyskania poprawnych wyników badań prowadzonych przy wykorzystaniu tego

modelu. Danio jest wrażliwe na większość patogenów występujących w praktyce

akwarystycznej. Jednak w warunkach laboratoryjnych ,wymagania dotyczące zdrowia ryb są

znacznie wyższe niż w hodowli amatorskiej.

Choroby wirusowe obecnie nie stanowią kluczowego zagrożenia dla utrzymywanej populacji

w laboratoriach na całym świecie. Pamiętać jednak należy, że ryba ta jest wrażliwa na

większość wirusów występujących u ryb karpiowatych (Cyprinidae). Przedostanie się tych

wirusów do hodowli laboratoryjne, może przynieść nieprzewidywalne skutki. W badaniach

okresowych uwzględnia się wirus ISKNV (Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)

należący do rodziny Iridoviridae (Megalocytivirus).

Choroby bakteryjne, podobnie jak w przypadku innych ryb stanowią dużą część

zachorowań.Z najważniejszych patogenów należy wymienić: Mycobacterium spp.,

Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Edwardsiella ictaluri, Proteus spp., Vibrio spp.

Flexibacter spp. i inne. Szczególne znaczenie mają mykobakteriozy. W hodowlach

laboratoryjnych danio pręgowanego w materiałe pochodzącym z ryb jak również osadów

najczęściej wykrywa się: M.marinum, M.chelonae, M.fortuitum, M.abscessus, M.pillulare,

M.haemophilum. Objawy w chorobach bakteryjnych nie zawsze muszą być typowe.

Najczęściej stwierdzane są : przekrwienia i wybroczyny na skórze i płetwach, owrzodzenia,

rozdęcie powłok brzusznych z nastroszeniem łusek, martwica płetw i wiele innych.

Mykobakteriozy występujące u danio mogą doprowadzić do zachorowań u ludzi (zoonoza).

Objawy kliniczne to zmiany dermatologiczne, wymagające długiego i specjalistycznego

leczenia. Również bytujące w akwakulturze Pseudomonas spp. i Vibrio spp. mogą być

przyczyną zachorowań personelu i użytkowników.

Wśród licznych chorób stwierdzanych u tego gatunku (oodinoza, ichthyoftiriaza, kostioza,

inwazje przywr Gyrodactlus spp. i Dactylogyrus spp.,choroby grzybicze wywołane przez

Saprolegnia spp., Achlya spp., Branchiomyces spp.) szczególne zagrożenie niesie

Pseudoloma neurophilia, przedstawiciel Microsporidia, atakująca centralny układ nerwowy,

dając całą gamę objawów neurologicznych. Innym patogenem, często stwierdzanym

w akwakulturach jest nicień jelitowy Pseudocapillaria tomentosa, wywołujący przewlekłe

37

stany zapalne błony śluzowej jelit ze wszystkimi te skutkami (osłabienie,upadki a nawet

promocja nowotworów).

W hodowli laboratoryjnej stwierdza się dużą ilość różnorakich wad rozwojowych, nowotwory

(seminoma, melanoma, carcinoma i inne), nefrokalcinoze, megalocytoze wątroby,

kardiomiopatie, EAI (Egg Associated Inflamation).

Stworzony w OMD program ochrony zdrowia Danio pręgowanego, pozwala na

kontrolowanie stanu zdrowia tych ciekawych zwierząt laboratoryjnych.

.

38

Piśmiennictwo

• http://zebrafish.org/health/diseaseManual.php

• http://people.ucalgary.ca/~browder/why_fish.html

• http://slideplayer.pl/slide/9925860/

• http://www.nature.com/articles/srep15822

• http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f09.jpg

• http://annualreport.nichd.nih.gov/weinstein.html

• https://twojezwierzaki.org/artykul/85/choroby-ryb-grozne-dla-ludzi

• http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dvdy.10387/pdf