Practica 1 Guia de Diluciones 1

5/13/2018 Practica 1 Guia de Diluciones 1

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Catedra de Microbiologia e Inmunologia F.C.V.-U.C.V.

P IPETAS ,AUTOM AT ICA S Y,CALCULO DED ILUC IONESAsignatura: Inmunologfa


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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELAFACUl TAD DE CIENCIAS VETERINARIASDEPARTAMENTO DE PATOlOGiAVETERINARIACATEDRA DE MICROBIOlOGiA E INMUNOlOGiAASIGNATURA: INMUNOLOGiA

PIPETAS AUTOMATtCAS Y CAlCULO DE DllUCIONES1.-OBJETIVO GENERAL:

At terminar la practica, et estudiante estara en la capacidad de manipulaadecuadamente los diferentes tipos de pipetas automaticas que se emplean en un laboratoride djagnostico serolOgico, con ef fin de preparar los diversos tipos de diluciones que srealizan comunmente en et mismo.11.-OBJETIVOS ESPECiFI.COS:1.- Reconocer todas las partes yel correcto fUncionamiento de los diferentes tipos de pipetaautomancas.2.~ Realizar las recnicas de pipeteo manipulando adecuadamente tos diversos tipos de pipetaautomaticas.3.- Determiner la utilidad de la preparacion de diluciones en el anatisis clinico de muestrabiol6gicas.4.- Realizar los respectivos calculos de conversion de las unidades de valumen de usa ma

frecuente.5.- Explicar eJprincipia en el que sa basan las difuciones simples.6.- Calcular y realizar las diluciones finales de diversas muestras biol6gicas.7.- Calcutar y realizar diluciones seriadas dobies, cucidruples, en base diez y a volume

variable.8.- Calcular el factor de diluci6nen difucianes seriadas.1 1 1 . - CONTENIDOS:

PIPETAS AUTOMATICASIntroducci6nPartes ExternasTecrncas de pipeteo

Recomendaciones generalesTecnica directaTecmca inverseProcedimientoPipetas automaticas volumen fijaPipetas autornaticas volumen variablePipetas automaticas y placas de microtitulaci6n

DILUCIONESIntroduccionUnrdades de medida (volumen)Principia de las diluciones simplesCalculo de diluciones


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Preparaeion de una diluci6n de la muestra a un volumen finalCalculo de dilucion final de una. rnezcla de suero no diluido can volumen ddiluyente.Calculo de diluci6n final de una rnezcla de suero (previamente diluido) covolumen de diluyente.Dilucrones seriadas dobles.Diluciones seriadas cuadruples.Diluc;ones seriadas a volumen variable.Calcuto de factor de ditucion en diluciones seriadas.

IV.- ACTIVIDADES DEL DOCENTE:ExposiciOn demostrativa de aproximadamente 3040 minutos que incfuye:1.- Descripcion de las partes y et funcionamiento de los diversos tipos de pipetaautomaticas.2.- Explicacion del manejo y manlpulacion adecuada de los diversos tipos de pipetaautornaticas.3.- Explicaci6n de la importancia que tiene la preparaci6n de diluciones en el anafiseUnico de muestras biol6gicas y el principio en el que se basan las dilucionesimples.4.- Descripckm detallada de como calcular diluciones simples y seriadas dobie

cuadruples, en base diez, a volumen variable ysu factor de diluci6n.5.. Realizaci6n de diluciones simples. dobies, cuadruples, en base diez y a volumevariable empleando pipetas automaticas, tubos de ensayo y microplacas de tttulacio

V.- ACT'VIDADES DEL ALUMNO;1.- Reconocera todas las partes yel correcto funcionamiento de los diferentes tipos dpipetas automaticas.2.- Realizara las tecnicas de pipeteo manipulando adecuadamerne los diversos tipos d

pipetas automaticas.3.- Determinara la utitidad de la preparacion de diluciones en et analisis elinice d

muestras biologicas ..4.- Realizara los respectivos calculos de conversion de las unidades de volumen.5.- Explicara el principio en et que se basan las diluciones simples.6.- Cateulara y reahzara las dituciones finales de diversas muestras biol6gicas.7.- Calculara y reahzara diluciones seriadas dobies, cuadruples, en base diez y

volumen variable empleando pipetas automaticas, tubas de ensayo y microplacas dtitulaeicn8.- Calculara el factor de diluci6n en diluciones seriadas.9.- Uenartlla hoJa de actiVidades pnlcticas que se encuentra al final deesta guia

VI.- EVALUACION:1.- Prueba escrita pracfica de respuesta eorta.


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2.- Reconocimiento de los tipos de pipetas, componentes y funcionamiento de larnisrnas.3.- Calculo de diluciones diversas.

vn.- CONSIDERACfONES TEORfCASPIPETAS AUTOMATICAS1.- INTRODUCCIONEI usa de las pipetas automaticas manuates de un solo canal (0 rnumcanal). esmetoda de preferencia para extraer y dispensar pequefios volemenes. Estos Instrumentos so

accesibtes en distintos tamalios (pueden depositar diferentes volumenes en forma. fijavariable) y constituyen instrumentos de alta precision que nos permiten extraer un volumepredeterminado de muestra biol6gica (suero, plasma, liquido cefalorraquideo,. liquido sinoviaorina, entre otTOS)sin necesidad de pipetear con Ia.boca, por 10 que su usa evita el contacdirecto can la muestra, y esto es importante, ya que estas muestras pueden ser un media dtransmision de muchos microorganismospat6genos(virus, bacterias, hongos). las pi:petautornancas pueden ser de dos tipos: Volumen fijo y volumen variable.

Pipetas Volumen Fiio: Como su nombre 1 0 indica, son pipetas euyo volumen ya vienpredeterminado de fabrica y no puede ser modificado. Las hay de 5 J.II.10 pi, 25 1 - 1 1 , 50 J , J I . 101 - 1 1 , 500 1 - 1 1 Y 1000 Ill.

Pipetas de Volumen Variable: Pipetas cuyos volumen se puede predeterminar en urango de medicion", Algunos ejempJos de las mismas se presentan en la sfguiente tabla:

P2 Se pueden mSdir volurnenes entre 0,1 )JIY 2 JJIP5 Se pueden medir volumenes entre 0,5 IJIy 5 I.dP10 .Se pueden medir volurnenes entre O,5J .1 f y 10 IJIP20 Se pueden medir volurnenes entre 2 IJIy 20 ...1P50 Se pueden medir volumenes entre 5)J1y 50 ...1P100 Se pueden medir volumenes entre 20 pi Y 100 ...1P200 Se pueden medir volumenes entre 50 )JlY200 1-11P1.000 Se pueden medir volumenes entre 200 ~t y 1.000 JJIPS .OOO Se pueden medir volumenesentre 1.000 1-11S .O OO ....1P10.000 Se pueden medir volumenes entre 1.0001-11y 1.0.000 J.l1

2.- PARTES EXTERN.A.SPor 1 0 general una pipeta aatornatica esta constituida por las partes senaladas enfigura N 1. Tanto las pipetas de volumen fijo como las pipetas de volumen variable traen u

batOn pufsador que se encuentraen la parte superior de la pipeta (figura 1.A) y esta es la parde Ia plpeta con la que se puede realtzar Ias diferentes tecnicas de pipeteo, ya que esconectadoa un embole interne, el cual se desplaza a 1 0 largo de la pipeta, permitiendo aspiray dispel1sar un detenninado volumen de liquido. EI volumen de dispensaciOn de la pipeta esindK:ado en al baton pulsador 0en alguna otra parte de la pipeta. Et smo donde este indicad

B volumen minima que puede medir cada pipeta viene determinado por la marca de la plpeta


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depende de la marca de la pipeta. EI volumen de dispensacion esta relacionado con el modelde la pipeta.

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POSICI6N INICIAL SEGUNDA POSICI6NRfMERA POSICl6NFigura 2. Posidones para realizar las diferentes tecnicas de pipeteo

RECOMENDACIONES GENERALES1.- Oprima y suelte el boton del pulsador suavemente, particularmente cuand

trabaje con Hquidos de alta viscosidad ..Nunca deje que eI boton vuelva solosu posicion.2.- Asegirrese de que la punta este firmemente sujeta.3.- Compruebe que no halla particufas extranas en la punta.4.- Antes de empezar a pipetear, Ilene y vacie la punta 2-3 veces con lasctucio

que va a pipetear.5.- Sostenga la pipeta en posicion vertical mientras aspire elliquido.6.- EI mango (Figura 1.B) secmantiene sobre el dedo indice.7.- EI Baton pulsador (Figura 1.A) se manipula con el dedo pulgar.8.- Asegurese de que las puntas, pipeta y solucicn estana mi,sma temperatura9.- Cuando se usen estos instrumentos es importante evitar la formaci6nburbujas (que alteran el, volumen), para eUa se recomienda (encaso

aspsacion de la muestra 0 diluyente), introducir verticalmente la pipets (posicion Pp) y colocar la punta de la misma apenas por debajo de la superficde la muestra (0 diluyente), luego aspire lentamente (hasta la posicion Pdejando la punta de la pipeta por debajo dela superficie de ' a muestradiluyente. Si la punta se introduce demasiado por debajo de la superficie, upequefia gota de muestra 0diluyente puede quedar adherida en el exteriorsu extremo. Et traslado de este exceso de muestra 0diluyente aumentaravolumen real distribuido, 10 que podra alterar e1 resultado de la prueba 0 dediluci6n que deseamos preparar. Esteerror 'en fa distribucion del volumen seaumentado a medida que disminuye et volumen de djstribucion deseadRecuerde siempre que para obtener volumenes correctos es importante aspirlentamente.


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10.- Cuando dispense et volumen de la muestra en pruebas en las que se utilicetubos de ensayo, coloque a este en forma ligeramente inclinad(independientemente que este vacio 0can algun diluyente), seguidamente situla punta de la pipeta contra la parte interior del tubo (Iigeramente inclinado) tacerca del fondo (en caso de tubos vactos) 0 de la superficie (en caso de tubocon difuyentes) como sea posible. No coloque fa punta' de la pipedirectamente en el fondo del tubo en posicion vertical, pues esto afectadistrieucion debido al bloqueo del orificio en el extrema. Evile depositarvolumen de la muestra desde la parte superior del tuba, ya que as posible quno todo e1volumen se escurra por el costado del tubo y entonces no tendra ucontacto suficiente 'con los reactivos. En cualquier caso, agregue primerodiluyente y seguidamente la muestra (ej. Suero).

11.- En caso que se utilice una pipeta para trasladar un volumen de muestra de utuba, de ensayo a otro (ej. Diluciones seriadas) sin cambiar las puntas de lrnisrnas, no debe quedar ningun residua en estas. Si esto ocurre,recomienda colocar nuevas puntas en las pipetas antes de agregar la muestralos otros tubos de ensayo. EI rnetodo mas exacto para garantizarprecisiOn ecambiar las puntas de las pipetas para cada tubo de ensayo ..Asimismo, meze1 0 suficiente moviendo el embole de la pipeta hacia arriba y hacia aba(posiciones Pi y Pp) tres a cuatro veces, posteriormente transfiera el volumedeseado al siguiente tuba de diluci6n y haga 10 mismo hasta Uegar al ultimtubo.

12.-Hay discusiones acerca de si una punta de pipeta deberiaestar "cebada""mojada" antes de usarla. Estas palabras se retieren a la aspiracion delliquido(muestra 0 diluyente) varias veces antes de proceder a aspirarta. Se podrargumentar que esta practica del "cebado" incrementa la exactitud del volumenA favor de este argumento se podria utilizar un ejemplo de una prueba enlaque seutilicen controles positives y negatives: supongames queestamosrealizando una tecnica que requiere tres controles negativos y tres positivoPara ahorrar puntas de pipetas, decidimos utilizar la misma punta para lcontroles negativos y posterionnente con una nueva punta de pipeta agregamolos tres controles positives a. sus respectivos tubos de ensayo. Si la punta nfue "mojada" 0 "cebada" antes de agregar el control respective al primer tubeste tendra ligeramente menos volumen que los tubos dos y tres. Esto podrocasionar una disminuei6n de la densidad optica (si la lecturaespectrofotometriea:) suflCiente para provocar un IIgero rechazo ..Para evilar esproblema. es recomendable "cebar" 0 preferiblemente utilizar una punta dpipeta distinta para cada tubo de ensayo. aOn cuando sa agregue el mismcontrol en tres tubos diferentes. Ademas, si una punta en particular esta dafiado fabricada incorrectamente, el usa de puntas diferentes evitani cue todos locontroles sean mal distribuidos. Usarlas pipetas de esta manera, garantizauniformidad de controles y especimenes desde el principio de la prueba hassu finalizaci6n.

TECNICA DIRECTA1.- Ueneel reservorio de reactivo timpio con elliquido a dispensar.2.- Presione el boten pulsador hasta el primer tope.


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3.- Sumerja la punta en el liquido del reservorio alrededor de 1 cm y suavementsuelte el boton pulsador hasta su posicion inicial. Retirar la punta del liquidtocando las paredes del recipiente para eliminar el liqurdo sobrante del exterior dla punta.

4.- Dispensar et Uquido presionandosuavemente el boton pulsador hasta el primetope. Despues de un segundo, seguir presionando el baton completamente hasel segundo tope. Esta accion vaciara totalmente la punta.5.- Oejar que el pulsador vuelva a su posicion inicial 0de reposo

Si es necesario cambie ta punta y continueel pipeteo.

Figura 2. Posiciones para realizar las diferentes tecnicas de pipeteo

TECNICA INVERSA*Esta tecnica es la mas adecuada cuando se trabaja can los liquidos muy viscososcon tendencia a hacer espuma.. Esta tecnica se recomien


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3.- Sumeria la punta en el llquido del reservorio alrededor de 1 cm y suavementsuelte eI pulsador hasta la posicion inicial. Retirar la punta del liquido tocando lparedes del recipiente para eliminar el liquido sobrante de' exterior de la punta ..4.- Dispensar el liquido presionando suavemente el boton pulsador hasta el primetope ..Elliquido quequeda en las puntas es sobrante y no debe dispensarse ..5.- EI Uquido sobrante se vacia apretando el boton pulsador hasta el segundo tope,

bien se aspira de nuevo con la misma secuencia de pipeteo.

Fi.gura 3 , . , Posi.ciones para realizar laTecnica inversa de pipeteo

PROCEDIMIENTO1 .- PIPETAS AUTOMATICAS VOlUMEN FIJO1.- EI Profesor responsable de la practice Ie indicara las partes y la forma dutilizar una pipeta automatica de volumen fijo, preste particular atenci6n a

explicacion.2.- En su equipo de trabajo usted encontrara un tuba de ensayo con agudestilada en una gradiUa. Adernas, tambien habra cuatro tubos de ensay

12x75 vacios.3.- De acuerdo a la explicaci6n de su profesor de practice pipetee vario

volurnenes de agua destilada con la tecnica directa e inversa. Utilice un tubde ensayo diferente para cada tecnica.


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1 1 . - PIPETAS AUTOMATICAS VOLUMEN VARIABLE1.- EI profesor responsable de fa praetica Ie indicara las partes y la forma'utitizar una pipeta automanca de volumen variable, preste particular aterrcioa la explieaci6n.2.- De acuerdo a la explicacion de su profesor de practice pipetee diferentevolurnenes de agua destitada con la tecnica directa.1lI .- PIPETAS AUTOMA TICAS Y PLACAS DEMICROTITULACIONHay muchas tecnicas inmunoserof6gicas que se reatizan en pia casmierotitulaci6n y la (mica forma de poder dispensar tanto los reactivos comlas muestras biol6gicas en estas pJacas es utilizando pipetas automaticas.1.- En su equipo de trabajo encontrara una placa de microtitulaciOn. Su profesGuia Ie indicara cuales son las cotumnas y las frlas 0 hUeras.2.- Atiada por intermedio de una pipeta automatica volumen fijo 0 volumevariable eI volumen de agua destilada que Ie indicara el profesor responsabde la practica a' los pociUos desde el A 1 hasta at A12.de un hilera de la plac

de microtitulacion.3.- Agregue, por intermedio de una pipeta automatics, el volumen de suero que

indicara et profesor responsable de la practica al poelllo A 1 mezclando bi(baje y suba el boton pulsador 6 veces sin lIegar at segundo tope, esevitara la tormaclon de espuma) ..4.- Transfiera ese misma volumen del contenido del paciUa A1 al pocillo A2mezcle bien de ta misma forma anterior. Repita esta misma operacion haslJegar al pecillo A 12.5.- Finalmente, descarte este volumen del pociUo 12 de manera que todos lpocillos contengan el mismo volumen del suero diluido_6.- Es importante cuando realice todoet procedimiento evitar la formaci6nespuma.

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