PRACTICA 2 SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA KIRBY-BAUER.Prctica No. 2

Prueba sensibilidad in vitro a los antimicrobianos (Metodo de Kirby- Bauer)

Objetivo:

Aplicar el criterio de difusin en placa del antimicrobiano propuesto por Bauer, Kirby, Sherris y Turk (1966) modificada y recomendada por la FDA y CLSI (NCCLS) para determinar la susceptibilidad antimicrobiana in vitro.

Duracin de la prctica: 4 hrs.

Introduccin:

En la clnica, el tratamiento de las enfermedades infecciosas de etiologa bacteriana, se requiere de la eleccin adecuada de los antimicrobianos a utilizar para controlar una infeccin de esta naturaleza, ya que si no es as el cuadro clnico correspondiente se puede complicar alcanzando niveles de riesgo compatibles con la muerte del paciente o en el mejor de los casos con complicaciones que determinan mayores riesgos y estancias hospitalarias o mayores tiempos de recuperacin de la salud del paciente a nivel comunitario.

El conocimiento del comportamiento actual de los niveles de resistencia antimicrobiana de las cepas patgenas comnmente asociadas a cudros clnicos de los pacientes a niveles locales, permite determinar acciones generales que pretenden bajo esta informacin brindar la mejor opcin teraputica en la prescripcin de los antimicrobianos correctos para tratar estas infecciones, representndose estos criterios en los denominados tratamientos de eleccin empricos o de tipo primario.

Sin embargo la evolucin permanente y en ocasiones sorprendente de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos, requiere de una vigilancia efectiva para detectar sus tendencias y comportamiento actual, con lo que se podr garantizar tratamientos clncios efectivos de los pacientes al emplearse los antimicrobianos adecuados y con ello recuperar la salud de los mismos.

Por lo tanto con ste propsito, se deber considerar en la practica clnica, la prescripcin de antimicrobianos descritos en las opciones que hemos denominado empricas o de primera eleccin, pero conjuntamente el mdico responsable de prescribir estos tratamientos deber remitir al laboratorio una muestra clnica apropiada segn el caso, para confirmar la etiologa del cuadro clnico y sobre todo la suceptibilidad antimicrobiana del microorganismo aislado de acuerdo a la prescripcin elegida con el propsito de mantenerla o modificarla segn sea requerido.

Algunos microorganismos presentan alta sensibilidad a uno u otro antimicrobiano en condiciones normales dentro de la clnica, a los cuales no es necesario realizar antibiogramas de rutina, sin embargo los informes epidemiolgicos sealan aunque en baja frecuencia casos de resistencia antimicrobiana; dentro de estos grupos de bacterias se encuentran: S. penumoniae, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, C. perfringes, otros Clostidia; Finalmente bacterias como S. pyogenes B. anthracis, C. diptheriae, A. israelii. B. pertusis, B. melitensis siguen presentando suceptibilidad a los antimicrobianos de eleccin primarios.

Por otra parte, para un nmero importante de microorganismos es indispensable realizar las pruebas de suceptibilidad antimicrobiana por presentar porcentajes importantes de resistencia in vivo e in vitro conforme ha transcurrido el tiempo, como es el caso de S. aureus, Staphylococcus Coagulasa Negativos, P. aeruginosa, Acinetobacter spp., H. influenzae, Enterobacterias como E. coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter, e igualmente Enterococcus faecium y E. faecalis entre otros.

La terapia antimicrobiana requiere del conocimiento previo de la susceptibilidad del microorganismo, de las propiedades farmacolgicas de los antibiticos, experiencia clnica al respecto y la historia natural de la enfermedad, as como del estado inmune del hospedero y la confiabilidad de los resultados del laboratorio para lograr el xito esperado en el control de una enfermedad infeccisa.

Las pruebas de susceptibilidad in vitro se realizan bajo dos fundamentos: dilucin seriada en tubos y difusin en placa del antimicrobiano. As el fundamento de difusin se puede realizar en discos de papel, en pozos o en cilindros. En la ltima dcada se ha venido empleando cada vez ms las tiras E-Test, las cuales presentan un gradiente de concentracin del antimicrobiano, equivalente a las concentraciones empleadas para la determinacin de las CMI, combinando la difusin y los diferentes concentraciones del antimicrobiano.

En la practica clnica se aplica en forma comn el mtodo de difusin en placa con discos de papel filtro impregnados con el antimicrobiano a una concentracin fija determinada, que suele indicar la respuesta a la concentracin srica del frmaco que se logra in vitro con los regmenes posolgicos convencionales, proporcionado as una informacin valiosa para la eleccin de un tratamiento antimicrobiano eficaz.

El fundamento de esta prueba se relaciona a la inhibicin microbiana por la difusin del antimicrobiano en la placa de agar y su interaccin con las bacterias en cultivo puro.

Dentro de los factores que influyen en la definicin de la zona de inhibicin estn principalmente: la composicin, volumen o altura del medio de cultivo, produccin de enzimas beta lactamasas, cantidad del inculo, edad microbiana, difusibilidad del antibitico (solubilidad, peso molecular), estabilidad y modo de accin, temperatura y tiempo de incubacin, pureza del cultivo, formas L; procedimientos, lectura e interpretacin. Todas estas variables debern estar perfectamente controladas para evitar la obtencin de resultados errneos y poner en riesgo la salud del paciente.

Esta metodologa se considera limitada para aplicarla con microorganismos de crecimiento lento, anaerobios estrictos y capnoflicos.

El medio de cultivo de eleccin para esta prueba in vitro es el Mueller Hinton con pH de 7.2 a 7.4, aunque en casos de emergencia se puede emplear TSA.

Material y equipo de laboratorio:

Cepas problema en cultivo puro (18-24 horas de incubacin 35-37C)2 placas de Mueller Hinton (0.5 cm. de altura)Unidiscos para bacterias Gram negativasUnidiscos para bacterias Gram positivasHisopos estrilesPinzas de punta roma o dispensador de unidiscosNefelmetro de Mac Farland 0.5Vernier o regla milimtrica.Incubadora 35-37CCepas control: E. coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923

Procedimento:

1. De un cultivo joven de 18 a 20 Hrs. tome 4 o 5 asadas y realice una suspensin en caldo Muller Hinton solucin salina fisiolgica estril2. Ajuste con caldo Muller Hinton o solucin salina fisiolgica estril, la turbiedz tomando como referencia el tubo Mac Farland 0.5 (1.5 x 104 bacterias/ml.).3. Siembre las placas de Mueller Hinton por estra cerrada con un hisopo humedecido en la suspensin bacteriana (presione sobre las paredes del tubo para eliminar el exceso).4. Deje impregnar el inculo bacteriano en la placa de Muller Hinton por 5 min.5. Con el dispensador de unidiscos coloque stos sobre la placa de Muller Hinton inoculada o con pinzas colquelos a una distancia entre ellos de 2.0 cm. y de 1.5 cm. a la pared de la caja y entre ellos.6. Presione ligeramente sobre el agar asegurando el contacto o adherencia del unidisco con la superficie.7. Incube a 35oC durante 18 Hrs. mnimo en condiciones normales. Regularmente se incuban 24 horas.8. Observe y mida los dimetros de los halos de inhibicin con Vernier, regla o plantilla por el fondo de la caja.9. Relacione sus resultados con las tablas de referencia (CLSI) segn la categora de susceptible (S), intermedio (I) o resistente (R).10. Reporte la actividad del antibitico contra el microorganismo.11. Realice una discusin y obtenga las conclusiones pertinentes segn los resultados observados.

Flujograma

Cultivo puro (18-20 hrs. Incubar a 35C)

Tres a cinco colonias, suspender en sol. salina agua destilada estril.

Ajustar suspensin a MacFarland 0.5

Sembrar masivamente en la superficie dela placa de Mueller Hinton con el hisopo

Esperar 5 minutos y distribur los discos sobrela superficie de la placa de Mueller Hinton

Incubar /18 hrs mnimo, a 35C, preferentemente24 horas.

Interpretar resultados y reportar.

Dispensador de unidisco

Resistencia y suceptibilidad (halos de inhibicin) antimicrobiana.Unidiscos y tiras E-Test.

Medicin del dimetro del halo de inhibicin

Evaluacin de la prctica:

Examen escrito sobre la temticaReporte de la prcticaHabilidades sobre el desarrollo de la prctica

Anlisis y discusin de resultados

Conclusiones y sugerencias

Cuestionario.

1. Discuta la validez o no, de la consideracin de realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos in vitro a microorganismos como: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae.

2. Cul es el concepto de antimicrobiano, antibitico y antibacteriano.

3. Cules son los principales mecanismos bioqumicos de la accin de los antimicrobianos sobre las bacterias.

4. Cules son los mecanismos de resistencia bacteriana a los antimicrobianos.

5. Qu condicin debe reunir un microorganismo que va a ser sometido a una prueba de sensibilidad a los antimicrobianos.

6. Qu es una concentracin mnima inhibitoria MIC- y como se determina.

ACTIVIDADES DE SNTESIS:

El alumno elaborar un resumen contrastando la prueba de sensibilidad por el mtodo de difusin en placa y la concentracin mnima inhibitoria.

Lmites aceptables para las cepas de control de calidad empleadas para monitorear la confiabilidad de la prueba de difusin en disco de organismos no fastidiosos (empleando medio de Muller Hinton sin sangre u otro suplemento). CLSI 2012 (Adaptacin).

Agente AntimicrobianoConcentracin en el Disco (g)Escherichia coli ATCC 25922Staphylococcus aureusATCC 25923Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

AmikacinaAmoxicilina Acido ClavulnicoAmpicilinaAmpicilina-SulbactamAzitromicinaAztreonam3020/101010/10

153019-2618-2416-2219-24-28-36--20-2628-3627-3529-3721-26-18-26----23-29

CarbenicilinaCefepimeCefotaximaCefotetanCeftazidimaCeftriaxonaCefuroximaCiprofloxacinaClindamicinaColistina100303030303030521023-2931-3729-3528-3425-3229-3520-2630-40-11-17-23-2925-3117-2316-2022-2827-3522-3024-30-18-2424-3018-22-22-2917-23-25-33-11-17

DoxicilinaErtapenemEritromicinaEstreptomicina3010151018-2429-36-12-2023-2924-3122-3014-22-13-21--

GatifloxacinaGentamicina51030-3719-2627-3319-2720-2816-21

ImipenemKanamicinaLevofloxacinaLinezolid103053026-3217-2529-37--19-2625-3025-3220-28-19-26-

MeropenemMeticilina10528-34-29-3717-2227-33-

Acido NalidxicoNetilmicina303022-2822-30-22-31-17-23

OxacilinaPiperacilinaPiperacilina-Tazobactam1100100/10-24-3024-3018-24-27-36-25-3325-33

RifampicinaTeicoplaninaTetraciclinaTigeciclinaTrimetoprim-Zulfametoxazol53030151.25/23.758-10-18-2520-2723-2926-3415-2124-3020-2524-32---9-13-

Vancomicina30-17-21-

Grupos de agentes antimicrobianos sugeridos con indicaciones clnicas de la FDA que pueden ser considerados para pruebas de rutina y su reporte, para organismos no fastidiosos por los laboratorios de microbiologa clnica (USA). CLSI 2012. (Adaptacin).

EnterobacteriaceaePseudomonas aeruginosaStaphylococcus spp.Enterococcus spp.

GRUPO A

Pruebas primarias y reporteAmpicilinaCeftazidimaAzitromicina oClaritromicina oEritromicinaOxacilina(Disco de Cefoxitina)ClindamicinaAmpicilinaPenicilina

Cefazolina

GentamicinaTobramicinaPenicilina

GentamicinaTobramicinaPiperacilina

Trimetoprim-Sulfametoxazol

GRUPO B

Prueba primaria reporte selectivamenteAmikacinaAmikacina*Daptomicina

*Daptomicina

Amoxicilina-cido. clavulnicoAmpicilina-sulbactamPiperacilina-tazobactamTicarcilina-cido clavulnicoAztreonam

LinezolidVancomicina

Linezolid

Telitromicina

DoxiciclinaMinociclina Tetraciclina

Cefuroxima

CefepimeCefepimeVancomicina

CefotetanCefoxitinaCiprofloxacinaLevofloxacinaRifampicina

Cefotaxima o Ceftriaxona

DoripenemImipenemMeropenem

CiprofloxacinaLevofloxacinaPiperazilina-tazobactamTicarcilina

DoripenemErtapenemImipenemMeropenem

Piperacilina

Trimetoprim-sulfametoxazol

Continuacin.

EnterobacteriaceaePseudomonas aeruginosaStaphylococcus spp.Enterococcus spp.

GRUPO C

AdicionalesReporte selectivoAztreonamCeftazidima(Ambas son indicadores tiles para beta-lactamasas de espectro extendido)CloramfenicolGentamicina (Alto nivel de resistencia realizar prueba solamente)

CloramfenicolCiprofloxacina oLevofloxacina o OfloxacinaMoxifloxacinaEstreptomicina (Alto nivel de resistencia realizar prueba solamente)

Quinupristin-Delfopristin

Gentamicina

Tetraciclina

GRUPO U

Adicionales para orina solamenteCefalotinaLomefloxainaNorfloxacinaCiprofloxacinaLevofloxacinaNorfloxacina

Lomefloxacina o OfloxacinaNorfloxacinaLomefloxacina o Ofloxacina

NorfloxacinaNitrofurantoinaNitrofurantoina

Sulfisoxazol

TrimetoprimTetraciclina

Nitrofurantoina

Sulfisoxazol

Trimetoprim

Interpretacin de los halos de inhibicin para Enterobacterias. CLSI 2012. (Adaptacin)

GRUPOANTIMICROBIANOCONCENTRACIN gDIMETRO DE LA ZONA (mm)

RIS

PENICILINAS

AAmpicilina101314-1617

BBPiperacilinaTicarcilina10075 171418-2015-192120

COMBINACIONES DE BETA-LACTMICOS/INHIBIDORES DE BETA-LACTAMASAS

BBBBAmoxicilina-cido clavulnicoAmpicilina-sulbactamPiperacilina-tazobactamTicarcilina-cido clavulnico20/1010/10100/10

75/10 1311171414-1712-1418-2015-1918152120

CEFEMS (PARENTERAL) (INCLUYENDO CEFALOSPORINAS DE PRIMERA A CUARTA GENERACIN)

AACefazolinaCefalotina3030191420-2215-172318

BBCefamandole

Cefuroxima parenteral3030141415-1715-171818

BCefepime301415-1718

BBBCefoperozonaCefotetanCefoxitina75303015121416-2013-1515-17211618

BBBCefotaxima o CeftriaxonaCeftixozima30303022192123-2520-2222-24262325

CCeftazidima301718-2021

OMoxalactam301415-2223

CEFEMS (ORAL)

BCefuroxima axetil (oral)301415-2223

OCefpodoxima101718-2021

CARBAPENEMICOS

BBBErtapenemImipenemMeropenem10101018191919-2120-2220-22222323

MONOBACTAMICOS

CAztreonam301718-2021

AMINOGLICSIDOS

AGentamicina101213-1415

BAmikacina301415-1617

CKanamicina301314-1718

CNetilmicina301213-1415

CTobramicina101213-1415

OEstreptomicina101112-1415

TETRACICLINAS

CTetraciclina301112-1415

OMinociclina301213-1516

Continuacin.

FLUOROQUINOLONAS

BBCiprofloxacinaLevofloxacina55151316-2014-162117

UGatifloxacina51415-1718

ULomefloxacina oOfloxacinaNorfloxacin1051018121219-2113-1513-16221617

QUINOLONAS

UCinoxacina100 1415-1819

OAcido Nalidxico301314-1819

INHIBIDORES DE LA VA DEL FOLATO

BTrimetoprim sulfametoxazol1.25/23.751011-1516

USulfonamidas250 3001213-1617

UTrimetoprim51011-1516

FENICOLES

CCloramfenicol301213-1718

NITROFURANTOINAS

UNitrofurantoina3001415-1617

FOSFOMICINAS

UFosfomicina2001213-1516

R = Resistente I = IntermedioS = Sensible

Referencias bibliogrficas:

1. Yi-Wei Tang, Charles W. Stratton. (2006) Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology. Ed. Springer Science. USA.2. Bailey & Scott`s Diagnostic Microbiology. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Editors.(2002).Eleventh Edition.Mosby-Elsevier Science. USA.3. Schlossberg D. Clinical Infectious Disease. Part XXV. Antimicrobial Therapy-General Considerations. (2008). Cambridge University Press. Hong Kong. China.4. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. (2009).Microbiologa Mdica. Sexta Edicin. Elsevier-Mosby.Barcelona, Espaa.5. Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI. (NCCLS). (2012). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Seventeenth International Supplement. M100-S22, Vol.23 N 3.